Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rensing av Tubulin med kontrollerte posttranslasjonelle modifikasjoner og isotyper fra begrensede kilder ved polymerisering-depolymeriseringssykluser

Published: November 5, 2020 doi: 10.3791/61826
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver tubulinrensing fra små/mellomstore kilder som dyrkede celler eller enkeltmushjerner, ved hjelp av polymerisasjons- og depolymeriseringssykluser. Den rensede tubulinen er beriket i spesifikke isotyper eller har spesifikke posttranslasjonelle modifikasjoner og kan brukes i in vitro rekonstitueringsanalyser for å studere mikrotubuldynamikk og interaksjoner.

Abstract

Et viktig aspekt ved studier av mikrotubul cytoskeleton er undersøkelse av mikrotubul atferd i in vitro rekonstitueringseksperimenter. De tillater analyse av de iboende egenskapene til mikrotubuler, som dynamikk, og deres interaksjoner med mikrotubule-assosierte proteiner (MAPer). "Tubulin-koden" er et fremvoksende konsept som peker på forskjellige tubulinisotyper og ulike posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMer) som regulatorer av mikrotubule egenskaper og funksjoner. For å utforske de molekylære mekanismene i tubulinkoden, er det avgjørende å utføre in vitro rekonstitueringsforsøk ved hjelp av renset tubulin med spesifikke isotyper og PTMer.

Til dags dato var dette teknisk utfordrende som hjerne tubulin, som er mye brukt i in vitro eksperimenter, havner mange PTMer og har en definert isotype sammensetning. Derfor utviklet vi denne protokollen for å rense tubulin fra forskjellige kilder og med forskjellige isotypesammensetninger og kontrollerte PTMer, ved hjelp av den klassiske tilnærmingen til polymerisasjon og depolymeriseringssykluser. Sammenlignet med eksisterende metoder basert på affinitetsrensing, gir denne tilnærmingen ren, polymerisasjons-kompetent tubulin, da tubulinresistent mot polymerisering eller depolymerisering kastes under de påfølgende rensetrinnene.

Vi beskriver rensing av tubulin fra cellelinjer, vokst enten i suspensjon eller som tilhengerkulturer, og fra enkeltmushjerner. Metoden beskriver først genereringen av cellemasse i både suspensjons- og tilhengerinnstillinger, lysistrinnet, etterfulgt av de påfølgende stadiene av tubulinrensing ved polymeriseringsdepolymeriseringssykluser. Vår metode gir tubulin som kan brukes i eksperimenter som adresserer virkningen av tubulinkoden på de iboende egenskapene til mikrotubuler og mikrotubulinteraksjoner med tilknyttede proteiner.

Introduction

Mikrotubuler spiller kritiske roller i mange cellulære prosesser. De gir cellene sin form, bygger meiotiske og mitotiske spindler for kromosomsegregering, og tjener som spor for intracellulær transport. For å utføre disse forskjellige funksjonene organiserer mikrotubuler seg på forskjellige måter. Et av de spennende spørsmålene på feltet er å forstå de molekylære mekanismene som gjør at de strukturelt og evolusjonært bevarte mikrotubulene kan tilpasse seg denne mengden organisasjoner og funksjoner. En potensiell mekanisme er diversifisering av mikrotubuler, som er definert av konseptet kjent som 'tubulinkoden'1,2,3. Tubulinkoden inneholder to hovedkomponenter: differensialinkorporering av α- og β-tubulingenprodukter (tubulinisotyper) i mikrotubulene og tubulin posttranslational modifikasjoner (PTMer).

Siden 1970-tallet har in vitro rekonstitueringsforsøk, kombinert med utviklende lysmikroskopiteknikker, banet vei for viktige funn om egenskapene til mikrotubuler: dynamisk ustabilitet4 og tredemølle5, og deres andre mekanismer og funksjoner6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Nesten alle in vitro-forsøkene som er utført så langt, har vært basert på tubulin renset fra hjernevev ved hjelp av gjentatte sykluser av polymerisering og depolymerisering16,17. Selv om rensing fra hjernevevet gir fordelen av å skaffe høykvalitets tubulin i store mengder (vanligvis grammengder), er en viktig ulempe heterogeniteten som tubulin renset fra hjernevev er en blanding av forskjellige tubulin isotyper og er beriket med mange tubulin PTMs. Denne heterogeniteten gjør det umulig å avgrense rollen til en bestemt tubulin PTM eller isotype i kontroll av mikrotubule egenskaper og funksjoner. Dermed er det viktig å produsere monterings kompetent tubulin med kontrollerte tubulin PTMer og homogen isotypesammensetning for å adressere molekylmekanismene til tubulinkoden.

Nylig har en tilnærming for å rense tubulin ved affinitetskromatografi ved hjelp av det mikrotubule-bindende TOG -domenet (tumor-overekspressert gen) av gjær Stu2p blitt utviklet18. I denne metoden overføres tubulin i rå lysater av celler eller vev gjennom en kolonne der den binder seg til det matrise-immobiliserte TOG-domenet, noe som gjør det mulig å analysere hele tubulinbassenget til en gitt, til og med veldig liten prøve. En etterlengtet tilnærming for å rense rekombinant tubulin har også blitt beskrevet de siste årene. Den er basert på baculovirussystemet, der en bi-cistronic vektor som inneholder α- og β-tubulingener uttrykkes i insektceller19. Denne metoden er imidlertid veldig tungvint og tidkrevende og brukes derfor mest til å studere effekten av tubulinmutasjoner20 og tubulin isotyper21,22,23 in vitro.

I den nåværende protokollen beskriver vi en metode som bruker den veletablerte og mye brukte polymerisasjonsdepolymeriseringsmetoden som en blåkopi for å generere tubulin med forskjellige nivåer av modifikasjon enten fra cellelinjer eller fra musens hjernevev24. I denne prosedyren sykles tubulin mellom den oppløselige (tubulin dimer ved 4 °C) og polymerisert form (mikrotubul ved 30 °C i nærvær av guanosin 5'-tripfosfat [GTP]). Hver form er skilt gjennom påfølgende trinn i sentrifugering: tubulin dimers vil forbli i supernatanten etter et kaldt (4 °C) spinn, mens mikrotubuler vil bli pelletert ved 30 °C. Videre utføres ett polymerisasjonstrinn ved høy piperazin-N,N′-bis(2-etesulfonsyre) (PIPES) konsentrasjon, noe som gjør det mulig å fjerne mikrotubule-assosierte proteiner fra mikrotubulene og dermed fra den endelig rensede tubulin. Tubulin renset fra HeLa S3 celler vokst som suspensjon eller tilhenger kulturer er nesten fri for noen tubulin PTM og har blitt brukt i nyere in vitro rekonstituering eksperimenter25,26,27,28. Vi har videre tilpasset metoden for å rense tubulin fra enkeltmushjerner, som kan brukes til et stort antall musemodeller med endringer i tubulinistyper og PTMer.

I protokollen beskriver vi først genereringen av kildematerialet (cellemasse eller hjernevev), dets lysis (figur 1A), etterfulgt av de påfølgende trinnene for tubulinpolymerisering og depolymerisering for å rense tubulinen (figur 1B). Vi beskriver videre prosessen for å vurdere renheten (figur 2A, B) og mengden ( figur3A,B) av den rensede tubulinen. Metoden kan tilpasses for å produsere tubulin beriket med en valgt PTM ved å overtrykke et modifiserende enzym i celler før tubulinrensing (figur 4B). Alternativt kan tubulinmodifiserende enzymer legges til tubulin under renseprosessen. Til slutt kan vi rense tubulin som mangler spesifikke isotyper eller PTMer fra hjernen til mus som mangler i de tilsvarende tubulinmodifiserende enzymene (Figur 4B)29.

Metoden vi beskriver her har to hovedfordeler: (i) det tillater produksjon av tilstrekkelig store mengder tubulin på relativt kort tid, og (ii) det genererer ren tubulin av høy kvalitet, med enten spesifikk tubulin isotypesammensetning eller PTMer. I den tilknyttede videoen av dette manuskriptet fremhever vi noen av de kritiske trinnene som er involvert i denne prosedyren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrepleie og bruk for denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene fra Det europeiske fellesskap (2010/63/UE). Eksperimentelle prosedyrer ble spesifikt godkjent av etikkkomiteen i Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisasjon nr. 04395.03 gitt av National Authority) i samsvar med de internasjonale retningslinjene.

1. Utarbeidelse av reagenser for Tubulin Rensing

MERK: Alle bufferne som brukes til tubulinrensing bør inneholde kaliumsalter og IKKE natriumsalter30.

  1. Forbered 1 L av komplett medium: Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM), med 10% foster bovint serum (FBS, 100 ml), 200 mM L-glutamin (10 ml 2 M lager) og 1x penicillin-streptomycin (10 ml 100x lager). Oppbevars ved 4 °C.
  2. Forbered 10 M kaliumhydroksid (KOH) ved å oppløse 140 g KOH i vann, juster det endelige volumet til 250 ml, og lagre ved romtemperatur.
  3. Forbered 0,5 M etylendiamintetraacetisk syre (EDTA), pH 8, ved å oppløse 36,5 g EDTA i vann, juster pH til 8,0 ved hjelp av KOH (ellers vil EDTA ikke oppløses) og det endelige volumet til 250 ml, filtersterilisere og lagre ved romtemperatur.
  4. Forbered 5 mM fosfatbufret saltvann (PBS)-EDTA ved å tilsette 5 ml 0,5 M EDTA til 500 ml PBS, filtersterilisere og lagre ved romtemperatur.
  5. Forbered 0,5 M K-RØR, pH 6,8, ved å oppløse 75,5 g RØR i vann, juster til pH 6,8 med KOH (ellers vil rørene ikke oppløses) og det endelige volumet til 500 ml, filtersterilisere og oppbevares ved 4 °C.
  6. Forbered 1 M K-PIPES, pH 6,8, ved å oppløse 15,1 g RØR i vann, juster til pH 6,8 med KOH og det endelige volumet til 50 ml, filtresteriliser og oppbevar ved 4 °C.
  7. Forbered 0,5 M kalium-etylenglykol-bis(β-aminoetyl eter)-N,N,N′,N′-tetraedsyre (K-EGTA, pH 7.7) ved å oppløse 47,5 g EGTA i vann, justere til pH 7.7 med KOH og det endelige volumet til 250 ml, filtreresterilisere og oppbevare ved romtemperatur.
  8. Forbered BRB80 (80 mM K-PIPES, pH 6,8; 1 mM K-EGTA; 1 mM magnesiumklorid [MgCl2]) oppløsning ved å blande 3,2 ml 0,5 M RØR, 40 μL 0,5 M K-EGTA og 20 μL 1 M MgCl2 og juster det endelige volumet til 20 ml. Oppbevars ved 4 °C.
  9. Forbered 0,1 M fenylmetanesulfonylfluorid (PMSF) ved å oppløse 435 mg PMSF i isopropanol for å oppnå et endelig volum på 25 ml og lagre ved -20 °C.
  10. Forbered proteasehemmere blanding (200x) ved å oppløse 10 mg aprotinin, 10 mg leupeptin og 10 mg 4-(2-aminoetyl)-benzensulfonylfluorid i vann for å oppnå et sluttvolum på 2,5 ml, lage aliquots på 100 μL og lagre ved -20 °C.
  11. Forbered 10% Triton X-100 ved å blande 5 ml Triton X-100 i 45 ml vann, filtersterilisere og lagre ved romtemperatur.
  12. Klargjør Lysis buffer (BRB80 supplert med 1 mM 2-mercaptoetanol, 1 mM PMSF, 1x proteasehemmere blandes og eventuelt for HEK-293 celler, 0,2% Triton X-100) på dagen for tubulinrensing ved å blande 20 ml BRB80 med 1,5 μL 2-mercaptoetanol, 200 μL 0,1 M PMSF, 100 μL av proteasehemmere blandes og eventuelt for HEK-293 celler , 400 μL av 10% Triton X-100.
    MERK: 2-mercaptoetanol er giftig og bør brukes i avtrekkshetten.
  13. Forbered 0,2 M GTP ved å oppløse 1 g GTP i 9,5 ml vann, juster pH til 7,5 ved hjelp av KOH, lag aliquots på 20 μL, og lagre ved -20 °C. Unngå gjentatte fryse-tine sykluser.
  14. Forbered 1 M tris (hydroksymetyl) aminometanhydroklorid (Tris-HCl) ved å oppløse 60,56 g Tris i vann, juster til pH 6,8 med HCl, komplett til et sluttvolum på 500 ml, filtersterilisere og lagre ved romtemperatur.
  15. Forbered 5x Laemmli prøvebuffer (450 mM dithiothreitol (DTT); 10% natrium dodecylsulfat (SDS); 400 μM Tris-HCl, pH 6,8; 50 % glyserol; ~0,006 % bromofenolblå) ved å tilsette 4 g SDS til 16 ml forvarmet 1 M Tris-HCl, pH 6,8 og bland oppløsningen forsiktig. Tilsett 2,6 g DTT og 20 ml 100% glyserol i blandingen og rør til løsningen blir homogen. Tilsett ønsket mengde bromofenolblå (2,5 mg) for å nå ønsket fargeintensitet. Lag 5 ml aliquots og oppbevar ved -20 °C. Forbered 2x arbeidsløsning av Laemmli prøvebuffer ved å fortynne 5x-lageret i destillert vann.

2. Forsterkning og høsting kilder til tubulin

MERK: I denne protokollen ble tre kilder til tubulin brukt: (i) celler (HeLa S3 og HEK-293) dyrket som suspensjonskulturer; (ii) celler dyrket som tilhengerkulturer (HEK-293, HeLa og U2 OS); og (iii) musens hjernevev. Denne protokollen anser dagen for tubulinrensing som 'dag 0', og følgelig er andre trinn beskrevet i forhold til dag 0.

  1. Forsterkning av celler
    1. Celler dyrket som suspensjonskulturer
      MERK: For å rense tubulin fra suspensjonskulturer, bruk minst 2 L suspensjonskultur.
      1. For 2 L suspensjonskultur, gjenopplive og vokse den foretrukne celletypen for å oppnå 6 × 107 celler 10 dager før forberedelsesdagen. På dag -10, plateceller på seks 15 cm diameter retter på 107 celler per tallerken.
      2. På dag -8, forvarm den nødvendige mengden av komplett medium til 37 °C. Tilsett 1 L forvarmet medium til hver spinnerflaske under sterile forhold. Plasser spinnerne på et rørebord satt til 20-25 rpm inne i cellekulturinkubatoren, åpne sidespinnerhettene litt slik at mediet kan likevekte til inkubatorens atmosfære.
        MERK: For å unngå forurensning, rengjør den ytre overflaten av mediet og spinnerflaskene grundig med 70% etanol.
      3. På dag -7, prøv og samle cellene vokst til 80-90% samløp (ca. 1,8 × 108 celler). Samle celler fra 3 retter om gangen, spinn ned (200 × g, 5 min, romtemperatur), og re-suspendere alle celler i 10 ml DMEM.
        MERK: Grundig dissosiasjon av cellene på dette punktet er svært viktig for å unngå dannelse av større aggregater i spinnerflaskene, noe som påvirker celleoverlevelse og resulterer i lavt tubulinutbytte.
      4. Tilsett 5 ml celleoppheng i hver spinnerflaske som inneholder 1 L DMEM, returner spinnerne til rørebordet i cellekulturinkubatoren, og la cellene vokse i en uke.
    2. Celler dyrket som adherent kulturer
      MERK: For å rense tubulin fra adherentceller, bruk minst 10 retter med 80-90% samløp.
      1. Gjenoppliv og forsterk ønsket celletype for å oppnå 1 × 108 celler tre dager før dagen for tubulinpreparatet.
      2. På dag -3, tallerken disse cellene på ti 15 cm retter på 1 × 107celler per tallerken og la dem vokse 80-90% samløp.
      3. På dag -1, om nødvendig, transfekter celler med en plasmid for å uttrykke et tubulinmodifiserende enzym eller en bestemt tubulinisotype.
  2. Høsting av celler/hjernevev
    1. Celler dyrket som suspensjonskulturer
      1. Overfør cellefjæringen fra spinnere til 1 L sentrifugeflasker (Tabell over materialer) og pelletsceller ved 250 × g, 15 min, romtemperatur. For umiddelbart å starte en annen kultur av HeLa S3-celler i spinnerflaskene, la 100 ml cellefjæring i spinnerne, og legg til 1 L komplett, forhåndsoppvarmet DMEM til spinnerflasken.
        MERK: Kontroller nøye for bakteriell forurensning før du fortsetter med tubulinrensing.
      2. Resuspend pelleted celler fra hver sentrifuge flaske i 10 ml iskald PBS, og overføre alle cellene til 50 ml skrue-cap rør. Hold cellene på is under re-suspensjon. Pellet cellene ved 250 × g, 15 min, 4 °C.
        MERK: Følg anbefalingene for rengjøring og oppbevaring av spinnerflasker (se Tabell over materialer).
      3. Kast supernatanten og bestem volumet på cellepelleten. Fra 2 L suspensjonskultur (to spinnerflasker), forvent en cellepellet på 5-6 ml.
        MERK: I protokollen som er beskrevet nedenfor, antas cellepelletsvolumet å være 10 ml. Juster eksperimentet i henhold til pelletsvolumene.
      4. Tilsett 1 volum (10 ml) lysisbuffer og re-suspender cellepelleten.
        MERK: Forholdet mellom cellepelletvolum og lysisbuffervolum er svært viktig for vellykket tubulinrensing. Å legge til mer lysisbuffer reduserer tubulinkonsentrasjonen, som deretter ikke klarer å nå den kritiske konsentrasjonen som trengs for polymerisering, og dermed redusere tubulinutbyttet sterkt.
        MERK: Celler som er resuspendert i lysisbuffer kan fryses i flytende nitrogen og lagres ved -80 °C i to måneder.
    2. Celler dyrket som adherent kulturer
      MERK: Celler fra tilhengerkulturer må høstes veldig raskt for vellykket tubulinrensing (ca. 15 minutter for høsting av ti 15 cm retter). Tre personer deltok i dette trinnet i protokollen.
      1. Fjern mediet fra 15 cm retter ved å helle oppvasken, og vask deretter cellene forsiktig med 7 ml PBS-EDTA ved romtemperatur (person 1). Arbeid bare med tre 15 cm retter om gangen for å unngå å forlate cellene uten medium eller buffer.
      2. Tilsett 5 ml PBS-EDTA i cellene og inkuber dem i 5 minutter ved romtemperatur.
      3. Bruk en celleløfter til å løsne cellene forsiktig ved å skyve dem til en kant av parabolen (person 2), og samle alle cellene i et 50 ml skruehettrør (person 3). Skyll hver tallerken med ytterligere 2 ml PBS-EDTA for å samle eventuelle gjenværende celler fra oppvasken. I løpet av dette trinnet, hold 50 ml skruehettrør som inneholder cellefjæringen på is.
      4. Pellet cellene ved 250 × g, 10 min, 4 °C. Kast supernatanten og bestem volumet på cellepelleten. Forvent et volum på ~ 1 ml fra ti 15 cm retter.
        MERK: I protokollen som er beskrevet nedenfor, antas cellepelletsvolumet å være 10 ml. Juster forsøkene i henhold til pelletsvolumene.
      5. Resuspend cellene i 1 volum (10 ml) lysis buffer.
        MERK: Celler som er resuspendert i lysisbuffer kan lagres ved -80 °C i opptil to måneder.
    3. Hjernevev
      MERK: Mus i alle aldre, kjønn eller genetiske bakgrunner kan brukes. Valget av den transgene musestammen vil avhenge av det vitenskapelige spørsmålet som skal løses. I dette manuskriptet viser vi eksempelet på tubulin renset fra ttll1-/- musen, mangler en stor hjerneglutamylerende enzym, tubulin tyrosin ligase-lignende 1 (TTLL1) protein31.
      1. Ofre musen ved cervical dislokasjon, raskt halshugge, og samle hjernen i en rundbunnsrør. Hvis det er overflødig blod på hjernen, vask raskt med lysisbuffer. Samle hjernen så snart musen er ofret som en post-mortem forsinkelse kan påvirke suksessen med tubulin rensing. Bruk rundbunnsrør for å imøtekomme bredden på sonden som brukes til homogenisering.
        MERK: Innsamlede musehjerner kan fryses i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 °C i opptil 3 år.
      2. Tilsett 500 μL lysisbuffer til en enkelt hjerne ekstrahert fra en voksen mus. For resten av protokollen antas volumet av lysisbuffer lagt til å være 10 ml. Juster for eksperimentet ditt i henhold til antall hjerner som skal brukes.

3. Lysis av celler eller hjernevev

  1. Celler dyrket som suspensjonskulturer
    1. For HEK-293 lyser cellene på is ved å pipettere opp og ned gjentatte ganger ved hjelp av pipettespisser av forskjellige bredder. Fest først en p1000-spiss til en 10 ml pipette, og pipette cellefjæringen opp og ned hver 5 min, i 10 min (tre pipetteringssykluser). Deretter fester du en p200-spiss til en p1000-spiss og ytterligere pipette hver 5 min, i 20 min (fem sykluser med pipettering).
    2. For HeLa S3 lyser cellene ved hjelp av en fransk presse (se Tabell over materialer for innstillinger).
    3. Ta 1/100th volum av lysis mix (L) (200 μL for 20 ml L), og tilsett samme volum av 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og lagre ved -20 °C for videre analyse.
  2. Celler dyrket som adherent kulturer
    1. Overfør cellene til et 14 ml rundbunnsrør hvis høyde er redusert for å imøtekomme lydsonden (se Tabell over materialer for innstillinger). Soniker cellene for ~45 pulser, og bekreft cellelys ved å ta prøver av en dråpe lysisblanding under et mikroskop.
      MERK: Antall pulser kan variere avhengig av celletypen som brukes til tubulinrensing. Sonikering av celler for mye kan føre til at tubulin utfelles og vil påvirke renseutbyttet negativt.
    2. Pipette cellene opp og ned på is hvert 5 min i 20 min (fem sykluser med pipettering), ved hjelp av en p200-spiss.
    3. Ta 1/100th volum lysis mix (L) (200 μL for 20 ml L) og tilsett samme volum 2x Laemmli buffer, kok i 5 min og lagre ved -20 °C for videre analyse.
  3. Hjernevev
    1. Lyse hjernevevet ved hjelp av en vevsmikser (se Materialtabell for innstillinger). Alternativt kan du lyse vevet ved hjelp av en mikrotube pestle eller et tilsvarende utstyr og pipette opp og ned på is med en 1 ml sprøyte med en 18 G nål.
    2. Ta 1/100th volum lysis mix (L) (200 μL for 20 ml L), og tilsett samme volum 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og lagre ved -20 °C for videre analyse.

4. Rensing av Tubulin

  1. Lysate avklaring
    1. Fjern lysatet (separer pellet og løselig brøkdel av lysisblandingen) ved sentrifugering ved 150.000 × g, 4 °C, 30 min. Se Tabell over materialer for detaljer om ultracentrifuge rotorer og rør. For celleekstrakter dannes ofte et hvitt flytende lag etter sentrifugering. Ikke overfør dette flytende laget sammen med supernatanten, da det forstyrrer tubulinpolymerisering. Bruk en sprøyte med passende volum festet til en lang 20 G eller 21 G nål for å forsiktig fjerne supernatanten uten å forstyrre det flytende laget. Hvis supernatanten fortsatt er overskyet, sentrifuge ved 5000 × g, 4 °C i 10 minutter.
    2. Overfør supernatanten (SN1) til et ultracentrifuge rør og noter volumet. For en 10 ml cellepellet, forvent et volum på ~ 12 ml for SN1.
    3. Ta 1/100th volum SN1 (120 μL for 12 ml SN1), og tilsett samme volum 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og lagre ved -20 °C for videre analyse.
    4. Resuspend pellets (P1) i BRB80 (Tabell over materialer) med samme volum som SN1. Ta 1/100th volum P1 (200 μL for 20 ml P1), og tilsett samme volum 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og lagre ved -20 °C for videre analyse.
  2. Første polymerisering i buffer med lav molaritet
    1. Forbered polymerisasjonsblandingen ved å kombinere 1 volum SN1 (12 ml), 1/200th volum 0,2 M GTP (60 μL, sluttkonsentrasjon 1 mM) og 0,5 volum for oppvarmet glyserol (6 ml) i et skruehettrør med riktig volum.
      MERK: Glyserol brukes som et trengselmiddel i polymerisasjonstrinnene gjennom hele protokollen og vurderes derfor ikke i beregningene av andre komponenters konsentrasjoner.
    2. Pipette blandingen opp og ned, unngå forsiktig dannelsen av luftbobler og overfør den til de aktuelle ultracentrifuge rørene.
      MERK: Mens du overfører blandingen til rørene, juster vekten på rørene (parvis). Dette gjør at eksperimenteren direkte kan fortsette til sedimentering av mikrotubuler etter polymerisasjonstrinnet. Gjør dette for alle polymerisasjonstrinn gjennom hele protokollen.
    3. Dekk rørene med parafilm, overfør til et vannbad satt til 30 °C, og inkuber i 20 minutter.
    4. Sentrifuger rørene ved 150 000 × g, 30 °C i 30 minutter. Fjern supernatanten (SN2), og hold pelletsen av polymeriserte mikrotubuler (P2).
      MERK: Mikrotubulpellet kan fryses og oppbevares ved -80 °C i opptil 1 år.
    5. Ta 1/200th volum SN2 (90 μL for 18 ml SN2) og tilsett samme volum 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og lagre ved -20 °C for videre analyse.
  3. Første depolymerisering
    1. Depolymeriser mikrotubuler ved å legge til iskald BRB80 til pellets P2, og la på is i 5 min: for tubulin fra celler, tilsett 1/60th (200 μL), og for tubulin fra hjerner, tilsett 1/20th (600 μL) av volumet av SN1.
      MERK: Volumet av iskald BRB80 lagt til pellets under depolymeriseringstrinn er alltid i forhold til volumet av SN1.
    2. Resuspend mikrotubule pellet forsiktig, unngå luftbobler, til løsningen er helt homogen. Bruk en p1000-spiss for et par pipetteringssykluser etterfulgt av en p200-spiss hver 5 min, i 20 min (fem pipetteringssykluser). Dette er et avgjørende skritt for suksessen til tubulinrensingen.
    3. Overfør løsningen til passende ultracentrifuge rør, og spinn ned på 150,000 × g,4 °C i 20 minutter. Overfør SN3 til et nytt 1,5 ml ultrasenterrør. Pellet dannet etter dette sentrifugeringstrinnet (P3) inneholder utfelte proteiner (mikrotubule-assosierte proteiner eller MAPer) og ikke-depolymeriserte mikrotubuler. Den supernatante (SN3) inneholder løselige komponenter: depolymeriserte tubulin dimers og MAPs, som har løsnet fra de depolymeriserte mikrotubulene.
    4. Ta 1-4 μL SN3, og tilsett 9 volumer 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og lagre ved -20 °C for videre analyser.
    5. Resuspend pellet P3 i BRB80 (i samme volum SN3), ta 1-4 μL, og tilsett 9 volumer av 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og lagre ved -20 °C.
  4. Andre polymerisasjon (i buffer med høy molaritet)
    1. Forbered polymerisasjonsblandingen ved å kombinere 1 volum SN3 (200 μL), 1 volum foroppvarmet 1 M PIPES (200 μL, sluttkonsentrasjon 0,5 M), 1/100th volum på 0,2 M GTP (2 μL, sluttkonsentrasjon 1 mM) og 1 volum for oppvarmet glyserol (200 μL) i et rør med riktig volum.
    2. Pipette blandingen opp og ned, unngå dannelse av luftbobler, og overfør den til ultracentrifuge rør.
    3. Dekk rørene med parafilm, overfør dem til et vannbad satt til 30 °C, og inkuber i 20 minutter.
    4. Sentrifuger rørene ved 150.000 × g, 30 °C i 30 min. Fjern supernatanten (SN4), og hold pelletsen av polymeriserte mikrotubuler (P4). Pellet P4 inneholder polymeriserte mikrotubuler, og den supernatante SN4 inneholder upokalymeriserte tubulin,MAPer og andre løselige proteiner.
      MERK: Mikrotubulpelleten etter det andre polymerisasjonstrinnet kan fryses og lagres ved -80 °C i opptil 1 år.
    5. Ta 1–4 μL og tilsett 9 volumer 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og oppbevar ved -20 °C for videre analyser.
  5. Andre depolymerisering
    1. Depolymeriser mikrotubuler ved å legge til iskald BRB80 til pellets P4, og la på is i 5 min: for tubulin fra celler, tilsett 1/100th (120 μL), og for tubulin fra hjerner, tilsett 1/40th (300 μL) av volumet av SN1.
    2. Pipette opp og ned med en p200 spiss hver 5 min, i 20 min (fem sykluser med pipettering).
    3. Overfør løsningen til et 1,5 ml ultracentrifuge rør, og spinn ned på 150.000 × g, 4 °C i 20 minutter. Overfør SN5 til et nytt 1,5 ml ultracentrifuge rør. Pellet dannet etter dette sentrifugeringstrinnet (P5) inneholder ikke-depolymeriserte mikrotubuler. Den supernatante (SN5) inneholder den oppløselige tubulinen.
    4. Ta 1–4 μL og tilsett 9 volumer 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og oppbevar ved -20 °C for videre analyser.
    5. Resuspend pellet P5 i BRB80 (samme volum SN5), ta 1-4 μL, og tilsett 9 volumer av 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og lagre ved -20 °C for videre analyser.
  6. Tredje polymerisasjon (i buffer med lav molaritet)
    1. Forbered polymerisasjonsblandingen: 1 volum SN5 (120 μL), 1/200th volum 0,2 M GTP (0,6 μL, endelig konsentrasjon er 1 mM) og 0,5 volum for oppvarmet glyserol (60 μL) i et rør med riktig volum.
    2. Pipette blandingen opp og ned, unngå forsiktig dannelse av luftbobler, og overfør den til de aktuelle ultracentrifuge rørene.
    3. Dekk rørene med parafilm, overfør dem til et vannbad satt til 30 °C, og inkuber i 20 minutter.
    4. Sentrifuger rørene ved 150.000 × g, 30 °C i 30 min. Pelletsen (P6) inneholder polymeriserte mikrotubuler, og den supernatante SN6 inneholder små mengder ikke-polymerisert tubulin.
      MERK: Mikrotubulpellets kan fryses og oppbevares ved -80 °C i opptil 1 år.
    5. Ta 1–4 μL og tilsett 9 volumer 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og oppbevar ved -20 °C for videre analyser.
  7. Tredje depolymerisering
    1. Depolymeriser mikrotubuler ved å tilsette iskald BRB80 til pellets P6, og la på is i 5 min: for tubulin fra celler, tilsett 1/100th (120 μL), og for tubulin fra hjerner, tilsett 1/40th (300 μL) av volumet av SN1.
    2. Pipette opp og ned med en p200 spiss hver 5 min, i 20 min (fem sykluser med pipettering).
    3. Overfør løsningen til de aktuelle ultracentrifuge rørene, og spinn ned på 150.000 × g, 4 °C i 20 minutter. Overfør SN7 til et nytt 1,5 ml ultrasenterrør. Pelletsen (P7) inneholder små mengder ikke-depolymeriserte mikrotubuler. Den supernatante (SN7) inneholder utelukkende depolymeriserte mikrotubuler (løselig tubulin).
    4. Ta 1–4 μL og tilsett 9 volumer 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og oppbevar ved -20 °C for videre analyser.
    5. Resuspend pellet P7 i BRB80 (samme volum SN7), ta 1-4 μL, og tilsett 9 volumer av 2x Laemmli buffer, kok i 5 min, og lagre ved -20 °C for videre analyser.
    6. Kvantifisere mengden tubulin (se Representative Results) og aliquot SN7 i små volumer, snap-freeze og oppbevar ved -80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hovedmålet med denne metoden er å produsere monterings kompetent tubulin av høy kvalitet i mengder som er tilstrekkelig til å utføre gjentatte in vitro-eksperimenter med de rensede komponentene. Mikrotubuler montert fra denne tubulinen kan brukes i rekonstitueringsanalyser basert på den totale interne refleksjonsfluorescensen (TIRF) mikroskopiteknikk med enten dynamiske eller stabile mikrotubuler, i eksperimenter som tester mikrotubuldynamikk, interaksjoner med MAPer eller molekylære motorer, og kraftgenerering av motorene25. De kan også brukes i microtubule-MAP co-pelleting analyser og solid-state NMR spektroskopi28.

Berikelse og renhet av tubulin gjennom renseprosessen kan overvåkes ved hjelp av en Coomassie-farget SDS-polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) gel, helst 'TUB' SDS-PAGE geler, som tillater separasjon av α- og β-tubuliner, som samtidig migrerer som et enkelt bånd i klassiske geler32. Lysates samlet på forskjellige trinn (bortsett fra den aller siste depolymeriseringen, se protokoll) lastes på gelen i sammenlignbare mengder for å vurdere suksessen til tubulinrensing (Figur 2A)24. Den endelige tubulinprøven, som er veldig dyrebar, er bare lastet på gelen for bestemmelse av tubulinkonsentrasjon. Det er normalt å miste litt tubulin i prosessen med gjentatte sykluser av polymerisasjon og depolymerisering. Et lavere enn forventet utbytte av den endelige rensede tubulinen kan skyldes enten (i) ufullstendig depolymerisering av mikrotubuler, visualisert ved tilstedeværelse av en viktig mengde tubulin i brøker P3, P5 og P7, eller (ii) en ineffektiv tubulinpolymerisering i mikrotubuler, i så fall er en lavere mengde tubulin til stede i brøker P2, P4 og P6 og høyere i brøkdeler SN2, SN4 og SN6 (Figur 2B). Hvis tubulin går tapt under polymerisasjonstrinn (lavere mengder P2 og P4) (i) sikre tilstrekkelig tubulinkonsentrasjon under polymerisering (ii) bruk en frisk aliquot av GTP, og / eller (iii) bekrefte temperaturen på polymerisasjonsreaksjonen. Hvis tubulin går tapt under depolymeriseringstrinn (lavere mengder SN3 og SN5), øker du tiden samt pipettering av blandingen på is.

For kvantifisering av renset tubulin, kjør prøvene sammen med de kjente mengdene bovint serumalbumin (BSA, 0,5 μg – 1 μg – 2 μg – 4 μg) (Figur 3A) på SDS-PAGE. Geler er farget med Coomassie strålende blå, skannet, og intensitetene til BSA og tubulinbånd måles ved kvantitativ densitometri (Figur 3B) som beskrevet ved https://openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ. Vær oppmerksom på at den samme analysen kan gjøres i Fiji, en oppgradert versjon av ImageJ33. Verdier fra BSA-båndene ble brukt til å bestemme den lineære regresjonsligningen, som ble brukt til å beregne mengden protein i tubulinbåndene. Bare tubulinbåndintensiteter innenfor rekkevidden av BSA-kurven brukes til å bestemme tubulinkonsentrasjon. Basert på den beregnede tubulinkonsentrasjonen fremstilles aliquots av ønskede mengder tubulin, snap-frossen i flytende nitrogen og lagres ved -80 °C. Vi får vanligvis ca ~ 2 mg tubulin fra fire spinnerflasker med HeLa S3 suspensjonskulturer (~ 15 g celler), ~ 250 μg tubulin fra ti 15 cm diameter retter (~ 1,2 g celler), og ~ 1 mg tubulin fra 1 g musehjernevev.

For å bekrefte berikelsen av en bestemt tubulin isotype eller modifikasjon, kan ~ 0,1 μg av renset tubulin immunoblott ved hjelp av respektive antistoffer34,35. Kontroll tubulin vil variere avhengig av tubulin av interesse. For tubulin modifisert in vitro med et modifiserende enzym, bruk ikke-behandlet tubulin som kontroll. For tubulin modifisert i cellulo ved overekspresjon av et modifiserende enzym, bruk tubulin renset fra celler som ikke uttrykker enzymet som kontroll (Figur 4A). Kontroll tubulin for tubulin renset fra knockout-mus hjerner vil være tubulin fra vill type mus (Figur 4B). I alle immunoblotanalyser verifiseres en lik belastning av tubulin ved hjelp av et PTM-uavhengig anti-α-tubulin antistoff (12G10).

Figure 1
Figur 1: Tubulinrensing fra ulike kilder ved bruk av polymerisasjonsdepolymeriseringssykluser. (A) Ulike kilder til tubulin lyser ved hjelp av spesifikke strategier. HeLa S3 celler dyrket i suspensjon er lysed ved hjelp av en fransk presse; HEK-293 celler lyser av repeterende pipettering. Adherent celler ble lysed ved hjelp av korte pulser av sonikering og musen hjernevev ved hjelp av en vev homogenisator. (B) Skjematisk representasjon av de påfølgende trinnene i tubulinrensingsprotokollen ved hjelp av sykluser med kalddepolymerisering og varmpolymerisering. Etter lysis og lysat avklaring polymeriseres mikrotubuler og pelleteres. Mikrotubuler blir deretter depolymerisert og deretter tillatt å polymerisere i en høymolaritetsbuffer, og forhindrer mikrotubule-assosiert protein (MAP) ko-sedimentering med mikrotubulene. MAP-frie mikrotubuler blir deretter depolymerisert og kan videre bli utsatt for en tredje syklus av polymerisasjon-depolymerisering for å fjerne spormengder av høymolaritetsbufferen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Evaluering av suksessen til tubulinrensingen. Prøver samlet inn på ulike trinn i tubulinrensingsprotokollen ble kjørt på en 'TUB' natriumdedylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel (se protokoll for detaljer) og farget med Coomassie strålende blå. (A) I en vellykket tubulin rensing, α- og β-tubuins er gradvis beriket gjennom hele prosessen. Etter den andre polymerisasjonen er mikrotubulpellet (P4) praktisk talt fri for forurensning fra andre proteiner eller mikrotubule-assosierte proteiner (MAPer). Vær oppmerksom på at det er normalt å miste litt tubulin under prosedyren. (B) I en mislykket tubulinrensing er det endelige tubulinutbyttet lavt, og tubulin forblir enten i pellets etter depolymerisering eller i supernatant etter polymerisering (røde bokser). I eksemplet som er vist her, polymeriserte tubulin ikke effektivt i begge polymerisasjonstrinnene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kvantifisering av renset tubulin ved hjelp av Coomassie-farget natriumdedylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) geler og densitometri. (A) Coomassie-farget SDS-PAGE gel med kjente mengder bovint serumalbumin (BSA; 0,5, 1, 2 og 4 μg, grå gradientlinje) og forskjellige volumer (henholdsvis 0,5 og 1 μL, lyse og mørke farger) av renset tubulin. I eksemplet som vises, ble tyrosinert tubulin (HeLa S3 tubulin, lys og mørk oransje) og detyrosinert tubulin (HeLa S3 tubulin behandlet med karboksypeptidase A, lys og mørk blå) lastet på gelen. (B) BSA-bånd fra (A) ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ (i vilkårlige enheter, AU) og plottet mot mengden protein lastet (grå til svarte punkter). Disse punktene ble brukt til å beregne den lineære regresjonslinjen (den grå gradientlinjen) og ligningen, som ble brukt til å beregne mengden protein i tubulinprøvene (lys og mørk oransje og blå punkter) lastet på gelen. Dette forenklet beregningen av konsentrasjonen av tubulinprøvene. Vær oppmerksom på at punktene som ligger utenfor BSA-standardkurven, ikke bør brukes til å bestemme konsentrasjon (mørke oransje og blå punkter). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Immunoblotanalyse av renset tubulin med ulike PTMer. (A) Tubuliner renset fra HEK-293 celler: vill type, eller celler overekspresserende TTLL5 eller TTLL7 ble analysert for spesifikk berikelse av polyglutamylering ved hjelp av GT335 antistoff. Mens TTLL5 overekspressjon øker polyglutamylering på α- og β-tubulin, beriker TTLL7 overekspression spesielt β-tubulin glutamylering. (B) Tubulin renset fra hjernevev av vill type og ttll1-/- mus ble analysert for mønstre av glutamylering. Legg merke til den sterke reduksjonen av polyglutamylering av tubulin fra ttll1-/- mus, som mangler den store hjernen glutamylase TTLL136. 'TUB' geler ble brukt til å skille α- og β-tubulin. En lik mengde tubulinbelastning ble bekreftet av 12G10, et anti-α-tubulin antistoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som er beskrevet her, gir en plattform for raskt å generere monterings kompetent tubulin av høy kvalitet i mellomstore mengder fra cellelinjer og enkeltmushjerner. Den er basert på gullstandardprotokollen for tubulinrensing fra storfehjerner som brukes i feltet i mange år16,17. En spesiell fordel med tilnærmingen er bruken av suspensjonskulturer av HeLa S3-celler, som når de er etablert, gir store mengder celler samtidig som det krever lite praktisk tid. Dette gjør protokollen relativt enkel å utføre i et hvilket som helst cellebiologisk laboratorium, mens andre tubulinrensemetoder18,19,32,37 krever spesifikt utstyr og kompetanse og brukes dermed mest av laboratorier med sterk bakgrunn innen proteinrensing. Ved produksjon av mindre mengder tubulin fra tilhengercellelinjer, kan en rekke cellelinjer brukes. Vi har renset tubulin fra HeLa, U-2 OS og HEK-293 celler. Hvis en større rensing er nødvendig, kan høstede celler eller hjerner fryses i lysisbuffer og lagres ved -80 °C, og flere cellepellets eller hjerner kan samles sammen for å rense større mengder tubulin.

Tubulin renset fra cellelinjer er praktisk talt fri for tubulin PTMer. Denne Tyr-tubulin kan lett konverteres til detyrosinert (deTyr-) tubulin i et enkelt enkelt trinn25. For å produsere tubulin med andre PTMer, kan spesifikke tubulinmodifiserende enzymer overekspresseres i celler før tubulinrensing. Videre bidrar bruk av cellelinjer av menneskelig opprinnelse som kilde til materiale til å unngå potensielle kryssartsproblemer når man studerer interaksjoner mellom mikrotubuler og menneskelige MAPer. Videre kan tubulin fra utransformerte (som HEK293) eller transformerte (for eksempel HeLa) celler gi informasjon om effekten av mikrotubule-rettet narkotika (f.eks. taxanes) på normale kontra tumorcelle mikrotubuler.

Til slutt letter vår protokoll rensing av tubulin fra enkeltmushjerner. Etter hvert som et økende antall musemodeller av tubulinmutasjoner og modifikasjoner genereres, tillater denne protokollen direkte analyse av egenskapene og interaksjonene til mikrotubuler med endret tubulin isotypesammensetning38,39,40 eller tubulin PTMs31,41.

Tilnærmingen er basert på sykluser av polymerisasjon og depolymerisering. Dermed kan spesifikke tubulinistyper eller tubulin med bestemte PTMer som påvirker monterings- og demonteringsegenskapene til mikrotubuler føre til et uforholdsmessig tap eller reduksjon av slike tubulinformer under renseprosessen. Likevel har vi vist at store tubulin PTMer, som acetylering, detyrosinasjon, glutamylering og glykylering, beholdes på mikrotubulene gjennom tubulinrensingsprosessen24. Det skal imidlertid bemerkes at for kvantitative analyser av tubulinsammensetningen i celler eller vev, er DEN TOG-kolonnebaserte tubulinrensingsmetoden mer hensiktsmessig, da det vil tillate en objektiv, polymerisasjonsuavhengig tubulinrensing18. Til tross for begrensningen, tilbyr vår protokoll en stor fordel i å generere store mengder høykvalitets tubulin som kan brukes i omhyggelige in vitro rekonstitueringsforsøk. Spesielt letter det bruken av PTM-rik hjerne tubulin i rutinemessige eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 og Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ støttes av Institut Curie, Det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) tildeler ANR-12-BSV2-0007 og ANR-17-CE13-0021, Institut National du Cancer (INCA) stipend 2014-PL BIO-11-ICR-1, og Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) tilskudd DEQ201703676. MMM støttes av Fondation Vaincre Alzheimer grant FR-16055p, og av France Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. JAS ble støttet av EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen No 675737, og FRM-bevilgningen FDT201904008210. SB ble støttet av FRM grant FDT201805005465.

Vi takker alle medlemmer av Janke lab, spesielt J. Souphron, samt G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) og A. Gautreau (Ecole Polytechnique) for hjelp under etableringen av protokollen. Vi vil gjerne takke dyreavdelingen til Institut Curie for hjelp med musavl og omsorg.

Antistoffet 12G10, utviklet av J. Frankel og M. Nelson, ble hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdt av University of Iowa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C. Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. Correia, J. J., Wilson, L. , Academic Press. 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

Tags

Biokjemi Utgave 165 Mikrotubuler in vitro rekonstituering tubulin tubulinrensing polymerisering mikrotubuldynamikk tubulinkode tubulinisotyper suspensjonskultur tubulin posttranslasjonelle modifikasjoner
Rensing av Tubulin med kontrollerte posttranslasjonelle modifikasjoner og isotyper fra begrensede kilder ved polymerisering-depolymeriseringssykluser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bodakuntla, S., Jijumon, A. S.,… More

Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter