Summary
Этот протокол представляет собой усовершенствованный метод получения преходящей гипертрофии миокарда с абсорбируемым швом, имитируя снижение гипертрофии левого желудочка после удаления перегрузки давления. Это может быть ценным для исследований по гипертрофической предусловия миокарда.
Abstract
На основе двух поперечных сужений аорты (TACs) у мышей, доказано, что гипертрофическое предпосылок миокарда (MHP) может затухать гипертрофию кардиомиоцитов и замедлить прогрессирование до сердечной недостаточности. Для новичков, однако, модель MHP, как правило, довольно трудно установить из-за технических препятствий в работе вентилятора, открытие груди неоднократно, и кровотечение, вызванное debanding. Чтобы облегчить эту модель, увеличить хирургический показатель успеха и уменьшить частоту кровотечений, мы перешли на абсорбируемые швы для первого расчесывания TAC с помощью техники, свободной от вентилятора. Используя 2-недельный абсорбируемый шов, мы продемонстрировали, что эта процедура может вызвать значительную гипертрофию миокарда через 2 недели; и через 4 недели после операции гипертрофия миокарда была почти полностью регрессирована к исходной точке. Используя этот протокол, операторы могли легко освоить модель MHP с более низкой смертностью от эксплуатации.
Introduction
Ишемическое предварительное условие является явлением, которое вызывает краткие нелетальные эпизоды ишемии и реперфузии к сердцу и имеет возможность резко уменьшить травмумиокарда 1. Учитывая очевидные клинические последствия ишемической предпосылки, такие как ограничение инфарктамиокарда размер 2 и подавление желудочковых тахиаритмий после реваскуляризациимиокарда 3,было много исследований, чтобы вскрыть механизмы, лежащие в основе кардио-защитных эффектов, вызванныхпредварительными 4,5. В отличие от этого, другим неишемическим видам предпосылок уделялся относительно мало внимания. Сердечная гипертрофия может быть притуплена у пациентов с стенозом аорты, проходящих замену аортальногоклапана 6. Везде, где существует состояние патологической гипертрофии миокарда, принцип предпосылки редко сообщается.
В 1991 году Rockman et al. во-первых, создали модель мыши гипертрофии левого желудочка путем поперечного сужения аорты (TAC)7. Оперив TAC дважды у мышей, мы ранее доказали, что гипертрофическое предустановка миокарда (MHP) приводит к преходящей гипертрофической стимуляции в сердце, тем самым делая сердце более устойчивым к устойчивому гипертрофированному стрессув будущем 8. Характеристики модели MHP были подтверждены ультразвуковым биомикроскопом и гемодинамической оценкой9. Ключевыми моментами в построении модели было выполнить торакотомию три раза, TAC в течение недели, debanding в течение недели, и вторичные TAC в течение 6 недель. Тем не менее, debanding может вызвать кровотечение, которое затрудняет быть освоены новичками и трудно быть популяризировал. Кроме того, это также техническая проблема для итубации мышей. Неправильная инубация может привести к травме трахеи, пневмотораксу и даже смерти у мышей. Таким образом, при построении модели MHP необходимо и ценно совершенствовать некоторые процедуры.
Чтобы уменьшить сложность модели и увеличить ее успех, мы перешли на абсорбируемые швы для первого TAC и следили за успехом модели, измеряя градиент давления через аортическое сужение под эхокардиографией10. Основываясь на нашем предварительном эксперименте, было бы трудно вызвать достаточную гипертрофию миокарда у мышей со слишком градиентом низкого давления, в то время как у мышей со слишком градиентом высокого давления развивалась бы острая сердечная недостаточность или даже умирала. Идеальный градиент давления для модели колеблется от 40-80 мм рт.ст. Кроме того, этот эксперимент не опираться на вентилятор, который мог бы эффективно избежать вентилятора связанных технических манипуляций и травм12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами ухода и использования лабораторных животных, опубликованными Национальными институтами здравоохранения США (Публикация NIH No 85-23, пересмотренная в 1996 году). Мышей C57BL/6J (8-10 недель, 20-25 г) предоставил Центр животных Южного медицинского университета.
1. Предоперационная подготовка
- Pinch покинуть кончик 25 G иглы с держателем иглы и притупить его с жесткого объекта, как держатель.
- Пройдите 5-0 абсорбируемый шов через иглу, а затем кривой его до 90 "с держателем13.
ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с различными целями исследований, исследователи могут выбрать абсорбируемые линии с различным временем поглощения. В этом протоколе мы использовали 2-недельный абсорбируемый шов, чтобы сжать арку аорты. - Кривая еще 25 G иглы до 120 "и сгладить кончик с держателем, который будет использоваться в качестве космонавта в этапе перевязки.
ПРИМЕЧАНИЕ: 25 G игла была использована в качестве космического для мышей, имеющих вес тела (BW) Используйте 26 G иглы для мышей с 19-24 г BW. - Дезинфекция оперативного участка 75% алкоголем.
- Отрегулируйте температуру грелки до 37 градусов по Цельсию.
- Подготовка стерилизованных хирургических инструментов (в том числе 1 офтальмологические ножницы, 1 микро ножницы, 2 микрохирургических пинцета локтя, 1 держатель иглы, и 1 микро держателя иглы).
2. Индукция анестезии и бритья
- Обезболивать мышь путем внутриперитонеальной инъекции смеси ксилазина (5 мг/кг) и кетамина (100 мг/кг), разбавленного солевым раствором (0,9% NaCl). Подтвердите полную анестезию отрицательным рефлексом снятия педали.
- Держите мышь в положении лежа, фиксируя резцы с швом и фиксации конечностей с клейкой ленты.
- Нанесите крем для удаления волос на шее и xiphoid. Дезинфицировать область йодом, за которым следует 75% алкоголя.
3. Хирургия
- Сделайте разрез более 10 мм в средней линии между надумной вырезкой и грудью скальпелем. Затем отделить кожу и поверхностную фасцию.
- Определите первое межреберное пространство, подсчитав ребра с кормального угла. Выполните разрез в первом межреберном пространстве и как можно ближе к грудине. Тупо проникнуть в него с локтем пинцетом, чтобы открыть это пространство.
- Аккуратно отделите паренхиму и тимус до тех пор, пока не будет видна поперечная аорта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не повреждайте теменной плевры, чтобы избежать пневмоторакса. - Перейти 5-0 абсорбируемых швов под аркой аорты между брахиоцефалией и левой общей сонной артерии с защелкойиглы 14. Пожалуйста, убедитесь, что брахиоцефалическая артерия, левая общая сонная артерия и левая подклавианская артерия видны в области операции.
- Поместите космический, подготовленный в шаге 1.3, на поперечную аорту и выполните двойной узел на космическом пространстве с швом в шаге 3.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик спейсера должен быть тупым, чтобы избежать повреждения поперечной аорты при его удалении. - Снимите спейсер быстро, но осторожно, а затем вырезать концы шва.
- Закройте первое межреберные пространства и кожи с помощью 5-0 нейлоновых швов. Снова дезинфицировать кожу 75% алкоголем.
- Поместите мышь на грелку, чтобы способствовать восстановлению. Инъекционный бупренорфин (0,1 мг/кг, q12h) интраперитонально в течение первых 3 дней после операции.
- Верните мышь в клетку в комнате с светом/темным циклом 12 ч, когда она восстановит сознание.
- Выполните фиктивную операцию, идентичную всем вышеперечисленным шагам, но без сужения (шаг 3.5).
- Выполните операцию для группы шелковых швов, идентичных всем вышеперечисленным шагам, но используя 5-0 шелковый шов в шаге 1.2.
4. Эхокардиографическая оценка успешной перевязки и измерений
- Выполните эхокардиографическую оценку в День (D) 7 после операции.
- Обезболивать мышь с 3% изофлюран через ингаляцию для индукции, и 1,5% для поддержания глубины анестезии, с 0,5-1 л / мин скорость потока кислорода.
- Поместите мышь в положение лежа на платформе, поддерживается на 37 градусов по Цельсию, и ленты его конечностей к электроду.
- Удалите волосы на груди с кремом для депиляния и нанесите ультразвуковой ас-говоруля на грудь мыши.
- Оцените поперечное сужение аорты с помощью зонда 30 МГц.
- Наклоните платформу влево. Держите зонд в вертикальном положении и опустите его на грудь вдоль правой парастральной линии. Затем манипулируйте X-оси и Y-оси под B-режим, пока аортальная арка хорошо видна.
- Найдите сужение B-режимом, чтобы получить вид аорты арки11. Используйте цветной режим Doppler и импульсную волну для измерения пиковой скорости потока и выберите мышей со скоростью более 3000 мм/с в качестве группы TAC (значения основаны на предварительных экспериментах).
- Рассчитайте градиент давления в соответствии с измененной версией уравненияБернулли 11:
градиент давления 4 x Vмакс2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный градиент давления для поперечной модели сужения аорты колеблется от 40-80 ммрт.ст. - Сохраните данные и изображения с помощью Cine Store и Frame Store.
- Оцените размеры и контрактность левого желудочка (LV) с зондом 30 МГц.
- Сброс платформы в горизонтальное положение. Держите зонд на 30 "против часовой стрелки по отношению к левой парастральной линии.
- Используйте B-режим и манипулировать X и Y, чтобы получить четкий и полный вид оси сердца.
- Нажмите M-режим, чтобы показать линию индикатора. Приобретайте изображения с помощью Cine Store и Frame Store для более поздних измерений измерения измерения камеры LV, дробного сокращения и толщины стен LV.
- После этого прекратите вдыхание изофлюрана и позвольте мыши оправиться от анестезии. Затем верните животное в клетку в комнате с светом/темным циклом 12 ч.
- На D14 и D28 после операции повторите вышеуказанные шаги для измерения параметров сердца, а затем собрать сердце для гистологических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании мы случайным образом разделили 45 мышей на три группы: фиктивную, шелковую шовную группу и поглощаемую группу швов (число каждой группы на D0 (базовый), D14 и D28 после TAC было 15, 10 и 5 соответственно). На D7, D14, D21 и D28 после операции суженная пиковая скорость определялась эхокардиографией. Мы обнаружили, что скорость кровотока при сужении была еще больше, чем 3000 мм / с на второй неделе после TAC, хотя абсорбируемый шов был использован для сужения аортальной арки (Рисунок 1A). Кроме того, градиент давления при сужении абсорбируемой группы швов поддерживался выше 40 мм рт. ст. в течение 2 недель(рисунок 1Б). Интересно, что на четвертой неделе после операции не было сужения, что указывает на то, что абсорбируемый шов был полностью поглощен.
Мы также обнаружили, что толщина левого желудочка задней стенки при конце диастола увеличилась и левый желудочковый внутренний диаметр в конце диастола несколько уменьшилась на D14 после TAC (Рисунок 2A-C). Интересно, что толщина левой желудочковой задней стенки при энд-диастоле в поглощаемой группе швов существенно регрессировала на D28 после TAC, который не имел существенного отличия от базового уровня. Кроме того, использование абсорбируемого шва для того, чтобы сделать модель, не повлияло на выброс фракции левого желудочка(рисунок 2D).
Коэффициенты HW/BW группы шелковых швов и поглощаемой группы швов увеличились на 30% по сравнению с фиктивной группой. На D28 после TAC гипертрофия миокарда регрессировала, и соотношение упало до базового уровня(рисунок 3A)в поглощаемой группе швов, в то время как соотношение увеличилось на 64% в группе шелкового шва. Результаты Окрашивания H и E также поддерживали сердечную гипертрофию(рисунок 3B). В заключение, абсорбируемый шов подходил для вызвать транзиторную патологическую гипертрофию стимуляции, которая соответствовала требованиям гипертрофической предусловия миокарда модели.
Количественные данные были представлены как среднее ± SD. Сравнения между обманом, шелковым швом и абсорбируемым швом проводились с использованием одной из сторон ANOVA, за которым следовала пост-специальная Bonferroni.
Рисунок 1: Импульсно-волновая доплеровая визуализация и результаты пиковой скорости и градиента давления сужения. На D0 (базовый), D7, D14, D21 и D28 после TAC с использованием шелкового шва или абсорбируемой швы, аорты арки или сужения измеряется импульсной волной Доплера. (A) Репрезентативная визуализация пиковой скорости на D0 (базовый), D14 и D28 после операции в группе шелковых швов и поглощаемой группе швов. Скорость кровотока поглощаемой группы швов вернулась к исходной линии, в то время как скорость группы шелковых швов была еще больше 3000 мм/с на D28 после операции. (B) Градиент давления был рассчитан в соответствии с измененным уравнением Бернулли: градиент давления No 4 х Vмакс2 (максимальная пиковая скорость). Вопрос: р йт; 0,05 против обмана. Вопрос: p lt; 0,05 против группы шелковых швов (число каждой группы на D0 (базовый), D14 и D28 после TAC было 15, 10 и 5, соответственно). Данные, представленные как ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Левые желудочковые параметры структуры и систолической функции. (A) M-режим изображения из левого желудочка (LV) в группе шелковых швов и абсорбируемой группы швов на D0 (базовый), D14, и D28 после TAC. Репрезентативное изображение толщины стены LV в конце диастола было около 0,70 мм (D0) до 1,089 мм (D28) в группе шелковых швов. Что касается абсорбируемой шовной группы, то толщина стены составила около 0,658 мм (D28), что вернулось почти к исходной точке. (B)Толщина левого желудочка задней стенки при энд-диастоле (LVPWd). (C)Левый желудочковый внутренний диаметр при энд-диастоле (LVIDd). (D)Левая желудочковой фракции выброса (EF). Вопрос: p lt; 0.05 против фиктивы в то же время (число каждой группы на D0 (базовый), D14 и D28 после TAC было 15, 10 и 5, соответственно). Данные, представленные как ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Обратимая сердечная гипертрофия в модели гипертрофической предустановки миокарда. (A) Вес сердца (HW) к весу тела (BW) отношение. (B)Гистологические ломтики сердца, окрашенные H и E (шкала бар 50 мкм). Кардиомиоциты в группе шелковых швов были значительно увеличены с D14 до D28, в то время как размер клеток в основном регрессировал на D28 в поглощаемой группе швов. Вопрос: p lt; 0.05 против фиктивы в то же время (число каждой группы на D0 (базовый), D14 и D28 после TAC было 15, 10 и 5, соответственно). Данные, представленные как ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует еще значительно недостаточно изучены области в сердечной неишемической предпосылки. Основываясь на наших предыдущих исследованиях, мы перешли на использование абсорбируемых швов для улучшения гипертрофической модели предпосылок миокарда.
В предыдущих докладах, многие исследователи использовали шелковый шов, чтобы сузитьарку аорты 8,14,15. Шелковый шов был легко доступен и часто использовался для хирургического шва раны, перевязки тканей и фиксации тканей. В этом протоколе мы заменили шелковый шов абсорбируемым швом для первого TAC. Мы обнаружили, что скорость кровотока в сужении все еще достигла 3000 мм/с или более и длилась в течение 2 недель, что было достаточно, чтобы служить в качестве долгосрочной гипертрофической стимуляции. Затем он вернется к исходной линии на D28. Тем не менее, трудно контролировать время поглощения абсорбируемых швов. Время поглощения связано с материалом и партией абсорбируемого шва, при сужении при адаптации тканей и герметичностью. Ранее мы обнаружили, что ужесточение сужения, меньше времени поглощения, но в то же время смертность мышей будет увеличиваться. Таким образом, мы выбрали пиковую скорость около 3000 мм/с в качестве стандарта, так что время поглощения может контролироваться в течение 2 недель и выживаемость мышей также может быть увеличена. Более важным моментом было то, что использование абсорбируемых швов может сократить время открытия груди в два раза, что снижает сложность операции и увеличивает успешность модели.
Вентилятор, как правило, требуется для жизнеобеспечения мышей во время операции. Сообщается, что аортальная арка мышей может быть сужена без аппарата искусственной вентиляции легких с помощью супрастерна фосса подход15. Тем не менее, это требует резки грудины мышей, которые могут продлить время хирургического восстановления. В этом исследовании мы выбрали такой подход: сужение первого межреберного пространства вблизи грудины, для выполнения операции. Это был минимально инвазивный подход с помощью боковой торакотомии14. Удивительно, но мы могли бы выполнить TAC без вентилятора, если разрез был как можно ближе к грудине. Такой подход может также эффективно избежать связанных с аппаратом искусственной вентиляции легких технических манипуляций итравм 12. Более того, войдя в медиастинум мышей через разрез, аортическая арка была явно выставлена, потому что почти не было вмешательства в тимические ткани и другие кровеносные сосуды в хирургическом поле.
Хотя удобно не использовать вентилятор в течение всей операции, улучшенный метод по-прежнему несет в себе риск пневмоторакса, вызванного плевральной травмы. Есть некоторые предложения, которые могут быть полезны, чтобы избежать повреждения плевры. Притупить кончик иглы как можно больше. После входа в mediastinum, держать кончик локтевого пинцета как вертикальные, как это возможно в течение всей операции. Во время перевязки поместите прокладку в медиастинум вдоль передней медианной линии.
Таким образом, мы улучшили модель мыши гипертрофии миокарда и регрессии с использованием абсорбируемых швов, которые могли бы иметь много потенциальных применений в создании модели гипертрофической предпосылок миокарда, изучение механизма гипертрофии регрессии, и изучение времени левого желудочка обратимой реконструкции, и так далее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81770271; Y, Ляо), Объединенных фондов Национального фонда естественных наук Китая (U1908205; Y, Ляо), а также муниципальных проектов планирования научных технологий Гуанчжоу (201804020083; д-р Ляо).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable suture (5-0) | Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd | 5-0 | Ligation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Close the skin |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made spacer | 25-gauge needle | ||
| Silk suture (5-0) | Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd. | 5-0 | Ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
References
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Ban, K., et al. Phosphatidylinositol 3-kinase gamma is a critical mediator of myocardial ischemic and adenosine-mediated preconditioning. Circulation Research. 103 (6), 643-653 (2008).
- Wu, Z. K., Iivainen, T., Pehkonen, E., Laurikka, J., Tarkka, M. R. Ischemic preconditioning suppresses ventricular tachyarrhythmias after myocardial revascularization. Circulation. 106 (24), 3091-3096 (2002).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Preconditioning and postconditioning: underlying mechanisms and clinical application. Atherosclerosis. 204 (2), 334-341 (2009).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Lund, O., Emmertsen, K., Dorup, I., Jensen, F. T., Flo, C. Regression of left ventricular hypertrophy during 10 years after valve replacement for aortic stenosis is related to the preoperative risk profile. European Heart Journal. 24 (15), 1437-1446 (2003).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciiences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Wei, X., et al. Myocardial hypertrophic preconditioning attenuates cardiomyocyte hypertrophy and slows progression to heart failure through upregulation of S100A8/A9. Circulation. 131 (17), 1506-1517 (2015).
- Huang, J., et al. Ultrasound biomicroscopy validation of a murine model of cardiac hypertrophic preconditioning: comparison with a hemodynamic assessment. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 313 (1), 138-148 (2017).
- Oka, T., et al. Cardiac-specific deletion of Gata4 reveals its requirement for hypertrophy, compensation, and myocyte viability. Circulation Research. 98 (6), 837-845 (2006).
- Li, L., et al. Assessment of cardiac morphological and functional changes in mouse model of transverse aortic constriction by echocardiographic imaging. Journal of Visualized Experiments. (112), e54101 (2016).
- Veldhuizen, R. A., Slutsky, A. S., Joseph, M., McCaig, L. Effects of mechanical ventilation of isolated mouse lungs on surfactant and inflammatory cytokines. The European Respiratory Journal. 17 (3), 488-494 (2001).
- Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59431 (2019).
- Eichhorn, L., et al. A closed-chest model to induce transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57397 (2018).
- Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of minimally invasive transverse aortic constriction in mice for induction of left ventricular hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (127), e56231 (2017).
