Summary
このプロトコルは、吸収性縫合糸を有する一過性心筋肥大を得るための改善された方法を提示し、圧力過負荷を除去した後に減少した左心室肥大をシミュレートする。これは、心筋肥大型プレコンディショニングに関する研究のために貴重な可能性があります。.
Abstract
マウスの2回横筋狭窄(TAC)に基づいて、心筋肥大前調整(MHP)が心筋細胞肥大を減衰させ、心不全への進行を遅らせることができることが証明されています。しかし、初心者にとって、MHPモデルは、人工呼吸器の操作における技術的な障害、胸部の繰り返し開き、およびデパンディングによる出血のために確立することは通常非常に困難である。このモデルを容易にするために、外科的成功率を高め、出血の発生率を減少させるために、人工呼吸器のない技術を用いた最初のTACコーミングのための吸収可能な縫合糸に切り替えた。2週間の吸収性縫合糸を用いて、この手順が2週間で重大な心筋肥大を引き起こす可能性があることを実証した。そして手術後4週間、心筋肥大はほぼ完全にベースラインに後退した。このプロトコルを使用すると、オペレータは、より低い操作死亡率でMHPモデルを簡単に習得することができます。
Introduction
虚血性プレコンディショニングは、虚血と心臓への再灌流の短い非致死的なエピソードを誘発する現象であり、心筋損傷を劇的に減少させる能力を有する1。心筋梗塞サイズ2の制限や心筋血管化後の心室頻脈不整脈の抑制など、虚血性プレコンディショニングの明らかな臨床的影響を考えると、プレコンディショニング4,5によって誘発される心臓保護効果のメカニズムを解剖する研究が多い。対照的に、他の非虚血型のプレコンディショニングは比較的注目されていない。心臓肥大は、大動脈弁置換術6を受けている大動脈狭窄症の患者において鈍化し得る。病理学的心筋肥大の状態が存在するところはどこでも、プレコンディショニングの原理はほとんど報告されない。
1991年、ロックマンらは、まず横大動脈収縮(TAC)7により左心室肥大のマウスモデルを確立した。マウスでTACを2回操作することにより、心筋肥大型プレコンディショニング(MHP)が心臓の一過性肥大刺激につながることが以前に証明され、それによって心臓は将来の持続的な肥大性ストレスに対してより耐性を高める8。MHPモデルの特性は、超音波バイオ顕微鏡と血行力学的評価9によって検証されています。モデルを構築する際の重要なポイントは、3回の経術術、1週間のTAC、1週間のデバンディング、および6週間の二次TACを行うことであった。しかし、デベンディングは出血を引き起こす可能性があり、初心者によって習得されにくく、普及することは困難でした。また、マウスを挿管することは技術的な課題でもあります。不適切な挿管は、気管損傷、気胸、さらにはマウスの死を引き起こす可能性があります。したがって、MHPモデルを構築しながら、いくつかの手順を改善することが必要であり、価値があります。
モデルの難易度を軽減し、その成功を高めるために、我々は最初のTACのための吸収可能な縫合線に切り替え、心エコー検査10の下で大動脈収縮の間の圧力勾配を測定することによってモデルの成功を監視した。我々の予備実験に基づいて、あまりにも低圧勾配のマウスに十分な心筋肥大を誘発することは困難であり、高圧勾配が高すぎるマウスは急性心不全を発症するか死ぬことさえある。モデルの理想的な圧力勾配は40-80 mmHg11から範囲。さらに、この実験は人工呼吸器に頼らず、人工呼吸器関連の技術的操作や傷害を効果的に回避できる12.
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Protocol
すべての手順は、米国国立衛生研究所(NIH出版第85-23号、1996年に改訂)が発行した 実験動物のケアと使用 のガイドラインに従って行われました。C57BL/6J雄マウス(8-10週、20〜25g)は、南医科大学動物センターによって提供された。
1. 術前準備
- 針ホルダーで25G針の先端をつまみ、ホルダーのような硬い物体で鈍らせる。
- 5~0 の吸収性縫合糸を針に通し、それをホルダー13で 90° にカーブさせます。
注:異なる研究目的に従って、研究者は異なる吸収時間で吸収可能なラインを選択することができます。このプロトコルでは、大動脈弓を収縮させるために2週間の吸収可能な縫合糸を使用しました。 - 別の25G針を120°までカーブさせ、ライゲーションステップでスペーサーとして使用するホルダーで先端を滑らかにします。
注:体重(BW)>25gを持つマウスのスペーサーとして25G針が使用されました。19-24 g BW のマウスには 26 G 針を使用してください。 - 75%アルコールで手術部位を消毒します。
- 加熱パッドの温度を37°Cに調整します。
- 滅菌された手術器具(1つの眼科用ハサミ、1つのマイクロハサミ、2つのマイクロ外科肘ピンセット、1針のホルダーおよび1つのマイクロ針のホールダーを含む)
2. 麻酔とシェービングの誘導
- 生理食塩水(0.9%NaCl)で希釈したキシラジン(5mg/kg)とケタミン(100mg/kg)の混合物の腹腔内注射によりマウスを麻酔します。陰性ペダル離脱反射で完全麻酔を確認します。
- 縫合糸で切歯を固定し、粘着テープで手足を固定することにより、マウスを上手に置いてください。
- 脱毛クリームを適用して、首とシフォイドの毛髪を取り除きます。ヨウ素で地域を消毒し、その後75%のアルコールを消毒します。
3. 手術
- メスで上胸部ノッチと胸部の間の正中位置に10mm以上の切開を行います。次に、皮膚と表面性筋膜を分離する。
- 胸骨の角度からリブを数えることによって、最初の肋間空間を識別します。最初の肋間空間で切開を行い、胸骨にできるだけ近い。このスペースを開くために肘のピンセットでそれをぶっきらぼうに貫通してください。
- 横大動脈弓が見えるまで、パレンチマと胸腺を穏やかに分離します。
注意:気胸を避けるために頭頂胸膜を損傷しないでください。 - 大動脈弓の下に5-0吸収性縫合糸を、腕頭筋動脈と左共通頸動脈の間に、ラッチ針14で渡す。手術場には、腕頭筋動脈、左共通頸動脈、左鎖骨下動脈が見えるようにしてください。
- ステップ1.3で準備したスペーサーを横断大オルタに置き、ステップ3.4で縫合糸でスペーサーにダブルノットを実行します。
注:スペーサーの先端は、それを取り外している間に横の大オルタを傷つけることを避けるために鈍くなければなりません。 - スペーサーを素早くそっと取り出し、縫合糸の端を切ります。
- 5-0 ナイロン縫合糸を使用して、最初の肋間空間とスキンを閉じます。75%アルコールで再び皮膚を消毒する。
- 回復を促進するために加熱パッドの上にマウスを置きます。手術後最初の3日間、ブプレノルフィン(0.1mg/kg、q12h)腹腔内注射を行う。
- 意識回復時に、12時間の明暗サイクル室でマウスをケージに戻します。
- 上記の手順と同一の、収縮なしの恥の手術を行う(ステップ3.5)。
- 上記のすべてのステップと同じシルク縫合糸群の手術を行いますが、ステップ1.2では5-0シルク縫合糸を使用します。
4. 結紮と測定の成功の心エコー評価
- 手術後の日(D)7に対して心エコー評価を行う。
- 誘導のための吸入を通して3%のイオブルラン、および0.5-1 L/min酸素流量で麻酔の深さを維持するために1.5%でマウスを麻酔します。
- マウスをプラットフォーム上の上の位置に置き、37°Cに維持し、その手足を電極にテープで貼ります。
- 脱毛クリームで胸の毛を取り除き、マウスの胸部に超音波カップリング剤を塗布します。
- 30MHzプローブで横大動脈収縮を評価します。
- プラットフォームを左端に傾けます。プローブを垂直位置に保ち、胸部の右寄尾翼線に沿って下げます。次に、大動脈のアーチがはっきりと見えるまで、BモードでX軸とY軸を操作します。
- Bモードで狭窄を見つけて大動脈アーチビュー11を得る。カラードップラーモードとパルス波を使用してピーク流速を測定し、TACグループとして3,000mm/s以上の速度を持つマウスを選択します(値は予備実験に基づいています)。
- ベルヌーイの方程式11の修正版に従って圧力勾配を計算する:
圧力勾配 = 4 x Vmax2.
注: 横方向の大動脈収縮モデルの理想的な圧力勾配は 40 ~ 80 mmHg11から範囲です。 - Cine ストアとフレーム ストアを使用して、データと画像を保存します。
- 30 MHz プローブで左心室(LV)の寸法と収縮性を評価します。
- プラットフォームを水平位置にリセットします。左寄縁線に対して、プローブを反時計回りに30°に保ちます。
- Bモードを使用し、XとYを操作して、心臓の明確で全長の軸図を得ます。
- Mモードを押して、インジケータラインを表示します。後でLVチャンバー寸法、分数短縮、LV壁厚を測定するために、Cine Storeとフレームストアで画像を取得します。
- 一度行われた, イソファラン吸入を停止し、マウスが麻酔から回復することができます.その後、12時間の明暗サイクルルームでケージに動物を戻します。
- 手術後のD14とD28では、上記の手順を繰り返して心臓パラメータを測定し、組織学的研究のために心臓を収穫します。
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Representative Results
本研究では、45匹のマウスを無作為に、シャム、シルク縫合糸群、および吸収性縫合グループ(D0(ベースライン)、D14、D28後の各群の数をそれぞれ15、10、および5に分割した。手術後のD7、D14、D21、およびD28では、収縮したピーク速度を心エコー検査によって決定した。吸収性の縫合糸を使用して大動脈弓を収縮させたにもかかわらず、TACの後の第2週に収縮時の血流速度は依然として3,000mm/sを超えていることがわかった(図1A)。また、吸収性縫合材群の収縮時の圧力勾配は2週間で40mmHg以上に維持された(図1B)。興味深いことに、手術後の第4週には収縮はなく、吸収可能な縫合糸が完全に吸収されたことを示している。
また、末側-拡張期の左心室後壁厚が増加し、末側-拡張期の左心室内径がTAC後のD14でわずかに減少したこともわかりました(図2A-C)。興味深いことに、吸収性縫合体中の末側の側頭層下層部における左心室後壁厚は、ベースラインレベルと有意な差がなかったTAC後のD28で実質的に後退した。また、吸収性縫合線を使用してモデルを作成しても、左心室の射出率には影響を与えなかった(図2D)。
絹糸口基と吸収性縫合材群のHW/BW比は、シャム群に比べて30%増加した。TAC後のD28では、心筋肥大が後退し、吸収性縫合糸群のベースラインレベル(図3A)に戻り、シルク縫合糸群では比率が64%増加した。H&E染色の結果は心臓肥大も支持した(図3B)。結論として、吸収可能な縫合糸は、心筋肥大前処理モデルの要件を満たす一過性の病理学的肥大刺激を引き起こすのに適していた。
定量的データは、SD±平均値として提示されており、シャム、シルク縫合糸、吸収可能縫合糸の比較は、一方向のANOVAを使用して行われ、続いてボンフェローニのポストホックが行われました。
図1:パルス波ドップラーイメージングと収縮のピーク速度と圧力勾配からの結果。D0(ベースライン)上、D7、D14、D21、およびD28は、シルク縫合または吸収可能な縫合糸を用いてTAC後、大動脈弓または狭窄をパルス波ドップラーにより測定した。(A)シルク縫合糸群及び吸収性縫合材における手術後のD0(ベースライン)、D14、及びD28のピーク速度の代表的な画像化。吸収性縫合糸群の血流速度はベースラインに戻り、シルク縫合糸群の速度は手術後もD28で3,000mm/sを超えていた。(B)圧力勾配は、変更されたベルヌーイの方程式に従って計算された:圧力勾配= 4 x Vmax2 (V= 最大ピーク速度)。*: p < 0.05 対シャム.#: p < 0.05 とシルク縫合グループ (TAC の後の D0 (ベースライン)、D14、および D28 の各グループの数は、それぞれ 15、10、および 5 でした。平均±SDとして提示されたデータは 、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:構造と収縮期機能の左心室パラメータ。(A)シルク縫合糸群の左心室(LV)からのMモードイメージング、およびTAC後のD0(ベースライン)上の吸収性縫合糸群、D14、およびD28。末端の直径のLV壁厚の代表的なイメージは、シルク縫合糸群において約0.70mm(D0)〜1.089mm(D28)であった。吸収性縫合材については、壁厚は約0.658mm(D28)で、ほぼベースラインに戻った。(B) 末端-拡張期(LVPWd)で左心室後壁厚さ。(C) 末端-直径(LVIDd)で左心室内径。(D) 左心室放出画分(EF)。*: p < 0.05 と sham の対同時に (TAC の後の D0 (ベースライン)、D14、および D28 の各グループの数は、それぞれ 15、10、および 5 でした。平均±SDとして提示されたデータは、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:心筋肥大型前調整モデルにおける可逆的な心臓肥大。(A) 体重 (HW) と体重 (BW) 比。(B) H&E (スケールバー = 50 μm) で染色された心臓の組織学的スライス。シルク縫合糸群の心筋細胞はD14からD28に有意に拡大し、細胞の大きさは吸収可能な縫合糸群においてD28で大部分が後退した。*: p < 0.05 と sham の対同時に (TAC の後の D0 (ベースライン)、D14、および D28 の各グループの数は、それぞれ 15、10、および 5 でした。平均±SDとして提示されたデータは 、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
心臓非虚血予備調整には、依然として非常に未踏の領域があります。これまでの研究に基づき、吸収性縫合糸を使用して心筋肥大プリコンディショニングモデルを改善することに切り替えました。
以前の報告では、多くの研究者がシルク縫合糸を使用して大動脈弓8、14、15を収縮させました。シルク縫合糸は容易に入手でき、しばしば外科的創傷縫合糸、組織結紮、および組織固定に使用された。このプロトコルでは、最初の TAC のシルク縫合糸を吸収可能な縫合糸に置き換えました。収縮中の血流速度は依然として3,000mm/s以上に達し、2週間続き、長期的な肥大刺激として十分であることがわかりました。その後、D28 のベースラインに戻ります。しかし、吸収性縫合糸の吸収時間を制御することは困難である。吸収時間は、吸収性縫合糸の材料とバッチ、組織の適応性、収縮時の圧迫度に関連しています。先に、収縮が厳しく、吸収時間が少ないことがわかりましたが、同時にマウスの死亡率は増加します。そのため、約3,000mm/sのピーク速度を標準として選択し、吸収時間を2週間以内に制御し、マウスの生存率も高くすることができました。さらに重要な点は、吸収性縫合糸を使用すると胸の開封時間を2倍に短縮し、手術の難しさを減らし、モデルの成功率を増加させた。
通常、手術中のマウスの生命維持のために人工呼吸器が必要です。マウスの大動脈弓は、suprasternalフォッサアプローチ15を使用して人工呼吸器なしで収縮することができることが報告されている。しかし、これは、外科的回復時間を延長する可能性があり、マウスの胸骨を切断する必要があります。本研究では、このアプローチを選択しました:胸骨に近い最初の肋間空間の狭窄、手術を行う。これは、横回り経術14を介した低侵襲的アプローチであった。驚くべきことに、切開が胸骨にできるだけ近い場合は、人工呼吸器なしでTACを実行することができました。このアプローチはまた、人工呼吸器関連の技術的操作および傷害12を効果的に回避できる。また、切開を介してマウスの媒介状態に入ると、大動脈弓は、外科分野における胸腺組織および他の血管との干渉がほとんどなかったため、はっきりと露出した。
全体の操作中に人工呼吸器を使用しないのは便利ですが、改善された方法は、まだ胸膜損傷によって引き起こされる気胸のリスクを運びます。いくつかの提案がありますが、これは胸膜を傷つけることを避けるのに役立つかもしれません。できるだけ針の先端を鈍らせる。縦隔に入った後、肘ピンセットの先端を操作全体の間、できるだけ垂直に保ちます。結紮の間、スペーサーを前中央線に沿って中隔に入れる。
要約すると、心筋肥大および退行のマウスモデルを吸収性縫合糸を用いて改良し、心筋肥大前処理のモデルの確立、肥大回帰のメカニズムの探索、左心室可逆リモデリングの時間の調査などにおいて多くの潜在的な用途を有する可能性がある。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(81770271;Y、遼)、中国国立自然科学財団の共同資金(U1908205;Y,Liao)、広州科学技術の自治体計画プロジェクト(201804020083;Liao博士)からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable suture (5-0) | Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd | 5-0 | Ligation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Close the skin |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made spacer | 25-gauge needle | ||
| Silk suture (5-0) | Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd. | 5-0 | Ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
References
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