Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rening av tubulin med kontrollerade posttranslational modifieringar och isotyper från begränsade källor genom polymerisation-depolymeriseringscykler

Published: November 5, 2020 doi: 10.3791/61826
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver tubulin rening från små /medelstora källor såsom odlade celler eller enstaka mus hjärnor, med hjälp av polymerisation och depolymerisering cykler. Det renade tubulinet är berikat i specifika isotyper eller har specifika posttranslational modifieringar och kan användas i in vitro-beredningsanalyser för att studera mikrotubuledynamik och interaktioner.

Abstract

En viktig aspekt av studier av microtubule cytoskeleton är undersökningen av microtubule beteende i in vitro rekonstitution experiment. De möjliggör analys av de inneboende egenskaperna hos mikrotubuler, såsom dynamik, och deras interaktioner med mikrotubule-associerade proteiner (MAPs). "Tubulinkoden" är ett framväxande koncept som pekar på olika tubulinisottyper och olika posttranslational modifieringar (PTMs) som regulatorer av mikrotubule egenskaper och funktioner. För att utforska de molekylära mekanismerna i tubulinkoden är det viktigt att utföra in vitro-rekonstitutionsexperiment med renad tubulin med specifika isotyper och PTMs.

Hittills var detta tekniskt utmanande som hjärnan tubulin, som används ofta i in vitro experiment, hyser många PTMs och har en definierad isotyp sammansättning. Därför utvecklade vi detta protokoll för att rena tubulin från olika källor och med olika isotypkompositioner och kontrollerade PTMs, med hjälp av den klassiska metoden för polymerisation och depolymerisering cykler. Jämfört med befintliga metoder baserade på affinitet rening, ger detta tillvägagångssätt ren, polymerisation-kompetent tubulin, som tubulin resistent mot polymerisation eller depolymerisering kasseras under de successiva rening steg.

Vi beskriver reningen av tubulin från cellinjer, odlas antingen i suspension eller som vidhäftande kulturer, och från enstaka mus hjärnor. Metoden beskriver först genereringen av cellmassa i både suspension och vidhäftande inställningar, lyssteget, följt av de successiva stadierna av tubulinrening genom polymerisation-depolymeriseringscykler. Vår metod ger tubulin som kan användas i experiment som behandlar effekten av tubulinkoden på de inneboende egenskaperna hos mikrotubuler och mikrotubuleinteraktioner med associerade proteiner.

Introduction

Mikrotubuler spelar kritiska roller i många cellulära processer. De ger cellerna sin form, bygger meiotiska och mitotiska spindlar för kromosomsegregering och fungerar som spår för intracellulär transport. För att utföra dessa olika funktioner organiserar sig mikrotubuler på olika sätt. En av de spännande frågorna inom området är att förstå de molekylära mekanismer som gör det möjligt för de strukturellt och evolutionärt bevarade mikrotubulerna att anpassa sig till denna mängd organisationer och funktioner. En potentiell mekanism är diversifiering av mikrotubuli, som definieras av begreppet "tubulinkod"1,2,3. Tubulinkoden innehåller två huvudkomponenter: differentiell inkorporering av genprodukterna α- och β-tubulin (tubulinisotyper) i mikrotubuli och tubulin posttranslational modifieringar (PTMs).

Sedan 1970-talet har in vitro-rekonstitutionsexperiment, i kombination med framväxande ljusmikroskopitekniker, banat väg för viktiga upptäckter om egenskaperna hos mikrotubuler: dynamisk instabilitet4 och löpband5, och deras andra mekanismer ochfunktioner 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Nästan alla in vitro-experiment som utförts hittills har baserats på tubulin renat från hjärnvävnad med upprepade cykler av polymerisation och depolymerisering16,17. Även om rening från hjärnvävnaden ger fördelen av att få högkvalitativ tubulin i stora mängder (vanligtvis gram mängder), är en viktig nackdel heterogeniteten som tubulin renad från hjärnvävnad är en blandning av olika tubulin isotyper och berikas med många tubulin PTMs. Denna heterogenitet gör det omöjligt att avgränsa rollen för en viss tubulin PTM eller isotyp i kontrollen av mikrotubule egenskaper och funktioner. Att producera monteringskompande tubulin med kontrollerade tubulin-PTM:er och homogen isotypsammansättning är därför viktigt för att ta itu med tubulinkodens molekylära mekanismer.

Nyligen har en metod för att rena tubulin genom affinitetskromatografi med hjälp av den mikrotubulebindande TOG-domänen (tumör-överuttryckt gen) av jäst Stu2p utvecklats18. I denna metod passerar tubulin i rålystnater av celler eller vävnad genom en kolumn där den binder till den matris-immobiliserade TOG-domänen, vilket möjliggör analys av hela tubulinpoolen i ett givet, till och med mycket litet, prov. Ett efterlängtat tillvägagångssätt för att rena rekombinant tubulin har också beskrivits under de senaste åren. Det är baserat på baculovirussystemet, där en bi-cistronic vektor som innehåller α- och β-tubulingener uttrycks i insektsceller19. Denna metod är dock mycket besvärlig och tidskrävande och används därför främst för att studera effekten av tubulinmutationer20 och tubulinisotyper21,22,23 in vitro.

I det nuvarande protokollet beskriver vi en metod som använder den väletablerade och allmänt använda polymerisationsdepolymeriseringsmetoden som en plan för att generera tubulin med olika nivåer av modifiering antingen från cellinjer eller från mushjärnvävnad24. I detta förfarande cyklas tubulin mellan lösliga (tubulin dimer vid 4 °C) och polymeriserad form (mikrotubule vid 30 °C i närvaro av guanosin 5'-triphosphate [GTP]). Varje form separeras genom successiva centrifugeringssteg: tubulin dimers kommer att förbli i supernatanten efter en kall (4 °C) spinn, medan mikrotubuler kommer att pelleteras vid 30 °C. Dessutom utförs ett polymerisationssteg vid hög piperazin-N,N′-bis(2-etanesulfonsyra) (PIPES) koncentration, vilket gör det möjligt att avlägsna mikrotubule-associerade proteiner från mikrotubulerna och därmed från det slutligen renade tubulinet. Tubulin renad från HeLa S3-celler som odlas som suspension eller vidhäftande kulturer är praktiskt taget fri från någon tubulin PTM och har använts i de senaste in vitro-rekonstitutionsexperimenten25,26,27,28. Vi har ytterligare anpassat metoden för att rena tubulin från enmushjärnor, som kan användas för ett stort antal musmodeller med förändringar i tubulinisottyper och PTM.

I protokollet beskriver vi först genereringen av källmaterialet (cellmassa eller hjärnvävnad), dess lysis (Figur 1A), följt av successiva steg av tubulinpolymerisering och depolymerisering för att rena tubulinet (Figur 1B). Vi beskriver vidare processen för att bedöma renheten (figur 2A, B) och kvantiteten ( figur3A, B) av det renade tubulinet. Metoden kan anpassas för att producera tubulin berikat med en utvald PTM genom att överuttrycka ett modifierande enzym i celler före tubulinrening (Figur 4B). Alternativt kan tubulinmodifierande enzymer tillsättas till tubulin under reningsprocessen. Slutligen kan vi rena tubulin som saknar specifika isotyper eller PTM från hjärnan hos möss som saknar motsvarande tubulinmodifierande enzymer (Figur 4B)29.

Metoden vi beskriver här har två huvudsakliga fördelar: i) det möjliggör produktion av tillräckligt stora mängder tubulin på relativt kort tid, och (ii) det genererar högkvalitativ, ren tubulin, med antingen specifik tubulin isotypkomposition eller PTMs. I den tillhörande videon av detta manuskript belyser vi några av de kritiska stegen som är involverade i denna procedur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurvård och användning för denna studie utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapens rekommendationer (2010/63/UE). Experimentella förfaranden godkändes särskilt av den etiska kommittén vid Institut Curie CEEA-IC #118 (tillstånd nr 04395.03 från den nationella myndigheten) i enlighet med de internationella riktlinjerna.

1. Beredning av reagenser för tubulinrening

OBS: Alla buffertar som används för tubulinrening bör innehålla kaliumsalter och INTE natriumsalter30.

  1. Förbered 1 L av komplett medium: Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM), med 10% fetala nötkreatur serum (FBS, 100 mL), 200 mM L-glutamin (10 mL 2 M lager) och 1x penicillin-streptomycin (10 mL 100x lager). Förvaras vid 4 °C.
  2. Förbered 10 M kaliumhydroxid (KOH) genom att lösa upp 140 g KOH i vatten, justera den slutliga volymen till 250 ml och förvara vid rumstemperatur.
  3. Förbered 0,5 M etylendiamintetraättikasyra (EDTA), pH 8, genom att lösa upp 36,5 g EDTA i vatten, justera pH-talet till 8,0 med KOH (annars kommer EDTA inte att lösas upp) och den slutliga volymen till 250 ml, filtersteriliseras och förvaras vid rumstemperatur.
  4. Förbered 5 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-EDTA genom att tillsätta 5 ml 0,5 M EDTA till 500 ml PBS, filtersterilisera och förvara vid rumstemperatur.
  5. Förbered 0,5 M K-PIPES, pH 6.8, genom att lösa upp 75,5 g rör i vatten, justera till pH 6.8 med KOH (annars kommer rören inte att lösas upp) och den slutliga volymen till 500 ml, filtersterilisera och lagra vid 4 °C.
  6. Förbered 1 M K-PIPES, pH 6.8, genom att lösa upp 15,1 g rör i vatten, justera till pH 6,8 med KOH och den slutliga volymen till 50 ml, filtersterilisera och förvara vid 4 °C.
  7. Bered 0,5 M kalium-etylenglykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N′,N′-tetraättiksyra (K-EGTA, pH 7.7) genom att lösa upp 47,5 g EGTA i vatten, justera till pH 7,7 med KOH och den slutliga volymen till 250 ml, filtersterilisera och förvara vid rumstemperatur.
  8. Förbered BRB80 (80 mM K-PIPES, pH 6.8; 1 mM K-EGTA; 1 mM magnesiumklorid [MgCl2]) lösning genom att blanda 3,2 ml 0,5 M RÖR, 40 μL 0,5 M K-EGTA och 20 μL 1 M MgCl2 och justera den slutliga volymen till 20 ml. Förvaras vid 4 °C.
  9. Förbered 0,1 M fenylmetanesulfonylfluorid (PMSF) genom att lösa upp 435 mg PMSF i isopropanol för att erhålla en slutlig volym på 25 ml och lagra vid -20 °C.
  10. Förbered proteashämmare blanda (200x) genom att lösa upp 10 mg aprotinin, 10 mg leupeptin och 10 mg 4-(2-aminoetyl)-bensenesulfonylfluorid i vatten för att erhålla en slutlig volym på 2,5 ml, göra alikvoter på 100 μL och förvara vid -20 °C.
  11. Förbered 10% Triton X-100 genom att blanda 5 ml Triton X-100 i 45 ml vatten, filtersterilisera och förvara vid rumstemperatur.
  12. Förbered Lysis buffert (BRB80 kompletterad med 1 mM 2-merkaptoethanol, 1 mM PMSF, 1x proteashämmare blandas och, valfritt för HEK-293 celler, 0,2% Triton X-100) på dagen för tubulinrening genom att blanda 20 ml BRB80 med 1,5 μL 2-merkaptoetanol, 200 μL 0,1 M PMSF, 100 μL proteashämmarblandningen och, valfritt för HEK-293 celler , 400 μL 10% Triton X-100.
    OBS: 2-mercaptoethanol är giftigt och ska användas i rökhuven.
  13. Förbered 0,2 M GTP genom att lösa upp 1 g GTP i 9,5 ml vatten, justera pH-talet till 7,5 med KOH, gör alikvoter på 20 μL och förvara vid -20 °C. Undvik upprepade frys-tina cykler.
  14. Förbered 1 M tris(hydroxymethyl) aminometan-hydroklorid (Tris-HCl) genom att lösa upp 60,56 g Tris i vatten, justera till pH 6.8 med HCl, komplett till en slutlig volym på 500 ml, filtersterilisera och lagra vid rumstemperatur.
  15. Förbered 5x Laemmli provbuffert (450 mM dithiothreitol (DTT); 10% natriumdcylsulfat (SDS); 400 μM Tris-HCl, pH 6,8; 50% glycerol; ~0,006% bromophenol blå) genom att tillsätta 4 g SDS till 16 ml förvärmd 1 M Tris-HCl, pH 6,8, och blanda lösningen försiktigt. Tillsätt 2,6 g DTT och 20 ml 100% glycerol till blandningen och rör om tills lösningen blir homogen. Tillsätt önskad mängd bromophenol blå (2,5 mg) för att nå önskad färgintensitet. Gör 5 ml alikvoter och förvara vid -20 °C. Förbered 2x arbetslösningen av Laemmlis provbuffert genom att späda ut 5x-beståndet i destillerat vatten.

2. Förstärknings- och skördekällor för tubulin

OBS: I detta protokoll användes tre källor till tubulin: i) celler (HeLa S3 och HEK-293) odlade som suspensionskulturer; ii) Celler som odlas som vidhäftande kulturer (HEK-293, HeLa och U2 OS). och iii) mushjärnvävnad. I detta protokoll behandlas dagen för tubulinrening som "dag 0" och därför har andra steg beskrivits i förhållande till dag 0.

  1. Förstärkning av celler
    1. Celler odlade som suspensionskulturer
      OBS: För att framgångsrikt rena tubulin från suspensionskulturer, använd minst 2 L suspensionskultur.
      1. För 2 L suspension kultur, återuppliva och växa den föredragna celltypen för att få 6 × 107 celler 10 dagar före förberedelsedagen. På dag -10, tallriksceller på sex 15 cm diameter rätter vid 107 celler per tallrik.
      2. På dag -8, förvärm den erforderliga mängden komplett medel till 37 °C. Tillsätt 1 L förvärmt medium till varje spinnerflaska under sterila förhållanden. Placera spinnarna på ett omrörarbord på 20–25 varv/min inuti cellkulturinkubatorn, öppna de laterala spinnerlocken något så att mediet kan balansera till inkubatorns atmosfär.
        OBS: För att undvika kontaminering, rengör mediets och spinnerflaskorns yttre yta noggrant med 70 % etanol.
      3. På dag -7, trypsinize och samla cellerna odlas till 80-90% sammanflöde (cirka 1,8 × 108 celler). Samla celler från 3 rätter åt gången, snurra ner (200 × g,5 min, rumstemperatur) och suspendera alla celler i 10 ml DMEM.
        OBS: Noggrann dissociation av cellerna vid denna tidpunkt är mycket viktigt för att undvika bildandet av större aggregat i spinnerflaskorna, vilket påverkar cellens överlevnad och resulterar i lågt tubulinutbyte.
      4. Tillsätt 5 ml cellfjädring till varje spinnerflaska som innehåller 1 L DMEM, sätt tillbaka spinnarna i omrörarbordet i cellkulturinkubatorn och låt cellerna växa i en vecka.
    2. Celler som odlas som vidhäftande kulturer
      OBS: För att framgångsrikt rena tubulin från vidhäftande celler, använd minst 10 rätter med 80-90% sammanflöde.
      1. Återuppliva och förstärk önskad celltyp för att erhålla 1 × 108 celler tre dagar före dagen för tubulinpreparatet.
      2. På dag -3, plätera dessa celler på tio 15 cm rätter vid 1 × 107celler per maträtt och låt dem växa 80-90% sammanflöde.
      3. Dag -1, om det behövs, transfektera celler med en plasmid för att uttrycka ett tubulinmodifierande enzym eller en viss tubulinisotyp.
  2. Skörd av celler/hjärnvävnad
    1. Celler odlade som suspensionskulturer
      1. Överför cellfjädringen från spinnare till 1 L centrifugflaskor(Table of Materials)och pelletsceller vid 250 × g,15 min, rumstemperatur. För att omedelbart starta en annan kultur av HeLa S3-celler i spinnerflaskorna, lämna 100 ml cellfjädring i spinnarna och tillsätt 1 L komplett, förvärmd DMEM till spinnerflaskan.
        OBS: Kontrollera noggrant om det finns bakteriell kontaminering innan du fortsätter med tubulinrening.
      2. Återanvänd pelleterade celler från varje centrifugflaska i 10 ml iskallt PBS och överför alla celler till 50 ml skruvlocksrör. Håll cellerna på is under återupphängningen. Pellet cellerna vid 250 × g, 15 min, 4 °C.
        OBS: Följ rekommendationerna för rengöring och förvaring av spinnerflaska (se Materialförteckning).
      3. Kassera supernaten och bestäm volymen på cellpelleten. Från 2 L suspensionskultur (två spinnerflaskor), förvänta dig en cellpellet på 5-6 ml.
        OBS: I det protokoll som beskrivs nedan antas cellpelletvolymen vara 10 ml. Justera experimentet enligt pelletsvolymerna.
      4. Tillsätt 1 volym (10 ml) lysbuffert och suspendera cellpelleten igen.
        OBS: Förhållandet mellan cellpelletsvolym och lysbuffertvolym är mycket viktigt för framgångsrik tubulinrening. Att tillsätta mer lysbuffert minskar tubulinkoncentrationen, som sedan inte når den kritiska koncentration som behövs för polymerisation, vilket kraftigt minskar tubulinutbytet.
        OBS: Celler som återanvänds i lysbuffert kan snapfrysas i flytande kväve och lagras vid -80 °C i två månader.
    2. Celler som odlas som vidhäftande kulturer
      OBS: Celler från vidhäftande kulturer måste skördas mycket snabbt för framgångsrik tubulinrening (cirka 15 minuter för skörd av tio 15 cm rätter). Tre personer deltog i detta steg i protokollet.
      1. Ta bort mediet från 15 cm disk genom att luta disken och tvätta sedan försiktigt cellerna med 7 ml PBS-EDTA vid rumstemperatur (person 1). Arbeta endast med tre 15 cm rätter åt gången för att undvika att lämna cellerna utan medium eller buffert.
      2. Tillsätt 5 ml PBS-EDTA i cellerna och inkubera dem i 5 minuter vid rumstemperatur.
      3. Använd en celllyftare för att försiktigt lossa cellerna genom att skyffla dem till ena kanten av skålen (person 2) och samla alla celler i ett 50 ml skruvlocksrör (person 3). Skölj varje tallrik med ytterligare 2 ml PBS-EDTA för att samla upp eventuella kvarvarande celler från disken. Under detta steg, håll 50 ml skruvlocksrör som innehåller cellfjädringen på is.
      4. Pellet cellerna vid 250 × g, 10 min, 4 °C. Kassera supernaten och bestäm volymen på cellpelleten. Räkna med en volym på ~1 ml från tio 15 cm rätter.
        OBS: I det protokoll som beskrivs nedan antas cellpelletvolymen vara 10 ml. Justera experimenten efter pelletsvolymerna.
      5. Återanvänd cellerna i 1 volym (10 ml) lysbuffert.
        OBS: Celler som återanvänds i lysbuffert kan förvaras vid -80 °C i upp till två månader.
    3. Hjärnvävnad
      OBS: Möss i alla åldrar, kön eller genetisk bakgrund kan användas. Valet av den transgena musstammen kommer att bero på den vetenskapliga fråga som ska tas upp. I detta manuskript visar vi exemplet med tubulin renat från ttll1-/- musen, som saknar ett stort hjärnan glutamylerande enzym, tubulin tyrosin ligase-liknande 1 (TTLL1) protein31.
      1. Offra musen genom livmoderhalsförskjutning, halshugg snabbt och samla hjärnan i ett rundbottnad rör. Om det finns överflödigt blod på hjärnan, tvätta snabbt med lysbuffert. Samla hjärnan så snart musen offras eftersom en försening efter döden kan påverka framgången med tubulinrening. Använd rör med rund botten för att passa bredden på sonden som används för homogenisering.
        OBS: Insamlade mushjärnor kan snabbfrysas i flytande kväve och lagras vid -80 °C i upp till 3 år.
      2. Tillsätt 500 μL lysbuffert till en enda hjärna som extraherats från en vuxen mus. För resten av protokollet antas volymen av den tillsatta lysbufferten vara 10 ml. Justera för ditt experiment enligt antalet hjärnor som ska användas.

3. Lys av celler eller hjärnvävnad

  1. Celler odlade som suspensionskulturer
    1. För HEK-293, lys cellerna på is genom att repetitivt pipettera upp och ner med pipettspetsar av olika bredder. Fäst först en p1000-spets på en 10 ml pipett och pipetten cellfjädringen upp och ner var 5:e minut i 10 min (tre rördragningscykler). För det andra, fäst en p200-spets på en p1000-spets och ytterligare pipett var 5: e minut, i 20 min (fem cykler av pipettering).
    2. För HeLa S3, lys cellerna med en fransk press (se Tabell över material för inställningar).
    3. Ta 1/100 volym lysisblandningen (L) (200 μL för 20 ml L) och tillsätt sammavolym på 2x Laemmli-buffert, koka i 5 minuter och förvara vid -20 °C för vidare analys.
  2. Celler som odlas som vidhäftande kulturer
    1. Överför cellerna till ett 14 ml rundbottnat rör vars höjd har minskats för att rymma ljudsonden (se Materialförteckning för inställningar). Sonicate cellerna för ~45 pulser, och bekräfta cell lysis genom att prova en droppe av lysisblandningen under ett mikroskop.
      OBS: Antalet pulser kan variera beroende på vilken celltyp som används för tubulinrening. Ultraljudsceller för mycket kan orsaka tubulin att fälla ut och kommer att påverka rening utbytet negativt.
    2. Pipett cellerna upp och ner på is var 5:e minut i 20 min (fem cykler av pipettering), med en p200 spets.
    3. Ta 1/100 volym lysisblandning (L) (200 μL för 20 ml L) och tillsätt sammavolym 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för vidare analys.
  3. Hjärnvävnad
    1. Lysa hjärnvävnaden med hjälp av en vävnadsblandare (se Materialförteckning för inställningar). Alternativt kan du lysa vävnaden med hjälp av en mikrorörspis eller motsvarande utrustning och pipett upp och ner på isen med en 1 ml spruta med en 18 G-nål.
    2. Ta 1/100 volym lysisblandning (L) (200 μL för 20 ml L) och tillsätt sammavolym 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för vidare analys.

4. Rening av Tubulin

  1. Förtydligande av lysat
    1. Rensa lysatet (separera pellet och löslig fraktion av lysblandningen) genom centrifugering vid 150 000 × g, 4 °C, 30 min. Se Tabell över material för detaljer om ultracentrifugrotorer och rör. För cellextrakt bildas ofta ett vitt flytande lager efter centrifugation. Överför inte detta flytande lager tillsammans med supernatanten, eftersom det stör tubulinpolymeriseringen. Använd en spruta med lämplig volym fäst vid en lång 20 G eller 21 G nål för att försiktigt ta bort supernaten utan att störa det flytande skiktet. Om supernatanten fortfarande är grumlig, centrifugera vid 5 000 × g, 4 °C i 10 min.
    2. Överför supernatanten (SN1) till ett ultracentrifugrör och notera dess volym. För en 10 ml cellpellet, förvänta dig en volym på ~ 12 mL för SN1.
    3. Ta 1/100:e volymen SN1 (120 μL för 12 ml SN1) och tillsätt sammavolym 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för vidare analys.
    4. Återanvänd pelleten (P1) i BRB80(Materialförteckning)med samma volym som SN1. Ta 1/100:e volymen P1 (200 μL för 20 ml P1) och tillsätt samma volym på 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för vidare analys.
  2. Första polymerisationen i buffert med låg molaritet
    1. Förbered polymerisationsblandningen genom att kombinera 1 volym SN1 (12 ml), 1/200th volym på 0,2 M GTP (60 μL; slutlig koncentration 1 mM) och 0,5 volym förvärmd glycerol (6 ml) i ett skruvlocksrör med lämplig volym.
      OBS: Glycerol används som trängselmedel i polymerisationsstegen genom hela protokollet och beaktas därför inte i beräkningarna av andra komponenters koncentrationer.
    2. Pipetten blandas upp och ner, undviker försiktigt bildandet av luftbubblor och överför den till lämpliga ultracentrifugerör.
      OBS: När blandningen överförs till rören, justera rörens vikt (i par). Detta gör det möjligt för experimenteraren att direkt gå vidare till sedimentering av mikrotubuler efter polymerisationssteget. Gör detta för alla polymerisationssteg i hela protokollet.
    3. Täck rören med parafilm, överför till ett vattenbad vid 30 °C och inkubera i 20 minuter.
    4. Centrifugera rören vid 150 000 × g, 30 °C i 30 min. Ta bort supernatanten (SN2) och behåll pelleten av polymeriserade mikrotubuler (P2).
      OBS: Microtubule pellet kan snabbfrysas och förvaras vid -80 °C i upp till 1 år.
    5. Ta 1/200:evolymen SN2 (90 μL för 18 ml SN2) och tillsätt samma volym på 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för vidare analys.
  3. Första depolymeriseringen
    1. Depolymerisera mikrotubuler genom att tillsätta iskall BRB80 till pelleten P2 och lämna på is i 5 minuter: för tubulin från celler, tillsätt 1/60th (200 μL) och för tubulin från hjärnor, tillsätt 1/20th (600 μL) av volymen av SN1.
      OBS: Volymen av iskallt BRB80 som tillsätts pelleten under depolymeriseringsstegen är alltid i förhållande till volymen av SN1.
    2. Återanvänd mikrotubulepellet försiktigt och undvik luftbubblor tills lösningen är helt homogen. Använd en p1000 spets för ett par cykler av pipetting följt av en p200 spets var 5: e minut, i 20 min (fem cykler av pipetting). Detta är ett avgörande steg för framgången med tubulinrening.
    3. Överför lösningen till lämpliga ultracentrifugrör och snurra ner vid 150 000 × g, 4 °C i 20 minuter. Överför SN3 till ett nytt 1,5 ml ultracentrifugrör. Pelleten som bildas efter detta centrifugationssteg (P3) innehåller fällda proteiner (mikrotubule-associerade proteiner eller MAPs) och icke-depolymeriserade mikrotubuler. Supernatanten (SN3) innehåller lösliga komponenter: depolymeriserade tubulin dimers och MAPs, som har lossnat från de depolymeriserade mikrotubulerna.
    4. Ta 1–4 μL SN3 och tillsätt 9 volymer 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för ytterligare analyser.
    5. Återanvänd pellets P3 i BRB80 (i samma volym SN3), ta 1–4 μL och tillsätt 9 volymer 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C.
  4. Andra polymerisationen (i buffert med hög molaritet)
    1. Förbered polymerisationsblandningen genom att kombinera 1 volym SN3 (200 μL), 1 volym förvärmda 1 M RÖR (200 μL, slutlig koncentration 0,5 M), 1/100th volym på 0,2 M GTP (2 μL, slutlig koncentration 1 mM) och 1 volym förvärmt glycerol (200 μL) i ett rör med lämplig volym.
    2. Pipettera blandningen upp och ner, undvik bildandet av luftbubblor och överför den till ultracentrifugerör.
    3. Täck rören med parafilm, överför dem till ett vattenbad vid 30 °C och inkubera i 20 minuter.
    4. Centrifugera rören vid 150 000 × g,30 °C i 30 min. Ta bort supernatanten (SN4) och behåll pelleten av polymeriserade mikrotubuler (P4). Pelleten P4 innehåller polymeriserade mikrotubuler, och supernatanten SN4 innehåller oförminskad tubulin, MAPs och andra lösliga proteiner.
      OBS: Mikrotubulepellet efter det andra polymerisationssteget kan snabbfrysas och förvaras vid -80 °C i upp till 1 år.
    5. Ta 1–4 μL och tillsätt 9 volymer 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för ytterligare analyser.
  5. Andra depolymeriseringen
    1. Depolymerisera mikrotubuler genom att tillsätta iskall BRB80 till pelleten P4 och lämna på is i 5 minuter: för tubulin från celler, tillsätt 1/100th (120 μL) och för tubulin från hjärnor, tillsätt 1/40th (300 μL) av volymen av SN1.
    2. Pipett upp och ner med p200-spets var 5:e minut, i 20 min (fem cykler av pipettering).
    3. Överför lösningen till ett 1,5 ml ultracentrifugerör och snurra ner vid 150 000 × g, 4 °C i 20 min. Överför SN5 till ett nytt 1,5 ml ultracentrifugrör. Pelleten som bildas efter detta centrifugationssteg (P5) innehåller icke-depolymeriserade mikrotubuler. Supernatanten (SN5) innehåller det lösliga tubulinet.
    4. Ta 1–4 μL och tillsätt 9 volymer 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för ytterligare analyser.
    5. Återanvänd pellets P5 i BRB80 (samma volym SN5), ta 1–4 μL och tillsätt 9 volymer 2x Laemmli-buffert, koka i 5 minuter och förvara vid -20 °C för ytterligare analyser.
  6. Tredje polymerisationen (i buffert med låg molaritet)
    1. Förbered polymerisationsblandningen: 1 volym SN5 (120 μL), 1/200th volym på 0,2 M GTP (0,6 μL, slutlig koncentration är 1 mM) och 0,5 volym förvärmd glycerol (60 μL) i ett rör med lämplig volym.
    2. Pipettera blandningen upp och ner, undvik försiktigt bildandet av luftbubblor och överför den till lämpliga ultracentrifugerör.
    3. Täck rören med parafilm, överför dem till ett vattenbad vid 30 °C och inkubera i 20 minuter.
    4. Centrifugera rören vid 150 000 × g,30 °C i 30 min. Pelleten (P6) innehåller polymeriserade mikrotubuler och supernatanten SN6 innehåller små mängder icke-polymeriserat tubulin.
      OBS: Mikrotubulepellets kan snabbfrysas och förvaras vid -80 °C i upp till 1 år.
    5. Ta 1–4 μL och tillsätt 9 volymer 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för ytterligare analyser.
  7. Tredje depolymeriseringen
    1. Depolymerisera mikrotubuler genom att tillsätta iskall BRB80 till pelleten P6 och lämna på is i 5 minuter: för tubulin från celler, tillsätt 1/100th (120 μL) och för tubulin från hjärnor, tillsätt 1/40th (300 μL) av volymen av SN1.
    2. Pipett upp och ner med p200-spets var 5:e minut, i 20 min (fem cykler av pipettering).
    3. Överför lösningen till lämpliga ultracentrifugrör och snurra ner vid 150 000 × g, 4 °C i 20 minuter. Överför SN7 till ett nytt 1,5 ml ultracentrifugrör. Pelleten (P7) innehåller små mängder icke-depolymeriserade mikrotubuler. Supernatanten (SN7) innehåller uteslutande depolymeriserade mikrotubuler (lösligt tubulin).
    4. Ta 1–4 μL och tillsätt 9 volymer 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för ytterligare analyser.
    5. Återanvänd pellets P7 i BRB80 (samma volym SN7), ta 1–4 μL och tillsätt 9 volymer 2x Laemmli-buffert, koka i 5 min och förvara vid -20 °C för ytterligare analyser.
    6. Kvantifiera mängden tubulin (se representativa resultat)och alikvoten SN7 i små volymer, snäppfrysa och förvara vid -80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Huvudsyftet med denna metod är att producera högkvalitativ, monteringsbekräftande tubulin i mängder som är tillräckliga för att utföra upprepade in vitro-experiment med de renade komponenterna. Mikrotubuli monterade från detta tubulin kan användas i beredningsanalyser baserade på tirf-mikroskopiteknik (Total Internal Reflection Fluorescence) med antingen dynamiska eller stabila mikrotubuler, i experiment som testar mikrotubuledynamik, interaktioner med MAPs eller molekylära motorer och kraftgenereringav motorerna 25. De kan också användas i mikrotubule-MAP co-pelleting analyser och solid state NMR spektroskopi28.

Anrikning och renhet av tubulin under hela reningsprocessen kan övervakas med hjälp av en Coomassie-färgad SDS-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) gel, helst "TUB" SDS-PAGE geler, som möjliggör separation av α- och β-tubuliner, som sam migrerar som ett enda band i klassiska geler32. Lysater som samlas in i olika steg (med undantag för den allra sista depolymeriseringen, se protokoll) lastas på gelén i jämförbara mängder för att bedöma framgången med tubulinrening (figur 2A)24. Det slutliga tubulinprovet, som är mycket värdefullt, laddas endast på gelén för bestämning av tubulinkoncentration. Det är normalt att förlora lite tubulin i processen med upprepade cykler av polymerisation och depolymerisering. Ett lägre utbyte än väntat av det slutliga renade tubulinet kan bero på antingen (i) ofullständig depolymerisering av mikrotubuli, visualiseras genom förekomst av en betydande mängd tubulin i fraktionerna P3, P5 och P7, eller ii) en ineffektiv tubulinpolymerisering i mikrotubuler, i vilket fall en lägre mängd tubulin förekommer i fraktionerna P2, P4 och P6 och högre i fraktionerna SN2, SN4 och SN6 (Figur 2B). Om tubulinet går förlorat under polymerisationssteg (lägre mängder P2 och P4) (i) säkerställa tillräcklig tubulinkoncentration under polymerisation (ii) använd en frisk alikvot av GTP och/eller (iii) bekräfta polymerisationsreaktionens temperatur. Om tubulinet går förlorat under depolymeriseringssteg (lägre mängder SN3 och SN5), öka tiden samt pipetting av blandningen på is.

För kvantifiering av renat tubulin, kör proverna tillsammans med de kända mängderna bovint serumalbumin (BSA, 0,5 μg – 1 μg – 2 μg – 4 μg) (Figur 3A) på SDS-PAGE. Geler är färgade med Coomassie lysande blå, skannad, och intensiteterna hos BSA- och tubulinband mäts med kvantitativ densitometri (Figur 3B) enligt beskrivningen vid https://openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ. Observera att samma analys kan göras i Fiji, en uppgraderad version av ImageJ33. Värden från BSA-banden användes för att bestämma den linjära regressionsekvationen, som användes för att beräkna mängden protein i tubulinbanden. Endast tubulinbandsintensiteter inom BSA-kurvan används för att bestämma tubulinkoncentrationen. Baserat på den beräknade tubulinkoncentrationen bereds alikvoter av önskade volymer tubulin, snäppfryses i flytande kväve och lagras vid -80 °C. Vi får vanligtvis ca ~ 2 mg tubulin från fyra spinnerflaskor med HeLa S3 suspensionskulturer (~ 15 g celler), ~ 250 μg tubulin från tio 15 cm diameter rätter (~ 1,2 g celler) och ~ 1 mg tubulin från 1 g mushjärnvävnad.

För att bekräfta anrikningen av en viss tubulinisotyp eller modifiering kan ~0,1 μg av det renade tubulinet immunoblotteras med respektive antikroppar34,35. Kontrollkarulinet varierar beroende på tubulin av intresse. För tubulinmodifierad in vitro med modifierande enzym, använd icke-behandlad tubulin som kontroll. För tubulin modifierat i cellulo genom överuttryck av ett modifierande enzym, använd tubulin renat från celler som inte uttrycker enzymet som kontroll (Figur 4A). Kontrollkarulin för tubulin renat från knockoutmushjärnor kommer att vara tubulin från vilda möss (Figur 4B). I alla immunoblot analyser verifieras en lika stor belastning av tubulin med hjälp av en PTM-oberoende anti-α-tubulin antikroppar (12G10).

Figure 1
Figur 1: Tubulinrening från olika källor med hjälp av polymerisationsdepolymeriseringscykler. A)Olika källor till tubulin lysas med hjälp av specifika strategier. HeLa S3-celler odlade i suspension lysas med hjälp av fransk press; HEK-293 celler lysas av repetitiv pipetting. Vidhäftande celler lysed med korta pulser av ultraljudsbehandling och mus hjärnan vävnad med hjälp av en vävnad homogenisator. B)Schematisk representation av de successiva stegen i tubulinreningsprotokollet med hjälp av cykler av kalldepolymerisering och varmpolymerisering. Efter lysis och lysat förtydligande polymeriseras mikrotubuler och pelleteras. Mikrotubuler depolymeriseras sedan och får därefter polymeriseras i en buffert med hög molaritet, vilket förhindrar mikrotubule-associerad protein (MAP) samsedimentering med mikrotubulerna. MAP-fria mikrotubuler depolymeriseras sedan och kan ytterligare utsättas för en tredje cykel av polymerisation-depolymerisering för att ta bort spårmängder av hög molaritetsbufferten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Utvärdering av framgången med tubulinrening. Prover som samlats in i olika steg i tubulinreningsprotokollet togs på en tub natriumdcylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) gel (se protokoll för detaljer) och färgas med Coomassie lysande blå. a)Vid en framgångsrik tubulinrening berikas α- β tubuliner successivt under hela processen. Efter den andra polymerisationen är mikrotubulepellet (P4) praktiskt taget fri från förorening från andra proteiner eller mikrotubule-associerade proteiner (MAPs). Observera att det är normalt att förlora lite tubulin under proceduren. B)Vid en misslyckad tubulinrening är det slutliga tubulinutbytet lågt, och tubulin förblir antingen i pelleten efter depolymerisering eller i supernatanten efter polymerisation (röda lådor). I exemplet som visas här polymeriserade tubulin inte effektivt i båda polymerisationsstegen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Kvantifiering av det renade tubulinet med coomassiefärgade natriumdcylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) geler och densitometri. A)Coomassie-färgad SDS-PAGE gel med kända mängder bovint serumalbumin (BSA; 0,5, 1, 2 och 4 μg, grå lutningslinje) respektive olika volymer (0, 5 respektive 1 μL, ljusa respektive mörka färger) av renat tubulin. I exemplet som visas, tyrosinated tubulin (HeLa S3 tubulin, ljus och mörkorange) och detyrosinated tubulin (HeLa S3 tubulin behandlas med carboxypeptidase A, ljus och mörkblå) laddades på gelén. BB)BSA-band från (A) kvantifierades med ImageJ (i godtyckliga enheter, AU) och plottades mot mängden protein som lastats (grå till svarta punkter). Dessa punkter användes för att beräkna den linjära regressionslinjen (den grå gradientlinjen) och ekvationen, som användes för att beräkna mängden protein i tubulinproverna (ljusa och mörkorange och blå punkter) laddade på gelén. Detta underlättade beräkningen av koncentrationen av tubulinproverna. Observera att de punkter som ligger utanför BSA-standardkurvan inte bör användas för att bestämma koncentrationen (mörkorange och blå punkter). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Immunoblotanalys av renat tubulin med olika PTM: er. (A) Tubuliner som renats från HEK-293 celler: vild typ, eller celler överuttryckande TTLL5 eller TTLL7 analyserades för specifik berikning av polyglutamylation med hjälp av GT335 antikroppar. Medan TTLL5 överuttryck ökar polyglutamylation på α- och β-tubulin, TTLL7 överuttryck berikar specifikt β-tubulin glutamylation. (B) Tubulin renas från hjärnvävnader av vild typ och ttll1-/- möss analyserades för mönster av glutamylation. Notera den starka minskningen av polyglutamylering av tubulin från ttll1-/- möss, som saknar den stora hjärnan glutamylas TTLL136. Tubgeler användes för att separera α- β-tubulin. En lika stor mängd tubulin belastning bekräftades av 12G10, en anti-α-tubulin antikroppar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som beskrivs här ger en plattform för att snabbt generera högkvalitativ, monterings kompetent tubulin i medelstora stora mängder från cellinjer och enmushjärnor. Det är baserat på guldstandardprotokollet för tubulinrening från nötkreatur hjärnor som används på fältet i många år16,17. En särskild fördel med tillvägagångssättet är användningen av suspensionskulturer av HeLa S3-celler, som när de väl har etablerats ger stora mängder celler samtidigt som de kräver lite praktisk tid. Detta gör protokollet relativt enkelt att utföra i alla cellbiologiska laboratorier, medan andra tubulinreningsmetoder18,19,32,37 kräver specifik utrustning och expertis och används därför mestadels av laboratorier med stark bakgrund inom proteinrening. Vid produktion av mindre mängder tubulin från vidhäftande cellinjer kan en mängd olika cellinjer användas. Vi har framgångsrikt renat tubulin från HeLa, U-2 OS och HEK-293 celler. Om en storskalig rening behövs kan skördade celler eller hjärnor snapfrysas i lysbuffert och lagras vid -80 °C, och flera cellpellets eller hjärnor kan slås samman för att rena större mängder tubulin.

Tubulin renad från cellinjer är praktiskt taget fri från tubulin PTMs. Denna Tyr-tubulin kan lätt omvandlas till detyrosinerad (deTyr-) tubulin i ett enda enkelt steg25. För att producera tubulin med andra PTMs kan specifika tubulinmodifierande enzymer överuttryckas i celler före tubulinrening. Att använda cellinjer av mänskligt ursprung som materialkälla bidrar dessutom till att undvika potentiella problem mellan arter när man studerar interaktioner mellan mikrotubuli och mänskliga MAP. Vidare kan tubulin från otransformerade (t.ex. HEK293) eller omvandlade (t.ex. HeLa) celler ge information om effekterna av mikrotubulestyrda läkemedel (t.ex. taxaner) på normala- vs. tumörcellsmikrotubuler.

Slutligen underlättar vårt protokoll rening av tubulin från enmushjärnor. Eftersom ett ökande antal musmodeller av tubulinmutationer och modifieringar genereras, tillåter detta protokoll direkt analys av egenskaperna och interaktionerna hos mikrotubuler med förändrad tubulin isotypkomposition38,39,40 eller tubulin PTMs31,41.

Tillvägagångssättet är baserat på polymerisations- och depolymeriseringscykler. Specifika tubulinisotyper eller tubulin med särskilda PTM:er som påverkar mikrotubulernas sammansättning och demonteringsegenskaper kan således leda till en oproportionerlig förlust eller minskning av sådana tubulinformer under reningsprocessen. Ändå har vi visat att stora tubulin PTMs, såsom acetylering, detyrosination, glutamylering och glykosylering, behålls på mikrotubuli under hela tubulinreningsprocessen24. Det bör dock noteras att för kvantitativa analyser av tubulinsammansättningen i celler eller vävnader är den TOG-kolumnbaserade tubulinreningsmetoden lämpligare eftersom den skulle möjliggöra en opartisk, polymerisationsoberoende tubulinrening18. Trots sin begränsning erbjuder vårt protokoll en stor fördel med att generera stora mängder högkvalitativt tubulin som kan användas i noggranna in vitro-rekonstitutionsexperiment. I synnerhet underlättar det användningen av PTM-rik hjärn tubulin i rutinmässiga experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 och Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ stöds av Institut Curie, Franska nationella forskningsbyrån (ANR) beviljar ANR-12-BSV2-0007 och ANR-17-CE13-0021, Institut National du Cancer (INCA) bidrag 2014-PL BIO-11-ICR-1 och Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) bidrag DEQ20170336756. MMM stöds av Fondation Vaincre Alzheimer grant FR-16055p, och av Frankrike Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. JAS stöddes av Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 675737 och FRM-bidraget FDT201904008210. SB stöddes av FRM-bidraget FDT201805005465.

Vi tackar alla medlemmar i Janke lab, särskilt J. Souphron, samt G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) och A. Gautreau (Ecole Polytechnique) för hjälp under upprättandet av protokollet. Vi vill tacka Institut Curies djuranläggning för hjälp med musuppfödning och skötsel.

Antikroppen 12G10, utvecklad av J. Frankel och M. Nelson, erhölls från Developmental Studies Hybridoma Bank utvecklad under beskydd av NICHD och underhållen av University of Iowa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C. Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. Correia, J. J., Wilson, L. , Academic Press. 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

Tags

Biokemi Utgåva 165 Mikrotubuler in vitro-rekonstitution tubulin tubulinrening polymerisation mikrotubuledynamik tubulinkod tubulinisotyper suspensionskultur tubulin posttranslational modifieringar
Rening av tubulin med kontrollerade posttranslational modifieringar och isotyper från begränsade källor genom polymerisation-depolymeriseringscykler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bodakuntla, S., Jijumon, A. S.,… More

Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter