Summary
LEfSe (حجم تأثير LDA) هو أداة لتعدين المؤشرات الحيوية عالية الأبعاد لتحديد السمات الجينومية (مثل الجينات والمسارات والتصنيفات) التي تميز بشكل كبير مجموعتين أو أكثر في بيانات الميكروبيوم.
Abstract
هناك اهتمام متزايد نحو الجينوم البيولوجي المغلق في البيئة والصحة. لاستكشاف والكشف عن الاختلافات بين المجموعات بين العينات أو البيئات المختلفة ، من الأهمية بمكان اكتشاف المؤشرات الحيوية ذات الاختلافات الإحصائية بين المجموعات. يمكن أن يساعد تطبيق التحليل التمييزي الخطي لحجم التأثير (LEfSe) في العثور على مؤشرات حيوية جيدة. استنادا إلى بيانات الجينوم الأصلية ، يتم إجراء مراقبة الجودة والقياس الكمي للتسلسلات المختلفة بناء على التصنيفات أو الجينات. أولا ، تم استخدام اختبار رتبة Kruskal-Wallis للتمييز بين الاختلافات المحددة بين المجموعات الإحصائية والبيولوجية. بعد ذلك ، تم إجراء اختبار رتبة ويلكوكسون بين المجموعتين اللتين تم الحصول عليهما في الخطوة السابقة لتقييم ما إذا كانت الاختلافات متسقة. وأخيرا، أجري تحليل تمييزي خطي (LDA) لتقييم تأثير المؤشرات الحيوية على مجموعات مختلفة اختلافا كبيرا استنادا إلى درجات LDA. باختصار ، وفر LEfSe الراحة لتحديد المؤشرات الحيوية الجينومية التي تميز الاختلافات الإحصائية بين المجموعات البيولوجية.
Introduction
المؤشرات الحيوية هي خصائص بيولوجية يمكن قياسها ويمكن أن تشير إلى بعض الظواهر مثل العدوى أو المرض أو البيئة. من بينها ، قد تكون المؤشرات الحيوية الوظيفية وظائف بيولوجية محددة لنوع واحد أو مشتركة بين بعض الأنواع ، مثل الجينات والبروتين والمستقلب والمسارات. إلى جانب ذلك ، تشير المؤشرات الحيوية التصنيفية إلى نوع غير عادي ، أو مجموعة من الكائنات الحية (المملكة ، الفصيلة ، الطبقة ، الترتيب ، العائلة ، الجنس ، الأنواع) ، أو Varient Sequence Amplicon (ASV)1 ، أو وحدة التصنيف التشغيلية (OTU)2. من أجل العثور على المؤشرات الحيوية بسرعة ودقة أكبر ، من الضروري وجود أداة لتحليل البيانات البيولوجية. يمكن تفسير الاختلافات بين الفئات بواسطة LEfSe إلى جانب الاختبارات القياسية للدلالة الإحصائية والاختبارات الإضافية التي تشفر الاتساق البيولوجي وأهمية التأثير3. يتوفر LEfSe كوحدة مجرة ، وصيغة كوندا ، وصورة عامل رصيف ، ويتم تضمينه في bioBakery (VM و cloud)4. بشكل عام ، غالبا ما يستخدم تحليل التنوع الميكروبي اختبارا غير بارامتري للتوزيع غير المؤكد لمجتمع العينة. اختبار مجموع الرتب هو طريقة اختبار غير بارامترية ، والتي تستخدم رتبة العينات لتحل محل قيمة العينات. وفقا لاختلاف مجموعات العينات ، يمكن تقسيمها إلى عينتين مع اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون وإلى عينات متعددة مع اختبار Kruskal-Wallis 5,6. ومن الجدير بالذكر أنه عندما تكون هناك اختلافات كبيرة بين مجموعات متعددة من العينات، ينبغي إجراء اختبار مجموع الرتب للمقارنة الزوجية لعينات متعددة. LDA (الذي يرمز إلى التحليل التمييزي الخطي) الذي اخترعه رونالد فيشر في عام 1936 ، هو نوع من التعلم تحت الإشراف ، والمعروف أيضا باسم Fisher's Linear Discriminant7. إنها خوارزمية كلاسيكية وشعبية في المجال الحالي لاستخراج بيانات التعلم الآلي.
هنا ، تم تحسين فحص LEfSe بواسطة خوادم Conda و Galaxy. يتم تحليل ثلاث مجموعات من تسلسلات جينات 16S rRNA لإظهار الاختلافات الكبيرة بين المجموعات المختلفة مع درجات LDA من المجتمعات الميكروبية ونتائج التصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم الحصول على البروتوكول وتعديله من بحث Segata et al.3. يتم توفير الطريقة في https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse.
1. إعداد ملف الإدخال للتحليل
- قم بإعداد ملف الإدخال (الجدول 1) الخاص ب LEfSe ، والذي يمكن إنشاؤه بسهولة بواسطة العديد من مهام سير العمل8 أو البروتوكولات السابقة9 مع الملفات الأصلية (ملف العينة وملف التعليق التوضيحي للأنواع المقابلة).
2. تحليل LEfSe الأصلي (يقتصر على خادم Linux)
- تركيب LEfSe
ملاحظة: يوصى بتثبيت خط أنابيب LEfSe مع Conda10.- قم بتشغيل الأوامر التالية لاستبعاد احتمال تعارض التبعيات. إنشاء بيئة conda ل LEfSe (يوصى بهذه الخطوة ولكنها غير مطلوبة). -n لتقف علي اسم البيئة.
$ conda create -n LEfSe-env - لتنشيط بيئة LEfSe التي تم إنشاؤها، قم بتشغيل:
$ مصدر تنشيط LEfSe-env - لتثبيت LEfSe باستخدام bioBakery للقناة حيث يشير -c إلى اسم القناة، قم بتشغيل:
$ كوندا تثبيت -ج biobakery lefse
- قم بتشغيل الأوامر التالية لاستبعاد احتمال تعارض التبعيات. إنشاء بيئة conda ل LEfSe (يوصى بهذه الخطوة ولكنها غير مطلوبة). -n لتقف علي اسم البيئة.
- تنسيق البيانات ل LEfSe
- قم بتشغيل الأمر التالي لتنسيق الملف الأصلي إلى التنسيق الداخلي ل LEfSe. الجدول .txt هو ملف الإدخال Table-reformat.in هو ملف الإخراج. يتم استخدام -c لتعيين الميزة ، والتي يتم استخدامها كفئة (افتراضية 1) ويتم استخدام -o لتعيين قيمة التطبيع (الافتراضي -1.0 بمعنى عدم التطبيع).
$ format_input.py الجدول.txt Table-reformat.in -c 1 -o 1000000
- قم بتشغيل الأمر التالي لتنسيق الملف الأصلي إلى التنسيق الداخلي ل LEfSe. الجدول .txt هو ملف الإدخال Table-reformat.in هو ملف الإخراج. يتم استخدام -c لتعيين الميزة ، والتي يتم استخدامها كفئة (افتراضية 1) ويتم استخدام -o لتعيين قيمة التطبيع (الافتراضي -1.0 بمعنى عدم التطبيع).
- حساب حجم تأثير التحليل التمييزي الخطي (LDA)
- قم بتشغيل الأمر التالي. الغرض من هذه الخطوة هو تنفيذ LDA للنتيجة السابقة وإنشاء ملف النتيجة للتصور. يتم إنشاء Table-reformat.in باستخدام الخطوة السابقة ويتم استخدامه كملف إدخال في هذه الخطوة. Table-reformat.res هو ملف النتيجة.
$ run_lefse.py Table-reformat.in جدول-reformat.res
- قم بتشغيل الأمر التالي. الغرض من هذه الخطوة هو تنفيذ LDA للنتيجة السابقة وإنشاء ملف النتيجة للتصور. يتم إنشاء Table-reformat.in باستخدام الخطوة السابقة ويتم استخدامه كملف إدخال في هذه الخطوة. Table-reformat.res هو ملف النتيجة.
- التصور عن طريق المؤامرات
- ارسم نتائج LEfSe. لرسم حجم تأثير المؤشرات الحيوية في ملف pdf ،. يتم إنشاء Table-reformat.res باستخدام الخطوة السابقة و LDA.pdf هو ملف المؤامرة. -يستخدم التنسيق لتعيين نسق ملف الإخراج.
$ plot_res.py جدول-reformat.res LDA.pdf --تنسيق pdf - مؤامرة cladogram. لرسم شجرة الأنواع وعرض المؤشرات الحيوية في cladogram. cladogram.pdf هو ملف الإخراج.
$ plot_cladogram.py جدول-reformat.res cladogram.pdf --تنسيق pdf -
ميزة قطعة واحدة (اختياري) لرسم الاختلافات في علامة حيوية واحدة بين المجموعات المختلفة. -f يستخدم لتعيين ميزات المؤامرة. إذا تم تعيين واحد ، يجب إعطاء -feature_name.
$ plot_features.py -f one --feature_name "k__Bacteria.p__Firmicutes.c__Bacilli.o__Bacillales" --تنسيق pdf Table-reformat.in Table-reformat.res Bacillales.pdf - ارسم الميزات التفاضلية (اختياري) لرسم جميع الميزات ، ولكن هناك الكثير مما يجب القيام به بحذر. --يستخدم الأرشيف لاختيار ما إذا كان سيتم ضغط النتائج. ./ يعني مسار النتائج.
$ plot_features.py -f diff --archive none --format pdf Table-reformat.in Table-reformat.res ./
- ارسم نتائج LEfSe. لرسم حجم تأثير المؤشرات الحيوية في ملف pdf ،. يتم إنشاء Table-reformat.res باستخدام الخطوة السابقة و LDA.pdf هو ملف المؤامرة. -يستخدم التنسيق لتعيين نسق ملف الإخراج.
3. تحليل LEfSe عبر الإنترنت (المجرة)
- انتقل إلى خادم المجرة huttenhower 11: http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy.
- قم بتحميل الملفات. اضغط على زر السهم لأعلى في الجزء الأيمن وقم بتحميل الملف. انقر فوق اختيار ملف محلي لتحديد ملف الإدخال وتحديد جدول التنسيق ، ثم انقر فوق الزر ابدأ .
ملاحظة: بالإشارة إلى صفحة ويب (https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse)، استخدم البرنامج النصي (taxonomy_summary. R) لإنشاء ملف إدخال LEfSe ، والتنسيق (كل عمود له اسم مجموعة ، كل سطر بمستوى مختلف من التعليقات التوضيحية مفصولة ب "|") مطلوب كما هو موضح في الجدول 1. يظهر الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية لعملية التحميل. - تنسيق البيانات ل LEfSe. انقر على | LEfSe تنسيق البيانات ل LEfSe الارتباط في الجزء الأيمن، وحدد الصفوف المحددة للفئة في الملف، وانقر على زر تنفيذ . ويبين الشكل 2 لمحة عامة تخطيطية عن العملية التشغيلية والبارامترات المستخدمة.
- حساب حجم تأثير LDA. انقر على | LEfSe ارتباط حجم تأثير LDA (LEfSe) في الجزء الأيمن، وحدد قيم المعلمات وفقا لمتطلبات التحليل. انقر على تنفيذ. ويبين الشكل 3 لمحة عامة تخطيطية عن العملية التشغيلية والبارامترات المستخدمة.
- ارسم نتائج LEfSe. انقر على | LEfSe رسم رابط نتائج LEfSe في الجزء الأيسر ، وانقر فوق الزر تنفيذ . ويبين الشكل 4 لمحة عامة تخطيطية عن العملية التشغيلية والبارامترات المستخدمة.
- مؤامرة cladogram. انقر فوق Plot Cladogram في الجزء الأيسر ، وانقر فوق الزر تنفيذ بعد تحديد قيم المعلمات. ويبين الشكل 5 لمحة عامة تخطيطية عن العملية التشغيلية والبارامترات المستخدمة.
- ارسم ميزة واحدة بالنقر فوق Plot One Feature في الجزء الأيسر ، والنقر فوق الزر " تنفيذ" بعد تحديد قيم المعلمات. ويبين الشكل 6 لمحة عامة تخطيطية عن العملية التشغيلية والبارامترات المستخدمة.
- ارسم المعالم التفاضلية بالنقر فوق رسم الميزات التفاضلية في الجزء الأيمن، والضغط على الزر تنفيذ بعد تحديد قيم المعلمات. ويبين الشكل 7 لمحة عامة تخطيطية عن العملية التشغيلية والبارامترات المستخدمة.
ملاحظة: يمكن تصور هذه الأشكال التي تم إنشاؤها وتنزيلها مقابل المخرجات الناتجة في الجزء الأيسر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر الشكل 8 درجات LDA للمجتمعات الميكروبية ذات الاختلافات الكبيرة في كل مجموعة من خلال تحليل تسلسل جينات 16S rRNA لثلاث عينات. يمثل لون الرسم البياني مجموعات مختلفة ، بينما يمثل الطول درجة LDA ، وهو تأثير الأنواع ذات الاختلافات الكبيرة بين المجموعات المختلفة. يوضح الرسم البياني الأنواع ذات الاختلافات الكبيرة التي تكون درجة LDA فيها أكبر من القيمة المحددة مسبقا. القيمة الافتراضية المحددة مسبقا هي 2.0، لذلك يتم عرض القيم المطلقة فقط لدرجة LDA (abscissa) الأكبر من 2.0 في المؤامرة.
ويبين الشكل 9 المؤشرات الحيوية ذات الاختلاف الكبير وشجرة الأنواع بين مستويات التصنيف المختلفة. تمثل الدوائر التي تشع من الداخل إلى الخارج مستويات التصنيف من فصيلة إلى جنس (الدائرة الصفراء الأعمق هي المملكة). يمثل قطر كل دائرة صغيرة عند مستويات التصنيف المختلفة حجم الوفرة النسبية. الأنواع التي ليس لها فرق كبير هي صفراء اللون بشكل موحد ، ويتم تلوين المؤشرات الحيوية للأنواع المختلفة بشكل كبير مع المجموعات المقابلة. الفئات A و B و C هي أسماء مجموعات العينات الميكروبية التي تم جمعها. تمثل العقد الحمراء المجموعات الميكروبية التي تلعب دورا مهما في المجموعة الحمراء (A) ؛ تمثل العقد الخضراء المجموعات الميكروبية التي تلعب دورا مهما في المجموعة الخضراء (B) ؛ وتمثل العقد الزرقاء المجموعات الميكروبية التي تلعب دورا مهما في المجموعة الزرقاء (C). يتم عرض اسم الأنواع المقابلة للمؤشرات الحيوية غير الموضحة في المؤامرة على الجانب الأيمن ، وتتوافق أرقام الحروف مع تلك الموجودة في المؤامرة (تظهر فقط الأنواع التفاضلية من الفصيلة إلى العائلة بشكل افتراضي لأغراض جمالية).
يظهر الشكل 10 وفرة من المؤشرات الحيوية التي لها اختلافات بين المجموعات المختلفة وفقا لنتائج LEfSe. في شريط الوفرة النسبية ، يمثل الخط الصلب متوسط الوفرة النسبية ، ويمثل الخط المنقط الوفرة النسبية المتوسطة ، ويمثل كل عمود الوفرة النسبية لكل عينة في مجموعات مختلفة.
الجدول 1: ملف المثال لتحليل LEfSe عبر الإنترنت. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية لعملية التحميل. انقر على الأرقام الحمراء بترتيب تسلسلي على الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة تخطيطية على العملية التشغيلية لتغيير شكل البيانات. انقر على الأرقام الحمراء بترتيب تسلسلي على الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نظرة عامة تخطيطية للعملية التشغيلية لحساب حجم تأثير LDA. انقر على الأرقام الحمراء بترتيب تسلسلي على الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نظرة عامة تخطيطية على العملية التشغيلية لرسم نتائج LEfSe. انقر على الأرقام الحمراء بترتيب تسلسلي على الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نظرة عامة تخطيطية على العملية التشغيلية لتخطيط مخطط الكلادوغرام. انقر على الأرقام الحمراء بترتيب تسلسلي على الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نظرة عامة تخطيطية على العملية التشغيلية لرسم ميزة واحدة. انقر على الأرقام الحمراء بترتيب تسلسلي على الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: نظرة عامة تخطيطية على العملية التشغيلية لرسم السمات التفاضلية. انقر على الأرقام الحمراء بترتيب تسلسلي على الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: الرسم البياني لتوزيع قيم LDA. تم تحليل درجات LDA من المجتمعات الميكروبية ذات الاختلافات الكبيرة في كل مجموعة بواسطة LDA Effect Size وفقا لتأثيراتها وارتباطاتها. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.
الشكل 9: كلادوغرام. المؤامرة النموذجية للكلادوجرام التي تم الحصول عليها بواسطة البروتوكول ، والتي تمكن من تمثيل الفرق بين مستويات التصنيف المختلفة لثلاث مجموعات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: مخطط ميزة واحدة. تم عرض الوفرة الشريطية لعلامة حيوية واحدة لها اختلافات بين المجموعات المختلفة وفقا results.is LEfSe. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، يتم وصف بروتوكول تحديد وتوصيف المؤشرات الحيوية داخل مجموعات مختلفة. يمكن بسهولة تكييف هذا البروتوكول مع أنواع العينات الأخرى ، مثل OTUs للكائنات الحية الدقيقة. يمكن للطريقة الإحصائية بواسطة LEfSe العثور على الكائنات الحية الدقيقة المميزة في كل مجموعة (الافتراضي هو LDA >2) ، أي الكائنات الحية الدقيقة الأكثر وفرة في هذه المجموعة مقارنة بالآخرين12. يتوفر LEfSe في كل من إصدارات Linux الأصلية والويب حيث يمكن للمستخدمين أيضا إجراء تحليل LEfSe على صفحات الويب. يعتمد LEfSe على خوارزمية LDA ويحتاج إلى مستوى الأنواع لرسم شجرة الأنواع. من خلال تطبيق الأداة ، يمكن مقارنة الوفرة النسبية بين المجموعات. يمكن رسم جميع المؤشرات الحيوية التفاضلية في رسم بياني واحد. أيضا ، يمكن رسم علامة حيوية واحدة أو جميع المؤشرات الحيوية على دفعات.
سواء تم تنفيذ LEfSe من خلال الخادم الأصلي أو موقع عبر الإنترنت ، فهناك الكثير من المعلمات القابلة للضبط لرسم الصور المطلوبة. نظرا للهيكل المعقد لملفات الإدخال والحاجة إلى تحويلها إلى تنسيقات بيانات مفضلة لمزيد من التحليلات ل LEfSe ، تم أيضا تطوير بعض خدمات الشباك الواحد. لذلك ، يمكن أن يكون تحسين العمليات الأسهل تحديا. من ناحية أخرى ، هناك بعض القيود عند تحليل البيانات المعقدة باستخدام LEfSe. تعرض LDA ميزة ذات بعد واحد أقل من الفئة ، وإذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من الميزات ، تقديم طرق أخرى. المتغيرات من LDA قد تحل بعض الصعوبات. على سبيل المثال، يعد Kernel LDA حلا إذا تعذر فصل البيانات الأصلية جيدا بعد الإسقاط. نظرا لأن مقدار حساب LDA مرتبط ببعد البيانات ، يمكن أن يقلل 2DLDA بشكل كبير من مقدار حساب LDA. كل من LDA و PCA هي تقنيات شائعة الاستخدام لتقليل الأبعاد. يرتبط تقليل أبعاد PCA (تحليل المكون الرئيسي) ارتباطا مباشرا ببعد البيانات ، ونظام الإحداثيات المتوقع متعامد. ومع ذلك ، يركز LDA على قدرة التصنيف وفقا لوضع العلامات على الفئات ، وبالتالي فإن نظام الإحداثيات المتوقع ليس متعامدا بشكل عام.
تقدم LEfSe المساعدة في اختيار المؤشرات الحيوية. مع العديد من المزايا (على سبيل المثال ، المعلمات القابلة للتعديل ، والنتائج التفصيلية لأجزاء مختلفة ، والتطبيق بين مجموعتين أو أكثر) ، فقد تم استخدامه على نطاق واسع13. مع تزايد الطلب على تحليل البيانات عالية الأبعاد ، سيصبح تطبيق هذه الطريقة أكثر شمولا لاستكشاف المؤشرات الحيوية للميزات (الكائنات الحية ، الكتل ، وحدات التصنيف التشغيلية ، الجينات ، أو الوظائف) التي تؤثر على صحة الإنسان والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة من صناديق البحوث الأساسية للمعاهد المركزية لبحوث الرفاه العام (TKS170205) ومؤسسة تطوير العلوم والتكنولوجيا ، ومعهد تيانجين لبحوث هندسة النقل المائي (TIWTE) ، M.O.T. (KJFZJJ170201).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No materials used |
References
- Bolyen, E., et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37 (8), 852-857 (2019).
- Knight, R., et al. Best practices for analysing microbiomes. Nature Reviews. Microbiology. 16 (7), 410-422 (2018).
- Segata, N., et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biology. 12 (6), 60 (2011).
- McIver, M., Sayoldin, B., Shafquat, A. Biobakery / lefse [tool]. , Available from: https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse (2019).
- Kruskal, W. H. A nonparametric test for the several sample problem. The Annals of Mathematical Statistics. 23 (4), 525-540 (1952).
- Wilcoxon, F. Individual comparisons by ranking methods. Biometrics Bulletin. 1 (6), 80-83 (1945).
- Fisher, R. A. The use of multiple measurements in taxonomic problems. Annals of Eugenics. 7 (1), 179-188 (1936).
- Liu, Y. X., et al. A practical guide to amplicon and metagenomic analysis of microbiome data. Protein and Cell. 41 (7), 1-16 (2020).
- Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N. V., Mangalam, A. K. Microbiota analysis using two-step PCR and next-generation 16S rRNA gene sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e59980 (2019).
- Grüning, B., et al. Bioconda: sustainable and comprehensive software distribution for the life sciences. Nature Methods. 15 (7), 475-476 (2018).
- Blankenberg, D., Chilton, J., Coraor, N. Galaxy external display applications: closing a dataflow interoperability loop. Nature Methods. 17 (2), 123-124 (2020).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Shilei, Z., et al. Reservoir water stratification and mixing affects microbial community structure and functional community composition in a stratified drinking reservoir. Journal of Environmental Management. 267, 110456 (2020).
