Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rensning af Tubulin med kontrollerede posttranslationale modifikationer og isotyper fra begrænsede kilder ved polymerisering-depolymeriseringscyklusser

Published: November 5, 2020 doi: 10.3791/61826
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver tubulinrensning fra små/mellemstore kilder såsom dyrkede celler eller hjerner med en enkelt mus ved hjælp af polymeriserings- og depolymeriseringscyklusser. Den rensede tubulin er beriget med specifikke isotyper eller har specifikke posttranslationale modifikationer og kan bruges i in vitro rekonstitutionsanalyser til at studere mikrotubuledynamik og interaktioner.

Abstract

Et vigtigt aspekt af undersøgelser af mikrotubule cytoskelet er undersøgelsen af mikrotubule adfærd i in vitro rekonstitution eksperimenter. De gør det muligt at analysere mikrotubulis iboende egenskaber, såsom dynamik, og deres interaktioner med mikrotubule-associerede proteiner (MAP'er). Den "tubulin kode" er et spirende koncept, der peger på forskellige tubulin isotyper og forskellige posttranslational ændringer (PTMs) som regulatorer af mikrotubule egenskaber og funktioner. For at udforske de molekylære mekanismer i tubulinkoden er det afgørende at udføre in vitro-rekonstitutionseksperimenter ved hjælp af renset tubulin med specifikke isotyper og PTM'er.

Til dato var dette teknisk udfordrende som hjerne tubulin, som er meget udbredt i in vitro eksperimenter, havne mange PTMs og har en defineret isotype sammensætning. Derfor har vi udviklet denne protokol til at rense tubulin fra forskellige kilder og med forskellige isotypesammensætninger og kontrollerede PTM'er ved hjælp af den klassiske tilgang til polymeriserings- og depolymeriseringscyklusser. Sammenlignet med eksisterende metoder baseret på affinitetsrensning giver denne tilgang ren, polymeriserings-kompetent tubulin, da tubulin resistent over for polymerisering eller depolymerisering kasseres under de efterfølgende rensningstrin.

Vi beskriver rensning af tubulin fra cellelinjer, dyrket enten i suspension eller som klæbende kulturer og fra enkeltmushjerner. Metoden beskriver først generering af cellemasse i både suspensions- og vedhængende indstillinger, lysis-trinnet, efterfulgt af de efterfølgende stadier af tubulinrensning ved polymeriseringsdepolymeriseringscyklusser. Vores metode giver tubulin, der kan bruges i eksperimenter, der adresserer virkningen af tubulinkoden på de iboende egenskaber ved mikrotubuli og mikrotubuleinteraktioner med tilknyttede proteiner.

Introduction

Mikrotubuli spiller kritiske roller i mange cellulære processer. De giver cellerne deres form, bygger meiotiske og mitotiske spindler til kromosomadskillelse og tjener som spor til intracellulær transport. For at udføre disse forskellige funktioner organiserer mikrotubuli sig på forskellige måder. Et af de spændende spørgsmål på området er at forstå de molekylære mekanismer, der gør det muligt for strukturelt og evolutionært bevarede mikrotubuli at tilpasse sig denne overflod af organisationer og funktioner. En potentiel mekanisme er diversificeringen af mikrotubuli, som er defineret ved begrebet »tubulinkode«1,2,3. Tubulinkoden omfatter to hovedkomponenter: differentialinkorporering af α- og β tubulin-genprodukter (tubulinisotyper) i mikrotubuli og tubulin efteroversættelsesændringer (PTMs).

Siden 1970'erne har in vitro-rekonstitueringseksperimenter kombineret med udviklende lysmikroskopiteknikker banet vejen for vigtige opdagelser om mikrotubulis egenskaber: dynamisk ustabilitet4 og løbebånd5og deres andre mekanismer og funktioner6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15. Næsten alle de in vitro-eksperimenter , der er udført indtil videre , er baseret på tubulin renset fra hjernevæv ved hjælp af gentagne polymeriseringscyklusser og depolymerisering16,17. Selv om rensning fra hjernevævet giver den fordel at opnå høj kvalitet tubulin i store mængder (normalt gram mængder), en vigtig ulempe er heterogenitet som tubulin renset fra hjernevæv er en blanding af forskellige tubulin isotyper og er beriget med mange tubulin PTMs. Denne heterogenitet gør det umuligt at afgrænse en bestemt tubulin PTM's eller isotypens rolle i kontrollen af mikrotubuleegenskaber og -funktioner. Det er således vigtigt at producere samle-kompetente tubulin med kontrollerede tubulin-PTM'er og homogen isotypesammensætning for at adressere de molekylære mekanismer i tubulinkoden.

For nylig er en tilgang til rensning af tubulin ved affinitetskromatografi ved hjælp af det mikrotubule-bindende TOG (tumor-overekspresseret gen) domæne af gær Stu2p blevet udviklet18. I denne metode passerer tubulin i rå lysater af celler eller væv gennem en kolonne, hvor den binder sig til det matrix-immobiliserede TOG-domæne, hvilket gør det muligt at analysere hele tubulinpuljen i en given, selv meget lille, prøve. En længe ventet tilgang til rensning af rekombinant tubulin er også blevet beskrevet i de senere år. Den er baseret på baculovirussystemet, hvor en bi-cistronic vektor, der indeholder α- og β-tubulingener, udtrykkes i insektceller19. Denne metode er imidlertid meget besværlig og tidskrævende og bruges derfor mest til at studere virkningen af tubulinmutationer20 og tubulin isotyper21,22,23 in vitro.

I den nuværende protokol beskriver vi en metode, der bruger den veletablerede og udbredte polymeriseringsdepolymeriseringsmetode som en plan for at generere tubulin med forskellige ændringsniveauer enten fra cellelinjer eller fra musehjernevæv24. I denne procedure cykles tubulin mellem den opløselige (tubulin dimer ved 4 °C) og polymeriseret form (mikrotubule ved 30 °C i nærværelse af guanosin 5'-triphosphat [GTP]). Hver formular adskilles gennem flere på hinanden følgende trin af centrifugering: tubulin dimers forbliver i supernatanten efter et koldt (4 °C) spin, mens mikrotubuli vil blive pelleteret ved 30 °C. Desuden udføres et polymeriseringstrin ved høj piperazin-N,N'-bis(2-ethanesulfonsyre) (PIPES) koncentration, som gør det muligt at fjerne mikrotubule-associerede proteiner fra mikrotubbulerne og dermed fra det endeligt rensede tubulin. Tubulin renset fra HeLa S3 celler dyrket som suspension eller vedhængende kulturer er næsten fri for enhver tubulin PTM og er blevet brugt i de seneste in vitro rekonstitution eksperimenter25,26,27,28. Vi har yderligere tilpasset metoden til rensning af tubulin fra enkeltmushjerner, som kan bruges til et stort antal musemodeller med ændringer i tubulin isotyper og PTMs.

I protokollen beskriver vi først generationen af kildematerialet (cellemasse eller hjernevæv), dets lysis (Figur 1A), efterfulgt af de successive trin i tubulin polymerisering og afpolymerisering for at rense tubulin (Figur 1B). Vi beskriver endvidere processen til vurdering af renheden (figur 2A,B) og mængden (figur 3A,B) af den rensede tubulin. Metoden kan tilpasses til fremstilling af tubulin beriget med en udvalgt PTM ved at overekspressere et modificerende enzym i celler før tubulinrensning (Figur 4B). Alternativt kan tubulinmodificerende enzymer tilsættes til tubulin under rensningsprocessen. Endelig kan vi rense tubulin mangler specifikke isotyper eller PTMs fra hjernen hos mus mangelfuld i de tilsvarende tubulin-modificerende enzymer (Figur 4B)29.

Den metode, vi beskriver her, har to hovedfordele: (i) den tillader produktion af tilstrækkeligt store mængder tubulin på relativt kort tid, og (ii) den genererer højkvalitets, ren tubulin, med enten specifik tubulin isotypesammensætning eller PTMs. I den tilhørende video af dette manuskript fremhæver vi nogle af de kritiske trin, der er involveret i denne procedure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrepleje og -anvendelse i forbindelse med denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs henstillinger (2010/63/UE). Forsøgsprocedurerne blev specifikt godkendt af institut Curie CEEA-IC's etiske komité #118 (tilladelse nr. 04395.03 fra den nationale myndighed) i overensstemmelse med de internationale retningslinjer.

1. Tilberedning af reagenser til rensning af tubulin

BEMÆRK: Alle de buffere, der anvendes til rensning af tubulin, skal indeholde kaliumsalte og IKKE natriumsalte30.

  1. Forbered 1 L af hele medium: Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM), med 10% føtal kvæg serum (FBS, 100 ml), 200 mM L-glutamin (10 ml 2 M bestand), og 1x penicillin-streptomycin (10 ml 100x lager). Opbevares ved 4 °C.
  2. Forbered 10 M kaliumhydroxid (KOH) ved at opløse 140 g KOH i vand, juster det endelige volumen til 250 mL, og opbevar ved stuetemperatur.
  3. Der fremstilles 0,5 M ethylendiaminmethansyre (EDTA), pH 8 ved at opløse 36,5 g EDTA i vand, pH-temperaturen justeres til 8,0 ved hjælp af KOH (ellers opløses EDTA) og det endelige volumen til 250 mL, filtreres sterilt og opbevares ved stuetemperatur.
  4. Forbered 5 mM fosfat-buffered saltvand (PBS)-EDTA ved at tilføje 5 mL på 0,5 M EDTA til 500 mL PBS, filtersterilisere og opbevare ved stuetemperatur.
  5. Forbered 0,5 M K-RØR, pH 6,8, ved at opløse 75,5 g rør i vand, justere til pH 6,8 med KOH (ellers rør vil ikke opløses) og det endelige volumen til 500 mL, filter-sterilisere, og opbevares ved 4 °C.
  6. Forbered 1 M K-PIPES, pH 6,8, ved at opløse 15,1 g RØR i vand, juster til pH 6,8 med KOH og det endelige volumen til 50 mL, filtersteriliser, og opbevar ved 4 °C.
  7. Forbered 0,5 M kalium-ethylen glycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraeddikesyre (K-EGTA, pH 7,7) ved at opløse 47,5 g EGTA i vand, indstille til pH 7,7 med KOH og det endelige volumen til 250 mL, filtersterilisere og opbevares ved stuetemperatur.
  8. Forbered BRB80 (80 mM K-PIPES, pH 6,8; 1 mM K-EGTA; 1 mM magnesiumchlorid (MgCl2]) opløsning ved at blande 3,2 ml 0,5 M PIPES, 40 μL på 0,5 M K-EGTA og 20 μL 1 M MgCl2 og justere det endelige volumen til 20 ml. Opbevares ved 4 °C.
  9. Der fremstilles 0,1 M phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) ved at opløse 435 mg PMSF i isopropanol for at opnå et endeligt volumen på 25 mL og opbevares ved -20 °C.
  10. Proteasehæmmere blandes (200x) ved at opløse 10 mg aprotinin, 10 mg leupeptin og 10 mg 4-(2-aminoethyl)-benzensulfonylfluorid i vand for at opnå et endeligt volumen på 2,5 mL, lave aliquots på 100 μL og opbevare ved -20 °C.
  11. Forbered 10% Triton X-100 ved at blande 5 mL Triton X-100 i 45 mL vand, filtersterilisere og opbevare ved stuetemperatur.
  12. Forbered Lysis buffer (BRB80 suppleret med 1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM PMSF, 1x protease hæmmere mix og eventuelt for HEK-293 celler, 0,2% Triton X-100) på dagen for tubulinrensning ved at blande 20 mL BRB80 med 1,5 μL 2-mercaptoethanol, 200 μL på 0,1 M PMSF, 100 μL af proteasehæmmere blandes og eventuelt for HEK-293 celler , 400 μL på 10% Triton X-100.
    BEMÆRK: 2-mercaptoethanol er giftigt og bør anvendes i røghætten.
  13. Der fremstilles 0,2 M GTP ved at opløse 1 g GTP i 9,5 mL vand, pH-lageret justeres til 7,5 ved hjælp af KOH, der fremstilles aliquots på 20 μL, og opbevares ved -20 °C. Undgå gentagne fryse-optøningscyklusser.
  14. Der fremstilles 1 M tris(hydroxymethyl) aminomethan-hydrochlorid (Tris-HCl) ved at opløse 60,56 g Tris i vand, indstilles til pH 6,8 med HCl, udfyldes til et slutvolumen på 500 mL, filtreresiliseres og opbevares ved stuetemperatur.
  15. Der fremstilles 5x Laemmli prøvebuffer (450 mM dithiothreitol (DTT), 10% natrium dodecylsulfat (SDS); 400 μM Tris-HCl pH 6,8; 50% glycerol; ~0,006% bromophenol blå) ved at tilsætte 4 g SDS til 16 ml forvarmet 1 M Tris-HCl, pH 6,8, og bland opløsningen forsigtigt. Tilsæt 2,6 g DTT og 20 ml 100% glycerol til blandingen og rør rundt, indtil opløsningen bliver homogen. Tilsæt den ønskede mængde bromophenolblå (2,5 mg) for at nå den krævede farveintensitet. Der fremstilles 5 mL aliquots og opbevares ved -20 °C. 2x arbejdsopløsningen af Laemmli-prøvebufferen fremstilles ved at fortynde 5x-lageret i destilleret vand.

2. Forstærknings- og høstkilder for tubulin

BEMÆRK: I denne protokol blev der anvendt tre kilder til tubulin: i) celler (HeLa S3 og HEK-293), der dyrkes som suspensionskulturer; ii) celler, der dyrkes som vedhængende kulturer (HEK-293, HeLa og U2 OS) og (iii) musehjernevæv. Denne protokol betragter dagen for tubulinrensning som 'dag 0', og derfor er andre trin blevet beskrevet i forhold til dag 0.

  1. Forstærkning af celler
    1. Celler dyrket som suspension kulturer
      BEMÆRK: For at rense tubulin fra suspensionskulturer skal du bruge mindst 2 L suspensionskultur.
      1. For 2 L suspensionskultur genoplives og dyrkes den foretrukne celletype for at opnå 6 × 107 celler 10 dage før forberedelsesdagen. På dag -10, plade celler på seks 15 cm diameter retter på 107 celler pr plade.
      2. På dag -8 forvarmes den krævede mængde komplet medium til 37 °C. Tilsæt 1 L forvarmet medium til hver spinnerflaske under sterile forhold. Placer spinnere på en omrører bord sæt på 20-25 omdrejninger i minuttet inde i cellen kultur inkubator, lidt åbne lateral spinner hætter at tillade mediet at ekvilibrere til inkubatorens atmosfære.
        BEMÆRK: For at undgå kontaminering skal mediet og spinnerflaskerne rengøres grundigt med 70 % ethanol.
      3. På dag -7, trypsinize og indsamle cellerne vokset til 80-90% sammenløb (ca. 1,8 × 108 celler). Indsamle celler fra 3 retter ad gangen, spin ned (200 × g, 5 min, stuetemperatur), og igen suspendere alle celler i 10 mL DMEM.
        BEMÆRK: Grundig dissociation af cellerne på dette tidspunkt er meget vigtigt for at undgå dannelsen af større aggregater i spinnerflaskerne, hvilket påvirker celleoverlevelsen og resulterer i lavt tubulinudbytte.
      4. Tilføj 5 mL af celleaffjedringen til hver spinnerflaske, der indeholder 1 L DMEM, vend spinnerne tilbage til omrørerbordet i cellekulturinkubatoren, og lad cellerne vokse i en uge.
    2. Celler dyrket som klæbende kulturer
      BEMÆRK: For at rense tubulin fra vedhængende celler skal du bruge mindst 10 retter på 80-90% sammenløb.
      1. Genoplive og forstærke den ønskede celletype for at opnå 1 × 108 celler tre dage før dagen for tubulinpræparatet.
      2. På dag -3, plade disse celler på ti 15 cm retter på 1 × 107celler pr parabol og give dem mulighed for at vokse 80-90% sammenløb.
      3. På dag -1, hvis det er nødvendigt, transfekt celler med en plasmid til at udtrykke en tubulin-modificerende enzym eller en bestemt tubulin isotype.
  2. Høst af celler / hjernevæv
    1. Celler dyrket som suspension kulturer
      1. Celleaffjedringen overføres fra spinnere til 1 L-centrifugeflasker (Materialetabel) og pelletceller ved 250 × g, 15 min. rumtemperatur. For straks at starte en anden kultur af HeLa S3 celler i spinner flasker, lad 100 mL celle suspension i spinnere, og tilsæt 1 L af komplet, forvarmet DMEM til spinner flasken.
        BEMÆRK: Kontroller omhyggeligt, om der er bakteriel kontaminering, inden der foretages rensning af tubulin.
      2. Resuspend pelleterede celler fra hver centrifugeflaske i 10 mL iskold PBS, og overfør alle cellerne til 50 mL skruehætterør. Under genophæng, holde cellerne på is. Cellerne ved 250 × g,15 min.
        BEMÆRK: Følg anbefalingerne for rengøring og opbevaring af spinnerflasker (se materialeoversigten).
      3. Kassér supernatanten og bestemme mængden af cellepillen. Fra 2 L af suspension kultur (to spinner flasker), forventer en celle pellet på 5-6 mL.
        BEMÆRK: I nedenstående protokol antages cellepillevolumenet at være 10 mL. Juster eksperimentet i henhold til pelletvolumenerne.
      4. Tilføj 1 volumen (10 mL) lysis buffer og ophæng cellepillen igen.
        BEMÆRK: Forholdet mellem celle pellet volumen til lysis buffer volumen er meget vigtigt for en vellykket tubulin rensning. Tilføjelse af mere lysis buffer reducerer tubulinkoncentrationen, som derefter ikke når den kritiske koncentration, der er nødvendig for polymerisering, hvilket i høj grad reducerer tubulinudbyttet.
        BEMÆRK: Celler, der genbruges i lysisbuffer, kan snapfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C i to måneder.
    2. Celler dyrket som klæbende kulturer
      BEMÆRK: Celler fra klæbende kulturer skal høstes meget hurtigt for vellykket tubulinrensning (ca. 15 minutter til høst af ti 15 cm retter). Tre personer deltog i dette trin i protokollen.
      1. Fjern mediet fra 15 cm retter ved at skråne opvasken, og vask derefter forsigtigt cellerne med 7 mL PBS-EDTA ved stuetemperatur (person 1). Arbejd kun med tre 15 cm retter ad gangen for at undgå at forlade cellerne uden medium eller buffer.
      2. Der tilsættes 5 mL PBS-EDTA til cellerne og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
      3. Brug en celleløfter til forsigtigt at løsne cellerne ved at skovle dem til den ene kant af skålen (person 2), og saml alle cellerne i et 50 mL skruehætterør (person 3). Skyl hver plade med yderligere 2 mL PBS-EDTA for at indsamle eventuelle resterende celler fra opvasken. I dette trin skal du holde det 50 mL skruehætterør, der indeholder celleaffjedringen, på is.
      4. Cellerne ved 250 × g,10 min. og 4 °C. Kassér supernatanten og bestemme mængden af cellepillen. Forvent et volumen på ~ 1 mL fra ti 15 cm retter.
        BEMÆRK: I nedenstående protokol antages cellepillevolumenet at være 10 mL. Juster forsøgene i henhold til pelletvolumenerne.
      5. Genbrug cellerne i 1 volumen (10 mL) lysis buffer.
        BEMÆRK: Celler, der genbruges i lysisbuffer, kan opbevares ved -80 °C i op til to måneder.
    3. Hjernevæv
      BEMÆRK: Mus i alle aldre, køn eller genetisk baggrund kan bruges. Valget af den transgene musestamme vil afhænge af det videnskabelige spørgsmål, der skal behandles. I dette manuskript viser vi eksemplet med tubulin renset fra ttll1-/- musen, der mangler et stort hjerne glutamylating enzym, tubulin tyrosin ligase-lignende 1 (TTLL1) protein31.
      1. Ofre musen ved livmoderhalskræft dislokation, hurtigt halshugge, og indsamle hjernen i en rund-bund rør. Hvis der er overskydende blod på hjernen, skal du hurtigt vaske med lysis buffer. Saml hjernen, så snart musen er ofret som en post-mortem forsinkelse kan påvirke succes tubulin rensning. Brug rundbundede rør til at rumme bredden af den sonde, der bruges til homogenisering.
        BEMÆRK: Indsamlede musehjerner kan snapfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C i op til 3 år.
      2. Tilsæt 500 μL lysis buffer til en enkelt hjerne udvundet fra en voksen mus. For resten af protokollen antages mængden af lysis buffer tilføjet at være 10 mL. Juster for dit eksperiment i henhold til antallet af hjerner, der skal bruges.

3. Lysis af celler eller hjernevæv

  1. Celler dyrket som suspension kulturer
    1. For HEK-293, lyse cellerne på isen ved gentagne gange pipetter op og ned ved hjælp af pipettespidser af forskellig bredde. Først fastgøres en p1000 spids til en 10 mL pipette, og pipette cellen suspension op og ned hver 5 min, i 10 min (tre cyklusser af pipetter). For det andet, vedhæfte en p200 spids til en p1000 spids og yderligere pipette hver 5 min, i 20 min (fem cyklusser af pipetter).
    2. For HeLa S3, lyse cellerne ved hjælp af en fransk presse (se Tabel over materialer for indstillinger).
    3. 1/100th volumen af lysis mix (L) (200 μL for 20 mL L), og tilsæt det samme volumen på 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyse.
  2. Celler dyrket som klæbende kulturer
    1. Overfør cellerne til et 14 mL rundt bundrør, hvis højde er blevet reduceret for at imødekomme sonikatorsonden (se Materialetabel for indstillinger). Sonicate cellerne for ~ 45 pulser, og bekræfte celle lysis ved at prøve en dråbe af lysis mix under et mikroskop.
      BEMÆRK: Antallet af impulser kan variere afhængigt af den celletype, der anvendes til tubulinrensning. Sonikering af celler for meget kan forårsage tubulin til at udfælde og vil påvirke renselsesudbyttet negativt.
    2. Pipette cellerne op og ned på is hver 5 min i 20 min (fem cyklusser af pipetter), ved hjælp af en p200 spids.
    3. Tag 1/100th volumen lysis mix (L) (200 μL for 20 mL L) og tilsæt det samme volumen af 2x Laemmli buffer, kog i 5 min og opbevar ved -20 °C til yderligere analyse.
  3. Hjernevæv
    1. Lyser hjernevævet ved hjælp af en vævsblender (se Materialetabel for indstillinger). Alternativt kan vævet lyses ved hjælp af en mikrorørs-støder eller et tilsvarende udstyr og pipette op og ned på isen med en 1 mL sprøjte med en 18 G nål.
    2. Tag 1/100th volumen lysis mix (L) (200 μL for 20 mL L), og tilsæt det samme volumen af 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyse.

4. Rensning af Tubulin

  1. Lysat præcisering
    1. Lysatet (adskillelse af pellet og opløselig fraktion af lysisblandingen) ryddes ved centrifugering ved 150.000 × g, 4 °C, 30 min. Se Materialeoversigten for at få flere oplysninger om ultracentrifugerotorer og -rør. For celleekstrakter dannes der ofte et hvidt flydende lag efter centrifugering. Overfør ikke dette flydende lag sammen med supernatanten, da det forstyrrer tubulin polymerisering. Brug en sprøjte med passende volumen fastgjort til en lang 20 G eller 21 G nål til forsigtigt at fjerne supernatanten uden at forstyrre det flydende lag. Hvis supernatanten stadig er overskyet, centrifuge ved 5.000 × g, 4 °C i 10 min.
    2. Overfør supernatanten (SN1) til et ultracentrifugerør, og noter dets volumen. For en 10 mL celle pellet, forventer et volumen på ~ 12 mL for SN1.
    3. Tag 1/100th volumen SN1 (120 μL for 12 mL SN1), og tilsæt det samme volumen af 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyse.
    4. Resuspend pellet (P1) i BRB80 (Tabel over materialer) ved hjælp af samme volumen som SN1. Tag 1/100th volumen P1 (200 μL for 20 mL P1), og tilsæt det samme volumen på 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyse.
  2. Første polymerisering i lavmolaritetsbuffer
    1. Polymeriseringsblandingen fremstilles ved at kombinere 1 volumen SN1 (12 mL), 1/200th volumen på 0,2 M GTP (60 μL; endelig koncentration 1 mM) og 0,5 volumen forvarmet glycerol (6 mL) i et skruehætterør med passende volumen.
      BEMÆRK: Glycerol anvendes som fortrængningsmiddel i polymeriseringstrinnene i hele protokollen og tages derfor ikke i betragtning ved beregningerne af andre komponenters koncentrationer.
    2. Pipette blandingen op og ned, forsigtigt undgå dannelsen af luftbobler og overføre den til de relevante ultracentrifuge rør.
      BEMÆRK: Når blandingen overføres til rørene, justeres rørenes vægt (parvis). Dette gør det muligt for eksperimentatoren direkte at gå videre til sedimentering af mikrotubuli efter polymeriseringstrinnet. Gør dette for alle polymeriseringstrin i hele protokollen.
    3. Rørene dækkes med parafilm, overføres til et vandbad, der er indstillet til 30 °C, og inkuberes i 20 min.
    4. Rørene centrifuges ved 150.000 × g, 30 °C i 30 min. Fjern supernatanten (SN2), og hold pellet af polymeriserede mikrotubuli (P2).
      BEMÆRK: Mikrotubulepellet kan snapfryses og opbevares ved -80 °C i op til 1 år.
    5. Tag 1/200th volumen SN2 (90 μL for 18 mL SN2) og tilsæt det samme volumen af 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyse.
  3. Første depolymerisering
    1. Depolymerisere mikrotubulies ved at tilsætte iskold BRB80 til pellet P2, og lad på is i 5 min: for tubulin fra celler, tilsæt 1/60th (200 μL), og for tubulin fra hjerner, tilsæt 1/20th (600 μL) af mængden af SN1.
      BEMÆRK: Mængden af iskold BRB80, der tilsættes pellet under afpolymeriseringstrin, er altid i forhold til mængden af SN1.
    2. Genbrug mikrotubule pellet forsigtigt, undgå luftbobler, indtil opløsningen er helt homogen. Brug en p1000 spids til et par cyklusser af pipetter efterfulgt af en p200 spids hver 5 min, i 20 min (fem cyklusser af pipetter). Dette er et afgørende skridt for tubulinrensningens succes.
    3. Opløsningen overføres til passende ultracentrifugerør, og der drejes ned ved 150.000 × g, 4 °C i 20 min. Overfør SN3 til et nyt 1,5 mL ultracentrifugerør. Pellet dannet efter dette centrifugeringstrin (P3) indeholder udfældede proteiner (mikrotubule-associerede proteiner eller MAPs) og ikke-depolymeriserede mikrotubuli. Supernatanten (SN3) indeholder opløselige komponenter: afpolymeriserede tubulin dimers og MAPs, som er løsrevet fra de afpolymeriserede mikrotubuli.
    4. Tag 1-4 μL SN3, og tilsæt 9 bind 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyser.
    5. Pellet P3 blev genbrugt i BRB80 (i samme volumen af SN3), tag 1-4 μL, og tilsæt 9 bind 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C.
  4. Anden polymerisering (i Højmolarity Buffer)
    1. Polymeriseringsblandingen fremstilles ved at kombinere 1 volumen SN3 (200 μL), 1 volumen forvarmede 1 M PIPES (200 μL endelig koncentration 0,5 M), 1/100th volumen på 0,2 M GTP (2 μL, endelig koncentration 1 mM) og 1 volumen forvarmet glycerol (200 μL) i et rør med det relevante volumen.
    2. Pipetter blandingen op og ned, undgå dannelsen af luftbobler, og overfør den til ultracentrifuge rør.
    3. Rørene dækkes med parafilm, overføres til et vandbad, der er indstillet til 30 °C, og inkuberes i 20 min.
    4. Rørene centrifuges ved 150.000 × g, 30 °C i 30 min. Fjern supernatanten (SN4), og hold pellet af polymeriserede mikrotubuli (P4). Pellet P4 indeholder de polymeriserede mikrotubuli, og den supernatant SN4 indeholder upolymeriseret tubulin, MAPs og andre opløselige proteiner.
      BEMÆRK: Mikrotubulepellet efter det andet polymeriseringstrin kan snapfryses og opbevares ved -80 °C i op til 1 år.
    5. Tag 1-4 μL og tilsæt 9 mængder 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyser.
  5. Anden depolymerisering
    1. Depolymerisere mikrotubulies ved at tilsætte iskold BRB80 til pellet P4, og lad på is i 5 min: for tubulin fra celler, tilsæt 1/100th (120 μL), og for tubulin fra hjerner, tilsæt 1/40th (300 μL) af mængden af SN1.
    2. Pipette op og ned med en p200 spids hver 5 min, i 20 min (fem cyklusser af pipetter).
    3. Opløsningen overføres til et ultracentrifugerør på 1,5 mL, og der drejes ned ved 150.000 × g, 4 °C i 20 min. Overfør SN5 til et nyt 1,5 mL ultracentrifugerør. Pellet dannet efter denne centrifugering trin (P5) indeholder ikke-depolymeriserede mikrotubuli. Supernatanten (SN5) indeholder det opløselige tubulin.
    4. Tag 1-4 μL og tilsæt 9 mængder 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyser.
    5. Pellet P5 genbruges i BRB80 (samme volumen af SN5), tager 1-4 μL og tilsættes 9 mængder 2x Laemmli-buffer, koges i 5 min og opbevares ved -20 °C til yderligere analyser.
  6. Tredje polymerisering (i Lav-Molarity Buffer)
    1. Polymeriseringsblandingen fremstilles: 1 volumen SN5 (120 μL), 1/200th volumen på 0,2 M GTP (0,6 μL, slutkoncentrationen er 1 mM) og 0,5 volumen forvarmet glycerol (60 μL) i et rør af det relevante volumen.
    2. Pipetter blandingen op og ned, undgå forsigtigt dannelse af luftbobler, og overfør den til de relevante ultracentrifugerør.
    3. Rørene dækkes med parafilm, overføres til et vandbad, der er indstillet til 30 °C, og inkuberes i 20 min.
    4. Rørene centrifuges ved 150.000 × g, 30 °C i 30 min. Pellet (P6) indeholder polymeriserede mikrotubuli, og supernatanten SN6 indeholder små mængder ikke-polymeriserede tubulin.
      BEMÆRK: Mikrotubulepiller kan snapfryses og opbevares ved -80 °C i op til 1 år.
    5. Tag 1-4 μL og tilsæt 9 mængder 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyser.
  7. Tredje depolymerisering
    1. Depolymerisere mikrotubulies ved at tilsætte iskold BRB80 til pellet P6, og lad på is i 5 min: for tubulin fra celler, tilsæt 1/100th (120 μL), og for tubulin fra hjerner, tilsæt 1/40th (300 μL) af mængden af SN1.
    2. Pipette op og ned med en p200 spids hver 5 min, i 20 min (fem cyklusser af pipetter).
    3. Opløsningen overføres til de relevante ultracentrifugerør, og der drejes ned ved 150.000 × g, 4 °C i 20 min. Overfør SN7 til et nyt 1,5 mL ultracentrifugerør. Pellet (P7) indeholder små mængder af ikke-depolymeriserede mikrotubuli. Supernatanten (SN7) indeholder udelukkende depolymeriserede mikrotubuli (opløselige tubulin).
    4. Tag 1-4 μL og tilsæt 9 mængder 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyser.
    5. Pellet P7 blev genbrugt i BRB80 (samme volumen af SN7), tag 1-4 μL, og tilsæt 9 mængder 2x Laemmli buffer, kog i 5 min, og opbevar ved -20 °C til yderligere analyser.
    6. Mængden af tubulin (se repræsentative resultater)og aliquot SN7 kvantificeres i små mængder, fastfryses og opbevares ved -80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hovedformålet med denne metode er at producere højkvalitets, montage-kompetente tubulin i mængder, der er tilstrækkelige til at udføre gentagne in vitro-forsøg med de rensede komponenter. Mikrotubuli, der er samlet fra denne tubulin, kan anvendes i rekonstitueringsanalyser baseret på den samlede interne refleksions-fluorescens (TIRF) mikroskopiteknik med enten dynamiske eller stabile mikrotubbuler, i forsøg, der tester mikrotubuledynamik, interaktioner med POP'er eller molekylære motorer og kraftgenerering af motorerne25. De kan også bruges i microtubule-MAP co-pelleting assays og solid-state NMR spektroskopi28.

Tilsætning og renhed af tubulin under hele rensningsprocessen kan overvåges ved hjælp af en Coomassie-farvede SDS-polyacrylamid gel elektrophoresis (PAGE) gel, helst 'TUB' SDS-PAGE geler, der giver mulighed for adskillelse af α- og β-tubuliner, der co-migrerer som et enkelt bånd i klassiske geler32. Lysater, der indsamles på forskellige trin (bortset fra den allersidste depolymerisering, se protokollen), læsses på gelen i sammenlignelige mængder til vurdering af tubulinrensningens succes (figur 2A)24. Den endelige tubulinprøve, som er meget dyrebar, indlæses kun på gelen til bestemmelse af tubulinkoncentrationen. Det er normalt at miste nogle tubulin i processen med gentagne cyklusser af polymerisering og depolymerisering. En lavere end forventet udbytte af den endelige rensede tubulin kan skyldes enten (i) ufuldstændig depolymerisering af mikrotubuli, visualiseret ved tilstedeværelsen af en betydelig mængde tubulin i fraktionerne P3, P5 og P7, eller (ii) en ineffektiv tubulin polymerisering i mikrotubuli, i hvilket tilfælde en lavere mængde tubulin er til stede i fraktioner P2, P4 og P6 og højere i fraktioner SN2, SN4 og SN6 (Figur 2B). Hvis tubulin går tabt under polymeriseringstrin (lavere mængder P2 og P4) i) sikre tilstrækkelig tubulinkoncentration under polymerisation (ii) bruge en frisk aliquot af GTP og/eller (iii) bekræfte temperaturen på polymeriseringsreaktionen. Hvis tubulinen går tabt under afpolymeriseringstrin (lavere mængder SN3 og SN5), skal du øge tiden såvel som pipettering af blandingen på is.

Til kvantificering af renset tubulin udtages prøverne sammen med de kendte mængder kvægserumalbumin (BSA, 0,5 μg – 1 μg – 2 μg – 4 μg) (Figur 3A) på SDS-PAGE. Geler farves med Coomassie strålende blå, scannet, og intensiteten af BSA og tubulinbånd måles ved kvantitativ densitometri (Figur 3B) som beskrevet ved https://openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ. Bemærk, at den samme analyse kan udføres i Fiji, en opgraderet version af ImageJ33. Værdier fra BSA-båndene blev brugt til at bestemme den lineære regressionsligning, som blev brugt til at beregne mængden af protein i tubulinbåndene. Kun tubulinbåndintensiteter inden for BSA-kurvens område anvendes til at bestemme tubulinkoncentrationen. På grundlag af den beregnede tubulinkoncentration fremstilles aliquots af de ønskede mængder tubulin, snap-frosne i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C. Vi får normalt omkring ~ 2 mg tubulin fra fire spinner flasker HeLa S3 suspension kulturer (~ 15 g celler), ~ 250 μg tubulin fra ti 15-cm diameter retter (~ 1,2 g celler), og ~ 1 mg tubulin fra 1 g mus hjernevæv.

For at bekræfte tilsætningen af en bestemt tubulin isotype eller ændring kan ~0,1 μg af den rensede tubulin immunoblotted ved hjælp af respektive antistoffer34,35. Kontrol tubulin vil variere afhængigt af tubulin af interesse. For tubulin modificeret in vitro med et modificerende enzym, skal du bruge ikke-behandlede tubulin som kontrol. For tubulin, der er modificeret i cellulo ved overekspression af et modificerende enzym, skal du anvende tubulin renset fra celler, der ikke udtrykker enzymet som kontrol (Figur 4A). Kontrol tubulin for tubulin renset fra knockout-mus hjerner vil blive tubulin fra vilde type mus (Figur 4B). I alle immunoblotanalyser verificeres en lige belastning af tubulin ved hjælp af et PTM-uafhængigt anti-α tubulin antistof (12G10).

Figure 1
Figur 1: Tubulinrensning fra forskellige kilder ved hjælp af polymeriseringsdepolymeriseringscyklusser. (A) Forskellige kilder til tubulin lyses ved hjælp af specifikke strategier. HeLa S3 celler dyrket i suspension er lysed ved hjælp af en fransk presse; HEK-293 celler lyser ved gentagne pipetter. Vedhængende celler blev lysed ved hjælp af korte pulser af sonikering og mus hjernevæv ved hjælp af et væv homogenisator. (B) Skematisk fremstilling af de efterfølgende trin i tubulinrensningsprotokollen ved hjælp af cyklusser med kolddepolymerisering og varmpolymerisering. Efter lysis og lysat præcisering polymeriseres mikrotubuli og pelletes. Mikrotubuli afpolymeriseres derefter og får efterfølgende lov til at polymerisere i en højmolaritetsbuffer, hvilket forhindrer mikrotubule-associeret protein (MAP) co-sedimentering med mikrotubulinene. MAP-fri mikrotubuli afpolymeriseres derefter og kan yderligere udsættes for en tredje cyklus af polymeriseringsdepolymerisering for at fjerne spormængder af højmolaritetsbufferen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Evaluering af tubulinrensningens succes. Prøver indsamlet på forskellige trin i tubulin rensning protokol blev kørt på en 'TUB' natrium dodecylsulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) gel (se protokollen for detaljer) og farves med Coomassie strålende blå. (A)I en vellykket rensning af tubulin beriges α- og β-tubuliner gradvist under hele processen. Efter den anden polymerisering er mikrotubulepellet (P4) næsten fri for kontaminering fra andre proteiner eller mikrotubule-associerede proteiner (MAPs). Bemærk, at det er normalt at miste nogle tubulin under proceduren. (B) I en mislykket tubulinrensning er det endelige tubulinudbytte lavt, og tubulin forbliver enten i pellet efter afpolymerisering eller i supernatanten efter polymerisering (røde kasser). I det eksempel, der er vist her, polymeriserede tubulin ikke effektivt i begge polymeriseringstrin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Kvantificering af det rensede tubulin ved hjælp af Coomassie-farvede natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektrophoresisgelgelelektrophoresisgeler (SDS-PAGE) og densitometri. (A) Coomassie-farvet SDS-PAGE gel med kendte mængder kvægserumalbumin (BSA; 0,5, 1, 2 og 4 μg, grå gradientlinje) og forskellige mængder (henholdsvis 0,5 og 1 μL, lyse og mørke farver) af renset tubulin. I det viste eksempel blev tyrosinerede tubulin (HeLa S3 tubulin, lys og mørk orange) og detyrosinerede tubulin (HeLa S3 tubulin behandlet med carboxypeptidase A, lys og mørkeblå) lagt på gelen. (B) BSA-bånd fra (A) blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ (i vilkårlige enheder, AU) og afbildet i forhold til mængden af indlæst protein (grå til sorte punkter). Disse punkter blev brugt til at beregne den lineære regressionslinje (den grå gradientlinje) og ligning, som blev brugt til at beregne mængden af protein i tubulinprøverne (lyse og mørke orange og blå punkter), der blev indlæst på gelen. Dette lettede beregningen af koncentrationen af tubulinprøverne. Bemærk, at de punkter, der ligger uden for BSA-standardkurven, ikke bør bruges til at bestemme koncentrationen (mørke orange og blå punkter). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Immunoblotanalyse af renset tubulin med forskellige PTM'er. (A) Tubuliner renset fra HEK-293 celler: vilde typer, eller celler overekspresserende TTLL5 eller TTLL7 blev analyseret for den specifikke berigelse af polyglutamylation ved hjælp af GT335 antistof. Mens TTLL5 overexpression øger polyglutamylering på α- og β-tubulin, beriger TTLL7 overexpression specifikt β tubulin glutamylering. (B) Tubulin renset fra hjernevæv af vild type og ttll1-/- mus blev analyseret for mønstre af glutamylation. Bemærk den stærke reduktion af polyglutamylering af tubulin fra ttll1-/- mus, som mangler den store hjerne glutamylase TTLL136. 'TUB' geler blev brugt til at adskille α- og β-tubulin. En tilsvarende mængde tubulin belastning blev bekræftet af 12G10, en anti-α-tubulin antistof. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metode, der er beskrevet her, giver en platform til hurtigt at generere højkvalitets, samlings-kompetente tubulin i mellemstore store mængder fra cellelinjer og enkeltmushjerner. Den er baseret på guldstandardprotokollen for tubulinrensning fra kvæghjerner, der anvendes i marken i mange år16,17. En særlig fordel ved tilgangen er brugen af suspensionskulturer i HeLa S3-celler, som, når de først er etableret, giver store mængder celler, mens de kræver lidt praktisk tid. Dette gør protokollen relativt let at udføre i ethvert cellebiologisk laboratorium, mens andre tubulinrensningsmetoder18,19,32,37 kræver specifikt udstyr og ekspertise og derfor for det meste bruges af laboratorier med en stærk baggrund i proteinrensning. Når der produceres mindre mængder tubulin fra vedhængende cellelinjer, kan der anvendes en række cellelinjer. Vi har med succes renset tubulin fra HeLa, U-2 OS, og HEK-293 celler. Hvis der er behov for en større rensning, kan høstede celler eller hjerner snapfryses i lysis buffer og opbevares ved -80 °C, og flere cellepiller eller hjerner kan samles for at rense større mængder tubulin.

Tubulin renset fra cellelinjer er næsten fri for tubulin PTMs. Denne Tyr-tubulin kan let omdannes til detyrosinated (deTyr-) tubulin i et enkelt ligetil trin25. For at producere tubulin med andre PTM'er kan specifikke tubulinmodificerende enzymer overekspresseres i celler før tubulinrensning. Desuden hjælper brugen af cellelinjer af menneskelig oprindelse som materialekilde med at undgå potentielle problemer på tværs af arter, når man studerer interaktioner mellem mikrotubuli og humane MOP'er. Endvidere kan tubulin fra utransformerede (såsom HEK293) eller transformerede (såsom HeLa) celler give oplysninger om virkningerne af mikrotubule-rettet medicin (f.eks taxanes) på normal- vs tumor-celle mikrotubbules.

Endelig letter vores protokol rensningen af tubulin fra enkeltmushjerner. Da et stigende antal musemodeller af tubulinmutationer og modifikationer genereres, giver denne protokol mulighed for direkte analyse af egenskaber og interaktioner af mikrotubuli med ændret tubulin isotypesammensætning38,39,40 eller tubulin PTMs31,41.

Tilgangen er baseret på cyklusser af polymerisering og afpolymerisering. Specifikke tubulinisotyper eller tubulin med bestemte PTM'er, der påvirker mikrotubulis monterings- og demonteringsegenskaber, kan således resultere i et uforholdsmæssigt tab eller reduktion af sådanne tubulinformer under rensningsprocessen. Ikke desto mindre har vi vist, at store tubulin PTMs, såsom acetylering, detyrosination, glutamylation og glycylation, bevares på mikrotubulierne under hele tubulinrensningsprocessen24. Det skal dog bemærkes, at for kvantitative analyser af tubulinsammensætningen i celler eller væv er TOG-kolonnebaseret tubulinrensningsmetode mere hensigtsmæssig, da det ville give mulighed for en upartisk, polymeriserings-uafhængig tubulinrensning18. På trods af sin begrænsning tilbyder vores protokol en stor fordel ved at generere store mængder tubulin af høj kvalitet, der kan bruges i omhyggelige in vitro-rekonstitutionseksperimenter. Det letter især brugen af PTM-rige hjerne tubulin i rutinemæssige eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 og Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ støttes af Institut Curie, Det franske nationale forskningsagentur (ANR) tildeler ANR-12-BSV2-0007 og ANR-17-CE13-0021, Institut National du Cancer (INCA) tilskud 2014-PL BIO-11-ICR-1 og Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) tilskud DEQ20170336756. MMM støttes af Fondation Vaincre Alzheimer-tilskuddet FR-16055p og af Frankrigs Alzheimer-tilskud AAP SM 2019 nr. 2023. JAS blev støttet af EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. 675737 og FRM-tilskuddet FDT201904008210. SB blev støttet af FRM-tilskuddet FDT201805005465.

Vi takker alle medlemmer af Janke lab, især J. Souphron, samt G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) og A. Gautreau (Ecole Polytechnique) for hjælp under udarbejdelsen af protokollen. Vi vil gerne takke Institut Curies dyrefacilitet for hjælp til museavl og pleje.

Antistoffet 12G10, udviklet af J. Frankel og M. Nelson, blev fremstillet af Developmental Studies Hybridoma Bank udviklet i regi af NICHD og vedligeholdt af University of Iowa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C. Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. Correia, J. J., Wilson, L. , Academic Press. 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

Tags

Biokemi Problem 165 Mikrotubuli in vitro-rekonstitution tubulin tubulinrensning polymerisering mikrotubuledynamik tubulinkode tubulinisotyper suspensionskultur tubulin-posttranslationale modifikationer
Rensning af Tubulin med kontrollerede posttranslationale modifikationer og isotyper fra begrænsede kilder ved polymerisering-depolymeriseringscyklusser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bodakuntla, S., Jijumon, A. S.,… More

Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter