Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Isolering og funksjonell vurdering av humane brystkreftstamceller fra celle- og vevsprøver

Published: October 2, 2020 doi: 10.3791/61775
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4
1London Regional Cancer Program, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Western University, 3Department of Oncology, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Denne eksperimentelle protokollen beskriver isoleringen av BCSC-er fra brystkreftcelle- og vevsprøver, samt in vitro - og in vivo-analysene som kan brukes til å vurdere BCSC-fenotype og funksjon.

Abstract

Brystkreft stamceller (BCSCs) er kreftceller med arvelige eller ervervede stamcellelignende egenskaper. Til tross for deres lave frekvens, er de store bidragsytere til brystkreftinitiering, tilbakefall, metastase og terapiresistens. Det er viktig å forstå biologien til brystkreft stamceller for å identifisere nye terapeutiske mål for å behandle brystkreft. Brystkreft stamceller er isolert og karakterisert basert på ekspresjon av unike celleoverflatemarkører som CD44, CD24 og enzymatisk aktivitet av aldehyddehydrogenase (ALDH). DisseALDH-høyeCD44 + CD24-cellene utgjør BCSC-populasjonen og kan isoleres ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for nedstrøms funksjonelle studier. Avhengig av det vitenskapelige spørsmålet, kan forskjellige in vitro og in vivo metoder brukes til å vurdere de funksjonelle egenskapene til BCSC. Her gir vi en detaljert eksperimentell protokoll for isolering av humane BCSC-er fra både heterogene populasjoner av brystkreftceller, samt primært tumorvev oppnådd fra brystkreftpasienter. I tillegg fremhever vi nedstrøms in vitro og in vivo funksjonelle analyser, inkludert kolonidannende analyser, mammosfæreanalyser, 3D-kulturmodeller og tumor xenograftanalyser som kan brukes til å vurdere BCSC-funksjonen.

Introduction

Å forstå de cellulære og molekylære mekanismene til humane brystkreftstamceller (BCSC) er avgjørende for å takle utfordringene som oppstår i brystkreftbehandling. Fremveksten av BCSC-konseptet dateres tilbake til begynnelsenav det 21. århundre, hvor en liten populasjon av CD44 + CD24- / lave brystkreftceller ble funnet å være i stand til å generere heterogene svulster hos mus 1,2. Deretter ble det observert at humane brystkreftceller med høy enzymatisk aktivitet av aldehyddehydrogenase (ALDHhøy) også viste lignende stamcellelignende egenskaper3. Disse BCSC-ene representerer en liten populasjon av celler som er i stand til selvfornyelse og differensiering, noe som bidrar til den heterogene naturen til bulktumorer 1,2,3. Akkumulerende bevis tyder på at endringer i evolusjonært konserverte signalveier driver BCSC-overlevelse og vedlikehold 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . I tillegg har cellens ekstrinsiske mikromiljø vist seg å spille en sentral rolle i å diktere forskjellige BCSC-funksjoner15,16,17. Disse molekylære banene og de eksterne faktorene som regulerer BCSC-funksjonen bidrar til tilbakefall av brystkreft, metastase18 og utvikling av resistens mot terapier 19,20,21, med gjenværende eksistens av BCSC etter behandling som utgjør en stor utfordring for den totale overlevelsen av brystkreftpasienter22,23 . Preklinisk evaluering av disse faktorene er derfor svært viktig for å identifisere BCSC-målrettede terapier som kan være gunstige for å oppnå bedre behandlingsresultater og forbedret total overlevelse hos brystkreftpasienter.

Flere in vitro humane brystkreftcellelinjemodeller og in vivo humane xenograftmodeller har blitt brukt til å karakterisere BCSCs 24,25,26,27,28,29. Cellelinjenes evne til kontinuerlig å repopulere etter hver påfølgende passasje gjør disse til et ideelt modellsystem for å utføre omics-baserte og farmakogenomiske studier. Imidlertid klarer cellelinjer ofte ikke å rekapitulere heterogeniteten observert i pasientprøver. Derfor er det viktig å utfylle cellelinjedata med pasientavledede prøver. Isolering av BCSC-er i sin reneste form er viktig for å muliggjøre detaljert karakterisering av BCSC. Å oppnå denne renheten avhenger av valg av fenotypiske markører som er spesifikke for BCSC. For tiden er ALDHhøyCD44 + CD24-celle fenotype mest brukt til å skille og isolere humane BCSC-er fra bulk brystkreftcellepopulasjoner ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for maksimal renhet1, 3,26. Videre kan egenskapene til isolerte BCSC-er som selvfornyelse, spredning og differensiering evalueres ved hjelp av in vitro og in vivo teknikker.

For eksempel kan in vitro kolonidannende analyser brukes til å vurdere en enkelt celles evne til selvfornyelse for å danne en koloni på 50 celler eller mer i nærvær av forskjellige behandlingsforhold30. Mammosfæreanalyser kan også brukes til å vurdere selvfornyelsespotensialet til brystkreftceller under forankringsuavhengige forhold. Denne analysen måler enkeltcellers evne til å generere og vokse som kuler (blanding av BCSC-er og ikke-BCSC-er) ved hver påfølgende passasje i serumfrie ikke-adherente kulturforhold31. I tillegg kan 3-dimensjonale (3D) kulturmodeller brukes til å vurdere BCSC-funksjonen, inkludert celle-celle- og cellematriseinteraksjoner som nøye rekapitulerer in vivo mikromiljøet og tillater undersøkelse av aktiviteten til potensielle BCSC-målrettede terapier32. Til tross for de ulike bruksområdene til in vitro-modeller, er det vanskelig å modellere kompleksiteten av in vivo-tilstander kun ved bruk av in vitro-analyser. Denne utfordringen kan overvinnes ved bruk av mus xenograft-modeller for å evaluere BCSC-oppførsel in vivo. Spesielt fungerer slike modeller som et ideelt system for å vurdere brystkreftmetastase 33, undersøke interaksjoner med mikromiljøet under sykdomsprogresjon 34, in vivo imaging35, og for å forutsi pasientspesifikk toksisitet og effekt av antitumormidler34.

Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse for isolering av human ALDHhøyCD44 + CD24- BCSC ved maksimal renhet fra bulkpopulasjoner av heterogene brystkreftceller. Vi gir også en detaljert beskrivelse av tre in vitro-teknikker (kolonidannende analyse, mammosfæreanalyse og 3D-kulturmodell) og en in vivo tumor xenograftanalyse som kan brukes til å vurdere ulike funksjoner av BCSC. Disse metodene vil være hensiktsmessige for bruk av etterforskere som er interessert i å isolere og karakterisere BCSC-er fra humane brystkreftcellelinjer eller primærpasientavledede brystkreftceller og tumorvev med det formål å forstå BCSC-biologi og / eller undersøke nye BCSC-målrettede terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Innsamling av pasientavledede kirurgiske eller biopsiprøver direkte fra samtykkende brystkreftpasienter ble utført i henhold til godkjent humanetisk protokoll godkjent av institusjonens etiske styre. Alle mus som ble brukt til å generere pasientavledede xenograftmodeller ble vedlikeholdt og plassert i et institusjonsgodkjent dyreanlegg. Tumorvevet fra pasientavledede xenograftmodeller ved bruk av mus ble generert i henhold til godkjent etikkprotokoll godkjent av institusjonens dyrepleiekomité.

1. Forberedelse av cellelinjer

  1. Utfør alle cellekultur- og fargeprosedyrer under sterile forhold i et biosikkerhetsskap. Bruk sterile cellekulturretter/flasker og reagenser.
  2. Opprettholde humane brystkreftceller ved 37 ° C med 5% CO2 i definerte medier supplert med føtalt bovint serum (FBS) og nødvendige vekstfaktorer som er spesifikke for hver cellelinje.
  3. Opprettholde mus NIH3T3 fibroblastcellekulturer (til bruk i kolonidannende analyser) ved 37 ° C med 5% CO2 i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) supplert med 10% FBS.
  4. For alle kulturer, fyll på de gamle mediene hver 2-3 dag med friske medier. Når kulturene når 75-80% sammenløp, subkultur i flere sterile cellekultur kolber.

2. Forberedelse av brystkreft tumorvev

  1. Samle pasientavledede kirurgiske eller biopsiprøver direkte fra samtykkende brystkreftpasienter i henhold til en human etikkprotokoll godkjent av institusjonens etiske styre.
  2. Deretter samler og genererer tumorvev fra pasientavledede xenograftmodeller ved hjelp av mus under en dyreetikkprotokoll godkjent av den institusjonelle dyrepleieutvalget.
  3. Samle alle tumorvev under sterile forhold i et 50 ml sterilt konisk rør som inneholder 30 ml DMEM: F12-medier, hold på is og behandle prøvene som beskrevet nedenfor innen 2 timer etter innsamling.

3. Generering av enkeltcellesuspensjoner av brystkreftceller

  1. Aspirer medier fra kolben som inneholder et monolag av brystkreftceller som er 60-80% sammenflytende (valgte cellelinjer). Vask cellene med 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Aspirer PBS og tilsett passende celledissosiasjonsløsning (f.eks. Trypsin: EDTA, akkurat nok til å dekke monolaget av celler) og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur (anbefalt) eller ved 37 ° C.
  2. Tilsett 5 ml kulturmedier for å nøytralisere aktiviteten til celledissosiasjonsløsning.
  3. Overfør den resulterende dissosierte celleoppløsningen til et 50 ml konisk rør og sentrifuge ved 1000 x g i 5 minutter.
  4. Kast supernatant og resuspended cellepelleten i 5 ml 1x PBS. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og et mikroskop.
    MERK: Vær oppmerksom på celleklumping i hemocytometeret. Gjenta celledissosiasjonstrinnet hvis enkeltcellesuspensjon ikke er dannet.
  5. Etter celletelling sentrifugerer du cellesuspensjonen på nytt ved 1000 x g i 5 minutter, kaster supernatant og resuspenderer cellepelleten i ALDH-substratbufferen ved en konsentrasjon på 1 x 106 celler/ml.

4. Generering av enkeltcellesuspensjon fra vevsprøver

  1. Hakk svulstvevet med kirurgiske kniver ved hjelp av en kryssteknikk for å oppnå mindre biter på ca. 1 mm i størrelse. Overfør vevsbitene til et nytt 50 ml konisk rør som inneholder 10 ml dissosiasjonsbuffer (1X kollagenase i DMEM: F12). Forsegl det koniske røret med parafilm og inkubert ved 37 °C i en shakerinkubator i 40 minutter.
    MERK: Hvis det ikke er en shaker-inkubator, legg røret i et 37 ° C vannbad og bland røret ved å virvle hvert 5-10 minutt.
  2. Pellet det fordøyede vevet ved sentrifugerprøve ved 530 x g i 5 minutter. Kast supernatanten og tilsett 5 ml trypsin. Pipetter opp og ned ved hjelp av 1 ml pipette (satt til 750 μL) for å forstyrre pelleten og inkubere i et 37 °C vannbad i 5 minutter. Etter inkubasjon, pipette opp og ned kraftig for å frigjøre enkeltceller.
  3. Fyll opp det totale volumet i røret til 25 ml med DMEM:F12-medier og sentrifuge ved 1000 x g i 5 minutter. Kast supernatanten og resuspend pelleten i 1 ml dispase-DNase-oppløsning. Inkuber i et 37 °C vannbad i 5 min.
  4. Fyll opp det totale volumet i røret til 10 ml med PBS. Bland ved pipettering opp og ned, pass den resulterende cellesuspensjonen gjennom en 40 μm cellesil festet til et friskt 50 ml konisk rør. Sentrifuge ved 1000 x g i 5 min.
  5. Kast supernatant og resuspend cellepelleten i 5 ml 1x PBS. Tell cellene og fullfør klargjøringen av cellesuspensjonen som beskrevet i trinn 3.4 og 3.5.

5. Isolering av brystkreft stamceller (BCSCs)

  1. Merk strømningsrør for den ufargede kontrollen, enkeltcellefargingskontroller (DEAB-kontroll, ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7, 7AAD), det negative kontrollrøret (farget med DEAB, CD44-PE, CD24-PE-Cy7 og 7AAD), fluorescerende minus en (FMO) kontroll og "sort" -røret (farget med ALDH, CD44, CD24 og 7AAD).
  2. Overfør 500 μL (0,5 x 106 celler) av cellesuspensjonene fra trinn 3.5 eller trinn 4.5 til hvert rør som bare er merket med celler, CD44, CD24 og 7AAD. Legg rørene på is til bruk.
  3. Overfør 2 ml prøve (2 x 106 celler) til respektive 'ALDH' rør. Tilsett 5 μL DEAB i slangene 'DEAB-kontroll' og 'negativ kontroll' og dekk den godt. Tilsett 10 μL ALDH-substrat til 'ALDH'-røret, bland godt ved virvel, og overfør umiddelbart 500 μL til tilsvarende 'DEAB-kontroll' og 'negativ kontroll'-rør. Oppsummere 'DEAB-kontroll', 'negativ kontroll' og 'ALDH-rør' og inkuber ved 37 °C i 30-60 minutter (ikke overskrid 60 minutter).
    MERK: Den optimale inkubasjonstiden kan kreve optimalisering avhengig av cellelinjen. Beskytt alltid ALDH-substratet og rørene som inneholder fargede celler mot lys.
  4. Etter inkubasjon, sentrifuger alle prøver i 5 minutter ved 250 x g. Resuspend cellene i 500 μL ALDH substratbuffer. Legg til produsent-anbefalt eller brukeroptimalisert konsentrasjon av anti-CD44-PE og anti-CD24-PE-Cy7 antistoffcocktail og inkuber ved 4 ° C i 30 minutter. Tilsett anti-CD44-PE og anti-CD24-PE-Cy7 antistoffer til respektive 'CD44' og 'CD24' merkede rør.
  5. Etter inkubasjon, sentrifuger alle prøver ved 250 x g i 5 minutter. Resuspend cellene i 500 μL ALDH substratbuffer. Inkuber 'negativ kontroll'-røret, 'Sorter rør' og '7ADD'-røret med 7AAD (foreslått konsentrasjon: 0,25 μg/1 x 106 celler) i 10 minutter på is.
    MERK: ALDH-aktiviteten oppdages i den grønne fluorescerende kanalen, derfor bør en fluorokrom med et annet kompatibelt utslippsspektrum brukes. Når spektral overlapping observeres under multiparameterstrømcytometri, bør enkeltfargekontroller og FMO-kontroll brukes som en veiledning for å tillate kompensasjon mellom fluorokromer for å minimere utslipp av fluorescerende signal til andre kanaler.
  6. Sett opp analyseprotokollen på FACS-instrumentet som forberedelse til prøveanalyse. Opprett spredningsplott (fremover mot side scatter, fremover scatter vs fluorescerende kanaler).
  7. Bruk den ufargede kontrollen, juster fotomultiplikatoren for å skille rusk fra hele cellepopulasjonen og juster fluorescerende spenning for å flytte hele cellepopulasjonen rundt den første loggskalaen (101). Bruk DEAB-kontrollen til å flytte hele cellepopulasjonen innenfor den andre loggskalaen (102) ved å justere den grønne fluorescerende spenningskanalen.
  8. Analyser alle de enkle fargekontrollene først (ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7) og 7AAD og FMO-kontroll, juster spenningen for å skille farget fra ufargede celler og for å minimere søl av fluorescerende signaler i andre kanaler.
  9. Gate på den positive populasjonen for hver enkelt farget celleprøve. Ved bruk av negativt kontrollrør, port for levedyktighet (7AAD negativ), ALDHlav og ALDHhøy cellepopulasjoner (representativ gating strategi vist i figur 1B).
  10. Analyser multiparameter fargede prøver av interesse for å isolere BCSCs. Bruk de levedyktige ALDHlave og ALDHhøye portene, velg for henholdsvis CD44 + CD24- (BCSC) og CD44-CD24 + (ikke-BCSC) cellepopulasjon (figur 1B).
  11. Samle levedyktige BCSC-er og ikke-BCSC-er i innsamlingsmedier i sterile oppsamlingsrør (populasjoner fra to representative cellelinjer vist i figur 2A&B). Bruk sorterte celler til nedstrøms in vitro og in vivo analyser som beskrevet nedenfor.
    MERK: I tillegg til in vitro og in vivo analyser beskrevet nedenfor, kan BCSC-er valideres ved å måle uttrykket av pluripotente markører som SOX2, OCT4 og NANOG via standard immunoblottingsteknikker.

Figure 1
Figur 1: FACS gating strategi for isolering av BCSC fra brystkreft cellelinjer og vevsprøver. (A) Flytskjema som beskriver prosedyren for BCSC-isolasjon. (B) Representative FACS-plott som viser sorteringsstrategien som brukes til å isolere levedyktige BCSC-er og ikke-BCSC-er fra et heterogent basseng av celler. MDA-MB-231 humane brystkreftceller er samtidig merket med 7-AAD, CD44-APC, CD24-PE og ALDH-substratet. Celleundergrupper ble isolert ved hjelp av en firefarget protokoll på en FACS-maskin. Celler velges basert på forventet lysspredning, deretter for singletter, og levedyktighet basert på 7-AAD-ekskludering. Celler blir deretter analysert for ALDH-aktivitet, og de øverste 20% mest positive er valgt som ALDHhøy befolkning, mens de nederste 20% av cellene med lavest ALDH-aktivitet ble ansett å være ALDHlave. Til slutt velges 50% av ALDH-lavcellene videre basert på en CD44 lav/-CD24+ fenotype, og 50% av ALDH-høycellene velges basert på CD44+CD24-fenotype. Dette tallet er tilpasset fra Chu et al.17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: BCSC-proporsjoner er variable i forskjellige brystkreftcellelinjer. Representativt bilde som viser differensiell andel av BCSC-er og ikke-BCSC-er i (A) SUM159 og (B) MDA-MD-468 trippel negative brystkreftcellelinjer etter merking og sortering som beskrevet i figur 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Kolonidannende analyse

  1. Gjenoppta interessecellene (sorterte celler fra trinn 5.11 eller usorterte celler fra trinn 3.5 eller 4.5) i fullstendige medier.
  2. Merk tre strømningsrør for 1 x 10 2, 2 x 10 2 og 5 x 102 celler. Legg til 2 ml komplett medium og overfør riktig cellenummer (sortert fra trinn 5.11 eller usorterte celler fra trinn 3.5 eller 4.5) i respektive rør. Bland celleoppløsningene grundig ved å pipettere den opp og ned 5 ganger.
  3. Plate cellene i en 6-brønns plate og fordel cellesuspensjonen ved å forsiktig virvle platene for å oppnå jevn fordeling av celler.
  4. Inkuber platene i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator til kolonier vises (hvor kolonier = ≥50 celler per koloni). Fyll forsiktig på media to ganger i uken uten å forstyrre kolonidannelsen.
  5. Aspirer media og vask en gang med 1 ml PBS. Tilsett 0,5 ml 0,05% krystallfiolett løsning i hver brønn og inkuber platen i 30 minutter. Fjern overflødig krystallfiolett flekk ved å vaske med 2 ml vann. Gjenta vasketrinnet til bakgrunnsfargingen er fjernet.
  6. Ved hjelp av et mikroskop ved 4x og 10x forstørrelse, telle og registrere det totale antallet kolonier generert (representative bilder vist i figur 3A).
  7. Beregn frekvensen av kolonidannelse som følger: Frekvens (%) = (# av kolonier dannet / antall celler frøet) x 100. For eksempel, hvis 25 kolonier genereres fra 1 x 102 celler, er frekvensen av kolonidannelse, Frekvens = (25/100) x100 = 25%.
  8. Alternativt kan du erstatte trinn 6.1 til 6.4 med en alternativ metode som involverer samkultur med fibroblaster, som gir en mikromiljøstøtte for BCSC-er gjennom produksjon av nødvendige vekst- og overlevelsesfaktorer.
  9. Pre-coat celle 60 mm kultur retter med type I storfe kollagen (1 i 30 fortynning av 3 mg / ml kollagen). La kollagen polymerisere i 30 minutter i en 37 °C inkubator. Aspirer det upolymeriserte kollagenet og vask platen to ganger med 1x PBS. Dekk den kollagenbelagte platen med 1 ml PBS og sett den til side ved romtemperatur til bruk.
  10. Merk tre strømningsrør for 1 x 10 3, 5 x 103 og 1 x 104 celler. Tilsett 4 ml kolonidannende analysemedier og overfør riktig antall celler (sortert fra trinn 5.11 eller usorterte celler fra trinn 3.5 eller 4.5) til de respektive rørene. Tilsett bestrålt mus NIH3T3 fibroblaster (4 x 104 celler/ml medier). Bland celleløsninger grundig ved å pipettere den opp og ned 5 ganger.
  11. Aspirer PBS fra kollagenbelagt kulturskål fra trinn 6.1 og plate celleblandingen på hver av cellekulturplatene som beskrevet i trinn 6.3.
  12. Inkuber platene i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator og la dem stå uforstyrret i 7-10 dager eller til kolonier dannes, uten å fylle på mediet. Tell og registrer det totale antallet kolonier generert som beskrevet i trinn 6.6 og 6.7.

