Summary
LEfSe (LDA Effect Size) ist ein Werkzeug für das hochdimensionale Biomarker-Mining zur Identifizierung genomischer Merkmale (wie Gene, Signalwege und Taxonomien), die zwei oder mehr Gruppen in Mikrobiomdaten signifikant charakterisieren.
Abstract
Es gibt eine wachsende Aufmerksamkeit für geschlossene biologische Genome in der Umwelt und in der Gesundheit. Um die Unterschiede zwischen den Gruppen zwischen verschiedenen Proben oder Umgebungen zu untersuchen und aufzudecken, ist es wichtig, Biomarker mit statistischen Unterschieden zwischen den Gruppen zu entdecken. Die Anwendung der linearen Diskriminanzanalyse Effect Size (LEfSe) kann helfen, gute Biomarker zu finden. Basierend auf den ursprünglichen Genomdaten werden Qualitätskontrollen und Quantifizierungen verschiedener Sequenzen basierend auf Taxa oder Genen durchgeführt. Zunächst wurde der Kruskal-Wallis-Rangtest verwendet, um zwischen spezifischen Unterschieden zwischen statistischen und biologischen Gruppen zu unterscheiden. Dann wurde der Wilcoxon-Rangtest zwischen den beiden im vorherigen Schritt erhaltenen Gruppen durchgeführt, um zu beurteilen, ob die Unterschiede konsistent waren. Schließlich wurde eine lineare Diskriminanzanalyse (LDA) durchgeführt, um den Einfluss von Biomarkern auf signifikant unterschiedliche Gruppen basierend auf LDA-Scores zu bewerten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass LEfSe die Möglichkeit bot, genomische Biomarker zu identifizieren, die statistische Unterschiede zwischen biologischen Gruppen charakterisieren.
Introduction
Biomarker sind biologische Eigenschaften, die gemessen werden können und auf einige Phänomene wie Infektionen, Krankheiten oder Umwelt hinweisen können. Unter ihnen können funktionelle Biomarker spezifische biologische Funktionen einzelner Spezies oder einiger Arten sein, wie Gen, Protein, Metabolit und Signalwege. Außerdem weisen taxonomische Biomarker auf eine ungewöhnliche Art, eine Gruppe von Organismen (Königreich, Stamm, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung, Art), den Amplicon Sequence Varient (ASV)1 oder die Operational Taxonomic Unit (OTU)2 hin. Um Biomarker schneller und genauer zu finden, ist ein Werkzeug zur Analyse der biologischen Daten notwendig. Die Unterschiede zwischen den Klassen können durch LEfSe in Verbindung mit Standardtests für statistische Signifikanz und zusätzlichen Tests zur Kodierung biologischer Konsistenz und Effektrelevanzerklärt werden 3. LEfSe ist als Galaxiemodul, als Conda-Formel, als Docker-Image und in bioBakery (VM und Cloud)4 enthalten. Im Allgemeinen wird bei der Analyse der mikrobiellen Vielfalt häufig ein nicht-parametrischer Test für die unsichere Verteilung einer Stichprobengemeinschaft verwendet. Der Rangsummentest ist ein nichtparametrisches Testverfahren, bei dem der Rang von Stichproben verwendet wird, um den Wert von Stichproben zu ersetzen. Entsprechend der Differenz der Stichprobengruppen kann sie mit dem Wilcoxon-Rangsummentest in zwei Stichproben und mit dem Kruskal-Wallis-Test 5,6 in mehrere Stichproben unterteilt werden. Insbesondere wenn signifikante Unterschiede zwischen mehreren Gruppen von Stichproben bestehen, sollte ein Rangsummentest des paarweisen Vergleichs mehrerer Stichproben durchgeführt werden. LDA (was für Linear Discriminant Analysis steht), das 1936 von Ronald Fisher erfunden wurde, ist eine Art überwachtes Lernen, auch bekannt als Fisher's Linear Discriminant7. Es ist ein klassischer und beliebter Algorithmus im aktuellen Bereich des Machine Learning Data Mining.
Hier wurde der LEfSe-Assay von Conda- und Galaxy-Servern optimiert. Drei Gruppen von 16S rRNA-Gensequenzen werden analysiert, um die signifikanten Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen mit LDA-Scores mikrobieller Gemeinschaften und Visualisierungsergebnissen zu demonstrieren.
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Protocol
HINWEIS: Das Protokoll wurde aus der Forschung von Segata et al.3 bezogen und modifiziert. Die Methode wird am https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse bereitgestellt.
1. Vorbereitung der Eingabedatei für die Analyse
- Bereiten Sie die Eingabedatei (Tabelle 1) von LEfSe vor, die von vielen Workflows8 oder früheren Protokollen9 mit den Originaldateien (Beispieldatei und entsprechende Speziesannotationsdatei) leicht generiert werden kann.
2. LEfSe native Analyse (beschränkt auf den Linux-Server)
- LEfSe Installation
HINWEIS: Es wird empfohlen, die LEfSe-Rohrleitung mit Conda10 zu installieren.- Führen Sie die folgenden Befehle aus, um die Möglichkeit eines Abhängigkeitskonflikts auszuschließen. Erstellen Sie eine Conda-Umgebung für LEfSe (Dieser Schritt wird empfohlen, ist aber nicht erforderlich.). -n steht für den Umgebungsnamen.
$ conda create -n LEfSe-env - Um die erstellte LEfSe-Umgebung zu aktivieren, führen Sie Folgendes aus:
$ Quelle aktivieren LEfSe-env - Um LEfSe mit Kanal bioBakery zu installieren, wobei -c für Kanalname steht, führen Sie Folgendes aus:
$ conda install -c biobakery lefse
- Führen Sie die folgenden Befehle aus, um die Möglichkeit eines Abhängigkeitskonflikts auszuschließen. Erstellen Sie eine Conda-Umgebung für LEfSe (Dieser Schritt wird empfohlen, ist aber nicht erforderlich.). -n steht für den Umgebungsnamen.
- Formatieren von Daten für LEfSe
- Führen Sie den folgenden Befehl aus, um die Originaldatei in das interne Format für LEfSe zu formatieren. Tabelle.txt ist die Eingabedatei und Table-reformat.in ist die Ausgabedatei. -c wird verwendet, um das Feature festzulegen, das als Klasse verwendet wird (Standard 1), und -o wird verwendet, um den Normalisierungswert festzulegen (Standard -1.0 bedeutet keine Normalisierung).
$ format_input.py Tisch.txt Table-reformat.in -c 1 -o 1000000
- Führen Sie den folgenden Befehl aus, um die Originaldatei in das interne Format für LEfSe zu formatieren. Tabelle.txt ist die Eingabedatei und Table-reformat.in ist die Ausgabedatei. -c wird verwendet, um das Feature festzulegen, das als Klasse verwendet wird (Standard 1), und -o wird verwendet, um den Normalisierungswert festzulegen (Standard -1.0 bedeutet keine Normalisierung).
- Berechnung der Effektgröße der linearen Diskriminanzanalyse (LDA)
- Führen Sie den folgenden Befehl aus. Der Zweck dieses Schritts besteht darin, LDA des vorherigen Ergebnisses durchzuführen und die Ergebnisdatei für die Visualisierung zu generieren. Table-reformat.in wird mit dem vorherigen Schritt generiert und in diesem Schritt als Eingabedatei verwendet. Table-reformat.res ist die Ergebnisdatei.
$ run_lefse.py Table-reformat.in Table-reformat.res
- Führen Sie den folgenden Befehl aus. Der Zweck dieses Schritts besteht darin, LDA des vorherigen Ergebnisses durchzuführen und die Ergebnisdatei für die Visualisierung zu generieren. Table-reformat.in wird mit dem vorherigen Schritt generiert und in diesem Schritt als Eingabedatei verwendet. Table-reformat.res ist die Ergebnisdatei.
- Visualisierung durch Plots
- Zeichnen Sie die LEfSe-Ergebnisse auf. Um die Effektgröße der Biomarker in einer PDF-Datei darzustellen, Table-reformat.res wird mit dem vorherigen Schritt generiert und LDA.pdf ist die Plotdatei. –format wird verwendet, um das Format der Ausgabedatei festzulegen.
$ plot_res.py Table-reformat.res LDA.pdf --format pdf - Zeichnen Sie das Kladogramm auf. Um den Artenbaum zu zeichnen und die Biomarker in einem Kladogramm anzuzeigen. cladogram.pdf ist die Ausgabedatei.
$ plot_cladogram.py Table-reformat.res Kladogramm.pdf --format pdf -
Ein Feature plotten (optional) Darstellung der Unterschiede eines einzelnen Biomarkers zwischen verschiedenen Gruppen. -f wird verwendet, um die Features des Plots festzulegen. Wenn eins gesetzt wurde, muss das –feature_name angegeben werden.
$ plot_features.py -f eins --feature_name "k__Bacteria.p__Firmicutes.c__Bacilli.o__Bacillales" --format pdf Table-reformat.in Table-reformat.res Bacillales.pdf - Zeichnen Sie die differentiellen Features (optional), um alle Features zu zeichnen, aber es gibt zu viel mit Vorsicht zu tun. --archive wird verwendet, um auszuwählen, ob die Ergebnisse komprimiert werden sollen. ./ bezeichnet den Weg der Ergebnisse.
$ plot_features.py -f diff --archive none --format pdf Table-reformat.in Table-reformat.res ./
- Zeichnen Sie die LEfSe-Ergebnisse auf. Um die Effektgröße der Biomarker in einer PDF-Datei darzustellen, Table-reformat.res wird mit dem vorherigen Schritt generiert und LDA.pdf ist die Plotdatei. –format wird verwendet, um das Format der Ausgabedatei festzulegen.
3. LEfSe Online-Analyse (Galaxie)
- Gehe zum Huttenhower Galaxy Server 11:http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy.
- Laden Sie die Dateien hoch. Klicken Sie im linken Bereich auf die Nach-oben-Taste und laden Sie die Datei hoch. Klicken Sie auf Lokale Datei auswählen , um die Eingabedatei auszuwählen und das Format tabellarisch auszuwählen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Start .
HINWEIS: Wenn Sie auf die Webseite (https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse) verweisen, verwenden Sie das Skript (taxonomy_summary. R) um die Eingabedatei von LEfSe zu generieren, und das Format (jede Spalte mit einem Gruppennamen, jede Zeile mit einer anderen Anmerkungsebene, getrennt durch "|") ist erforderlich, wie in Tabelle 1 gezeigt. Eine schematische Übersicht über den Upload-Prozess ist in Abbildung 1 dargestellt. - Formatieren Sie die Daten für LEfSe. Klicken Sie auf die LEfSe-| Formatieren Sie Daten für LEfSe im linken Bereich, wählen Sie die spezifischen Zeilen für die Klasse in der Datei aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen. Eine schematische Übersicht über den Betriebsablauf und die verwendeten Parameter ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Berechnen Sie die LDA-Effektgröße. Klicken Sie auf die LEfSe | Link LDA Effect Size (LEfSe) im linken Bereich und wählen Sie Parameterwerte entsprechend den Analyseanforderungen aus. Klicken Sie auf Ausführen. Eine schematische Übersicht über den Betriebsablauf und die verwendeten Parameter ist in Abbildung 3 dargestellt.
- Zeichnen Sie die LEfSe-Ergebnisse auf. Klicken Sie auf die LEfSe-| Plotten Sie LEfSe-Ergebnisse im linken Bereich und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen. Eine schematische Übersicht über den Betriebsablauf und die verwendeten Parameter ist in Abbildung 4 dargestellt.
- Zeichnen Sie das Kladogramm auf. Klicken Sie im linken Bereich auf Plot Cladogram und dann auf die Schaltfläche Ausführen, nachdem Sie die Parameterwerte ausgewählt haben. Eine schematische Übersicht über den Betriebsablauf und die verwendeten Parameter ist in Abbildung 5 dargestellt.
- Zeichnen Sie ein Feature, indem Sie im linken Bereich auf Plot One Feature (Ein Feature plotten ) klicken und nach der Auswahl der Parameterwerte auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Eine schematische Übersicht über den Betriebsablauf und die verwendeten Parameter ist in Abbildung 6 dargestellt.
- Zeichnen Sie differenzielle KEs, indem Sie im linken Fensterausschnitt auf Differenzielle KEs plotten klicken und nach Auswahl der Parameterwerte auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Eine schematische Übersicht über den Betriebsablauf und die verwendeten Parameter ist in Abbildung 7 dargestellt.
HINWEIS: Diese generierten Zahlen können visualisiert und gegen die resultierende Ausgabe im rechten Bereich heruntergeladen werden.
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Representative Results
Die LDA-Scores von mikrobiellen Gemeinschaften mit signifikanten Unterschieden in jeder Gruppe durch Analyse der 16S rRNA-Gensequenzen von drei Proben sind in Abbildung 8 dargestellt. Die Farbe des Histogramms repräsentiert verschiedene Gruppen, während die Länge den LDA-Score darstellt, der den Einfluss der Spezies mit signifikanten Unterschieden zwischen verschiedenen Gruppen darstellt. Das Histogramm zeigt die Arten mit signifikanten Unterschieden, deren LDA-Wert größer als der voreingestellte Wert ist. Der voreingestellte Standardwert ist 2,0, daher werden im Diagramm nur absolute Werte des LDA-Scores (Absziss) größer als 2,0 angezeigt.
Die Biomarker mit signifikanten Unterschieden und Artenbäumen zwischen verschiedenen Klassifikationsstufen sind in Abbildung 9 dargestellt. Die von innen nach außen abstrahlenden Kreise stellen die Klassifikationsebenen vom Stamm bis zur Gattung dar (der innerste gelbe Kreis ist das Königreich). Der Durchmesser jedes kleinen Kreises auf den verschiedenen Klassifikationsebenen stellt die Größe der relativen Häufigkeit dar. Die Arten ohne signifikanten Unterschied sind einheitlich gelb gefärbt, und die signifikant unterschiedlichen Spezies-Biomarker werden mit den entsprechenden Gruppen gefärbt. Die Klassen A, B und C sind die Gruppennamen der gesammelten mikrobiellen Proben. Rote Knoten repräsentieren die mikrobiellen Gruppen, die eine wichtige Rolle in der roten Gruppe spielen (A); grüne Knoten repräsentieren die mikrobiellen Gruppen, die eine wichtige Rolle in der grünen Gruppe spielen (B); und blaue Knoten repräsentieren die mikrobiellen Gruppen, die eine wichtige Rolle in der blauen Gruppe (C) spielen. Der entsprechende Artname der Biomarker, die nicht im Diagramm gezeigt werden, wird auf der rechten Seite angezeigt, und die Buchstabennummern entsprechen denen im Diagramm (nur abweichende Arten vom Stamm zur Familie standardmäßig aus ästhetischen Gründen).
Die Häufigkeit eines Biomarkers, der gemäß den LEfSe-Ergebnissen Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen aufweist, ist in Abbildung 10 dargestellt. Im Balkendiagramm relative Häufigkeit stellt die durchgezogene Linie die durchschnittliche relative Häufigkeit, die gepunktete Linie die mittlere relative Häufigkeit und jede Spalte die relative Häufigkeit jeder Stichprobe in verschiedenen Gruppen dar.
Tabelle 1: Die Beispieldatei für die LEfSe-Analyse online. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Abbildung 1: Schematische Übersicht über den Upload-Prozess. Klicken Sie auf die roten Zahlen in sequenzieller Reihenfolge auf der Abbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Übersicht über den Betriebsablauf zum Ändern des Datenformats. Klicken Sie auf die roten Zahlen in sequenzieller Reihenfolge auf der Abbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Schematische Übersicht über den Betriebsprozess zur Berechnung der LDA-Effektgröße. Klicken Sie auf die roten Zahlen in sequenzieller Reihenfolge auf der Abbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Schematische Übersicht über den Betriebsablauf zur Darstellung der LEfSe-Ergebnisse. Klicken Sie auf die roten Zahlen in sequenzieller Reihenfolge auf der Abbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Schematische Übersicht über den Betriebsablauf zum Plotten von Kladogrammen. Klicken Sie auf die roten Zahlen in sequenzieller Reihenfolge auf der Abbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Schematische Übersicht über den Betriebsprozess zum Plotten eines Features. Klicken Sie auf die roten Zahlen in sequenzieller Reihenfolge auf der Abbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Schematische Übersicht über den Betriebsprozess zum Darstellen von Differenzialmerkmalen. Klicken Sie auf die roten Zahlen in sequenzieller Reihenfolge auf der Abbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Histogramm der Verteilung der LDA-Werte. LDA-Scores von mikrobiellen Gemeinschaften mit signifikanten Unterschieden in jeder Gruppe wurden von LDA Effect Size nach ihren Einflüssen und Korrelationen analysiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Abbildung 9: Kladogramm. Das typische Diagramm des Kladogramms, das durch das Protokoll erhalten wird, ermöglicht die Darstellung der Differenz zwischen verschiedenen Klassifikationsebenen von drei Gruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10: Ein Feature-Plot. Das Abundanz-Barplot eines Biomarkers, der laut LEfSe Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen aufweist, results.is gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Hier wird das Protokoll zur Identifizierung und Charakterisierung von Biomarkern innerhalb verschiedener Gruppen beschrieben. Dieses Protokoll kann leicht für andere Probentypen, wie OTUs von Mikroorganismen, angepasst werden. Die statistische Methode vonLEfSe kann die charakteristischen Mikroorganismen in jeder Gruppe finden (Standard ist LDA >2), dh die Mikroorganismen, die in dieser Gruppe im Vergleich zu den anderen 12 häufiger vorkommen. LEfSe ist sowohl in nativen als auch in Web-Linux-Versionen verfügbar, in denen Benutzer auch LEfSe-Analysen auf Webseiten durchführen können. LEfSe basiert auf dem LDA-Algorithmus und benötigt eine Artenebene, um einen Artenbaum zu zeichnen. Durch die Anwendung des Werkzeugs kann die relative Häufigkeit zwischen Gruppen verglichen werden. Alle differentiellen Biomarker konnten in einem einzigen Graphen dargestellt werden. Auch ein einzelner Biomarker oder alle Biomarker können in Chargen aufgetragen werden.
Unabhängig davon, ob LEfSe über den nativen Server oder eine Online-Site durchgeführt wird, gibt es viele abstimmbare Parameter, um die erforderlichen Bilder zu zeichnen. Aufgrund der komplexen Struktur der Eingabedateien und der Notwendigkeit, sie für weitere Analysen von LEfSe in bevorzugte Datenformate zu konvertieren, wurden auch einige One-Stop-Services entwickelt. Daher kann die Optimierung einfacherer Operationen eine Herausforderung darstellen. Auf der anderen Seite gibt es einige Einschränkungen bei der Analyse komplexer Daten mit LEfSe. LDA projiziert ein Feature, das eine Dimension kleiner als die Kategorie ist, und wenn mehr Features benötigt werden, werden andere Methoden eingeführt. Die Varianten von LDA können einige Schwierigkeiten lösen. Beispielsweise ist Kernel-LDA eine Lösung, wenn die ursprünglichen Daten nach der Projektion nicht gut getrennt werden können. Da die Menge der Berechnung von LDA mit der Dimension der Daten zusammenhängt, kann 2DLDA die Menge der Berechnung von LDA erheblich reduzieren. Sowohl LDA als auch PCA sind häufig verwendete Techniken zur Dimensionsreduktion. Die PCA-Dimensionsreduktion (Principal Component Analysisis) steht in direktem Zusammenhang mit der Datendimension, und das projizierte Koordinatensystem ist orthogonal. LDA konzentriert sich jedoch auf die Fähigkeit der Klassifizierung gemäß der Beschriftung von Kategorien, so dass das projizierte Koordinatensystem im Allgemeinen nicht orthogonal ist.
LEfSe unterstützt bei der Auswahl von Biomarkern. Mit vielen Vorteilen (z. B. einstellbare Parameter, die detaillierten Ergebnisse verschiedener Teile, Anwendung zwischen zwei oder mehr Gruppen) wurde es häufig verwendet13. Mit zunehmender Nachfrage nach hochdimensionaler Datenanalyse wird die Anwendung dieser Methode immer umfangreicher, um die Biomarker der Merkmale (Organismen, Kladen, operative taxonomische Einheiten, Gene oder Funktionen) zu untersuchen, die sich auf die menschliche Gesundheit und Krankheit auswirken.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Grundlagenforschungsfonds für die zentralen Forschungsinstitute des öffentlichen Wohlergehens (TKS170205) und der Stiftung für die Entwicklung von Wissenschaft und Technologie sowie des Tianjin Research Institute for Water Transport Engineering (TIWTE), M.O.T. (KJFZJJ170201) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No materials used |
References
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