Summary
원발성 간세포는 시험관 내에서 간 반응과 신진 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여, 마우스 원발성 간세포 단리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다.
Abstract
원발성 간세포는 시험관내 간 연구, 특히 포도당 대사 연구에서 광범위하게 사용된다. 기본 기술은 시간, 노동, 비용 및 원발성 간세포 사용과 같은 다양한 요구에 따라 적용되어 다양한 원발성 간세포 분리 프로토콜을 초래합니다. 그러나, 원발성 간세포 단리에서의 수많은 단계 및 시간 소모적인 시약 제제는 효율성을 위한 주요한 단점이다. 장단점에 대해 서로 다른 프로토콜을 비교 한 후 각각의 장점을 결합하고 신속하고 효율적인 원발성 간세포 분리 프로토콜을 공식화했습니다. 불과 ~ 35 분 이내에이 프로토콜은 다른 프로토콜만큼 건강한 원발성 간세포를 산출 할 수 있습니다. 또한, 분리된 원발성 간세포를 사용하여 수행된 글루코스 대사 실험은 시험관내 간 대사 연구에서 이러한 프로토콜의 유용성을 검증하였다. 우리는 또한이 연구의 각 단계의 중요성과 목적을 광범위하게 검토하고 분석하여 미래의 연구자가 필요에 따라이 프로토콜을 더욱 최적화 할 수 있도록했습니다.
Introduction
간은 음식 소화, 혈액 순환 및 해독과 같은 수많은 생명 유지 기능에서 중요한 역할을하기 때문에 척추 동물의 신체에서 가장 중요한 기관 중 하나입니다. 시험관내 배양에서 마우스 원발성 간세포의 사용은 탄수화물 대사 및 간 암종에 대한 연구에서 점점 더 대중화되고 있다. 따라서, 마우스의 선천적 생리적 기능을 유지하면서 원발성 간세포를 분리하기 위한 편리한 방법을 개발하는 것이 중요하다. 포도당 대사의 허브로서의 기능으로 인해 간은 포도당 생산 및 저장의 중심이기도합니다1. 시험관 내에서 원발성 간세포를 이용한 실험은 대부분의 포도당 대사 연구에 필수적이다. 따라서 수년 동안 다양한 연구 그룹이 마우스 원발성 간세포 분리를위한 프로토콜을 개발했습니다.
마우스 간세포 분리의 일반적인 절차는 먼저 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 행크스 균형 소금 용액 (HBSS)과 같은 이소형 액체로 간에서 혈액을 씻어 낸 다음 콜라게나제 함유 용액을 사용하여 간세포를 해리시키는 것입니다. 이러한 프로토콜은 일반적인 절차를 공유하지만 필요에 따라 시약과 단계가 다릅니다. 그러나 필요한 시약을 준비하고 분리 단계를 수행하는 데는 시간이 걸립니다. 본 프로토콜을 개발할 때, 효율성은 우선 순위로 설정되었으며, 모든 시약은 즉시 사용 가능하고 시장에서 구입할 수 있으며 가능한 한 적은 단계였습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 단리된 원발성 간세포의 순도 및 생존력을 위태롭게 하지 않으면서 마우스로부터 원발성 간세포를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 제공하는 것이다.
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Protocol
모든 절차는 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6 암컷 마우스(8주령)를 본 연구에 사용하였다.
1. 준비:
- 윌리엄의 E 배지 (GlutaMAX 보충제)를 10 % FBS 및 1 % 항생제 - 항균제 용액과 혼합하여 배양 배지를 만듭니다.
- 25 mL의 콜라게나제-디스파제 배지 (예를 들어, 간 소화 배지)를 0.45 μm 시린지 필터를 통해 여과하여 입자 파편을 제거하였다.
- 50 mL의 이중 증류 H2O (ddH2O), 35 mL의 관류 배지 (예를 들어, 간 관류 배지) (또는 이 프로토콜을 사용하여 처음으로 50 mL), 및 25 mL의 여과된 콜라게나제-디스파제 배지를 45°C 수조에서 30분 동안 가온하였다.
- 멸균 조직 배양 후드 내에서 50mL 튜브에 10x HBSS 2mL와 Percoll 18mL를 섞어 20mL의 1x Percoll-HBSS를 만들고 얼음 또는 4°C에 보관합니다.
참고: 1x Percoll-HBSS는 최소 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. - 멸균 조직 배양 후드 내에, 30 mL의 세척 배지 (예를 들어, 간세포 세척 배지)를 깨끗한 페트리 접시에 붓고, 얼음 위에 보관한다.
- 펌핑 튜브를 45°C 수조의 물에 잠급니다. 결과는 실온이 25°C인 경우 가장 신뢰할 수 있습니다.
- 225 μL의 케타민 HCL, 93.75 μL의 자일라진, 및 1681 μL의 1x PBS를 혼합하여 2 mL의 1x 마취제를 제조하였다.
- 승인 된 방법을 사용하여 한 마리의 마우스를 마취하십시오. 여기에 마우스를 150 μL의 1x 마취제를 복강내 주사하였다. 완전한 마취를 보장하기 위해 발가락 꼬집음에 대한 반응과 같은 반사 신경의 손실에 대한 테스트를 수행하십시오.
- 마우스를 네 팔다리로 해부 패드에 고정하거나 방수 테이프 또는 기관의 동물 관리 및 사용 위원회 (또는 이에 상응하는 것)가 승인 한 기타 방법을 사용하여 고정하십시오.
- 해부를 위해 멸균 된 포셉과 가위를 준비하십시오. 가능한 오염을 피하려면 멸균 후드 내의 모든 단계를 수행하십시오.
2. 절차:
- 연동 펌프를 사용하여 예열 된ddH2O를 5 분 동안 4 mL / min의 속도로 펌핑하십시오. 펌핑 튜브를 물에서 예열 된 관류 매체로 바꿉니다.
- 마취 된 마우스의 복부를 70 % EtOH로 소독하고 가위로 잘라 간, 문맥 정맥 및 열등한 정맥 카바 (IVC)를 노출시킵니다.
- 연동 펌프를 정지하십시오. 24 G 카테터 (예를 들어, 폐쇄 IV 카테터, 24 G, 0.75 IN)를 IVC에 삽입하십시오. 펌핑을 시작하고 포털 정맥을 열어보십시오.
- 플러시 된 액체가 맑을 때까지 펌핑을 계속하십시오 (약 3-5 분). 매분마다 포털 정맥을 눌러 액체가 간 구석에 도달하도록하십시오. 기포가 IVC에 들어 가지 않도록주의하십시오.
참고 :이 단계는 간에서 가능한 한 많은 혈액을 씻어내는 것입니다. - 펌핑 튜브를 관류 배지에서 콜라게나제-디스파제 배지로 변경한다. 단계 2.6을 수행하는 동안 콜라게나제-디스파아제 배지의 모든 25 mL가 고갈될 때까지 펌핑을 계속한다.
- 매분마다 포털 정맥을 눌러 액체가 간 구석에 도달하도록하십시오.
참고 :이 단계에서 혈액의 완전한 손실은 마우스에 치명적입니다. 마우스의 죽음은 실험 후 심장 박동의 부족으로 확인할 수 있습니다. 시설 정책에 따라 시체를 처분하십시오. - 담낭 없이 간 전체를 얼음 위의 페트리 접시에 담낭 없이 30 mL 세척 배지로 분리한다.
- 포셉으로 조각으로 찢어 원발성 간세포를 용액으로 방출하십시오. 이 단계는 세척 배지를 방출 된 원발성 간세포와 작은 간 조각으로 가득 찬 흐린 용액으로 바꿀 것입니다.
- 단계 2.8에서 흐린 용액을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하여 얼음 위에 50 mL 튜브에 20 mL 1x Percoll-HBSS를 넣는다. 튜브를 20 번 뒤집어 혼합하십시오.
- 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
- 조직 배양 후드 내에서, 상청액을 흡인한다. 펠렛을 차가운 세척 배지 30 mL로 세척하십시오.
- 4°C에서 5분 동안 50 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 제거하고 펠렛을 조직 배양 후드 내의 25 mL의 배양 배지 (또는 적절한 다른 부피)에 재현탁시켰다.
- 세포 번호를 계수하고 실험 설계에 따라 원하는 배양 플레이트 상에 세포를 플레이트한다.
참고: 8주령 마우스 한 마리에서 적절하게 분리한 원발성 간세포는 보통 4개의 6웰 플레이트 또는 4개의 12웰 플레이트에 플레이팅하기에 충분합니다.
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Representative Results
효율을 시험하기 위하여, 본원의 일차 간세포 분리 프로토콜이 8주령 암컷 C57BL/6 마우스에 대해 수행되었다. 분리된 원발성 간세포의 부착 및 순도를 시험하였다. 원발성 간세포 분리는 간 약물 효과 및 글루코스 대사, 제약 바이오마커 활성2, 인슐린 감수성 및 글루코스 생산과 같은 간 생리학에 대한 매우 다양한 실험에 사용된다. 따라서, 이 프로토콜로 단리된 원발성 간세포의 활성을 다음의 실험에서 시험하였다.
코팅은 본 프로토콜에서 원발성 간세포 부착을 위해 요구되지 않았다.
단리된 일차 간세포를 6-웰 플레이트 상에 5 x 105 세포/웰로 플레이팅하였다. 1시간 후, 확고한 부착이 관찰되었고, 1차 간세포는 도금 후 12시간 후에 완전히 팽창되었다(도 3). 이것은 도금 후 12 시간, 세포가 실험에 활용 될 준비가되었음을 나타냈다. 간 내의 마우스 간세포의 핵 형태학에 기초하여, 단핵 간세포는 경계에서 풍부 해졌고, 말단 분화의 시그니처 인 binuclear / polynuclear 간세포는 중간 3,4에 있었다. 이미지화된 상당한 양의 세포는 전형적인 이중핵(diploid) 형태를 나타내었으며, 이는 살아있는 원발성 간세포를 단리하고 정제하는 데 성공했음을 나타낸다. 이것은 또한 콜라겐 코팅이이 프로토콜을 사용한 원발성 간세포 부착에 대한 요구 사항이 아니라는 것을 나타냅니다.
순도는 단리된 원발성 간세포 집단에서 농축되었다.
다양한 세포 유형 특이적 유전자 마커가 단리된 1차 간세포 순도를 확인하기 위해 이전 프로토콜에서 사용되어 왔다(표 1). TTR (트랜스 티레틴), CD95 (분화 95의 클러스터, Fas로도 알려짐), ASGR1 (아시아 당단백질 수용체 1) 및 ASGR2는 간세포에 대한 마커입니다. 단리 후, 이들 간세포 마커의 mRNA 수준은 간 전체에 비해 유의하게 증가하였다(도 4A-D, H).
이 프로토콜은 또한 다른 간 세포로부터의 간섭을 크게 감소시켰다. 면역 세포, 성상 세포 및 내피 세포의 존재는 CD45 (면역 세포 마커), COL1A1 (콜라겐, 유형 I, 알파 1, 성상 세포 마커) 및 TIE2 (튀니카 인터나 내피 세포 키나아제, 내피 세포 마커)의 mRNA 수준의 급격한 감소에 의해 더 낮았다 (도 4E-H ). 이들은 이 프로토콜이 간 세포로부터 원발성 간세포 집단을 정제할 수 있고, 따라서 실험에서 다른 세포 유형으로부터의 가능한 간섭을 감소시킬 수 있음을 시사한다.
약제학적 바이오마커의 활성은 보존되었다.
간세포 상의 바이오마커는 약물 표적화 및 전달을 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 따라서 제약 바이오마커의 활성 보존은 원발성 간세포 단리의 핵심 포인트이며 원발성 간세포 분리2의 유용성을 시험하는 표준입니다. 간세포 마커 ASGR1 및 ASGR2가 이러한 방식으로 사용된다2. 먼저 원발성 간세포 도금 전후에 이들 두 마커의 시간-과정 발현 수준을 시험하였다. 도금 후, 그들의 mRNA 수준은 시간이 지남에 따라 상당히 감소했지만, 특히 ASGR1의 경우 도금 후 12 시간 시점까지 전체 간 수준에 비해 상당한 수준을 유지했다 (그림 5A, B). 발현 경향은 이전 보고서 2와 일치하였고, 비교가능한 원발성 간세포 건강성을 나타내었다. 다양한 병원체는 간세포막 결합 단백질인 CD81을 표적으로 하여5형 간염 바이러스, 플라스모듐 팔시파럼 및 플라스모듐 요엘리이 6과 같은 세포 진입 및 감염을 용이하게 합니다. TLR4 (톨-유사 수용체 4)와 같은 다른 간세포막-위치 단백질은 또한 병원체에 의해 표적화되고 간세포 면역 반응에 중요하다7. 플레이팅 후, CD81의 발현 수준은 48h까지 일치하였다(도 5C). TLR4 발현 수준은 일반적으로 48 h 이후까지, 생체내보다 높은 수준에 도달했을 때까지 증가하지 않았다 (도 5D). 이들은 이 프로토콜에 의해 단리된 원발성 간세포가 또한 도금 후 적어도 48시간 이내에 CD81 및 TLR4 연구에 사용될 수 있음을 시사한다. 함께, 이들 결과는 단리된 원발성 간세포가 제약 바이오마커와 관련된 연구에 사용하기에 유효하다는 것을 나타낸다. RNA 및 단백질 수준이 신호 펩티드-유도된 RNA 이동, 번역 후 변형 및/또는 단백질 분해와 같은 전사 후 활동으로부터의 영향 때문에 일관성이 없을 수 있다는 점은 주목할 가치가 있다. 따라서, mRNA에 의해 확인된 제약 바이오마커의 단백질 수준 및 생체활성 검증은 실험 패러다임에 의해 요구되는 경우 필요할 수 있다.
단리된 원발성 간세포는 인슐린 민감성이었다.
포도당 대사 실험에서 일차 간세포 성능 또한 분석하였다. 포도당 대사에서 중심 역할을 하는 호르몬인 인슐린은 포도당 수치를 낮추고 AKT와 FOXO1(포크헤드 박스 O1)을 인산화하여 간 포도당 흡수 및 저장을 촉진합니다. 따라서, 단리된 원발성 간세포로 인슐린 감수성 검정을 수행하였다. 16시간 후, 세포를 무혈청 배지로 3시간 동안 굶주렸다. 기아의 마지막 0.5 시간에서, 100 nM 인슐린을 배양 배지에 투여하였다. 도 6A-C에 나타난 바와 같이, 인슐린은 Ser473에서 AKT와 Ser256에서 FOXO1 둘 다의 인산화를 유의하게 촉진시켰으며, 이는 인슐린에 대한 원발성 간세포의 민감성을 나타낸다. 이것은 본 프로토콜로부터 분리된 원발성 간세포가 인슐린/글루코스 대사 연구에 유용하다는 것을 시사한다.
분리된 원발성 간세포는 글루코스 생산이 가능하였다.
그들은 포도당 저장의 중심지 일뿐만 아니라 간세포도 포도당 생산을 담당합니다. 우리가 분리 한 일차 간세포가 포도당 생산 연구에 유용한지 여부를 테스트하기 위해 세포는 포도당 생산을 자극하기 위해 글루카곤의 존재하에 10 시간 동안 굶주렸다. 그런 다음 기아 배지를 포도당 분석을 위해 수집하고, 세포를 웨스턴 블롯을 위해 수확하였다. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제(PEPCK)는 간 포도당 생산에 필수적인 성분으로, 그 속도를 조절합니다8. 글루카곤 처리 후 PEPCK의 단백질 수준이 유의하게 증가하였는데, 이는 글루코스 생산 경로가 활성화되었음을 시사한다(도 7A,B). 이러한 활성화는 증가된 수준의 글루코스 생산에 의해 추가로 확인되었다(도 7C). 이 현상은 포스콜린 플러스 IBMX와 같은 다른 글루코스 생산 자극제에서도 확인되었다(도 7A-C). 그러나 이 실험의 한계로 인해, 글루코스 생산이 글루코신생을 통해 배타적인지 또는 글리코겐 분해의 성분이 있는지도 검증할 수 없었다.
그림 1: 벤치 설정. (A) 원발성 간세포 분리를 위한 벤치 설정. (B) 원발성 간세포 분리를 위한 만화 벤치 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스 해부, 관류 및 원발성 간세포 정제. (A) 해부 된 마우스, 간, IVC 및 문맥 정맥을 가리키는 화살표. (B) IVC로의 카테터 삽입. (C) 간 로페의 확대 및 뻣뻣함을 일으키는 문맥 정맥을 가압하여 성공적인 관류를 나타냅니다. (D) 관류 후 간을 부드럽게 하여 콜라게나제 소화의 성공을 나타냅니다. (E) 고립 된 간에서 담낭의 위치 (담낭을 가리키는 화살표). (F) 담낭 제거. (g) 간세포 세척 배지에서 찢어진 간. (h) 원심분리 전에 여과된 원발성 간세포와 1x Percoll-HBSS를 혼합한다. (I,J) 원심분리 후 일차 간세포 펠릿. (K) 간세포 세척 배지 내의 원발성 간세포 재현탁. (L, M) 원심분리 후 간세포 세척 배지 내에 형성된 일차 간세포 펠릿. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 도금 후의 원발성 간세포. 이미지는 (A)1 h, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h, 및 (H) 96 h 1차 간세포 도금 후에 촬영되었다. 배율 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 분리 후 향상된 원발성 간세포 순도. RNA는 이전의 프로토콜9에 따라 (단리된 원발성 간세포로부터) 및 (단리된 원발성 간세포로부터) 전에 (전체 간으로부터) 단리되었고, 이어서 역전사 PCR에 의해 단리되었다. 1차 간세포 순도는 간세포 마커 (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 및 (D) ASGR2에 대한 프라이머를 사용한 실시간 PCR에 의해 평가되었으며, 면역 세포 마커 (E) CD45, (F) 성상 세포 마커 COL1A1 및 (G) 내피 세포 마커 TIE2도 함께 평가하였다. (h) 히트맵은 원발성 간세포 분리 전후의 세포 유형 마커의 발현 변화에 대해 생성되었다. GAPDH (글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제)를 내부 대조군으로 사용하였다. 여기에 사용된 프라이머는 유전자에 대한 것이었다(프라이머 서열은 표 2에 있다. 서열 참조는 여기에서 인용된다: TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; 갭드17. 그래프 및 히트맵은 GraphPad Prism 8로 생성되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내고, 두 꼬리가 짝을 이루지 않은 상태(이 프로토콜이 처음부터 온전한 간을 필요로 하기 때문에 원발성 간세포 및 전체 간 샘플이 짝을 이루지 않았기 때문에)는 t-검정 유의성은 별표로 표시된다(*p< 0.05; **p< 0.01; ***p< 0.001). N = 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 제약 바이오마커의 발현. RNA는 도금 후 전체 간 및 원발성 간세포로부터 분리되었고, 이어서 역전사 PCR이었다. 제약 바이오마커의 발현은 (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81, 및 (D) TLR4에 대한 프라이머를 사용한 실시간 PCR에 의해 평가되었다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용하였다. 여기에 사용된 새로운 프라이머는 유전자에 대한 것이었다 (프라이머 서열은 표 2에 있다. 서열 참조가 여기에 인용된다): CD8118; TLR419. 그래프는 GraphPad 프리즘 8로 생성되었다. N = 5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 1차 간세포 분리 후 인슐린 감수성이 보존됨 . (A) 인슐린 처리 후 p-AKT(S473), AKT, p-FOXO1(S256), FOXO1 및 GAPDH의 웨스턴 블롯. (b) p-AKT (S473)/AKT in densitometry of western blot. (c) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 in densitometry of western blot. 인슐린 감수성 분석은 일차 간세포 플레이팅 후 16시간 후에 수행하였다. 1차 간세포는 FBS가 없는 윌리엄 E 배지(GlutaMAX 보충제)에서 3시간 동안 굶주렸지만, 1% 항생제-항균제 용액과 100nM 인슐린 처리로 마지막 30분에 1x RIPA 완충액으로 단백질 용해를 위해 수확되었다. 그래프는 GraphPad 프리즘 8로 생성되었다. 웨스턴 블롯 이미징은 LI-COR 오디세이 CLx로 수행되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내고, 두 꼬리 쌍을 이룬 t-검정 유의성은 별표로 표시된다(*p< 0.05; **p<01). N = 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 글루코스 생산 분석. (A) 글루카곤 또는 포스콜린+IBMX 처리 후 PEPCK 및 GAPDH의 웨스턴 블롯 10시간 동안 (B) 글루카곤 또는 포스콜린+IBMX 처리 후 GAPDH와 비교한 PEPCK 단백질 수준의 치밀측정법 10시간 동안 글루카곤 또는 포스콜린+IBMX 처리 후의 단백질 수준과 비교하는 글루코스 수준. 글루코스 생산 분석은 일차 간세포 플레이팅 후 16시간 후에 수행하였다. 일차 간세포는 글루코스- 및 페놀 적색이 없는 DMEM (2 mM L-글루타민, 2 mM 소듐 피루베이트, 20 mM 소듐 L-락테이트, 1% 펜스트렙과 함께 첨가됨)에서 10시간 동안 굶주렸고, 50nM 글루카곤 또는 20 μM 포스콜린 및 200 μM IBMX를 사용하였다. 배지는 글루코스 어세이 키트로 글루코스 농도 측정을 위해 수확되었고, 단백질은 웨스턴 블롯을 위해 수확되었다. 웨스턴 블롯 이미징은 LI-COR 오디세이 CLx로 수행되었다. 에러 바는 표준 편차를 나타내고, 두 꼬리 쌍을 이룬 t-검정 유의성은 별표로 표시된다(*p< 0.05; **p<0.01; *** p < 0.001). N = 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 원심분리 시간 | 리브 케이지 제거 | 관류 버퍼 자체 제작 | 외과 매듭 | 램프 난방 | 플레이트 코팅 | 분리된 세포량/마우스 | 구배 원심분리 | 순도 마커 유전자 | |
| 현재 프로토콜 | 2 | 아니요 | 아니요 | 아니요 | 아니요 | 아니요 | 2.5–4 x 107 | 예 | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | 예 | 예 | 예 | 예 | 예 | 1.8–2 x 107 | 아니요 | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 또는 6 | 아니요 | 아니요 | 아니요 | 아니요 | 예 | 1–3 x 106 | 예 | CD45, CD95 |
| Li et al.20. | 4 또는 5 | 아니요 | 예 | 예 | 아니요 | 언급되지 않음 | 1–4 x 107 | 아니요 | 해당 없음 |
| Salem et al.21. | 3 | 아니요 | 예 | 아니요 | 아니요 | 언급되지 않음 | 2 x 107 | 예 | 해당 없음 |
| Cabral et al.22. | 3 또는 6(구배 원심분리 포함) | 아니요 | 예 | 예 | 아니요 | 예/권장 사항 | 해당 없음 | 선택적 | N/A(광 현미경으로 평가된 순도) |
| Korelova et al.23. | 3 | 아니요 | 예 | 예 | 아니요 | 예 | 해당 없음 | 예 | 해당 없음 |
표 1: 원발성 간세포 프로토콜의 비교.
| 프라이머(앞으로) | 프라이머 (역방향) | 참조 | ||
| TTR 포워드 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR 역방향 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 포워드 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 역방향 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 포워드 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 리버스 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 포워드 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGATGG | ASGR2 리버스 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 포워드 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 리버스 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 포워드 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 역방향 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 포워드 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 리버스 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH 포워드 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH 리버스 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 포워드 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 역방향 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 포워드 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 리버스 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
표 2: 프라이머 목록: TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 및 TLR4 유전자에 사용되는 프라이머
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Discussion
다양한 원발성 간세포 분리 프로토콜이 개발되었다. 또한 다양한 요구에 따라 최적화되고 조정되었습니다 (표 1). 분리 프로토콜은 일반적으로 관류 (효소 소화 포함)와 정제의 두 부분으로 구성됩니다.
관류는 생체내 전체 간(2,20,21,22,23) 또는 해부된 간엽(24)과 함께 수행될 수 있다. 해부된 엽의 관류는 일반적으로 기술적 용이성을 위해 좌측 및 중간 엽으로 제한되었다. 이론적으로, 생체 내 관류는 모든 엽과 함께 전체 간을 사용하기 때문에 더 많은 원발성 간세포를 산출해야합니다. 관류 중에 간을 제자리에 유지하는 것은 또한 생체 내 간세포가이 단계 동안 항상 혈액 또는 관류 완충액의 유체로 목욕 될 수 있기 때문에 세포 사멸을 감소시킬 수 있습니다.
무균 상태의 유지 관리도이 단계에서 중요한 역할을합니다. 조건이 허락한다면, 깨끗한 후드에서 관류를 수행하는 것이 좋습니다. 조직에 직접 닿는 모든 도구는 멸균되어야하며, 오토클레이브에 의해 달성 될 수 있습니다. 박테리아 및 곰팡이로부터의 오염을 방지하기 위해, 항생제-항균제 용액을 배양 배지에 첨가하였다.
IVC와 문맥 정맥은 간을 다른 장기와 연결하는 두 가지 주요 혈관입니다. 대부분의 프로토콜은 관류를 위해 바늘을 삽입하기 위해 이러한 정맥 중 하나를 사용합니다 : IVC 2,20,21,23, 포털 정맥22. 포털 정맥의 위치는 비뚤어진 각도로되어 삽입 된 바늘을 배치하고 안정화시키는 데 어려움을 겪습니다. 따라서 봉합사는 일반적으로 바늘을 수술 매듭으로 제자리에 묶는 데 필요하며, 정맥이 손상되기 쉽기 때문에 매우 조심스럽게 수행해야합니다. 일반적으로 문맥 정맥의 직경은 IVC보다 작기 때문에 바늘 삽입이 복잡합니다. 이를 고려할 때, IVC의 사용이 더 편리할 수 있지만, 일부 프로토콜에서는 바늘이 IVC20에 외과적으로 매듭지어지기도 한다. IVC 삽입을 통한 관류는 문맥 정맥25보다 덜 생존 가능한 원발성 간세포를 초래한다는 것이 보고되었다. 그러나, 본 프로토콜에서, 우리는 IVC 삽입을 성공적으로 사용하였고, 단리된 원발성 간세포 생존력(최적화된 조건에서 >96%, 제조자의 프로토콜에 따라 Trypan Blue 염색으로 측정됨)은 다른 프로토콜만큼 높았다(프로토콜 및 조건2,22,23,24에 따라 80%와 96% 사이에서 변화함).
관류 단계에는 두 가지 목표가 있습니다 : 간엽에서 혈액을 씻어 내고 간을 소화하여 원발성 간세포를 방출합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해서는 적어도 두 개의 버퍼를 사용해야하며, 하나는 혈류 (플럭스 버퍼)와 소화 용 버퍼 (소화 버퍼)입니다. 대부분의 프로토콜은 HBSS 기반 플럭스 버퍼를 준비하고 콜라게나제를 첨가하여 소화 버퍼로 소화 할 수 있도록합니다. 이러한 버퍼의 준비는 시간이 많이 걸리며 버퍼는 배치에서 배치까지 pH와 같은 섬세한 특성에서 약간 다를 수 있으므로 초대받지 않은 변수가 도입됩니다. 이를 고려할 때, 상용화된 버퍼를 활용하면 귀중한 노동력과 시간을 절약하면서 이러한 변수를 최소화할 수 있습니다. Gibco는 시판되는 간 관류 배지 (플럭스 버퍼로서) 및 간 소화 배지 (소화 완충액으로)의 사용을 기반으로 성인 쥐26에서 일차 간세포 분리를위한 프로토콜을 개발했습니다. 설치류로서 마우스와 쥐는 신체 특성에서 높은 유사성을 공유합니다. 하나는 이들 두 래트-최적화된 완충제를 마우스 원발성 간세포 단리에 통합시킬 수 있다. 실제로, Gonçalves et al. 24, 성공적으로 이러한 버퍼와 해부 간 엽의 관류를 수행, 생체 내에서 간 관류에 자신의 사용에 대한 약속을 제기했다. 여기에서 우리는 현재 마우스 일차 간세포 프로토콜에서 간 관류 배지 및 간 소화 배지를 성공적으로 테스트하여 고품질의 생존 가능한 원발성 간세포를 산출했습니다 (그림 3 및 그림 4).
관류 완충액의 온도는 원발성 간세포가 단리에서 얼마나 잘 생존하는지를 결정한다. 온도가 너무 높으면 소화 완충액 내의 콜라게나제 활성이 감소할 수 있습니다. 너무 낮 으면 원발성 간세포가 감기 쇼크를 겪을 수 있으므로 분리 수율이 저하 될 수 있습니다. 버퍼가 관류 튜브를 통해 흐르는 데 걸리는 시간은 또한 완충액이 간에 도달 할 때 버퍼의 온도를 결정합니다. 이전 프로토콜에서, 40°C2 또는 42°C21 수조가 사용되었다. 이 온도는 환경 온도, 관류 튜브의 길이 및 Peristaltic Pump의 유형과 같은 실험실 조건에 따라 변경 될 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 여러 차례의 테스트 끝에 버퍼를 예열하기 위해 수조 온도를 45°C로 최적화했습니다.
분리된 원발성 간세포의 순도는 순도 비율이 높을수록 간섭이 적기 때문에 후속 실험에서 중요한 역할을 한다. 간은 주로 60 % -80 질량27을 차지하는 간세포로 구성되어 있지만 간 면역 활동에 중요한 면역 세포, 성상 세포 및 내피 세포와 같은 다양한 유형의 다른 세포도 존재합니다. 이들 세포 각각은 후술하는 실험(28)에서 잠재적인 간섭을 게시할 수 있었다. 예를 들어, 간에서 성상 세포는 또한 흉터 형성29와 관련된 병원균 침입 및 간 손상에 반응합니다. 숫자에서, 전체 간 세포 집단의 5%-8%는 성상 세포(30)에 의해 기여된다. 일반적으로 성상 세포는 정지 상태에 있지만 스트레스가있을 때이 상태는 깨질 수 있습니다. 따라서, 성상 세포 활성은 이들 세포 중 일부가 최종 단리된 원발성 간세포 풀에 남아 있는 경우 단리 또는 후속 치료 동안 도입된 스트레스에 의해 촉발될 수 있다. 다른 유형의 세포는 또한 간 정현파 내피 세포 (LSECs)와 같은 간 세포 집단의 상당 부분에 기여하며, 전체 간 세포 집단(31)의 20 %를 차지한다. 이러한 세포의 존재를 제거하는 방법은 원발성 간세포 분리 과정에서 수수께끼 같은 부분이었다. 따라서 정제는 원발성 간세포 분리의 핵심 부분이며, 이는 일반적으로 다른 유형의 세포 간의 무게 및 크기 차이를 이용합니다. 원심분리 속도 및/또는 정제 완충액을 최적화함으로써, 원발성 간세포는 튜브의 바닥까지 펠릿화될 수 있다.
죽은 세포로부터 살아있는 세포를 분리하는 것은 건강한 원발성 간세포와 정확한 세포 계수를 얻는 데에도 중요합니다. 보통, 세포 수를 세는 것은 세포 합류가 변함에 따라 수많은 실험의 결과가 변하기 때문에 정제 후에 필수입니다. 구배 원심분리기 시약은 Percoll과 같은 이 임무를 수행하기 위해 이 단계에서 사용될 수 있다. 원심 분리기 펠릿에있는 Percoll의 36 % -40 %는 살아있는 세포를 내리고 죽은 세포를 상청액에 보관합니다. 우리는 본 프로토콜에서 비일차 간세포 세포 집단을 줄이기 위해 원심분리 속도와 시간을 성공적으로 최적화했습니다. 세포 유형-특이적 마커는 다른 프로토콜과 마찬가지로 여기에서 단리된 원발성 간세포의 순도를 시험하기 위해 사용되었다. 여기에 사용된 간세포 마커는 TTR 2, CD95 24,32, ASGR133, 및 ASGR234였다. 다른 유형의 세포에 대한 마커는 CD45 (면역 세포 마커), COL1A1 (성상 세포 마커), TIE2 (내피 세포 마커)2,35를 포함한다. 이들 마커와 함께, 본 프로토콜로 단리된 원발성 간세포는 이전의 프로토콜2,24에 필적하는 높은 수준의 순도를 보였다(도 4).
관류 중에 소화 완충액의 콜라게나제는 세포외 매트릭스 내의 콜라겐을 분해하여 세포 간의 부착을 느슨하게 합니다. 이로 인해 도금 중 셀 달성에 어려움이 생깁니다. 이전 프로토콜의 대부분은 원발성 간세포의 더 나은 부착을 위해 콜라겐2,22 또는 젤라틴24로 플레이트의 사전 코팅을 요구하거나 권장합니다. 우리의 지식으로, 살렘 외에. 21 및 Li et al. 도 20은 이 단계를 논의하지 않았으며, 본 연구에서 평가된 다른 프로토콜들은 사전 코팅된 플레이트2,22,23,24의 사용을 명확하게 진술/추천하였다. 본 프로토콜에서, 우리는 플레이트 코팅이 특정 유형의 플레이트에 필요하지 않다는 것을 발견했다. 다른 유형의 플레이트, 특히 다른 제조업체의 경우 표면 평활도가 다르기 때문인지, 그리고 이러한 다양한 평활도가 존재하는 경우 원발성 간세포 부착에 중요한 역할을하는지 여부는 확실하지 않지만 효능을 위해 다른 단계 (플레이트 코팅)를 건너 뛸 수 있도록주의하는 것이 좋습니다. 또한, 이 프로토콜은 생체내 간정현파와 유사한 단핵간세포와 함께 말단 분화, 예를 들어, 이배체 간세포의 상당한 비율을 생성한다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
이 연구에서는 이전의 원발성 간세포 분리 프로토콜의 장점이 결합되었으며, 상업적으로 이용 가능한 시약을 사용하고 불필요한 단계를 제거하여 가능한 한 공정을 단순화했습니다. 원심분리 단계는 성공적으로 두 개로 줄어들었고, 이는 우리가 아는 한 출판 된 프로토콜에서 가장 적은 것입니다. 분리된 원발성 간세포의 순도 및 생체활성을 확인하기 위해, 다양한 간 세포 마커의 수준을 평가하여, 본 프로토콜이 원발성 간세포 순도를 크게 향상시키고 면역 세포, 성상 세포 및 내피 세포와 같은 다른 간 세포 집단을 감소시킬 수 있음을 확인하였다. ASGR1, ASGR2, CD81 및 TLR4와 같은 제약 바이오마커의 활성은 본 프로토콜로 분리된 일차 간세포에서 잘 보존되었으며, 이는 또한 인슐린 감수성 및 글루코스 생산 활성을 확인하였다. 이 프로토콜의 주요 한계는 모든 시약이 효율성을 위해 상업적으로 구입되었기 때문에 비용이 든다는 것입니다. 우리는 글리코게노시스가 본 프로토콜을 사용하여 단리된 원발성 간세포에서 손상되지 않았음을 구체적으로 확인하지 않았으며, 이는 관련 연구를 위한 추가 연구가 필요할 수 있다. 이 프로토콜은 IVC 삽입을 사용하여 Salem et al.21, Severgnini et al.2 및 Li et al.20 및 Korelova et al.23과 같은 이전의 것들과 유사한 관류 단계를 갖는다. 그들의 관류 및 소화 완충액은 준비하기 위해 여분의 노동력을 필요로 할 수 있으며, 효소 소화 시간의 변형이 거의없는 현재의 프로토콜과 함께 작동 할 수도 있습니다. 따라서, 이전 프로토콜의 시약을 본 프로토콜의 단계들과 조합하는 것은 또한 시간- 및 경제적으로 친환경적일 수 있다.
요약하면, 마우스 간으로부터의 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다. 이 프로토콜은 상업적으로 이용가능한 시약을 전적으로 이용하며, 해부된 마우스에서 일차 간세포 도금에 이르기까지 ~35분 내에 완료될 수 있으며, 따라서 원발성 간세포 관련 연구에 유용한 기술을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 보건원 (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
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