7. Mammosphere analyse

  1. Resuspend cellene av interesse (sorterte celler fra trinn 5.11 eller usorterte celler fra trinn 3.5 eller 4.5) i komplette mammosfæremedier og plateceller ved en sådensitet på 5 x 102 celler / cm2 område i en 96 brønn ultra-lav festecellekulturplate.
    MERK: Cellesåtetthet bør optimaliseres for forskjellige cellelinjer.
  2. Inkuber kulturplatene i 5-10 dager i en 37 °C inkubator med 5 % CO2. Fyll forsiktig på media to ganger i uken uten å forstyrre mammosfæredannelsen.
  3. Etter inkubasjon, telle antall mammosfærer generert i hver brønn ved hjelp av et mikroskop; hvor mammosfærene er definert som brystkreftcelleklynger større enn 100 μm i diameter (representative bilder vist i figur 3B).
  4. Beregn mammosfærens formasjonseffektivitet (MFE) som følger: MFE (%) = (antall mammosfærer per brønn) / (antall celler sådd per brønn) x 100 (dvs. hvis 5 mammosfærer genereres av 1 x 102 celler i en brønn, så MFE = (5/100) x 100 = 5%).
  5. For å subkulturere mammosfærer, overfør forsiktig mediet som inneholder mammosfæreinnhold til et nytt 50 ml konisk rør og sentrifugemedium ved 1000 x g i 5 minutter. Fjern forsiktig supernatanten, resuspend cellepelleten i 500 μL trypsin, og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
  6. Kast supernatanten og resuspend pelleten i 1 ml komplett mammosfæremedium. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og re-plate cellene i en ultra-lav vedlegg cellekultur plate som beskrevet i trinn 7.1.
    MERK: I tillegg til subkulturering kan mammosfæreavledede celler også analyseres videre av FACS for å vurdere BCSC-fenotype og / eller oppnå rene populasjoner av BCSC-er for andre nedstrømsanalyser.
  7. For å bestemme antall mammosfæreinitierende celler som finnes i cellepopulasjonene dine, bruk en alternativ metode som involverer sfærebegrensende fortynningsanalyse (SLDA). Plateceller i serielle fortynninger av høye til lave celletall i en 96-brønns ultra-lav festecellekulturplate, med den høyeste fortynningen som resulterer i mindre enn en celle per brønn.
  8. Inkuber kulturplaten i 10-14 dager i en 37 °C inkubator med 5% CO2 og la dem stå uforstyrret for å unngå celleaggregering.
  9. Etter inkubasjon, telle antall mammosfærer generert i hver brønn ved hjelp av et mikroskop; hvor mammosfærer er definert som brystkreftcelleklynger større enn 100 μm i diameter. Beregn sfæreinitierende frekvens og betydning ved hjelp av Extreme Limiting Dilution Analysis (ELDA) online programvare (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).

8.3D kulturmodell

  1. Avhengig av det eksperimentelle spørsmålet, bruk kjellermembranekstrakt (BME) med eller uten vekstfaktorer (redusert). For å evaluere effekten av individuell vekstfaktor på kreftceller, bruk vekstfaktor redusert BME. Det hjelper også med å minimere de ikke-spesifikke effektene av endogene vekstfaktorer som er tilstede i BME.
    MERK: BME stivner over 10 °C. Hold alltid BME på is selv under opptiningstrinnet.
  2. Tilsett forsiktig 50 μL BME per brønn i en 96-brønnsplate uten å skape luftbobler og la den polymerisere ved 37 ° C i 1 time. Etter 10 minutters inkubasjon, tilsett 100 μL PBS for å unngå tørking av gellaget.
  3. Resuspendere de sorterte cellene fra trinn 5.11 eller usorterte celler fra trinn 3.5 eller 4.5 ved en konsentrasjon på 5 x 103 til 5 x 104/200 μL i 3D-kulturmedier.
  4. Når BME har polymerisert, fjern PBS, tilsett 200 μL cellesuspensjon til hver brønn og inkuber i 37 ° C inkubator med 5% CO2. Tilsett PBS i de omkringliggende brønnene for å unngå fordampning av mediet.
    MERK: Det optimale antall celler for plating bør bestemmes før forsøket settes inn. Avhengig av det eksperimentelle spørsmålet, kan BCSC dyrkes alene eller sammen med andre celletyper (fibroblaster / endotel / immunceller etc.).
  5. Legg ferske medier til kulturplatene to ganger i uken. Opprettholde kulturer i 10-14 dager før du analyserer dannelsen av organoider (representative bilder vist i figur 3C).
  6. For subkulturering, aspirer forsiktig mediet og tilsett 200 μL dispase til hver brønnholdig celle. Inkuber platen i en 37 °C inkubator i 1 time. Halvveis i inkubasjonsperioden (30 min), ta ut platen, pipetter forsiktig spalteløsningen opp og ned 5 ganger, og sett tilbake i inkubatoren i ytterligere 30 minutter.
  7. Etter 1 time, overfør den dissosierte celleoppløsningen til et strømningsrør. Vask brønnen med 1x PBS som inneholder 2% FBS (fPBS) og overfør den til strømningsrøret. Sentrifuge røret ved 1000 x g i 5 minutter. Aspirer supernatanten forsiktig og tilsett 500 μL trypsin, inkuber ved 37 °C i 5 minutter. Inaktiver trypsin ved å tilsette like mye fPBS og sentrifuge ved 1000 x g i 5 minutter.
  8. Kast supernatanten og resuspend pelleten i 1 ml 3D-kulturmedier. Tell cellene og re-plate nødvendig antall celler i BME som i trinn 8.2 til 8.4.
    MERK: Flere brønner kan samles for å analysere eller sortere cellepopulasjonen av interesse ytterligere.

Figure 3
Figur 3: In vitro-analyser for å vurdere BCSC-cellefunksjonen. In vitro-analyser ble utført som beskrevet i protokollavsnittene 6.1 til 6.5 (A), 7.1 til 7.4 (B) eller 81. til 8,4 + 8,6 (C). (A) Representativt bilde som viser koloniene generert av MDA-MB-231 humane brystkreftceller; (B) Representative bilder som viser mammosfæredannelse av MCF7, SUM159 eller MDA-MB-468 humane cellelinjer samt pasientavledede LRCP17 brystkreftceller. (C) Representative bilder som viser 3D-strukturer dannet av MCF7 og MDA-MB-231 brystkreftceller i 3D-kulturer modeller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MERK: Utfør dyreforsøk under en dyreetikkprotokoll godkjent av institusjonens dyrepleieutvalg.

9. In vivo xenograft-modell

  1. For å bestemme tumorinitieringskapasiteten til brystkreftstamceller, forberede celler (sortert populasjon fra trinn 5.7 eller usorterte populasjoner fra trinn 3.5 eller 4.5) ved hjelp av en begrensende fortynningsmetode. Serialt fortynnede celler i PBS ved bruk av mellom 1 og 5 forskjellige fortynningsgrupper, med doser så lave som 0,01-0,2 x 102 celler/100 μL og så høye som 1 x 106 celler/100 μL.
    Usorterte/hele populasjonsceller kan brukes som en kontroll. Antall fortynningsgrupper som brukes vil avhenge av det ønskede vitenskapelige resultatet (f.eks. Hvis man bare tester tumorgenisitet, kan 1 gruppe ved et høyere cellenummer brukes, mens ved beregning av tumorinitierende kapasitet er det optimalt å teste 5 begrensende fortynningsdoser).
  2. For å generere xenograftmodeller fra humane brystkreftceller, bruk immunkompromitterte kvinnelige mus (akymisk naken [nu / nu], ikke-overvektig diabetiker / alvorlig kombinert immunsvikt [NOD / SCID] eller NOD / SCID IL2γ [NGS] stammer).
    MERK: Selv om minimum 4 dyr per gruppe kan brukes, anbefales 8-12 dyr per gruppe for å oppnå robuste resultater, spesielt for å begrense fortynningsanalyse.
  3. Utfør standard injeksjoner av brystfettpute (MFP) ved bruk av 100 μL / mus av hvert cellepreparat, under sterile forhold i et biosikkerhetsskap.
    MERK: For optimal brysttumorvekst og spontan metastase til fjerne organer, anbefales thorax MFP. Alternativt kan inguinal MFP også brukes.
  4. Etter injeksjon, overvåk musene daglig for generell helse og tumorvekst på injeksjonsstedet. Ved påvisning av en palpabel svulst, begynn å måle tumorstørrelsen med kalipere i to vinkelrette dimensjoner og ta opp ukentlig til endepunktet.
    MERK: Det eksperimentelle sluttpunktet bestemmes basert på regelverket som er fastsatt i den institusjonelle dyreetikkprotokollen; Vanligvis er endepunkt ved eutanasi vanligvis nødvendig når tumorvolumene når 1500 mm3. For BCSC-populasjoner og/eller høyere celledoser (f.eks. >1 x 104 celler) vil dette endepunktet sannsynligvis nås innen 4-8 uker etter MFP-injeksjon. For svært lave celledoser og/eller ikke-BCSC-cellepopulasjoner, bør tumorvekst få lov til å utvikle seg i opptil 8 måneder etter injeksjon.
  5. Fra disse målingene beregner du tumorvolumet ved hjelp av følgende formel: Volum i mm3 = 0, 52 x (bredde) 2 x lengde. Hvis du bruker en begrensende fortynningsmetode, beregner du tumorinitierende kapasitet og betydning ved hjelp av ELDA online programvare (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).
  6. Alternativt, for å humant utvide endepunktet, kirurgisk fjerne primære svulster og fortsette å overvåke mus for helse og / eller utvikling av spontan metastase i fjerne organer. Bruk resektert tumorvev for generering av serielle xenotransplantasjoner.
  7. Ved endepunkt høstes vev fra primære svulster og fjerne organer (lymfeknuter, lunge, lever, hjerne, bein) og utfører histopatologisk og/eller immunhistokjemisk analyse eller dissosierer tumorvevet og bruk i in vitro-analysene beskrevet i avsnitt 6-8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den beskrevne protokollen tillater isolering av humane BCSC-er fra en heterogen populasjon av brystkreftceller, enten fra cellelinjer eller fra dissosiert tumorvev. For en gitt cellelinje eller vevsprøve er det avgjørende å generere en jevn enkeltcellesuspensjon for å isolere BCSC-er ved maksimal renhet, da forurensende ikke-BCSC-populasjoner kan resultere i variable cellulære responser, spesielt hvis studiemålet er å evaluere effekten av terapeutiske midler rettet mot BCSC. Bruk av en streng sorteringsstrategi vil minimere tilstedeværelsen av forurensende ikke-BCSC-er og resultere i evnen til å samle andelen brystkreftceller med stamcellelignende egenskaper som viser en cellulær fenotype som skiller dem fra bulkpopulasjonen av kreftceller. Humane brystkreftceller som utviser forbedret ALDH enzymatisk aktivitet, uttrykker høye nivåer av celleoverflatemarkøren CD44, og lavt / negativt uttrykk for CD24 har en ALDHhøyCD44 + CD24- fenotype og kan klassifiseres som BCSCs. Andelen BCSC-er i bulkpopulasjonen kan variere mellom cellelinjer eller pasienter (figur 2), og avhenger ofte av sykdomsstadiet, med mer aggressiv brystkreft som vanligvis viser en høyere andel BCSCs26,36,37.

Isolerte BCSC-er kan brukes til å utføre forskjellige in vitro - og in vivo-analyser der deres oppførsel og funksjon kan sammenlignes med masse- og/eller ikke-BCSC-populasjonene. For eksempel kan evnen til en enkelt brystkreftcelle til selvfornyelse og generere kolonier på 50 celler vurderes ved kolonidannende analyser (figur 3A). BCSC's evne til selvfornyelse under forankringsuavhengige eksperimentelle forhold kan vurderes ved mammosfæreanalyser, hvor variabelt kulenummer, størrelse og sfæreinitierende kapasitet kan analyseres og korreleres med BCSC's tilstedeværelse og funksjon (figur 3B). Det er viktig å bestemme såcelletetthetene for forskjellige brystkreftcellelinjer eller brysttumorprøver for å oppnå optimale resultater. Dette er spesielt viktig når du utfører SLDA, da høyere celletettheter kan føre til celleaggregering som resulterer i feiltolkning av cellulær aktivitet.

Dyrking av brystkreftceller i BME gjør det mulig for BCSC-er å danne 3D-strukturer som rekapitulerer in vivo-forhold (figur 3C). 3D-kultur av brystkreftceller i nærvær av andre mikromiljøcelletyper som fibroblaster, endotelceller og / eller immunceller har ekstra kapasitet til å undersøke mikromiljøets rolle i 3D-vekst av BCSCs38,39. De spesifikke cellenumrene som kreves for å generere 3D-organoider, kan variere avhengig av cellelinjen eller pasientens tumorkilde, og det er derfor viktig å optimalisere kulturforholdene og celletallene før noen store eksperimenter.

Endelig kan in vivo mus xenograftmodeller brukes til å forstå forskjellene i vekst (figur 4) selvfornyelse, differensiering og / eller tumorinitierende evne til BCSC in vivo sammenlignet med ikke-BCSC- eller bulkcellepopulasjoner. De in vitro cellulære responsene observert i nærvær av eksogene faktorer eller terapeutiske midler er ofte ikke representative for in vivo-innstilling, noe som tyder på at in vitro-observasjon bør suppleres med in vivo-studier når det er mulig. Ved hjelp av in vivo xenograft-modeller bevares den cellulære heterogeniteten og tumorarkitekturen, og dermed kan disse modellene tjene som et system som nøye etterligner mikromiljøet hos menneskelige pasienter. In vivo LDA kan utføres for å bestemme andelen tumorinitierende celler i en gitt blandet populasjon av kreftceller (BCSC eller ikke-BCSCs) 40,41. Utvalget av cellefortynninger som brukes bør optimaliseres og vil avhenge av hyppigheten av initierende celler i cellepopulasjonen av interesse. Ideelt sett bør disse fortynningene inkludere doser som resulterer i 100% tumordannelse, ned til celledoser uten tumordannelse og et rimelig utvalg i mellom. Hyppigheten av tumorinitierende celler i primærprøver kan variere, og i tilfeller der brysttumorer har svært lavt antall eller heterogene populasjoner av tumorinitierende celler, kan det være spesielt utfordrende å utføre LDA42. I disse tilfellene vil injeksjon av større antall celler være mer hensiktsmessig for å forstå brystkreftbiologi.

Figure 4
Figur 4: In vivo xenograftanalyser for å vurdere BCSC-funksjonen. MDA-MB-231 brystkreftceller ble isolert av FACS som beskrevet i figur 1 og injisert i høyre brystbrystfettpute hos kvinnelige NSG-mus som beskrevet i protokollavsnitt 9.1 til 9.8 (5 x 105 celler/mus; 4 mus/cellepopulasjon). Primær brysttumorvekstkinetikk er vist for ALDHhiCD44 + CD24- (■) versus ALDH lav CD44lav/ -CD24 + (□) populasjoner. Data representert som gjennomsnittlig ± S.E.M. * = signifikant forskjellig tumorstørrelse enn respektive ALDH lav CD44lav/- delmengde på samme tidspunkt (P < 0,05). Denne figuren er tilpasset fra Croker et al.26. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Brystkreftmetastase og motstand mot terapi har blitt en viktig årsak til dødelighet hos kvinner over hele verden. Eksistensen av en underpopulasjon av brystkreftstamceller (BCSC) bidrar til forbedret metastase 26,43,44,45,46 og terapiresistens 21,47,48. Derfor bør fokuset på fremtidige behandlinger ta sikte på å utrydde BCSC for å oppnå bedre behandlingsresultater, og dette krever nøyaktige metoder for å isolere og karakterisere de funksjonelle egenskapene til BCSC ved bruk av både in vitro og in vivo metoder.

Udødeliggjorte cellelinjer avledet fra forskjellige subtyper av brystkreft har vist seg å være gjennomførbare modeller for å studere brystkreftbiologi, inkludert isolasjon og karakterisering av BCSCs 26,49,50. Den høye proliferative kapasiteten og ubegrensede ekspansjonsevnen til cellelinjer gir et ideelt modellsystem for å utføre studier som er svært reproduserbare og teknisk enkle. På grunn av den klonale opprinnelsen til cellelinjer kan de imidlertid ikke rekapitulere heterogeniteten som utvises av forskjellige pasienter og / eller av kreftceller i tumorvev. I tillegg kan genetiske endringer oppnås under seriell passering av cellelinjer og kan indusere genotypiske eller fenotypiske endringer som kan forvirre eksperimentelle resultater51. I motsetning til dette kan primære pasientavledede celler, til tross for deres begrensede proliferative og ekspansjonsevne, gi en mer nøyaktig modell til den som observeres in vivo. Slike prøver kan imidlertid være vanskeligere å skaffe og være mer teknisk utfordrende å jobbe med. Alle disse faktorene bør vurderes når du velger et startmodellsystem for å isolere og karakterisere BCSC-er.

FACS er en vanlig teknikk for å isolere celler av interesse basert på celleoverflatemarkøruttrykk52,53. Basert på celleoverflateantigener (CD44 og CD24) og ALDH enzymatisk aktivitet, kan humane BCSC-er isoleres ved høy renhet fra både brystkreftcellelinjer og tumorvev 1,2. Sorteringseffektiviteten bestemmer renheten til sortert prøve, og det anbefales at brukerne analyserer en liten del av sortert prøve inkubert med levedyktighetsfargestoff for å kontrollere effektiviteten av sortering53,54. Sorteringseffektiviteten kan forveksles av mange faktorer, inkludert tilstedeværelse av celleklumper, et høyt antall døde eller døende celler, feil kompensasjon av fluorokromene og / eller skade på celleoverflateantigener på grunn av følsomhet for trypsin eller kollagenase under dissosiasjonstrinn før sortering 53,54,55,56 . Derfor vil generering av en riktig enkeltcellesuspensjon og bruk av passende celledissosiasjonsteknikker øke sorteringseffektiviteten. Mens du utfører multiparametercellesortering, er det viktig å velge fluorokromer som minimerer spektral overlapping. I noen tilfeller, der spektral overlapping ikke kan unngås, bør en kontroll som inneholder alle fluorokromene unntatt en (fluorescens minus en, FMO) brukes til å minimere spillover av fluorescerende signaler til andre kanaler54. Alternativt kan spektraloverlappingen reduseres ved immunmagnetisk isolerende cellepopulasjoner før endelig FACS-isolering av celler av interesse56.

In vitro-analyser som kolonidannende og mammosfæreanalyser beskrevet i denne protokollen har blitt mye brukt til å studere selvfornyelsen og proliferativ evne til BCSCs 57,58,59,60,61,62. I tillegg kan disse analysene brukes til å vurdere aktiviteten til forskjellige terapeutiske legemidler på BCSC-funksjonen. Flere evolusjonært konserverte signalveier er implementert i BCSC-vedlikehold 63, og både kolonidannende 64,65,66 og mammosfæreanalyser64,67 har blitt brukt til å vurdere verdien av terapeutisk forstyrrelse av disse veiene som et inngrep for å blokkere BCSC-iboende signalering og redusere BCSC-aktivitet og sykdomsprogresjon. Kolonidannende analyse ved hjelp av primære celler kan være utfordrende på grunn av lav celletetthet, variasjon mellom prøver og mangel på tilpasningsevne til isolerte in vitro-forhold. Disse utfordringene kan overvinnes ved å dyrke BCSC-er på et mykt agarlag eller ved å coculturere dem med fibroblaster på en kollagenbelagt cellekulturskål68,69,70. I tillegg kan supplere vekstfaktorer i kulturmediene (som FGF771) også forbedre kolonidannende evne til celler isolert fra vevsprøver. I tillegg kan overfordøyelse av vev ved bruk av kollagenase eller trypsin under enkeltcellesuspensjonsgenereringstrinn resultere i lav til null kolonidannende evne og redusere mammosfæredannende effektivitet31. I begge analysene bør det tas hensyn til å inkubere analyseplatene uforstyrret for å unngå forstyrrelse av koloni- eller kulestrukturer når de dannes. Det anbefales også at brukerne forlenger inkubasjonsperioden for primære celler (i forhold til cellelinjer), da det kan ta lengre tid for disse cellene å danne kolonier eller kuler.

Flere bevislinjer har vist den kritiske rollen til ekstracellulær matrise (ECM) 15,17,72 og stromale komponenter, som fibroblaster, immunceller, endotelceller og adipocytter for å påvirke BCSC-funksjoner 15. Dermed kan 3D-kulturmodellen vi beskriver i denne protokollen gi et nyttig eksperimentelt system for å bidra til å rekapitulere in vivo tumormikromiljøet i en in vitro-setting. Selv om 3D-kultursystemet ligner tumormikromiljøet hos kreftpasienter, kan langsiktig vedlikehold av celler som organoider være vanskelig. I tillegg er optimalisering av 3D-kulturforholdene og evnen til å nøyaktig undersøke selvfornyelses- og differensieringsevnen til BCSC-er utfordrende73. Effektiviteten av organoider dannet i 3D-kultursystemet avhenger av vekstfaktorene som suppleres i kulturmediet74. Fravær av nøkkelkomponenter (for eksempel ROCK-hemmer) kan føre til redusert eller ingen organoiddannelse74. Media bør fylles på hver 3-4 dag for å opprettholde optimal cellulær funksjon og bærekraften til kulturen. For å rekapitulere in vivo tilstander og respons, er det alltid viktig å la cellene danne organoider før noen form for eksogen behandling75. Celler avledet fra pasientprøver bør gi tilstrekkelig tid til å danne organoider, spesielt hvis målet er å evaluere legemiddelrespons75.

Selv om disse in vitro-metodene er attraktive og tilgjengelige eksperimentelle verktøy for å karakterisere BCSC-funksjon, kan tumor heterogenitet og effekten av tumormikromiljø på BCSC-oppførsel ikke studeres med fullstendig effektivitet. Disse in vitro-analysene bør derfor suppleres med in vivo xenograftmodeller når det er mulig for ytterligere å validere eksperimentelle funn relatert til BSCS-biologi og/eller respons på nye terapier. Ulike in vivo-modeller har blitt brukt til å studere BCSC-tumorigenitet og metastase. Ektopiske (subkutan engraftment) og ortotopisk (MFP-engraftment) musemodeller har blitt brukt til å generere brysttumorer og vurdere langsgående endringer i tumorvekst over tid50. Selv om begge in vivo injeksjonsmetoder kan brukes til å studere BCSC-biologi, tillater de innfødte stromale og vaskulaturrelaterte komponentene i MFP mer nøyaktig rekapitulering av primær brysttumorprogresjon som observert hos pasienter, og dermed foretrekkes MFP-injeksjon76,77,78. Endelig er bruk av immunkompromitterte mus nødvendig for innkapsling av humane BCSC-er og tumorvekst, og dette forhindrer inkorporering av immuncellers rolle i tumorigenese- og metastasestudier79. Mer nylig har denne begrensningen blitt adressert gjennom bruk av humaniserte mus der et humant immunsystem rekonstitueres via benmargstransplantasjon før oppstart av xenograftstudier80,81,82. Imidlertid er disse modellene dyre og teknisk utfordrende, og er dermed fortsatt ikke vanlig brukt83.

Oppsummert har vi her gitt en protokoll for isolering av humane BCSC-er fra både brystkreftcellelinjer og pasientavledede tumorvevsprøver. Vi har også beskrevet in vitro og in vivo protokoller for nedstrøms analyser som kan brukes til å studere BCSC-funksjon, med evnen til å bli optimalisert for forskjellige brystkreftcellekilder og fleksibiliteten som skal utføres under forskjellige eksperimentelle forhold. Disse protokollene vil være nyttige for etterforskere som er interessert i kreftstamceller, brystkreftbiologi og terapeutisk utvikling, med det endelige målet å forbedre pasientresultatene i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av laboratoriet vårt for deres nyttige diskusjoner og støtte. Vår forskning på brystkreft stamceller og tumor mikromiljøet er finansiert av tilskudd fra Canadian Cancer Research Society Research Institute og US Army Department of Defense Breast Cancer Program (Grant # BC160912). VB støttes av et Western Postdoctoral Fellowship (Western University), og både ALA og VB støttes av Breast Cancer Society of Canada. CL støttes av et Vanier Canada Graduate Scholarship fra Canadas regjering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Aminoactinomycin D (7AAD) BD 51-68981E suggested: 0.25 µg/1x106 cells
Acetone Fisher A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME) Corning 354234 Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well Corning 877218
Cell culture plates: 60mm Corning 353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment Corning 3474
Cell strainer: 40 micron BD 352340
Collagen Stemcell Technologies 7001 Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase Sigma 11088807001 1x
Conical tubes: 50 mL Fisher scientific 05-539-7
Crystal violet Sigma C6158 Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase Stemcell Technologies 7913 5U/mL
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse Sigma D5052 0.1 mg/mL final concentration
FBS Avantor Seradigm Lifescience 97068-085  
Flow tubes: 5ml BD 352063 Polypropylene round-bottom tubes
Methanol Fisher 84124
mouse anti-Human CD24 antibody BD 561646 R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody BD 555479 R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) Stemcell Technologies 1700 Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS Wisent Inc 311-425-CL 1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Mammosphere Media Composition
B27 Gibco 17504-44 1x
bFGF Sigma F2006 10 ng/mL
BSA Bioshop ALB003 04%
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 20 ng/mL
Insulin Sigma 16634 5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301 Tocris 2939 500 nM
B27 Gibco 17504-44 1x
DMEM:F12 Gibco 11330-032 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF Sigma E9644 5 ng/mL
FGF10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMax Invitrogen 35050-061 1x
HEPES Gibco 15630-080 10 mM
N-acetylcysteine Sigma A9165 1.25 mM
Neuregulin β1 Peprotech 100-03 5 nM
Nicotinamide Sigma N0636 5 mM
Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
R-spondin3 R&D 3500 250 ng/mL
SB202190 Sigma S7067 500 nM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  2. Shipitsin, M., et al. Molecular definition of breast tumor heterogeneity. Cancer Cell. 11 (3), 259-273 (2007).
  3. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  4. Sulaiman, A., et al. Dual inhibition of Wnt and Yes-associated protein signaling retards the growth of triple-negative breast cancer in both mesenchymal and epithelial states. Molecular Oncology. 12 (4), 423-440 (2018).
  5. Debeb, B. G., et al. Histone deacetylase inhibitors stimulate dedifferentiation of human breast cancer cells through WNT/β-catenin signaling. Stem Cells. 30 (11), 2366-2377 (2012).
  6. Klutzny, S., et al. PDE5 inhibition eliminates cancer stem cells via induction of PKA signaling. Cell Death & Disease. 9 (2), 192 (2018).
  7. DiMeo, T. A., et al. A novel lung metastasis signature links Wnt signaling with cancer cell self-renewal and epithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancer. Cancer Research. 69 (13), 5364-5373 (2009).
  8. Liu, C. C., Prior, J., Piwnica-Worms, D., Bu, G. LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (11), 5136-5141 (2010).
  9. Miller-Kleinhenz, J., et al. Dual-targeting Wnt and uPA receptors using peptide conjugated ultra-small nanoparticle drug carriers inhibited cancer stem-cell phenotype in chemo-resistant breast cancer. Biomaterials. 152, 47-62 (2018).
  10. Mamaeva, V., et al. Inhibiting Notch Activity in Breast Cancer Stem Cells by Glucose Functionalized Nanoparticles Carrying γ-secretase Inhibitors. Molecular Therapy. 24 (5), 926-936 (2016).
  11. Ithimakin, S., et al. HER2 drives luminal breast cancer stem cells in the absence of HER2 amplification: implications for efficacy of adjuvant trastuzumab. Cancer Research. 73 (5), 1635-1646 (2013).
  12. Koike, Y., et al. Anti-cell growth and anti-cancer stem cell activities of the non-canonical hedgehog inhibitor GANT61 in triple-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 24 (5), 683-693 (2017).
  13. Sun, Y., et al. Estrogen promotes stemness and invasiveness of ER-positive breast cancer cells through Gli1 activation. Molecular Cancer. 13, 137 (2014).
  14. Colavito, S. A., Zou, M. R., Yan, Q., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) expression in claudin-low breast cancer and crosstalk with the nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB) pathway. Breast Cancer Research. 16 (5), 444 (2014).
  15. Bhat, V., Allan, A. L., Raouf, A. Role of the Microenvironment in Regulating Normal and Cancer Stem Cell Activity: Implications for Breast Cancer Progression and Therapy Response. Cancers. 11 (9), (2019).
  16. Pio, G. M., Xia, Y., Piaseczny, M. M., Chu, J. E., Allan, A. L. Soluble bone-derived osteopontin promotes migration and stem-like behavior of breast cancer cells. PloS One. 12 (5), 0177640 (2017).
  17. Chu, J. E., et al. Lung-derived factors mediate breast cancer cell migration through CD44 receptor-ligand interactions in a novel ex vivo system for analysis of organ-specific soluble proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-191 (2014).
  18. McGowan, P. M., et al. Notch1 inhibition alters the CD44hi/CD24lo population and reduces the formation of brain metastases from breast cancer. Molecular Cancer Research. 9 (7), 834-844 (2011).
  19. Mao, J., et al. ShRNA targeting Notch1 sensitizes breast cancer stem cell to paclitaxel. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (6), 1064-1073 (2013).
  20. Duru, N., et al. HER2-associated radioresistance of breast cancer stem cells isolated from HER2-negative breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6634-6647 (2012).
  21. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  22. Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13820-13825 (2009).
  23. Calcagno, A. M., et al. Prolonged drug selection of breast cancer cells and enrichment of cancer stem cell characteristics. Journal of the National Cancer Institute. 102 (21), 1637-1652 (2010).
  24. Feng, Y., et al. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis. 5 (2), 77-106 (2018).
  25. Samanta, D., Gilkes, D. M., Chaturvedi, P., Xiang, L., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors are required for chemotherapy resistance of breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5429-5438 (2014).
  26. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8), 2236-2252 (2009).
  27. Morel, A. P., et al. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PloS One. 3 (8), 2888 (2008).
  28. Muntimadugu, E., Kumar, R., Saladi, S., Rafeeqi, T. A., Khan, W. CD44 targeted chemotherapy for co-eradication of breast cancer stem cells and cancer cells using polymeric nanoparticles of salinomycin and paclitaxel. Colloids Surf B Biointerfaces. 143, 532-546 (2016).
  29. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  30. Munshi, A., Hobbs, M., Meyn, R. E. Clonogenic cell survival assay. Methods in Molecular Medicine. 110, 21-28 (2005).
  31. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  32. Shin, C. S., Kwak, B., Han, B., Park, K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Molecular Pharmaceutics. 10 (6), 2167-2175 (2013).
  33. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  34. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse models of cancer. Annual Review of Pathology. 6, 95-119 (2011).
  35. Lyons, S. K. Advances in imaging mouse tumour models in vivo. Journal of Pathology. 205 (2), 194-205 (2005).
  36. Margaryan, N. V., et al. The Stem Cell Phenotype of Aggressive Breast Cancer Cells. Cancers. 11 (3), (2019).
  37. Ma, F., et al. Enriched CD44(+)/CD24(-) population drives the aggressive phenotypes presented in triple-negative breast cancer (TNBC). Cancer Letters. 353 (2), 153-159 (2014).
  38. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER(+) Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388-401 (2019).
  39. Phan-Lai, V., et al. Three-dimensional scaffolds to evaluate tumor associated fibroblast-mediated suppression of breast tumor specific T cells. Biomacromolecules. 14 (5), 1330-1337 (2013).
  40. O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
  41. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  42. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  43. Abraham, B. K., et al. Prevalence of CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis. Clinical Cancer Research. 11 (3), 1154-1159 (2005).
  44. Balic, M., et al. Most early disseminated cancer cells detected in bone marrow of breast cancer patients have a putative breast cancer stem cell phenotype. Clinical Cancer Research. 12 (19), 5615-5621 (2006).
  45. Charafe-Jauffret, E., et al. Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (1), 45-55 (2010).
  46. Marcato, P., et al. Aldehyde dehydrogenase activity of breast cancer stem cells is primarily due to isoform ALDH1A3 and its expression is predictive of metastasis. Stem Cells. 29 (1), 32-45 (2011).
  47. Lacerda, L., Pusztai, L., Woodward, W. A. The role of tumor initiating cells in drug resistance of breast cancer: Implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 13 (4-5), 99-108 (2010).
  48. Liu, S., Wicha, M. S. Targeting breast cancer stem cells. Journal of Clinical Oncology. 28 (25), 4006-4012 (2010).
  49. D'Angelo, R. C., et al. Notch reporter activity in breast cancer cell lines identifies a subset of cells with stem cell activity. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (3), 779-787 (2015).
  50. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  51. Forozan, F., et al. Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data. Cancer Research. 60 (16), 4519-4525 (2000).
  52. Lanier, L. L. Just the FACS. Journal of Immunology. 193 (5), 2043-2044 (2014).
  53. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 19-39 (2007).
  54. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  55. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  56. Sun, C., et al. Immunomagnetic separation of tumor initiating cells by screening two surface markers. Scientific Reports. 7, 40632 (2017).
  57. Rodríguez, C. E., et al. Breast cancer stem cells are involved in Trastuzumab resistance through the HER2 modulation in 3D culture. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (2), 1381-1391 (2018).
  58. Kim, D. W., Cho, J. Y. NQO1 is Required for β-Lapachone-Mediated Downregulation of Breast-Cancer Stem-Cell Activity. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), (2018).
  59. Xu, L. Z., et al. p62/SQSTM1 enhances breast cancer stem-like properties by stabilizing MYC mRNA. Oncogene. 36 (3), 304-317 (2017).
  60. Huang, X., et al. Breast cancer stem cell selectivity of synthetic nanomolar-active salinomycin analogs. BMC Cancer. 16, 145 (2016).
  61. Liu, T. J., et al. CD133+ cells with cancer stem cell characteristics associates with vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer. Oncogene. 32 (5), 544-553 (2013).
  62. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  63. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  64. Palomeras, S., Ruiz-Martínez, S., Puig, T. Targeting Breast Cancer Stem Cells to Overcome Treatment Resistance. Molecules. 23 (9), (2018).
  65. McClements, L., et al. Targeting treatment-resistant breast cancer stem cells with FKBPL and its peptide derivative, AD-01, via the CD44 pathway. Clinical Cancer Research. 19 (14), 3881-3893 (2013).
  66. Berger, D. P., Henss, H., Winterhalter, B. R., Fiebig, H. H. The clonogenic assay with human tumor xenografts: evaluation, predictive value and application for drug screening. Annals of Oncology. 1 (5), 333-341 (1990).
  67. Tian, J., et al. Dasatinib sensitises triple negative breast cancer cells to chemotherapy by targeting breast cancer stem cells. British Journal of Cancer. 119 (12), 1495-1507 (2018).
  68. Samoszuk, M., Tan, J., Chorn, G. Clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured in direct contact with serum-activated fibroblasts. Breast Cancer Research. 7 (3), 274-283 (2005).
  69. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  70. Xu, Y., Hu, Y. D., Zhou, J., Zhang, M. H. Establishing a lung cancer stem cell culture using autologous intratumoral fibroblasts as feeder cells. Cell Biology International. 35 (5), 509-517 (2011).
  71. Palmieri, C., et al. Fibroblast growth factor 7, secreted by breast fibroblasts, is an interleukin-1beta-induced paracrine growth factor for human breast cells. Journal of Endocrinology. 177 (1), 65-81 (2003).
  72. Bourguignon, L. Y., Peyrollier, K., Xia, W., Gilad, E. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (25), 17635-17651 (2008).
  73. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  74. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  75. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
  76. Okano, M., et al. Orthotopic Implantation Achieves Better Engraftment and Faster Growth Than Subcutaneous Implantation in Breast Cancer Patient-Derived Xenografts. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  77. Zhang, Y., et al. Establishment of a murine breast tumor model by subcutaneous or orthotopic implantation. Oncology Letters. 15 (5), 6233-6240 (2018).
  78. Zhang, W., et al. Comparative Study of Subcutaneous and Orthotopic Mouse Models of Prostate Cancer: Vascular Perfusion, Vasculature Density, Hypoxic Burden and BB2r-Targeting Efficacy. Scientific Reports. 9 (1), 11117 (2019).
  79. Kim, R., Emi, M., Tanabe, K. Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology. 121 (1), 1-14 (2007).
  80. Rosato, R. R., et al. Evaluation of anti-PD-1-based therapy against triple-negative breast cancer patient-derived xenograft tumors engrafted in humanized mouse models. Breast Cancer Research. 20 (1), 108 (2018).
  81. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 99 (2018).
  82. Meraz, I. M., et al. An Improved Patient-Derived Xenograft Humanized Mouse Model for Evaluation of Lung Cancer Immune Responses. Cancer Immunol Res. 7 (8), 1267-1279 (2019).
  83. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. Biodrugs. 32 (3), 245-266 (2018).

Tags

Kreftforskning utgave 164 Brystkreftstamcelle (BCSC) fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kolonidannende analyse mammosfæreanalyse 3D-kulturmodell in vivo tumormodell
Isolering og funksjonell vurdering av humane brystkreftstamceller fra celle- og vevsprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., … More

Bhat, V., Lefebvre, C., Goodale, D., Rodriguez-Torres, M., Allan, A. L. Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples. J. Vis. Exp. (164), e61775, doi:10.3791/61775 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter