Summary
Este protocolo presenta un método mejorado para obtener hipertrofia miocárdica transitoria con sutura absorbible, simulando la disminución de la hipertrofia ventricular izquierda después de eliminar la sobrecarga de presión. Podría ser valioso para los estudios sobre el preaccondicionamiento hipertrófico miocárdico.
Abstract
Basado en constricciones aórticas dos veces transversales (TAC) en ratones, se demuestra que el preaccondicionamiento hipertrófico miocárdico (MHP) podría atenuar la hipertrofia de cardiomiocitos y ralentizar la progresión a la insuficiencia cardíaca. Para los principiantes, sin embargo, el modelo MHP suele ser bastante difícil de establecer debido a los obstáculos técnicos en la operación del respirador, la apertura del pecho repetidamente y el sangrado causado por la disolución. Para facilitar este modelo, para aumentar la tasa de éxito quirúrgico y reducir la incidencia de sangrado, cambiamos a suturas absorbibles para el primer peinado TAC con una técnica libre de respiradores. Usando una sutura absorbible de 2 semanas, demostramos que este procedimiento podría causar hipertrofia miocárdica significativa en 2 semanas; y 4 semanas después de la cirugía, la hipertrofia miocárdica se regresión casi por completo a la línea de base. Con este protocolo, los operadores podrían dominar el modelo MHP fácilmente con una menor mortalidad de funcionamiento.
Introduction
El preacondicionamiento isquémico es un fenómeno que induce breves episodios no letales de isquemia y reperfusión al corazón y tiene la capacidad de reducir drásticamente la lesión miocárdica1. Dadas las evidentes implicaciones clínicas del preaccondicionamiento isquémico, como limitar el tamaño de infarto de miocardio2 y suprimir las tachyarrhythmias ventriculares después de la revascularización miocárdica3,ha habido mucha investigación para diseccionar los mecanismos subyacentes a los efectos cardioprote protectores inducidos por el preaccondicionamiento4,5. Por el contrario, otros tipos no isquémicos de preacondicionamiento han recibido relativamente poca atención. La hipertrofia cardíaca puede ser contundente en pacientes con estenosis aórtica sometidos a reemplazo de válvula aórtica6. Dondequiera que exista el estado de hipertrofia miocárdica patológica, rara vez se informa del principio del preaccondicionamiento.
En 1991, Rockman et al. estableció en primer lugar un modelo de ratón de hipertrofia ventricular izquierda por constricción aórtica transversal (TAC)7. Al operar TAC dos veces en ratones, hemos demostrado previamente que el preaccondicionamiento hipertrófico miocárdico (MHP) conduce a la estimulación hipertrófica transitoria en el corazón, lo que hace que el corazón sea más resistente al estrés hipertrófico sostenido en el futuro8. Las características del modelo MHP han sido validadas por biomicroscopio ultrasonido y evaluación hemodinámica9. Los puntos clave en la construcción del modelo fueron realizar la toracotomía tres veces, TAC durante una semana, debanding por una semana, y TAC secundario durante 6 semanas. Sin embargo, la disolución podría causar sangrado, lo que divió ser dominado por novicios y difícil de popularizar. Además, también es un desafío técnico intubar ratones. La intubación inadecuada podría causar lesiones traqueales, neumotórax e incluso la muerte en ratones. Por lo tanto, es necesario y valioso mejorar algunos procedimientos mientras se construye el modelo MHP.
Para reducir la dificultad del modelo y aumentar su éxito, cambiamos a suturas absorbibles para el primer TAC y monitoreamos el éxito del modelo midiendo el gradiente de presión a través de la constricción aórtica bajo ecocardiografía10. Basado en nuestro experimento preliminar, sería difícil inducir suficiente hipertrofia miocárdica en ratones con gradiente de presión demasiado baja, mientras que los ratones con gradiente de presión demasiado alta desarrollarían insuficiencia cardíaca aguda o incluso morirían. El gradiente de presión ideal para el modelo oscila entre 40–80 mmHg11. Además, este experimento no se basó en un respirador, que podría evitar eficazmente la manipulación técnica asociada al respirador y la lesión12.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las directrices de cuidado y uso de animales de laboratorio publicadas por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (Publicación Nº 85-23 de los NIH, revisada en 1996). C57BL/6J ratones macho (8-10 semanas, 20-25 g) fueron proporcionados por el Centro de Animales de la Universidad Médica del Sur.
1. Preparación preoperatoria
- Pellizque la punta de una aguja de 25 G con un soporte de aguja y conzúltela con un objeto duro como el soporte.
- Pase una sutura absorbible de 5-0 a través de la aguja y luego curvarla a 90° con un soporte13.
NOTA: Según diferentes propósitos de investigación, los investigadores podrían seleccionar líneas absorbibles con diferentes tiempos de absorción. En este protocolo, usamos una sutura absorbible de 2 semanas para constreñir el arco aórtico. - Curva otra aguja de 25 G a 120° y suaviza la punta con un soporte para ser utilizado como espaciador en el paso de ligadura.
NOTA: Se utilizó una aguja de 25 G como espaciador para ratones con peso corporal (BW) >25 g. Utilice una aguja de 26 G para ratones con 19-24 g BW. - Desinfectar el lugar del operativo con un 75% de alcohol.
- Ajuste la temperatura de la almohadilla de calefacción a 37 °C.
- Preparar instrumentos quirúrgicos esterilizados (incluyendo 1 tijera oftálmica, 1 micro tijera, 2 pinzas microquirúrgicas del codo, 1 soporte de aguja y 1 soporte de micro aguja).
2. Inducción de anestesia y afeitado
- Anestesiar un ratón mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de xilazina (5 mg/kg) y ketamina (100 mg/kg) diluida en solución salina (0,9% NaCl). Confirme la anestesia completa con el reflejo negativo de retirada del pedal.
- Mantenga el ratón en posición supina fijando los incisivos con una sutura y fijando las extremidades con cintas adhesivas.
- Aplicar crema depilatoria para eliminar el cabello en su cuello y xifoides. Desinfectar la zona con yodo seguido de 75% alcohol.
3. Cirugía
- Haga una incisión de más de 10 mm en la posición de la línea media entre la muesca supraesternal y el pecho con un bisturí. Luego, separa la piel y la fascia superficial.
- Identifique el primer espacio intercostal contando las costillas desde el ángulo de esternón. Realice la incisión en el primer espacio intercostal y lo más cerca posible del esternón. Penetrar sin rodeos con pinzas de codo para abrir este espacio.
- Separe suavemente el parénquima y el timo hasta que el arco aórtico transversal sea visible.
NOTA: No dañe la pleura parietal para evitar el neumotórax. - Pase la sutura absorbible 5-0 debajo del arco aórtico entre la arteria braquiocéfala y la arteria carótida común izquierda con una aguja de pestillo14. Asegúrese de que la arteria braquiocéfala, la arteria carótida común izquierda y la arteria subclaviana izquierda sean visibles en el campo de operaciones.
- Coloque el espaciador, preparado en el paso 1.3, en la aorta transversal y realice un doble nudo en el espaciador con la sutura en el paso 3.4.
NOTA: La punta del espaciador debe ser contundente para evitar dañar la aorta transversal mientras se elimina. - Retire el espaciador rápidamente pero suavemente, y luego corte los extremos de la sutura.
- Cierra el primer espacio intercostal y la piel usando suturas de nylon 5-0. Desinfectar la piel de nuevo con un 75% de alcohol.
- Coloque el ratón en la almohadilla de calefacción para promover la recuperación. Inyectar buprenorfina (0,1 mg/kg, q12h) por vía intraperitoneally durante los primeros 3 días después de la cirugía.
- Devuelve el ratón a la jaula en una sala de ciclo claro/oscuro de 12 h cuando recupere el conocimiento.
- Realizar una cirugía simulada idéntica a todos los pasos anteriores pero sin la constricción (paso 3.5).
- Realice una cirugía para el grupo de sutura de seda, idéntica a todos los pasos anteriores, pero usando una sutura de seda de 5-0 en el paso 1.2.
4. Evaluación ecocardiográfica de ligaduras y mediciones exitosas
- Realice una evaluación ecocardiográfica el día (D) 7 después de la cirugía.
- Anestesiar el ratón con un 3% de isoflurano a través de la inhalación para la inducción, y un 1,5% para mantener la profundidad de la anestesia, con un caudal de oxígeno de 0,5-1 L/min.
- Coloque el ratón en posición supina en la plataforma, mantenido a 37 °C, y tape sus extremidades al electrodo.
- Retire el vello torácico con una crema depilatoria y aplique un agente de acoplamiento ultrasónico en el pecho del ratón.
- Evalúe la constricción aórtica transversal con una sonda de 30 MHz.
- Incline la plataforma hacia el extremo izquierdo. Mantenga la sonda en posición vertical y bárela sobre el pecho a lo largo de la línea parasteral derecha. A continuación, manipule el eje X y el eje Y en modo B hasta que el arco aórtico esté claramente visible.
- Localice la constricción en modo B para obtener la vista de arco aórtico11. Utilice el modo Color Doppler y la onda pulsada para medir la velocidad máxima de flujo y seleccionar ratones con una velocidad de más de 3.000 mm/s como grupo TAC (los valores se basan en experimentos preliminares).
- Calcular el gradiente de presión según la versión modificada de la ecuación11de Bernoulli:
gradiente de presión = 4 x Vmáx.2.
NOTA: El gradiente de presión ideal para modelo de constricción aórtica transversal oscila entre 40 y 80 mmHg11. - Guarde los datos y las imágenes con Cine Store y Frame Store.
- Evalúe las dimensiones y la contractilidad del ventricular izquierdo (LV) con una sonda de 30 MHz.
- Restablezca la plataforma a la posición horizontal. Mantenga la sonda a 30° en sentido contrario a las agujas del reloj en relación con la línea parasteral izquierda.
- Utilice el modo B y manipule X e Y para obtener una vista clara y completa del eje del corazón.
- Pulse el modo M para mostrar la línea del indicador. Adquiera imágenes con Cine Store y Frame Store para una medición posterior de la dimensión de la cámara LV, el acortamiento fraccionarios y el grosor de la pared LV.
- Una vez hecho esto, detenga la inhalación de isoflurano y permita que el ratón se recupere de la anestesia. Luego, devuelva al animal a su jaula en una sala de ciclo de 12 h de luz/oscuridad.
- En D14 y D28 después de la cirugía, repita los pasos anteriores para medir los parámetros cardíacos y luego coseche el corazón para estudios histológicos.
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Representative Results
En este estudio, dividimos aleatoriamente 45 ratones en tres grupos, la farsa, el grupo de sutura de seda y el grupo de sutura absorbible (el número de cada grupo en D0 (línea base), D14 y D28 después del TAC fue de 15, 10 y 5, respectivamente). En D7, D14, D21 y D28 después de la cirugía, la velocidad máxima constreñida fue determinada por ecocardiografía. Encontramos que la velocidad del flujo sanguíneo en la constricción era todavía mayor que 3.000 mm/s en la segunda semana después del TAC a pesar de que se había utilizado una sutura absorbible para constreñir el arco aórtico(Figura 1A). Además, el gradiente de presión en la constricción del grupo de sutura absorbible se mantuvo por encima de 40 mmHg en 2 semanas (Figura 1B). Curiosamente, no hubo constricción en la cuarta semana después de la cirugía, lo que indica que la sutura absorbible había sido completamente absorbida.
También encontramos que el espesor posterior de la pared ventricular izquierda en la diastole final aumentó y el diámetro interno ventricular izquierdo en la diastole final disminuyó ligeramente en D14 después del TAC (Figura 2A-C). Es interesante que el espesor de pared posterior ventricular izquierdo en la diastole final en el grupo de sutura absorbible retrocedió sustancialmente en D28 después del TAC, que no tenía ninguna diferencia significativa con respecto al nivel de línea de base. Además, el uso de sutura absorbible para hacer el modelo no afectó a la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (Figura 2D).
Las relaciones HW / BW del grupo de sutura de seda y el grupo de sutura absorbible habían aumentado en un 30% en comparación con el grupo sham. En D28 después del TAC, la hipertrofia miocárdica retrocedió y la relación volvió al nivel basal(Figura 3A)en el grupo de sutura absorbible, mientras que la proporción aumentó en un 64% en el grupo de sutura de seda. Los resultados de la tinción de H&E también apoyaron la hipertrofia cardíaca(Figura 3B). En conclusión, la sutura absorbible era adecuada para causar estimulación patológica transitoria de hipertrofia, que cumplía con los requisitos del modelo de preacondicionamiento hipertrófico miocárdico.
Los datos cuantitativos se han presentado como la media ± las comparaciones entre la farsa, la sutura de seda y la sutura absorbible que se realizaron utilizando ANOVA unidireccional seguida de la post-hoc de Bonferroni.
Figura 1: Imágenes doppler de onda pulsada y resultados de la velocidad máxima y el gradiente de presión de la constricción. En D0 (línea base), D7, D14, D21 y D28 después de TAC usando sutura de seda o sutura absorbible, el arco aórtico o la constricción se midió mediante un Doppler de onda pulsada. (A) Imágenes representativas de la velocidad máxima en D0 (línea base), D14 y D28 después de la cirugía en el grupo de sutura de seda y el grupo de sutura absorbible. La velocidad del flujo sanguíneo del grupo de sutura absorbible volvió a la línea de base, mientras que la velocidad del grupo de sutura de seda todavía era superior a 3.000 mm/s en D28 después de la cirugía. (B) El gradiente de presión se calculó según la ecuación modificada de Bernoulli: gradiente de presión = 4 x Vmax2 (V= velocidad máxima de pico). *: p < 0.05 vs sham. #: p < 0.05 vs el grupo de sutura de seda (el número de cada grupo en D0 (línea base), D14 y D28 después de TAC fue de 15, 10 y 5, respectivamente). Datos presentados como media ± SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Parámetros ventriculares izquierdos de la estructura y función sistólica. (A) Imágenes en modo M del ventrículo izquierdo (LV) en el grupo de sutura de seda y el grupo de sutura absorbible en D0 (línea base), D14 y D28 después del TAC. La imagen representativa del espesor de la pared LV en la diastole final era de aproximadamente 0,70 mm (D0) a 1.089 mm (D28) en el grupo de sutura de seda. En cuanto al grupo de sutura absorbible, el espesor de la pared era de aproximadamente 0,658 mm (D28), que regresó casi a la línea de base. (B) Espesor de pared posterior ventricular izquierda en la distóstole final (LVPWd). (C) Diámetro interno ventricular izquierdo al final de la diastole (LVIDd). (D) Fracción de eyección ventricular izquierda (EF). *: p < 0,05 vs la farsa al mismo tiempo (el número de cada grupo en D0 (línea base), D14 y D28 después de TAC fue 15, 10 y 5, respectivamente). Datos presentados como media ± SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Hipertrofia cardíaca reversible en el modelo de preaccondicionamiento hipertrófico miocárdico. (A) Relación peso del corazón (HW) a peso corporal (BW). B) Rodajas histológicas de corazón manchadas con H&E (barra de escala = 50 μm). Los cardiomiocitos en el grupo de sutura de seda se ampliaron significativamente de D14 a D28, mientras que el tamaño de las células en su mayoría retrocedió en D28 en el grupo de sutura absorbible. *: p < 0,05 vs la farsa al mismo tiempo (el número de cada grupo en D0 (línea base), D14 y D28 después de TAC fue 15, 10 y 5, respectivamente). Datos presentados como media ± SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Todavía hay un área muy subexplorada en el preacondicionamiento cardíaco no isquémico. Basándonos en nuestros estudios anteriores, pasamos a usar suturas absorbibles para mejorar el modelo de preacondicionamiento hipertrófico miocárdico.
En informes anteriores, muchos investigadores utilizaron sutura de seda para constreñir el arco aórtico8,14,15. La sutura de seda estaba fácilmente disponible y a menudo se utilizaba para la sutura quirúrgica de heridas, ligadura de tejido y fijación de tejidos. En este protocolo, reemplazamos la sutura de seda por sutura absorbible para el primer TAC. Encontramos que la velocidad del flujo sanguíneo en la constricción todavía alcanzaba los 3.000 mm/s o más y duró 2 semanas, lo que fue suficiente para servir como una estimulación hipertrófica a largo plazo. Luego, volvería a la línea de base en D28. Sin embargo, es difícil controlar el tiempo de absorción de suturas absorbibles. El tiempo de absorción está relacionado con el material y el lote de sutura absorbible, adaptabilidad de los tejidos y estanqueidad al constricción. Encontramos anteriormente que cuanto más estrecha es la constricción, menos es el tiempo de absorción, pero al mismo tiempo la tasa de mortalidad de ratones aumentaría. Por lo tanto, seleccionamos la velocidad máxima a unos 3.000 mm/s como estándar, de modo que el tiempo de absorción podría controlarse en 2 semanas y la tasa de supervivencia de los ratones también podría aumentar. Un punto más significativo fue que el uso de suturas absorbibles podría reducir los tiempos de apertura del pecho a dos veces, lo que redujo la dificultad en la cirugía y aumentó la tasa de éxito del modelo.
Por lo general, se requiere un respirador para el soporte vital de ratones durante la cirugía. Se informa que el arco aórtico de ratones podría ser restringido sin un respirador utilizando el enfoque de fosa supraesteronal15. Sin embargo, esto requirió cortar el esternón de ratones, lo que podría prolongar el tiempo de recuperación quirúrgica. En este estudio, seleccionamos este enfoque: constricción del primer espacio intercostal cerca del esternón, para realizar la cirugía. Este fue un enfoque mínimamente invasivo a través de la toracotomía lateral14. Sorprendentemente, podríamos realizar TAC sin un respirador si la incisión estuviera lo más cerca posible del esternón. Este enfoque también podría evitar eficazmente la manipulación técnica asociada al respirador y la lesión12. Además, al entrar en el mediastinum de ratones a través de la incisión, el arco aórtico fue expuesto claramente porque casi no había interferencia con los tejidos timicos y otros vasos sanguíneos en el campo quirúrgico.
Aunque es conveniente no utilizar un respirador durante toda la operación, el método mejorado todavía conlleva el riesgo de neumotórax causado por una lesión pleural. Hay algunas sugerencias, que pueden ser útiles para evitar dañar la pleura. Embotó la punta de la aguja tanto como sea posible. Después de entrar en el mediastinum, mantenga la punta de las pinzas del codo lo más vertical posible durante toda la operación. Durante la ligadura, coloque el espaciador en el mediastinum a lo largo de la línea media anterior.
En resumen, mejoramos un modelo de ratón de hipertrofia miocárdica y regresión utilizando suturas absorbibles, que podrían tener muchas aplicaciones potenciales en el establecimiento del modelo de preacondicionamiento hipertrófico miocárdico, explorando el mecanismo de regresión de la hipertrofia, e investigando el tiempo de remodelación reversible ventricular izquierda, y así sucesivamente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81770271; a Y, Liao), los Fondos Conjuntos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U1908205; a Y, Liao), y los Proyectos Municipales de Planificación de la Tecnología Científica de Guangzhou (201804020083; al Dr. Liao).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable suture (5-0) | Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd | 5-0 | Ligation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Close the skin |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made spacer | 25-gauge needle | ||
| Silk suture (5-0) | Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd. | 5-0 | Ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
References
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