Summary
Este protocolo apresenta um método aprimorado para obter hipertrofia miocárdia transitória com sutura absorvível, simulando diminuição da hipertrofia ventricular esquerda após a remoção da sobrecarga de pressão. Pode ser valioso para os estudos sobre pré-condicionamento hipertrófico do miocárdio.
Abstract
Com base em constrições aórticas transversais duas vezes (TACs) em camundongos, é comprovado que o pré-condicionamento hipertrófico do miocárdio (MHP) poderia atenuar a hipertrofia cardiomiocófica e retardar a progressão para insuficiência cardíaca. Para os novatos, no entanto, o modelo MHP geralmente é bastante difícil de estabelecer devido aos obstáculos técnicos na operação do ventilador, abertura do peito repetidamente e sangramento causado pela desbandada. Para facilitar esse modelo, para aumentar a taxa de sucesso cirúrgico e reduzir a incidência de sangramento, mudamos para suturas absorvíveis para o primeiro TAC penteando com uma técnica livre de ventiladores. Usando uma sutura absorvível de 2 semanas, demonstramos que este procedimento pode causar hipertrofia miocárdia significativa em 2 semanas; e 4 semanas após a cirurgia, a hipertrofia do miocárdio foi quase completamente regredida à linha de base. Usando este protocolo, os operadores poderiam dominar o modelo MHP facilmente com uma menor mortalidade operacional.
Introduction
O pré-condicionamento isquêmico é um fenômeno que induz breves episódios não letais de isquemia e reperfusão ao coração e tem a capacidade de reduzir drasticamente a lesão do miocárdio1. Dadas as óbvias implicações clínicas do pré-condicionamento isquêmico, como limitar o infarto do miocárdio tamanho2 e suprimir as taquiarritmias ventriculares após a revascularização do miocárdio3,tem havido muitas pesquisas para dissecar os mecanismos subjacentes aos efeitos cardioprotetos induzidos pelo pré-condicionamento4,5. Em contraste, outros tipos não isquêmicos de pré-condicionamento receberam relativamente pouca atenção. A hipertrofia cardíaca pode ser amenada em pacientes com estenose aórtica submetida à substituição da válvula aórtica6. Onde quer que exista o estado de hipertrofia patológica do miocárdio, o princípio do pré-condicionamento raramente é relatado.
Em 1991, Rockman et al. estabeleceram em primeiro lugar um modelo de rato de hipertrofia ventricular esquerda por constrição aórtica transversa (TAC)7. Ao operar tac duas vezes em camundongos, já provamos anteriormente que o pré-condicionamento hipertrófico do miocárdio (MHP) leva à estimulação hipertrófica transitória no coração, tornando assim o coração mais resistente ao estresse hipertrófico sustentado no futuro8. As características do modelo MHP foram validadas por biomicroscópio de ultrassom e avaliação hemodinâmica9. Os principais pontos na construção do modelo foram realizar a toracotomia três vezes, TAC por uma semana, debandada por uma semana, e TAC secundário por 6 semanas. No entanto, a desbandada pode causar sangramento, o que dificultou ser dominado por novatos e difícil de ser popularizado. Além disso, também é um desafio técnico entubar ratos. Intubação inadequada pode causar lesões traqueais, pneumotórax e até mesmo morte em camundongos. Por isso, é necessário e valioso melhorar alguns procedimentos ao construir o modelo MHP.
Para reduzir a dificuldade do modelo e aumentar seu sucesso, mudamos para suturas absorvíveis para o primeiro TAC e monitoramos o sucesso do modelo medindo o gradiente de pressão através da constrição aórtica sob ecocardiografia10. Com base em nosso experimento preliminar, seria difícil induzir hipertrofia mofárdia suficiente em camundongos com gradiente de baixa pressão, enquanto camundongos com gradiente de alta pressão desenvolveriam insuficiência cardíaca aguda ou até mesmo morreriam. O gradiente de pressão ideal para o modelo varia de 40 a 80 mmHg11. Além disso, este experimento não contava com um ventilador, o que poderia efetivamente evitar manipulação técnica associada ao ventilador e lesão12.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados seguindo as diretrizes do Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicados pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (Publicação NIH nº 85-23, revisado em 1996). Os camundongos machos C57BL/6J (8-10 semanas, 20-25 g) foram fornecidos pelo Centro Animal da Universidade Médica do Sul.
1. Preparação pré-operatória
- Aperte a ponta de uma agulha de 25 G com um suporte de agulha e corte-a com um objeto duro como o suporte.
- Passe uma sutura 5-0 absorvível através da agulha e, em seguida, curve-a para 90° com um suporte13.
NOTA: De acordo com diferentes propósitos de pesquisa, os investigadores poderiam selecionar linhas absorvíveis com diferentes tempos de absorção. Neste protocolo, usamos uma sutura absorvível de 2 semanas para restringir o arco aórtico. - Curve outra agulha de 25 G a 120° e suavize a ponta com um suporte para ser usado como espaçador na etapa de ligadura.
NOTA: Uma agulha de 25 G foi usada como espaçador para camundongos com peso corporal (BW) >25 g. Use uma agulha de 26 G para ratos com 19-24 g BW. - Desinfete o local operacional com 75% de álcool.
- Ajuste a temperatura da almofada de aquecimento para 37 °C.
- Prepare instrumentos cirúrgicos esterilizados (incluindo 1 tesoura oftálmica, 1 micro tesoura, 2 pinças microcirúrgicas de cotovelo, 1 porta-agulhas e 1 micro porta-agulhas).
2. Indução de anestesia e barbear
- Anestesiar um rato por injeção intraperitoneal de uma mistura de xilazina (5 mg/kg) e cetamina (100 mg/kg) diluída em solução salina (0,9% NaCl). Confirme a anestesia completa com o reflexo negativo de retirada do pedal.
- Mantenha o mouse em posição supina fixando os incisivos com uma sutura e fixando os membros com fitas adesivas.
- Aplique creme depilatório para remover o cabelo no pescoço e xiphoide. Desinfetar a área com iodo seguido de 75% de álcool.
3. Cirurgia
- Faça uma incisão acima de 10 mm na posição média entre entalhe supra-severo e peito com um bisturi. Então, separe a pele e a fáscia superficial.
- Identifique o primeiro espaço intercostal contando as costelas do ângulo severo. Realize a incisão no primeiro espaço intercostal e o mais próximo possível do esterno. Penetrá-lo sem rodeios com pinças de cotovelo para abrir este espaço.
- Separe suavemente o parenchyma e o timo até que o arco aórtico transverso seja visível.
NOTA: Não danifique a pleura parietal para evitar pneumotórax. - Passe a sutura 5-0 absorvível sob o arco aórtico entre a artéria braquiocefálica e a artéria carótida comum esquerda com uma agulha de trava14. Certifique-se de que a artéria braquiocefálica, a artéria carótida comum esquerda e a artéria subclávia esquerda são visíveis no campo de operação.
- Coloque o espaçador, preparado na etapa 1.3, na aorta transversal e realize um nó duplo no espaçador com a sutura na etapa 3.4.
NOTA: A ponta do espaçador deve ser cega para evitar danificar a aorta transversal enquanto a remove. - Remova o espaçador rapidamente, mas suavemente, e depois corte as extremidades da sutura.
- Feche o primeiro espaço intercostal e a pele usando suturas de nylon 5-0. Desinfete a pele novamente com 75% de álcool.
- Coloque o mouse na almofada de aquecimento para promover a recuperação. Injete buprenorfina (0,1 mg/kg, q12h) intraperitonealmente durante os primeiros 3 dias após a cirurgia.
- Devolva o mouse para a gaiola em uma sala de ciclo claro/escuro de 12 horas quando ele recuperar a consciência.
- Realizar cirurgia falsa idêntica a todas as etapas acima, mas sem a constrição (passo 3.5).
- Realize a cirurgia para o grupo de sutura de seda, idêntico a todas as etapas acima, mas usando uma sutura de seda 5-0 na etapa 1.2.
4. Avaliação ecocardiográfica de ligaduras e medidas bem sucedidas
- Realizar avaliação ecocardiográfica no Dia (D) 7 após a cirurgia.
- Anestesiar o camundongo com 3% de isoflurane através da inalação para indução, e 1,5% para manter a profundidade da anestesia, com uma taxa de fluxo de oxigênio de 0,5-1 L/min.
- Coloque o mouse em posição supina na plataforma, mantida a 37 °C, e tape seus membros no eletrodo.
- Remova o cabelo do peito com um creme depilatório e aplique agente de acoplamento ultrassônico no peito do rato.
- Avalie a constrição aórtica transversal com uma sonda de 30 MHz.
- Incline a plataforma para a extrema esquerda. Mantenha a sonda na posição vertical e abaixe-a no peito ao longo da linha parasternal direita. Em seguida, manipule o eixo X e o eixo Y sob o modo B até que o arco aórtico esteja claramente visível.
- Localize a constrição pelo modo B para obter a visão do arco aórtico11. Use o modo Doppler colorido e a onda pulsada para medir a velocidade de fluxo de pico e selecione ratos com uma velocidade de mais de 3.000 mm/s como o grupo TAC (os valores são baseados em experimentos preliminares).
- Calcule o gradiente de pressão de acordo com a versão modificada da equação11de Bernoulli:
gradiente de pressão = 4 x Vmax2.
NOTA: O gradiente de pressão ideal para modelo de constrição aórtica transversal varia de 40 a 80 mmHg11. - Salve os dados e imagens usando a Cine Store e a Frame Store.
- Avalie as dimensões e a contratilidade do ventricular esquerdo (LV) com uma sonda de 30 MHz.
- Reinicie a plataforma até a posição horizontal. Mantenha a sonda em 30° no sentido anti-horário em relação à linha parasteronal esquerda.
- Use o modo B e manipule X e Y para obter uma visão clara e completa do eixo do coração.
- Pressione o modo M para mostrar a linha indicadora. Adquira imagens com Cine Store e Frame Store para posterior medição da dimensão da câmara LV, encurtamento fracionado e espessura da parede LV.
- Uma vez feito, pare a inalação de isoflurane e permita que o rato se recupere da anestesia. Em seguida, devolva o animal à sua gaiola em uma sala de ciclo claro/escuro de 12 horas.
- Em D14 e D28 após a cirurgia, repita os passos acima para medir os parâmetros cardíacos e, em seguida, colher o coração para estudos histológicos.
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Representative Results
Neste estudo, dividimos aleatoriamente 45 camundongos em três grupos, o sham, o grupo de sutura de seda e o grupo de sutura absorvível (o número de cada grupo em D0 (linha de base), D14 e D28 após tac foi 15, 10 e 5, respectivamente). Em D7, D14, D21 e D28 após a cirurgia, a velocidade de pico constrito foi determinada pela ecocardiografia. Descobrimos que a velocidade de fluxo sanguíneo na constrição ainda era superior a 3.000 mm/s na segunda semana após o TAC, embora uma sutura absorvível tivesse sido usada para restringir o arco aórtico(Figura 1A). Além disso, o gradiente de pressão na constrição do grupo de sutura absorvível foi mantido acima de 40 mmHg em 2 semanas(Figura 1B). Curiosamente, não houve constrição na quarta semana após a cirurgia, indicando que a sutura absorvível havia sido completamente absorvida.
Também descobrimos que a espessura da parede posterior ventricular esquerda na estastole final aumentou e o diâmetro interno ventricular esquerdo na diastole final diminuiu ligeiramente em D14 após TAC (Figura 2A-C). É interessante que a espessura posterior da parede ventricular esquerda no final da diastole no grupo de sutura absorvível regrediu substancialmente em D28 após TAC, que não teve diferença significativa em parte do nível de linha de base. Além disso, o uso de sutura absorvível para fazer o modelo não afetou a fração de ejeção do ventrículo esquerdo(Figura 2D).
As relações HW /BW do grupo de sutura de seda e do grupo de sutura absorvível aumentaram 30% em comparação com o grupo sham. Em D28 após TAC, a hipertrofia do miocárdio regrediu e a razão caiu para o nível de base (Figura 3A) no grupo de sutura absorvível, enquanto a razão aumentou 64% no grupo de sutura de seda. Os resultados da coloração de H&E também suportaram hipertrofia cardíaca (Figura 3B). Em conclusão, a sutura absorvível foi adequada para causar estimulação transitória de hipertrofia patológica, que atendeu aos requisitos do modelo de pré-condicionamento hipertrófico miocárdico.
Os dados quantitativos têm sido apresentados como a média ± SD. Comparações entre a farsa, a sutura de seda e a sutura absorvível foram realizadas utilizando-se a ANOVA unidirecional, seguida pelo pós-hoc de Bonferroni.
Figura 1: Imagem doppler de ondas pulsadas e resultados de velocidade máxima e gradiente de pressão da constrição. Em D0 (linha de base), D7, D14, D21 e D28 após TAC usando sutura de seda ou sutura absorvível, arco aórtico ou constrição foi medido por um Doppler de ondas pulsadas. (A) Imagem representativa da velocidade máxima em D0 (linha de base), D14 e D28 após cirurgia no grupo de sutura de seda e no grupo de sutura absorvível. A velocidade de fluxo sanguíneo do grupo de sutura absorvível retornou à linha de base, enquanto a velocidade do grupo de sutura de seda ainda era superior a 3.000 mm/s em D28 após a cirurgia. (B) O gradiente de pressão foi calculado de acordo com a equação modificada de Bernoulli: gradiente de pressão = 4 x Vmax2 (V= velocidade máxima de pico). *: p < 0.05 vs sham. #: p < 0,05 vs o grupo de sutura de seda (o número de cada grupo em D0 (linha de base), D14 e D28 após tac foi 15, 10 e 5, respectivamente). Dados apresentados como média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Parâmetros ventriculares esquerdos de estrutura e função sistólica. (A) Imagem do modo M do ventrículo esquerdo (LV) no grupo de sutura de seda e no grupo de sutura absorvível em D0 (linha de base), D14 e D28 após TAC. A imagem representativa da espessura da parede lv no final da diástole foi de cerca de 0,70 mm (D0) a 1.089 mm (D28) no grupo de sutura de seda. Quanto ao grupo de sutura absorvível, a espessura da parede foi de cerca de 0,658 mm (D28), que voltou quase à linha de base. (B) Espessura da parede posterior ventricular esquerda na diastole final (LVPWd). (C) Diâmetro interno ventricular esquerdo na diastola final (LVIDd). (D) Fração de ejeção ventricular esquerda (EF). *: p < 0,05 vs. a farsa ao mesmo tempo (o número de cada grupo em D0 (linha de base), D14 e D28 após tac foi 15, 10 e 5, respectivamente). Dados apresentados como média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Hipertrofia cardíaca reversível no modelo de pré-condicionamento hipertrófico do miocárdio. (A) Relação peso cardíaco (HW) para peso corporal (BW). (B) Fatias histológicas de coração manchadas com H&E (barra de escala = 50 μm). Os cardiomiócitos no grupo de sutura de seda foram significativamente aumentados de D14 para D28, enquanto o tamanho das células regrediu principalmente em D28 no grupo de sutura absorvível. *: p < 0,05 vs. a farsa ao mesmo tempo (o número de cada grupo em D0 (linha de base), D14 e D28 após tac foi 15, 10 e 5, respectivamente). Dados apresentados como média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ainda há uma área muito pouco explorada no pré-condicionamento cardíaco não isquêmico. Com base em nossos estudos anteriores, passamos a usar suturas absorvíveis para melhorar o modelo de pré-condicionamento hipertrófico do miocárdio.
Em relatórios anteriores, muitos investigadores usaram sutura de seda para restringir o arco aórtico8,14,15. A sutura de seda estava facilmente disponível e era frequentemente usada para sutura de ferida cirúrgica, ligadura tecidual e fixação tecidual. Neste protocolo, substituímos a sutura de seda por sutura absorvível para o primeiro TAC. Descobrimos que a velocidade de fluxo sanguíneo na constrição ainda chegava a 3.000 mm/s ou mais e durava 2 semanas, o que foi suficiente para servir como uma estimulação hipertrófica de longo prazo. Então, ele voltaria para a linha de base em D28. No entanto, é difícil controlar o tempo de absorção de suturas absorvíveis. O tempo de absorção está relacionado ao material e ao lote de sutura absorvível, adaptabilidade dos tecidos e aperto ao constrição. Descobrimos anteriormente que mais apertado a constrição, menos é o tempo de absorção, mas ao mesmo tempo a taxa de mortalidade de camundongos aumentaria. Portanto, selecionamos a velocidade máxima em cerca de 3.000 mm/s como padrão, de modo que o tempo de absorção pudesse ser controlado dentro de 2 semanas e a taxa de sobrevivência dos camundongos também pudesse ser aumentada. Um ponto mais significativo foi que o uso de suturas absorvíveis poderia reduzir o tempo de abertura do peito para duas vezes, o que reduziu a dificuldade na cirurgia e aumentou a taxa de sucesso do modelo.
Um ventilador geralmente é necessário para o suporte de vida de camundongos durante a cirurgia. Relata-se que o arco aórtico de camundongos poderia ser constrito sem um ventilador usando a abordagem fossa suprasternal15. No entanto, isso exigiu o corte do esterno dos camundongos, o que pode prolongar o tempo de recuperação cirúrgica. Neste estudo, selecionamos essa abordagem: constrição do primeiro espaço intercostal próximo ao esterno, para realização da cirurgia. Esta foi uma abordagem minimamente invasiva através da toracotomia lateral14. Surpreendentemente, poderíamos realizar TAC sem um ventilador se a incisão estivesse o mais perto possível do esterno. Esta abordagem também poderia evitar efetivamente manipulação técnica associada ao ventilador e lesão12. Além disso, entrando no mediastino dos camundongos através da incisão, o arco aórtico foi exposto claramente porque quase não havia interferência com tecidos tímicos e outros vasos sanguíneos no campo cirúrgico.
Embora seja conveniente não usar um ventilador durante toda a operação, o método melhorado ainda carrega o risco de pneumotórax causado por lesão pleural. Existem algumas sugestões, que podem ser úteis para evitar danificar a pleura. Corte a ponta da agulha o máximo possível. Depois de entrar no mediastinum, mantenha a ponta da pinça do cotovelo o mais vertical possível durante toda a operação. Durante a ligadura, coloque o espaçador no mediastino ao longo da linha mediana anterior.
Em resumo, melhoramos um modelo de camundongo de hipertrofia do miocárdio e regressão usando suturas absorvíveis, que poderiam ter muitas aplicações potenciais no estabelecimento do modelo de pré-condicionamento hipertrófico miocárdio, explorando o mecanismo de regressão hipertrofia, e investigando o tempo de remodelação reversível ventricular esquerda, e assim por diante.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81770271; de Y, Liao), dos Fundos Conjuntos da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (U1908205; de Y, Liao), e dos Projetos Municipais de Planejamento de Tecnologia Científica de Guangzhou (201804020083; para o Dr. Liao).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable suture (5-0) | Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd | 5-0 | Ligation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Close the skin |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made spacer | 25-gauge needle | ||
| Silk suture (5-0) | Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd. | 5-0 | Ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
References
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