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Biochemistry

重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製

Published: November 5, 2020 doi: 10.3791/61826
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコルは、培養細胞や単一マウス脳などの中小規模の源からのチューブリン精製を、重合および非重合サイクルを用いて記述する。精製されたチューブリンは、特定のアイソタイプで濃縮されるか、または特定の翻訳後修飾を有し、微小管のダイナミクスおよび相互作用を研究するためにインビトロ再構成アッセイで使用することができる。

Abstract

微小管細胞骨格の研究の重要な側面の1つは、インビトロ再構成実験における微小管挙動の研究である。これらは、ダイナミクスなどの微小管の本質的な特性と、微小管関連タンパク質(MAPs)との相互作用を分析することを可能にする。「チューブリンコード」は、微小管の特性および機能の調節因子として、異なるチューブのアイソタイプおよび様々な翻訳後修飾(PTM)を指し示す新しい概念である。チューブリンコードの分子機構を調べるには、特定のアイソタイプとPTMを用いた精製チューブリンを用いたインビトロ再構成実験を行うことが重要です。

現在までに、これはインビトロ実験で広く使用されている脳管状突管として技術的に困難であり、多くのPTMを抱え、定義されたアイソタイプ組成を有する。そこで、重合と非重合サイクルの古典的アプローチを用いて、異なる供給源から、異なるアイソタイプ組成および制御PTMを用いてチューブリンを精製するこのプロトコルを開発しました。アフィニティ精製に基づく既存の方法と比較して、このアプローチは、純粋で重合能力のある管状尿管を生成し、重合または脱重合に耐性のあるチューブリンが連続した精製工程中に廃棄されるようにする。

懸濁液または付着培養物として、そして単一マウスの脳から成長した細胞株からのチューブリンの精製について述べた。この方法は、まず、懸濁および付着性の両方の設定における細胞塊の生成、リシス工程、続いて重合脱重合サイクルによるチューブリン精製の連続段階について説明する。我々の方法は、チューブリンコードが微小管の固有特性および関連タンパク質との微小管相互作用に及ぼす影響に対処する実験に使用できるチューブリンを生み出す。

Introduction

微小管は、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします。彼らは細胞に形状を与え、染色体分離のための大動脈および有糸性紡錘を構築し、細胞内輸送のトラックとして機能する。これらの多様な機能を実行するために、微小管はさまざまな方法で自分自身を整理します。この分野で興味深い質問の1つは、構造的および進化的に保存された微小管が、この多くの組織や機能に適応することを可能にする分子メカニズムを理解することです。潜在的なメカニズムの1つは、「管状コード1、2、3」と呼ばれる概念によって定義される微小管の多様化である。この管状には、αおよびβ-チューブリン遺伝子産物(チューブリンアイソタイプ)を微小管およびチューブリンの翻訳後修飾(PTM)に差動する2つの主要成分が含まれる。

1970年代以降、インビトロ再構成実験は、進化する光顕微鏡技術と組み合わせることで、微小管の特性に関する重要な発見への道を開いてきた:動的不安定性4とトレッドミリング5、およびその他のメカニズムおよび機能6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。これまでに行われたインビトロ実験のほとんどすべては、重合および脱重合16、17の繰り返しサイクルを用いて脳組織から精製されたチューブリンに基づいている。脳組織からの精製は、高品質のチューブリンを大量に得る利点(通常はグラム量)を与えるが、脳組織から精製されたチューブリンが異なるチューブリンアイソタイプの混合物であり、多くのチューブリンPTMで濃縮されるという1つの重要な欠点がある。この異種性は、微小管の特性および機能の制御における特定の管状PTMまたはアイソタイプの役割を表解することを不可能にする。したがって、管内管制御PTMと均質なアイソタイプ組成物を有するアセンブリ管管ビンの製造は、管状コードの分子機構に対処するために不可欠である。

近年、酵母Stu2pの微小チューブ結合TOG(腫瘍過剰発現遺伝子)ドメインを用いたアフィニティークロマトグラフィーによるチューブリンの精製法が開発された。この方法では、細胞または組織の粗いライセート中のチューブリンは、マトリックス固定化TOGドメインに結合するカラムを通過し、非常に小さなサンプルであっても、与えられたチューブリンプール全体の分析を可能にする。近年、組換え尿細管を精製する待望のアプローチも記載されている。これは、バキュロウイルス系に基づいており、αおよびβ-チューブリン遺伝子を含むバイシストロニックベクターが昆虫細胞19に発現する。しかし、この方法は非常に煩雑で時間がかかるため、尿細管変異20およびチューブリンアイソタイプ21、22、23 in vitroの影響を研究するためにほとんど使用される。

現在のプロトコルでは、細胞株またはマウス脳組織24から異なるレベルの修飾を有するチューブリンを生成する青写真として、確立され広く使用されている重合脱重合アプローチを用いる方法を説明する。この手順では、チューブリンは可溶性(4°Cのチューブリンダイマー)と重合形態(グアノシン5'-三リン酸[GTP]の存在下で30°Cで微小管)との間で循環する。各形態は遠心分離の連続したステップによって分離される:管状のダイマーは、冷間(4°C)の回転後に上清に残り、微小管は30°Cでペレット化される。 さらに、1つの重合工程は、高ピペラジン-N,N-ビス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)濃度で行われ、微小管から微小管関連タンパク質を除去し、したがって、最終的に精製されたチューブリンから行う。懸濁または付着培養物として増殖したHeLa S3細胞から精製されたチューブリンは、ほとんど全く全くチューブリンPTMを含まないものであり、最近のインビトロ再構成実験25、26、27、28で使用されている。さらに、単一マウス脳からチューブリンを精製する方法を適応させ、チューブリンアイソタイプおよびPTMの変化を伴う多数のマウスモデルに使用することができる。

プロトコルでは、まず、原料物質(細胞質量または脳組織)の生成、その分解(図1A)、次いでチューブリン重合および脱重合の連続したステップを記述して、チューブリンを精製する(図1B)。精製されたチューブリンの純度(図2A,B)と量(図3A,B)を評価するプロセスについてさらに説明します。この方法は、チューブリン精製前の細胞内で修飾酵素を過剰発現させることにより、選択したPTMを濃縮したチューブリンを製造するように適合させることができる(図4B)。あるいは、チューブリン修飾酵素は、精製プロセス中にチューブリンに添加することができる。最後に、対応するチューブリン修飾酵素に欠乏しているマウスの脳から特定のアイソタイプまたはPTMを欠いた管状またはPTMを欠いて、精製することができる(図4B)29。

ここで説明する方法には、(i)比較的短時間で十分に大量のチューブリンを生産でき、(ii)特定のチューブリンアイソタイプ組成物またはPTMのいずれかで高品質で純粋なチューブリンを生成するという2つの主な利点があります。この原稿の関連ビデオでは、この手順に関連する重要な手順のいくつかを強調しています。

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Protocol

この研究のための動物のケアおよび使用は、欧州共同体(2010/63/UE)の勧告に従って行われた。実験的手続きは、国際ガイドラインに準拠したキュリーCEEAIC#118(国家当局が与えた承認番号04395.03)の倫理委員会によって明確に承認されました。

1. チューブリン精製用試薬の製造

注:尿細管の精製に使用されるすべてのバッファーは、カリウム塩とナトリウム塩30を含んではなりません。

  1. 完全な培地の1 Lを準備する:ダルベックの改変されたイーグル培地(DMEM)、10%のウシ胎児血清(FBS、100 mL)、200mM L-グルタミン(2Mストックの10 mL)、および1xペニシリンストレプトマイシン(10mLの100xストック)4 °Cで保管。
  2. 140gのKOHを水に溶解して10Mの水酸化カリウム(KOH)を調製し、最終体積を250mLに調整し、室温で保存します。
  3. 0.5 Mエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を調製し、pH8、36.5 gのEDTAを水中に溶解させて、KOH(それ以外の場合EDTAが溶解しない)を用いてpHを8.0に調整し、最終容積を250mLに調整し、フィルター滅菌し、室温で保存する。
  4. 5 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)EDTA を 5 mL の 0.5 M EDTA に加えて PBS 500 mL に加え、フィルター滅菌し、室温で保存します。
  5. 0.5 M K-PIPES、pH 6.8を水に溶解して、PH 6.8に調整し、KOH(そうでない場合はPIPESが溶解しません)でpH 6.8に調整し、最終容積を500mLに調整し、フィルター滅菌し、4°Cで保管します。
  6. 1 M K-PIPES、pH 6.8を水に溶解して、PH 6.8に調整し、KOHでpH6.8、最終容積を50mLに調整し、フィルター滅菌し、4°Cで保管します。
  7. 0.5 Mカリウムエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N',N'-テトラ酢酸(K-EGTA,pH 7.7)を水中に47.5 g溶解して調製し、KOHでpH 7.7に調整し、最終体積を250mL、滅菌フィルター、および室温で処理します。
  8. BRB80(80 mM K-PIPES、pH 6.8;1 mM K-EGTA;1 mM塩化マグネシウム[MgCl2])溶液を0.5Mパイプの3.2 mL、0.5 M K-EGTAの40 μL、1 MMgCl2 の20 μLを混合して調製し、最終容積を20mLに調整します。4 °Cで保管。
  9. 435mgのPMSFをイソプロパノールに溶解して0.1Mのフェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)を調製し、25mLの最終容積を得て、-20°Cで保存します。
  10. プロテアーゼ阻害剤を調製し、10mgのアプロチニン、10mgのロイペプチン、4-(2-アミノエチル)-フルオライド10mgを水中に溶解して2.5mLの最終体積を得、100μLのアリコートを作り、-20°Cで保存する。
  11. トリトンX-100の5 mLを45mLの水に混ぜ、フィルター滅菌し、室温で保存して10%トリトンX-100を調製します。
  12. リシスバッファーを準備する (BRB80 1 mM 2-メルカプトエタノールを添加, 1 mM PMSF, 1xプロテアーゼ阻害剤は、必要に応じてHEK-293細胞、0.2%トリトンX-100)2.5μLの2-メルカプトエタノールとBRB80の20 mLを混合することにより、2.2%トリトンX-100)を混合し、200μLの0.1 M PMSF、100 μLのプロテアーゼ阻害剤を混合し、かつ29K-HE-23-293細胞の場合、400 μLの 10% トリトン X-100。
    注:2-メルカプトエタノールは有毒であり、ヒュームフードに使用する必要があります。
  13. 9.5mLの水にGTPの1gを溶解して0.2 M GTPを準備し、KOHを用いてpHを7.5に調整し、20μLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。 フリーズ解凍サイクルを繰り返さないようにしてください。
  14. 60.56 gのトリスを水に溶解して1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl)を調製し、HClでpH6.8に調整し、最終容積500mLに完全に調整し、フィルター滅菌し、室温で保存します。
  15. 5xレムリサンプルバッファー(450 mMジチオスライト(DTT);10%ドデシルスルフェートナトリウム(SDS);400 μM Tris-HClを準備し、 pH 6.8; 50% グリセロール; 〜0.006% ブロモフェノールブルー) 16 mLの予熱 1 M トリス-HClの 4 g を加えることによって、 pH 6.8, 溶液を穏やかに混合した。2.6 gの DTT と 20 mL のグリセロールを混合し、溶液が均質になるまでかき混ぜます。必要な色の強度に到達するために、希望する量のブロモフェノールブルー(2.5mg)を加えます。5 mLアリコートを作り、-20 °Cで保管してください。 5xストックを蒸留水に希釈して、レムリサンプルバッファーの2倍の作業溶液を調製します。

2. 管状の源の増幅と収穫

注:このプロトコルでは、3つの尿管源が使用されました:(i)細胞(HeLa S3およびHEK-293)は懸濁培養物として増殖しました。(ii) 細胞を接着培養物として増殖 (HEK-293, HeLa, U2 OS);(iii)マウス脳組織。このプロトコルは、尿細管精製の日を「0日目」と考え、それに応じて、0日目に対して他のステップが記載されている。

  1. 細胞の増幅
    1. 懸濁培養液として増殖した細胞
      注:懸濁液培養からチューブリンを正常に精製するには、少なくとも2Lの懸濁液培養液を使用してください。
      1. 2Lの懸濁液培養については、好ましい細胞型を復活させ、調製日の10日前に6×107個の細胞を得た。日-10に、プレート1板あたり107細胞で6つの15 cm直径の皿の上に細胞を版。
      2. 8日目に、必要な量の完全な培地を37°Cに予熱します。 滅菌条件下で各スピナーボトルに1Lの予熱媒体を加えます。20~25 rpmの細胞培養インキュベーター内にセットされたスターラーテーブルの上にスピナーを置き、外側のスピナーキャップを少し開けて、培地をインキュベーターの雰囲気に平衡させます。
        注:汚染を避けるために、70%エタノールを使用してメディアとスピナーボトルの外面を徹底的に清掃してください。
      3. 7日目に、トリプシン化し、合流率80~90%(約1.8×108細胞)に成長した細胞を集めます。一度に3皿から細胞を収集し、スピンダウン(200×g、5分、室温)、DMEMの10 mL内のすべての細胞を再中断します。
        注:この時点での細胞の徹底的な解離は、細胞の生存に影響を与え、低い尿管収量をもたらすスピナーボトル内のより大きな凝集体の形成を避けるために非常に重要です。
      4. DMEMの1 Lを含む各紡皮瓶に細胞懸濁液の5 mLを加え、細胞培養インキュベーターのスターラーテーブルにスピナーを戻し、細胞が1週間増殖することを可能にする。
    2. 接着培養物として増殖する細胞
      注:接着細胞からチューブリンを正常に精製するには、80〜90%の合流度の10皿以上を使用してください。
      1. 目的の細胞タイプを復活させ、増幅し、11×108細胞を、尿管製剤の日の3日前に得る。
      2. 3日目に、10個の15cm皿に10個の15cmの皿を10個皿10×10個7個の細胞に入れ、合流率80~90%成長させます。
      3. 1日目には、必要に応じて、プラスミドを用いたトランスフェクト細胞を、チューブリン修飾酵素または特定のチューブリンアイソタイプを発現させる。
  2. 細胞/脳組織の収穫
    1. 懸濁培養液として増殖した細胞
      1. 250×g、15分、室温で1L遠心分離機ボトル(材料表)とペレット細胞にスピナーからの細胞懸濁液を移します。すぐにスピナーボトルにHeLa S3細胞の別の培養を開始するために、スピナーに細胞懸濁液の100 mLを残し、スピナーボトルに完全な、事前加熱されたDMEMの1 Lを追加します。
        注:チューブリンの精製を進める前に、細菌汚染を慎重に確認してください。
      2. 10 mLの氷冷PBSで各遠心分離器ボトルからペレット化された細胞を再懸濁し、すべての細胞を50 mLスクリューキャップチューブに移します。再懸濁時には、細胞を氷の上に置いておきます。250×gで細胞をペレット、15分、4°C。
        注:スピナーボトルのクリーニングと保管に関する推奨事項に従ってください( 資料表を参照)。
      3. 上清を捨てて、細胞ペレットの体積を決定します。2 Lの懸濁液培養液(2本のスピナーボトル)から、5~6 mLの細胞ペレットを期待します。
        注: 以下に説明するプロトコルでは、セルペレットの体積は 10 mL であると想定しています。ペレットの体積に応じて実験を調整します。
      4. 1ボリューム(10mL)のリシスバッファーを加え、細胞ペレットを再中断します。
        注: 細胞ペレットの体積とリシスバッファーの体積の比率は、尿細管の精製を成功させるために非常に重要です。より多くのリシスバッファーを追加すると、チューブリン濃度が低下し、重合に必要な臨界濃度に達しないため、チューブリン収率が大幅に低下します。
        注:リシスバッファーに再懸濁した細胞は、液体窒素でスナップ凍結し、2ヶ月間-80°Cで保存することができます。
    2. 接着培養物として増殖する細胞
      注:接着培養物の細胞は、尿細管の精製を成功させるために非常に迅速に収穫する必要があります(15cmの皿を10個収穫するための約15分)。このプロトコルのステップには3人が参加しました。
      1. 皿を傾けて15cmの皿から培地を取り出し、室温でPBS-EDTAの7mLで細胞を静かに洗います(人1)。ミディアムやバッファなしで細胞を残すことを避けるために、一度に3つの15 cmの皿でのみ動作します。
      2. 5 mLのPBS-EDTAを細胞に加え、室温で5分間インキュベートします。
      3. セルリフターを使用して、細胞を皿の片端(人2)にシャベルで優しく取り外し、50 mLスクリューキャップチューブ(人3)にすべての細胞を集めます。PBS-EDTAの追加の2 mLで各プレートを洗いすき、残りの細胞を皿から採取します。このステップの間、氷の上に細胞懸濁液を含む50 mLスクリューキャップチューブを保ちます。
      4. 250×gで細胞をペレット、10分、4°C。 上清を捨てて、細胞ペレットの体積を決定します。10個の15cmの皿から〜1mLの容積を期待してください。
        注: 以下に説明するプロトコルでは、セルペレットの体積は 10 mL であると想定しています。ペレットの体積に応じて実験を調整します。
      5. 細胞を1体積(10mL)のリシスバッファーで再懸濁します。
        注:リシスバッファーに再懸濁した細胞は、-80 °Cで最大2ヶ月間保存することができます。
    3. 脳組織
      注:任意の年齢、性別、または遺伝的背景のマウスを使用することができます。トランスジェニックマウス株の選択は、対処されるべき科学的な質問に依存します。本稿では、ttll1-/-マウスから精製されたチューブリンの例を示し、主要な脳グルタミン酸酵素を欠き、チューブリンチロシンリガーゼ様1(TTLL1)タンパク質31を示す。
      1. 頸部脱臼でマウスを犠牲にし、すぐに首を切り落とし、脳を丸底チューブに集める。脳に過剰な血液がある場合は、すぐにリシスバッファーで洗浄します。死後の遅延が尿管の精製の成功に影響を与える可能性があるとして、マウスが犠牲になるとすぐに脳を収集します。均質化に使用するプローブの幅に合わせて、丸底チューブを使用します。
        注:収集されたマウスの脳は液体窒素でスナップ凍結することができ、3年まで-80°Cで保存することができます。
      2. 成虫マウスから抽出した単一の脳に500μLのリシスバッファーを加えます。プロトコルの残りの部分については、追加されるリシスバッファの体積は10 mLであると仮定する。使用する脳の数に応じて実験を調整します。

3. 細胞または脳組織のリシス

  1. 懸濁培養液として増殖した細胞
    1. HEK-293の場合、異なる幅のピペットチップを使用して繰り返し上下にピペットを使用して、氷上の細胞を分解します。まず、p1000チップを10 mLピペットに取り付け、5分ごとに細胞懸濁液を上下にピペットし、10分間(ピペットングの3サイクル)します。次に、p200チップをp1000チップに取り付け、さらにピペットを5分ごとに20分間(ピペットの5サイクル)に取り付けます。
    2. HeLa S3 の場合、フランス語プレスを使用してセルをライスします (設定については 、資料一覧 を参照)。
    3. 1/100ボリューム のリシスミックス(L)(200 μL、20mL L)を取り、同じ体積の2xレムリバッファーを加え、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
  2. 接着培養物として増殖する細胞
    1. 超音波処理器プローブに対応するために高さが減少した14 mLラウンドボトムチューブにセルを転送します(設定については 、材料表 を参照)。細胞を~45パルスに超音波処理し、顕微鏡下でリシスミックスの滴をサンプリングして細胞のライシスを確認します。
      注:パルスの数は、チューブリンの精製に使用される細胞タイプによって異なる場合があります。細胞を超音波処理しすぎると、チューブリンが沈殿し、精製収量に悪影響を及ぼす可能性があります。
    2. p200チップを使用して、5分ごとに氷の上で細胞を上下にピペット(ピペットの5サイクル)にピペットします。
    3. 1/100体積 のリシスミックス(L)(200 μL、L20mL)を取り、同じ体積の2xレムリバッファーを加え、5分間沸騰し、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
  3. 脳組織
    1. 組織ブレンダーを使用して脳組織をライゼします(設定については 、材料表 を参照)。あるいは、マイクロチューブの害虫または同等の装置を使用して組織をライスし、18G針の1 mLシリンジを用いて氷の上でピペットを上下にする。
    2. 1/100体積 のリシスミックス(L)(200μL、L20mL)を取り、同じ体積の2xレムリバッファーを加え、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。

4. チューブリンの精製

  1. リセートの明確化
    1. 150,000×g、4°C、30分で遠心分離することにより、溶解液(溶解液の分離、溶解液の溶解分率)をクリアします。超遠心回転子とチューブの詳細については、資料表を参照してください。細胞抽出物の場合、遠心分離後に白い浮遊層が形成されることがよくあります。この浮遊層は上清と共に、チューブリン重合を妨げるので転写しないでください。長い20Gまたは21Gの針に取り付けられた適切なボリュームの注射器を使用して、浮遊層を邪魔することなく優しく上清を除去します。上清がまだ曇っている場合は、5,000×gで遠心分離機、4°Cで10分間。
    2. 上清(SN1)を超遠心チューブに移し、その体積をメモします。10 mLのセルペレットの場合、SN1の体積は〜12 mLと期待されます。
    3. SN1の1/100体積 (SN1の12mLのための120 μL)を取り、2xレムリバッファーの同じ容積を加え、5分間沸騰し、さらに分析のために-20°Cで保存します。
    4. SN1 と同じボリュームを使用して、BRB80 (材料表) のペレット (P1) を再懸濁します。P1の1/100体積 (P1の20mLのための200 μL)を取り、2xレムリバッファーの同じ容積を加え、5分間沸騰し、さらに分析のために-20°Cで保存します。
  2. 低モルティリ度バッファーにおける第1重合
    1. SN1(12 mL)の1体積、0.2M GTP(60μL;最終濃度1mM)の1/200体積 、適当な体積のスクリューキャップチューブ内の0.5体積のプリ加熱グリセロール(6mL)を組み合わせて重合ミックスを調製します。
      注:グリセロールは、プロトコル全体の重合ステップで混雑剤として使用され、したがって、他の成分の濃度の計算では考慮されません。
    2. ピペットは上下に混合し、気泡の形成を避け、適切な超遠心チューブに移します。
      注:ミックスをチューブに転送しながら、チューブの重量を(ペアで)調整します。これにより、実験者は、重合工程後の微小管の沈降に直接進むことができます。プロトコル全体のすべての重合ステップでこれを行います。
    3. パラフィルムでチューブを覆い、30°Cに設定されたウォーターバスに移し、20分間インキュベートします。
    4. チューブを150,000×g、30°Cで30分間遠心します。上清(SN2)を取り除き、重合した微小管(P2)のペレットを保持する。
      メモ:微小管ペレットは、スナップ冷凍することができ、1年まで-80°Cで保存することができます。
    5. SN2の1/200第 1量(18 mL SN2のための90 μL)を取り、2xレムリバッファーの同じ容積を加え、5分間沸騰し、さらに分析のために-20°Cで保存します。
  3. 第1の脱重合
    1. ペレットP2に氷冷BRB80を加えて微小管を脱重合し、5分間氷上に放置します:細胞からのチューブリンの場合は1/60th(200 μL)を加え、脳からチューブリンの場合はSN1の体積の1/20(600 μL)を加えます。
      注:脱重合工程中にペレットに添加される氷冷BRB80の体積は、常にSN1の体積に対して相対的です。
    2. 溶液が完全に均質になるまで、気泡を避けて、微小管ペレットを穏やかに再懸濁します。ピペット数サイクルにp1000チップを使用し、その後5分ごとにp200チップを20分間使用します(ピペット処理の5サイクル)。これは、チューブリン精製の成功のための重要なステップです。
    3. 溶液を適切な超遠心チューブに移し、150,000×g、4°Cで20分間スピンダウンします。SN3を新しい1.5 mL超遠心チューブに移します。この遠心分離工程(P3)の後に形成されたペレットには、沈殿タンパク質(微小管関連タンパク質またはLIP)および非脱重性微小管が含まれています。上清(SN3)は、可溶性成分を含んでいる:脱重合されたチューブ状素子およびMAPsは、脱重合された微小管から剥離している。
    4. SN3を1~4μLとし、9体積の2xレムリバッファーを加え、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
    5. B80(同じ容量のSN3)のペレットP3を再び中断し、1~4μLを取り、2x Laemmliバッファーを9巻追加し、5分間沸騰し、-20°Cで保管します。
  4. 第二重合(高モルリティバッファー内)
    1. 1体積のSN3(200 μL)、1体積の予熱1Mパイプ(200μL、最終濃度0.5M)、0.2M GTP(2μL、最終濃度1mM)、適当な体積のチューブ内に1ボリュームのプリ加熱グリセロール(200μL)を組み合わせて重合ミックスを調製します。
    2. ピペットは上下に混合し、気泡の形成を避け、超遠心チューブに移します。
    3. パラフィルムでチューブを覆い、30°Cに設定されたウォーターバスに移し、20分間インキュベートします。
    4. チューブを150,000×g、30°Cで30分間遠心分離します。上清(SN4)を取り除き、重合した微小管(P4)のペレットを保持する。ペレットP4は重合された微小管を含み、上清SN4には非重合チューブ、MAP、および他の可溶性タンパク質が含まれています。
      注:2回目の重合工程後の微小管ペレットは、スナップ凍結し、-80°Cで最大1年間保存することができます。
    5. 1~4 μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを追加し、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
  5. 第2の脱重合
    1. ペレットP4に氷冷BRB80を加えて微小管を脱重合し、5分間氷上に放置します:細胞からのチューブリンの場合は1/100th(120 μL)を加え、脳からチューブリンの場合はSN1の体積の1/40(300 μL)を加えます。
    2. ピペットは、5分ごとにp200チップで上下に、20分間(ピペットの5サイクル)を行います。
    3. 溶液を1.5mL超遠心チューブに移し、150,000×g、4°Cで20分間スピンダウンします。SN5を新しい1.5 mL超遠心チューブに移します。この遠心分離工程(P5)の後に形成されたペレットは非脱重性微小管を含有する。上清(SN5)は、可溶性の尿細管を含有する。
    4. 1~4 μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを追加し、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
    5. ペレットP5をBRB80(同じ容量のSN5)で再懸濁し、1~4μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを追加し、5分間沸騰し、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
  6. 第三重合(低モルリティバッファー内)
    1. 重合ミックスを調製:SN5(120 μL)の1/200第 1体積(0.6μL、最終濃度は1mM)、適当な体積のチューブ内のプリ加熱グリセロール(60μL)の0.5体積。
    2. ピペットは上下に混合し、気泡の形成を避け、適切な超遠心チューブに移します。
    3. パラフィルムでチューブを覆い、30°Cに設定されたウォーターバスに移し、20分間インキュベートします。
    4. チューブを150,000×g、30°Cで30分間遠心分離します。ペレット(P6)は、重合微小管を含有し、上清SN6は、非重合チューブリンの少量を含む。
      メモ:微小管ペレットは、スナップ冷凍することができ、1年まで-80°Cで保存することができます。
    5. 1~4 μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを追加し、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
  7. 第3の脱重合
    1. ペレットP6に氷冷BRB80を加えて微小管を脱重合し、5分間氷上に放置します:細胞からのチューブリンの場合は1/100th(120 μL)を加え、脳からチューブリンの場合はSN1の体積の1/40(300 μL)を加えます。
    2. ピペットは、5分ごとにp200チップで上下に、20分間(ピペットの5サイクル)を行います。
    3. 溶液を適切な超遠心チューブに移し、150,000×g、4°Cで20分間スピンダウンします。SN7を新しい1.5 mL超遠心チューブに移します。ペレット(P7)は、非非重合性微小管を少量含む。上清(SN7)は、排他的に脱重合された微小管(可溶性チューブリン)を含む。
    4. 1~4 μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを追加し、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
    5. ペレットP7をBRB80(同じSN7の体積)で再懸濁し、1~4μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを加え、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
    6. チューブリンの量を定量化 ( 代表的な結果を参照)、アリコート SN7 を少量にし、スナップ凍結し、-80 °Cで保管します。

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Representative Results

この方法の主な目的は、精製された成分を使用して繰り返しインビトロ実験を行うのに十分な量の高品質でアセンブリに有能なチューブリンを製造することです。この管状から組み立てられた微小管は、動的または安定した微小管を用いた全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡技術に基づく再構成アッセイに用いることができ、微小管ダイナミクス、MAPsまたは分子モータとの相互作用、およびモータ25による力発生を試験する実験において。それらはまた、微小管MAP共ペレットアッセイおよび固体NMR分光法28に使用することができる。

精製プロセス全体を通して尿細管の濃縮および純度は、クーマッシー染色SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲル、好ましくは「TUB」SDS-PAGEゲルを用いて監視することができ、αおよびβチューブリンの分離を可能にする、古典的なゲル32の単一バンドとして共に移行する。異なるステップで採取されたライセート(最後の脱重合を除き、プロトコルを参照)は、チューブリン精製の成功を評価するための同等の量でゲルにロードされる(図2A)24。非常に貴重である最終的なチューブリンサンプルは、チューブリン濃度の決定のためにゲルにロードされるだけです。重合と脱重合の繰り返しサイクルの過程でいくつかのチューブリンを失うことは正常です。最終的な精製されたチューブリンの予想より低い収量は、(i)微小管の不完全な脱重合のいずれかによる可能性があり、 分画P3、P5、P7、または(ii)微小管への非効率的なチューブリン重合における重要な量のチューブリンの存在によって可視化され、その場合、より少ない量の管状が分画P2、P4、およびP6に存在し、その場合は分数SN2、SN4、およびSN6(図2B)に存在する。重合工程中にチューブリンが失われた場合(P2およびP4の量が少ない)(i)重合時に十分な尿素濃度を確保(ii)GTPの新鮮なアリコートを使用し、かつ/または(iii)重合反応の温度を再確認する。減重工程(SN3およびSN5の量が少ない)の間にチューブリンが失われた場合は、時間を増やし、氷上での混合物のピペット化も行います。

精製されたチューブリンの定量化のために、SDS-PAGE上の既知の量のウシ血清アルブミン(BSA、0.5 μg – 1 μg – 2 μg– 4 μg)と一緒にサンプルを実行します。ゲルは、クマシーブリリアントブルーで染色され、スキャンされ、BSAおよびチューブリンバンドの強度は、https://openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ に記載されているように定量的な濃度測定(図3B)によって測定されます。同じ分析は、フィジー、ImageJ33のアップグレード版で行うことができますことに注意してください。BSAバンドからの値は、チューブリンバンド中のタンパク質の量を計算するために使用された線形回帰式を決定するために使用されました。BSA曲線の範囲内のチューブリンバンド強度のみが、チューブリン濃度を決定するために使用される。計算されたチューブリン濃度に基づいて、所望の量の尿細管のアリコートが調製され、液体窒素中でスナップ凍結され、−80°Cで保存される。 HeLa S3懸濁液培養物の4本の紡主体(細胞の約15g)から約2mgのチューブリンを通常得る、直径15cmの皿から250μgのチューブリン(細胞の約1.2g)、マウス脳組織の1gから約1mgのチューブリンを得る。

特定のチューブリンアイソタイプまたは修飾の濃縮を確認するために、精製されたチューブリンの〜0.1μgは、それぞれの抗体34、35を用いて免疫ブロットすることができる。コントロールチューブリンは、目的の管状に応じて異なります。修飾酵素を用いてインビトロで変性されたチューブリンについては、非処理されたチューブリンをコントロールとして使用する。修飾酵素の過剰発現によりセルロで修飾されたチューブリンについては、その酵素をコントロールとして発現しない細胞から精製したチューブリンを用いる(図4A)。ノックアウトマウス脳から精製されたチューブリンのコントロールチューブリンは、野生型マウス由来のチューブリンになります(図4B)。すべての免疫ブロット分析において、PTM非依存性抗α尿管抗体(12G10)を用いて、同量の尿管が検証される。

Figure 1
図1:重合脱重合サイクルを用いた異なる供給源からのチューブリン精製。(A) チューブリンの異なる供給源は、特定の戦略を使用して lysed される。懸濁液で培養されたHeLa S3細胞は、フランスのプレスを使用してlysedされる。HEK-293細胞は、繰り返しピペットによってリセッティングされる。接着細胞は、組織ホモジナイザーを用いて超音波処理およびマウス脳組織の短いパルスを使用して、lysedした。(B)冷逆重合および温重合のサイクルを用いたチューブリン精製プロトコルの連続ステップの概略図。リシスおよびリセートの明確化後、微小管を重合し、ペレット化する。その後、微小管を脱重化し、その後高モルリティバッファーで重合させ、微小管関連タンパク質(MAP)を微小管と共沈殿させるのを防ぎます。MAPフリー微小管は、次いで脱重合され、さらに高モルティブバッファーの微量を除去するために重合脱重合の第3サイクルに供することができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:尿細管精製の成功を評価する。チューブリン精製プロトコルの異なるステップで採取したサンプルは、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドナトリウムゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲル(詳細についてはプロトコルを参照)で実行し、クマシーブリリアントブルーで染色した。(A) 尿細管の精製が成功すると、αおよびβ-管はプロセス全体を通して徐々に濃縮される。2回目の重合の後、微小管ペレット(P4)は、他のタンパク質または微小管関連タンパク質(MAPs)からの汚染を事実上含まない。手順中にチューブリンを失うことは正常であることに注意してください。(B)尿管の精製に失敗すると、最終的なチューブリン収率が低く、そして、末ろが、脱重合後のペレットまたは重合後の上清(赤い箱)に残る。ここに示す例では、チューブリンは、両方の重合工程において効率的に重合しなかった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:クーマシー染色ナトリウムドデシルサルフェート-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルおよびデンセトメトリーを用いた精製チューブリンの定量化。(A)ウシ血清アルブミンの既知の量を有するクマシー染色SDS-PAGEゲル(BSA;0.5、1、2および4μg、灰色の勾配線)および異なるボリューム(それぞれ0.5および1μL、明暗色、それぞれ)精製されたチューブリン。図示した例では、チロシン管ビン(HeLa S3チューブリン、ライトオレンジおよびダークオレンジ)およびデチロシンドチューブリン(カルボキシペプチダーゼA、ライトおよびダークブルーで処理したHeLa S3チューブリン)をゲルに装填した。(B)(A)からBSAバンドをImageJ(任意の単位、AU)を用いて定量化し、負荷されるタンパク質の量(灰色から黒点)に対してプロットした。これらの点は、ゲルにロードされたチューブリンサンプル(明るいオレンジと青の点)中のタンパク質の量を計算するために使用された線形回帰線(灰色のグラデーション線)と方程式を計算するために使用されました。これにより、チューブリンサンプルの濃度の計算が容易に行なわれます。BSA 標準曲線を超える点は、濃度 (濃いオレンジ色と青の点) を決定するために使用しないでください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:異なるPTMを有する精製されたチューブリンの免疫ブロット分析。(A)HEK-293細胞から精製されたチューブリン:野生型、またはTTLL5またはTTLL7を過剰発現する細胞を、GT335抗体を用いてポリグルタミン化の特異的濃縮について分析した。TTLL5過剰発現はαおよびβチューブリン上のポリグルタミン化を増加させるが、TTLL7過剰発現は特にβ-管状グルタミン化を豊かにする。(B)野生型およびttll1-/-マウスの脳組織から精製されたチューブリンをグルタミル化のパターンについて分析した。主要な脳のグルタミラーゼTTLL136を欠いているttll1-/-マウスからの管状突起のポリグルタミン化の強い減少に注意してください。「TUB」ゲルは、αチューブリンとβチューブリンを分離するために使用されました。同量のチューブリン負荷は、抗α尿管抗体である12G10によって確認された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明する方法は、細胞株および単一マウス脳から中量で高品質で組み立て能力の高いチューブリンを迅速に生成するプラットフォームを提供する。これは、長年の分野で使用される牛の脳からの尿細管浄化の金標準プロトコルに基づいています16,17.このアプローチの特に利点は、HeLa S3細胞の懸濁培養物の使用であり、一度確立されると、実践的な時間をほとんど必要とせずに大量の細胞を生み出す。これは、プロトコルは、任意の細胞生物学の研究室で比較的簡単に実行することができます, 他のチューブリン精製方法18,19,32,37特定の機器や専門知識を必要とし、したがって、タンパク質の浄化の強力な背景を持つ研究所によって主に使用されています.接着性細胞株から小量のチューブリンを製造する場合、様々な細胞株を使用することができる。HeLa、U-2 OS、HEK-293細胞のチューブリンの精製に成功しました。より大規模な精製が必要な場合、採取した細胞または脳をリシスバッファーでスナップ凍結し、-80°Cで保存し、複数の細胞ペレットまたは脳を一緒にプールして大量の尿管を精製することができます。

細胞株から精製されたチューブリンは、事実上、チューブリンPTMを含まない。このTyr-tubulinは単一の簡単なステップ25でデチロシン(deTyr-)管状に容易に変換することができる。他のPTMでチューブリンを製造するために、特定のチューブリン修飾酵素は、チューブリン精製の前に細胞で過剰発現することができる。さらに、ヒト起源の細胞株を材料の源として使用することは、微小管とヒトのMAPとの相互作用を研究する際に、潜在的な種間問題を回避するのに役立ちます。また、未形変換(HEK293など)または形質転換(HeLaなど)細胞からの管状は、正常対腫瘍細胞微小管に対する微小管指向薬物(例えば、タキサン)の影響に関する情報を提供することができる。

最後に、我々のプロトコルは、単一のマウス脳からのチューブリンの精製を容易にする。チューブリンの変異および改変のマウスモデルが増加するにつれて、このプロトコルは、改変されたチューブリンアイソタイプ組成物38、39、40またはチューブリンPTM31、41との微小管の特性および相互作用を直接分析することを可能にする。

このアプローチは、重合と脱重合のサイクルに基づいています。したがって、微小管の組立および分解特性に影響を与える特定のPTMを有する特定のチューブリンアイソタイプまたはチューブリンは、精製プロセス中にそのような管状の不均衡な損失または減少をもたらす可能性がある。それにもかかわらず、我々は、主要な管状管PTM、例えばアセチル化、脱チロシン、グルタニル化、および糖化が、管状の精製プロセス24全体にわたって微小管に保持されることを示した。しかしながら、細胞または組織におけるチューブリン組成物の定量的分析のために、TOGカラムベースの尿管精製アプローチは、公平で、重合非依存性の尿管精製18を可能にするほど適切である。制限にもかかわらず、当社のプロトコルは、細心の注意を払って体外再構成実験に使用できる高品質のチューブリンを大量に生成する上で大きな利点を提供します。特に、定期的な実験におけるPTMリッチな脳管管の使用を容易にする。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この研究は、ANR-10-IDEX-0001-0001-02、LabExセルンスケールANR-11-LBX-0038、コンバージェンス研究所Q-life Q-life QR-17-CONV-0005によって支えられました。CJはキュリー研究所によってサポートされています, フランス国立研究庁(ANR)は、ANR-12-BSV2-0007およびANR-17-CE13-0021、国立がん研究所(INCA)補助金2014-PL BIO-11-ICR-1を授与し、フォンダシオンはラ・レシェルシュ・メディカル(FRM)助成金DEQ20170366666666666666666666666年MMMはフォンダシオン・ヴァインクレ・アルツハイマー助成金FR-16055p、およびフランスのアルツハイマー付与AAP SM 2019 n°2023によって支えられている。JASは、マリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金第675737の下で欧州連合のホライゾン2020研究・イノベーションプログラムによって支援され、FRM助成金FDT201904008210。SB は FRM グラント FDT201805005465 によってサポートされました。

私たちは、ジャンケ研究所、特にJ.スープロン、G.ラキシック(MICALIS、アグロパリテック)とA.ゴートロー(エコールポリテクニック)のすべてのメンバーに、プロトコルの確立中に助けてくれてありがとう。私たちは、マウスの繁殖とケアの助けのためにキュリー研究所の動物施設に感謝したいと思います。

J.フランケルとM.ネルソンによって開発された抗体12G10は、NICHDの後援の下で開発された発達研究ハイブリドーマ銀行から取得され、アイオワ大学によって維持されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

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References

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生化学、課題165、微小管、インビトロ再構成、チューブリン、チューブリン精製、重合、微小管動態、チューブリンコード、チューブリンアイソタイプ、懸濁培養、チューブリン後翻訳修飾
重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製
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Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

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