Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Zuivering van tubuline met gecontroleerde posttranslationele modificaties en isotypes uit beperkte bronnen door polymerisatie-depolymerisatiecycli

Published: November 5, 2020 doi: 10.3791/61826
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft tubulinezuivering uit kleine/middelgrote bronnen zoals gekweekte cellen of enkele muizenhersenen, met behulp van polymerisatie- en depolymerisatiecycli. De gezuiverde tubuline is verrijkt in specifieke isotypes of heeft specifieke posttranslationele modificaties en kan worden gebruikt in in vitro reconstitutietesten om microtubulidynamiek en interacties te bestuderen.

Abstract

Een belangrijk aspect van studies van het microtubulicytoskelet is het onderzoek naar microtubuligedrag in in vitro reconstitutie-experimenten. Ze maken de analyse mogelijk van de intrinsieke eigenschappen van microtubuli, zoals dynamiek, en hun interacties met microtubuli-geassocieerde eiwitten (MAPs). De "tubulinecode" is een opkomend concept dat wijst op verschillende tubuline-isotypes en verschillende posttranslationele modificaties (PTM's) als regulatoren van microtubuli-eigenschappen en -functies. Om de moleculaire mechanismen van de tubulinecode te onderzoeken, is het cruciaal om in vitro reconstitutie-experimenten uit te voeren met gezuiverde tubuline met specifieke isotypes en PTM's.

Tot op heden was dit technisch uitdagend omdat hersentubulin, dat veel wordt gebruikt in in vitro experimenten, veel PTM's herbergt en een gedefinieerde isotypesamenstelling heeft. Daarom ontwikkelden we dit protocol om tubuline te zuiveren uit verschillende bronnen en met verschillende isotypesamenstellingen en gecontroleerde PTM's, met behulp van de klassieke benadering van polymerisatie- en depolymerisatiecycli. In vergelijking met bestaande methoden op basis van affiniteitszuivering levert deze aanpak zuivere, polymerisatie-competente tubuline op, omdat tubuline die bestand is tegen polymerisatie of depolymerisatie tijdens de opeenvolgende zuiveringsstappen wordt weggegooid.

We beschrijven de zuivering van tubuline uit cellijnen, gekweekt in suspensie of als aanhangculturen, en uit enkele muizenhersenen. De methode beschrijft eerst de generatie van celmassa in zowel suspensie- als aanhanginstellingen, de lysisstap, gevolgd door de opeenvolgende stadia van tubulinezuivering door polymerisatie-depolymerisatiecycli. Onze methode levert tubuline op dat kan worden gebruikt in experimenten die de impact van de tubulinecode op de intrinsieke eigenschappen van microtubuli en microtubuliinteracties met bijbehorende eiwitten aanpakken.

Introduction

Microtubuli spelen een cruciale rol in veel cellulaire processen. Ze geven cellen hun vorm, bouwen meiotische en mitotische spindels voor chromosoomsegregatie en dienen als sporen voor intracellulair transport. Om deze diverse functies uit te voeren, organiseren microtubuli zich op verschillende manieren. Een van de intrigerende vragen in het veld is om de moleculaire mechanismen te begrijpen die de structureel en evolutionair geconserveerde microtubuli in staat stellen zich aan te passen aan deze overvloed aan organisaties en functies. Een potentieel mechanisme is de diversificatie van microtubuli , die wordt gedefinieerd door het concept dat bekend staat als de "tubulinecode"1,2,3. De tubulinecode omvat twee hoofdcomponenten: differentiële integratie van α- en β tubuline-genproducten (tubuline-isotypes) in de microtubuli en tubuline-posttranslationele modificaties (PTM's).

Sinds de jaren 1970 hebben in vitro reconstitutie-experimenten, gecombineerd met evoluerende lichtmicroscopietechnieken, de weg vrijgemaakt voor belangrijke ontdekkingen over de eigenschappen van microtubuli: dynamische instabiliteit4 en loopbanden5, en hun andere mechanismen en functies6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Bijna alle tot nu toe uitgevoerde in vitro experimenten zijn gebaseerd op tubuline gezuiverd uit hersenweefsel met behulp van herhaalde cycli van polymerisatie en depolymerisatie16,17. Hoewel zuivering uit het hersenweefsel het voordeel oplevert van het verkrijgen van hoogwaardige tubuline in grote hoeveelheden (meestal gramhoeveelheden), is een belangrijk nadeel de heterogeniteit, omdat tubuline gezuiverd uit hersenweefsel een mengsel is van verschillende tubuline-isotypes en is verrijkt met veel tubuline-PTMs. Deze heterogeniteit maakt het onmogelijk om de rol van een bepaald tubuline PTM of isotype af te baken in de controle van microtubuli eigenschappen en functies. Het produceren van assemblage-competente tubuline met gecontroleerde tubuline PTMs en homogene isotype samenstelling is dus essentieel om de moleculaire mechanismen van de tubulinecode aan te pakken.

Onlangs is een benadering ontwikkeld om tubuline te zuiveren door affiniteitschromatografie met behulp van het microtubulibindende TOG-domein (tumor-overexpressed gen) van gist Stu2p18. Bij deze methode wordt tubuline in ruwe lysaten van cellen of weefsel door een kolom geleid waar het zich bindt aan het matrix-geïmmobiliseerde TOG-domein, waardoor de hele tubulinepool van een bepaald, zelfs zeer klein monster kan worden geanalyseerd. De afgelopen jaren is ook een langverwachte aanpak beschreven om recombinante tubuline te zuiveren. Het is gebaseerd op het baculovirussysteem, waarbij een bi-cistronic vector met α- en β tubulinegenen wordt uitgedrukt in insectencellen19. Deze methode is echter zeer omslachtig en tijdrovend en wordt daarom meestal gebruikt voor het bestuderen van de impact van tubulinemutaties20 en tubuline-isotypes21,22,23 in vitro.

In het huidige protocol beschrijven we een methode die de gevestigde en veel gebruikte polymerisatie-depolymerisatiebenadering gebruikt als blauwdruk om tubuline te genereren met verschillende niveaus van modificatie, hetzij van cellijnen of van muishersenweefsel24. Bij deze procedure wordt tubuline gefietst tussen de oplosbare (tubuline dimer bij 4 °C) en gepolymeriseerde vorm (microtubuli bij 30 °C in aanwezigheid van guanosine 5'-trifosfaat [GTP]). Elke vorm wordt gescheiden door opeenvolgende stappen van centrifugeren: tubuline dimers blijven in het supernatant na een koude (4 °C) spin, terwijl microtubuli worden geplet bij 30 °C. Bovendien wordt één polymerisatiestap uitgevoerd bij een hogepiperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonzuur) (PIPES) concentratie, die het mogelijk maakt om microtubuli-geassocieerde eiwitten uit de microtubuli en dus uit de uiteindelijk gezuiverde tubuline te verwijderen. Tubuline gezuiverd uit HeLa S3-cellen gekweekt als suspensie - of aanhangculturen is vrijwel vrij van tubuline PTM en is gebruikt in recente in vitro reconstitutie-experimenten25,26,27,28. We hebben de methode om tubuline te zuiveren van enkele muizenhersenen verder aangepast, die kan worden gebruikt voor een groot aantal muismodellen met veranderingen in tubuline-isotypes en PTM's.

In het protocol beschrijven we eerst de generatie van het bronmateriaal (celmassa of hersenweefsel), de lysis ervan(figuur 1A),gevolgd door de opeenvolgende stappen van tubulinepolymerisatie en depolymerisatie om de tubuline te zuiveren (Figuur 1B). We beschrijven verder het proces om de zuiverheid (figuur 2A, B) en de hoeveelheid ( figuur3A, B) van de gezuiverde tubuline te beoordelen. De methode kan worden aangepast om tubuline te produceren verrijkt met een geselecteerde PTM door een modificerend enzym in cellen te overexpresseren voorafgaand aan tubulinezuivering (figuur 4B). Als alternatief kunnen tubuline-modificerende enzymen tijdens het zuiveringsproces aan tubuline worden toegevoegd. Ten slotte kunnen we tubuline zonder specifieke isotypes of PTM's zuiveren uit de hersenen van muizen met een tekort aan de overeenkomstige tubuline-modificerende enzymen (figuur 4B)29.

De methode die we hier beschrijven heeft twee belangrijke voordelen: (i) het maakt de productie van voldoende grote hoeveelheden tubuline in relatief korte tijd mogelijk, en (ii) het genereert hoogwaardige, zuivere tubuline, met ofwel specifieke tubuline isotype samenstelling of PTMs. In de bijbehorende video van dit manuscript belichten we enkele van de kritieke stappen die bij deze procedure betrokken zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De verzorging en het gebruik van dieren voor dit onderzoek zijn uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Gemeenschap (2010/63/UE). Experimentele procedures werden specifiek goedgekeurd door de ethische commissie van het Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisatienr. 04395.03 gegeven door de Nationale Autoriteit) in overeenstemming met de internationale richtlijnen.

1. Bereiding van reagentia voor tubulinezuivering

OPMERKING: Alle buffers die worden gebruikt voor tubulinezuivering moeten kaliumzouten bevatten en GEEN natriumzouten30.

  1. Bereid 1 L volledig medium: Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM), met 10% foetale runderserum (FBS, 100 ml), 200 mM L-glutamine (10 ml 2 M bouillon) en 1x penicilline-streptomycine (10 ml 100x bouillon). Bewaren bij 4 °C.
  2. Bereid 10 M kaliumhydroxide (KOH) door 140 g KOH in water op te lossen, pas het uiteindelijke volume aan op 250 ml en bewaar bij kamertemperatuur.
  3. Bereid 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), pH 8, door 36,5 g EDTA in water op te lossen, stel de pH in op 8,0 met KOH (anders lost EDTA niet op) en het uiteindelijke volume tot 250 ml, steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur.
  4. Bereid 5 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)-EDTA voor door 5 ml 0,5 M EDTA toe te voegen aan 500 ml PBS, te filteren en op kamertemperatuur op te slaan.
  5. Bereid 0,5 M K-PIPES, pH 6,8, door 75,5 g PIPES in water op te lossen, stel in op pH 6,8 met KOH (anders lossen PIPES niet op) en het uiteindelijke volume tot 500 ml, steriliseer en bewaar bij 4 °C.
  6. Bereid 1 M K-PIPES, pH 6.8, door 15,1 g PIPES in water op te lossen, stel in op pH 6,8 met KOH en het uiteindelijke volume tot 50 ml, steriliseer en bewaar bij 4 °C.
  7. Bereid 0,5 M kalium-ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur (K-EGTA, pH 7,7) door 47,5 g EGTA op te lossen in water, stel in op pH 7,7 met KOH en het uiteindelijke volume tot 250 ml, steriliseer het filter en bewaar het bij kamertemperatuur.
  8. Bereid BRB80 (80 mM K-PIPES, pH 6,8; 1 mM K-EGTA; 1 mM magnesiumchloride [MgCl2]) oplossing door 3,2 ml 0,5 M PIPES, 40 μL van 0,5 M K-EGTA en 20 μL van 1 M MgCl2 te mengen en het uiteindelijke volume aan te passen tot 20 ml. Bewaren bij 4 °C.
  9. Bereid 0,1 M fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) voor door 435 mg PMSF in isopropanol op te lossen om een eindvolume van 25 ml te verkrijgen en op te slaan bij -20 °C.
  10. Bereid proteaseremmersmix (200x) voor door 10 mg aprotinine, 10 mg leupeptine en 10 mg 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonylfluoride in water op te lossen om een eindvolume van 2,5 ml te verkrijgen, aliquots van 100 μL te maken en op te slaan bij -20 °C.
  11. Bereid 10% Triton X-100 door 5 ml Triton X-100 te mengen in 45 ml water, te filteren en op kamertemperatuur op te slaan.
  12. Bereid Lysisbuffer voor (BRB80 aangevuld met 1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM PMSF, 1x proteaseremmersmix en, optioneel voor HEK-293 cellen, 0,2% Triton X-100) op de dag van tubulinezuivering door 20 ml BRB80 te mengen met 1,5 μL 2-mercaptoethanol, 200 μL van 0,1 M PMSF, 100 μL van de proteaseremmers , 400 μL van 10% Triton X-100.
    OPMERKING: 2-mercaptoethanol is giftig en moet in de zuurkast worden gebruikt.
  13. Bereid 0,2 M GTP voor door 1 g GTP op te lossen in 9,5 ml water, stel de pH in op 7,5 met KOH, maak aliquots van 20 μL en bewaar bij -20 °C. Vermijd herhaalde vries-dooi cycli.
  14. Bereid 1 M tris (hydroxymethyl) aminomethaan-hydrochloride (Tris-HCl) door 60,56 g Tris in water op te lossen, stel in op pH 6,8 met HCl, voltooi tot een eindvolume van 500 ml, fililiseer en bewaar bij kamertemperatuur.
  15. Bereid 5x Laemmli monsterbuffer (450 mM dithiothreitol (DTT); 10% natriumdodecylsulfaat (SDS); 400 μM Tris-HCl, pH 6,8; 50% glycerol; ~0,006% bromoffenolblauw) door 4 g SDS toe te voegen aan 16 ml voorverwarmde 1 M Tris-HCl. Voeg 2,6 g DTT en 20 ml 100% glycerol toe aan het mengsel en roer tot de oplossing homogeen wordt. Voeg de gewenste hoeveelheid bromoffenolblauw (2,5 mg) toe om de gewenste kleurintensiteit te bereiken. Maak 5 ml aliquots en bewaar bij -20 °C. Bereid de 2x werkende oplossing van laemmli monsterbuffer door de 5x voorraad in gedestilleerd water te verdunnen.

2. Versterking en oogst van tubulinebronnen

OPMERKING: In dit protocol werden drie bronnen van tubuline gebruikt: i) cellen (HeLa S3 en HEK-293) gekweekt als suspensieculturen; ii) cellen die als aanhangend culturen worden gekweekt (HEK-293, HeLa en U2 OS); en iii) hersenweefsel van muizen. Dit protocol beschouwt de dag van tubulinezuivering als 'dag 0' en daarom zijn andere stappen beschreven ten opzichte van dag 0.

  1. Versterking van cellen
    1. Cellen gekweekt als suspensieculturen
      OPMERKING: Gebruik ten minste 2 L suspensiecultuur om tubuline met succes uit suspensieculturen te zuiveren.
      1. Voor 2 L suspensiecultuur, herleef en kweek het gewenste celtype om 6 × 107 cellen te verkrijgen 10 dagen voor de dag van bereiding. Op dag -10, plaatcellen op zes schalen met een diameter van 15 cm met 107 cellen per bord.
      2. Verwarm op dag -8 de vereiste hoeveelheid volledig medium voor op 37 °C. Voeg 1 L voorverwarmd medium toe aan elke spinnerfles onder steriele omstandigheden. Plaats de spinners op een roertafel die is ingesteld op 20-25 tpm in de celkweek-incubator, open de laterale spinnerdoppen enigszins zodat het medium kan equilibreren naar de atmosfeer van de incubator.
        OPMERKING: Reinig het buitenoppervlak van de media en spinnerflessen grondig met 70% ethanol om verontreiniging te voorkomen.
      3. Op dag -7, trypsinize en verzamel de cellen gekweekt tot 80-90% samenvloeiing (ongeveer 1,8 × 108 cellen). Verzamel cellen uit 3 gerechten tegelijk, draai naar beneden (200 × g,5 min, kamertemperatuur) en hang alle cellen opnieuw op in 10 ml DMEM.
        OPMERKING: Een grondige dissociatie van de cellen op dit punt is erg belangrijk om de vorming van grotere aggregaten in de spinnerflessen te voorkomen, wat de celoverleving beïnvloedt en resulteert in een lage tubulineopbrengst.
      4. Voeg 5 ml van de celsuspensie toe aan elke spinnerfles met 1 L DMEM, breng de spinners terug naar de roertafel in de celkweek-incubator en laat cellen een week groeien.
    2. Cellen gekweekt als aanhangculturen
      OPMERKING: Gebruik minimaal 10 gerechten van 80-90% samenvloeiing om tubuline met succes te zuiveren uit aanhechtingscellen.
      1. Herleef en versterk het gewenste celtype om drie dagen voor de dag van het tubulinepreparaat 1 ×10 8 cellen te verkrijgen.
      2. Op dag -3, bord deze cellen op tien 15 cm gerechten op 1 ×10 7cellen per gerecht en laat ze groeien 80-90% samenvloeiing.
      3. Op dag -1, indien nodig, transfect cellen met een plasmide om een tubuline-modificerend enzym of een bepaald tubuline isotype uit te drukken.
  2. Het oogsten van de Cellen/Het Weefsel van hersenen
    1. Cellen gekweekt als suspensieculturen
      1. Breng de celsuspensie van spinners over in 1 L centrifugeflessen(tabel met materialen)en pelletcellen op 250 × g,15 min, kamertemperatuur. Voor het onmiddellijk starten van een andere cultuur van HeLa S3-cellen in de spinnerflessen, laat u 100 ml celsuspensie achter in de spinners en voegt u 1 L complete, voorverwarmde DMEM toe aan de spinnerfles.
        OPMERKING: Controleer zorgvuldig op bacteriële besmetting voordat u doorgaat met het zuiveren van tubulinen.
      2. Resuspend pelleted cellen van elke centrifugefles in 10 ml ijskoud PBS, en breng alle cellen over in 50 ml schroefdopbuizen. Houd de cellen tijdens de hersuspensie op ijs. Pellet de cellen bij 250 × g,15 min, 4 °C.
        OPMERKING: Volg de aanbevelingen voor het reinigen en bewaren van spinnerflessen (zie tabel met materialen).
      3. Gooi het supernatant weg en bepaal het volume van de celkorrel. Verwacht vanaf 2 L suspensiecultuur (twee spinnerflessen) een celkorrel van 5-6 ml.
        OPMERKING: In het hieronder beschreven protocol wordt aangenomen dat het volume van de celpellets 10 ml is. Pas het experiment aan op basis van de pelletvolumes.
      4. Voeg 1 volume (10 ml) lysisbuffer toe en hang de celkorrel opnieuw op.
        OPMERKING: De verhouding tussen het volume van de celkorrel en het buffervolume van de lysisbuffer is erg belangrijk voor een succesvolle tubulinezuivering. Het toevoegen van meer lysisbuffer verlaagt de tubulineconcentratie, die vervolgens niet de kritische concentratie bereikt die nodig is voor polymerisatie, waardoor de tubulineopbrengst sterk wordt verminderd.
        OPMERKING: Cellen die in de lysisbuffer worden geresuspendeerd, kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof en gedurende twee maanden bij -80 °C worden bewaard.
    2. Cellen gekweekt als aanhangculturen
      OPMERKING: Cellen uit aanhangende culturen moeten zeer snel worden geoogst voor een succesvolle tubulinezuivering (ongeveer 15 minuten voor het oogsten van tien gerechten van 15 cm). Drie mensen namen deel aan deze stap van het protocol.
      1. Verwijder het medium uit de schalen van 15 cm door de borden te kantelen en was de cellen vervolgens voorzichtig met 7 ml PBS-EDTA op kamertemperatuur (persoon 1). Werk alleen met drie gerechten van 15 cm tegelijk om te voorkomen dat de cellen zonder medium of buffer achterblijven.
      2. Voeg 5 ml PBS-EDTA toe aan de cellen en incubeer ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Gebruik een celheffer om de cellen voorzichtig los te maken door ze naar één rand van de schaal (persoon 2) te scheppen en verzamel alle cellen in een schroefdopbuis van 50 ml (persoon 3). Spoel elk bord af met nog eens 2 ml PBS-EDTA om de resterende cellen uit de gerechten te verzamelen. Houd tijdens deze stap de schroefdopbuis van 50 ml met de celsuspensie op ijs.
      4. Pellet de cellen bij 250 × g,10 min, 4 °C. Gooi het supernatant weg en bepaal het volume van de celkorrel. Verwacht een volume van ~1 ml van tien gerechten van 15 cm.
        OPMERKING: In het hieronder beschreven protocol wordt aangenomen dat het volume van de celpellets 10 ml is. Pas de experimenten aan op basis van de pelletvolumes.
      5. Resuspendeer de cellen in 1 volume (10 ml) lysisbuffer.
        OPMERKING: Cellen die in de lysisbuffer worden geresuspendeerd, kunnen maximaal twee maanden bij -80 °C worden bewaard.
    3. Hersenweefsel
      OPMERKING: Muizen van elke leeftijd, geslacht of genetische achtergrond kunnen worden gebruikt. De keuze van de transgene muisstam hangt af van de wetenschappelijke vraag die moet worden behandeld. In dit manuscript tonen we het voorbeeld van tubuline gezuiverd van de ttll1-/- muis, zonder een belangrijk hersenglutamylerend enzym, het tubuline tyrosine ligase-achtige 1 (TTLL1) eiwit31.
      1. Offer de muis op door cervicale dislocatie, onthoofd snel en verzamel de hersenen in een buis met ronde bodem. Als er overtollig bloed op de hersenen zit, was dan snel met lysisbuffer. Verzamel de hersenen zodra de muis wordt opgeofferd, omdat een postmortale vertraging het succes van tubulinezuivering kan beïnvloeden. Gebruik buizen met ronde bodem om tegemoet te komen aan de breedte van de sonde die wordt gebruikt voor homogenisatie.
        OPMERKING: Verzamelde muizenhersenen kunnen worden vastgeklikt in vloeibare stikstof en maximaal 3 jaar bij -80 °C worden bewaard.
      2. Voeg 500 μL lysisbuffer toe aan één brein dat is geëxtraheerd uit een volwassen muis. Voor de rest van het protocol wordt aangenomen dat het toegevoegde volume lysisbuffer 10 ml is. Pas je aan voor je experiment op basis van het aantal te gebruiken hersenen.

3. Lysis van cellen of hersenweefsel

  1. Cellen gekweekt als suspensieculturen
    1. Voor HEK-293 lyse de cellen op ijs door herhaaldelijk op en neer te pipetten met pipetpunten van verschillende breedtes. Bevestig eerst een p1000-tip aan een pipet van 10 ml en pipet de celsuspensie elke 5 minuten op en neer, gedurende 10 minuten (drie cycli pipetten). Bevestig ten tweede een p200-tip aan een p1000-tip en elke 5 minuten een verdere pipet, gedurende 20 minuten (vijf cycli pipetten).
    2. Voor HeLa S3 lyse de cellen met behulp van een Franse pers (zie Tabel met materialen voor instellingen).
    3. Neem 1/100e volume van de lysismix (L) (200 μL voor 20 ml L) en voeg hetzelfde volume 2x Laemmli-buffer toe, kook gedurende 5 minuten en bewaar bij -20 °C voor verdere analyse.
  2. Cellen gekweekt als aanhangculturen
    1. Breng de cellen over in een buis met ronde bodem van 14 ml waarvan de hoogte is verlaagd om de sonicatorsonde te huisvesten (zie tabel met materialen voor instellingen). Soniceer de cellen voor ~ 45 pulsen en bevestig cellyse door een druppel van de lysismix onder een microscoop te bemonsteren.
      OPMERKING: Het aantal pulsen kan variëren afhankelijk van het celtype dat wordt gebruikt voor tubulinezuivering. Te veel sonicerende cellen kunnen ervoor zorgen dat tubuline neerslaat en de zuiveringsopbrengst negatief beïnvloeden.
    2. Pipetteer de cellen elke 5 minuten op en neer op ijs gedurende 20 minuten (vijf cycli pipetten), met behulp van een p200-tip.
    3. Neem 1/100e volumelysismix (L) (200 μL voor 20 ml L) en voeg hetzelfde volume 2x Laemmli-buffer toe, kook gedurende 5 minuten en bewaar bij -20 °C voor verdere analyse.
  3. Hersenweefsel
    1. Lyse het hersenweefsel met behulp van een tissue blender (zie Tabel met materialen voor instellingen). U kunt het weefsel ook lyseren met behulp van een microtube stamper of een gelijkwaardige apparatuur en op en neer op ijs pipetten met een spuit van 1 ml met een naald van 18 G.
    2. Neem 1/100e volume lysismix (L) (200 μL voor 20 ml L) en voeg hetzelfde volume 2x Laemmli-buffer toe, kook gedurende 5 minuten en bewaar bij -20 °C voor verdere analyse.

4. Zuivering van Tubuline

  1. Lysate Verduidelijking
    1. Ontruim het lysaat (scheidende pellet en oplosbare fractie van het lysismengsel) door centrifugeren bij 150.000 × g,4 °C, 30 min. Zie tabel met materialen voor meer informatie over ultracentrifugerotors en -buizen. Voor celextracten wordt vaak een witte drijvende laag gevormd na centrifugeren. Breng deze drijvende laag niet samen met het supernatant over, omdat het de polymerisatie van tubulinen verstoort. Gebruik een spuit met het juiste volume bevestigd aan een lange naald van 20 G of 21 G om het supernatant voorzichtig te verwijderen zonder de zwevende laag te verstoren. Als het supernatant nog steeds troebel is, centrifugeer dan bij 5.000 × g, 4 °C gedurende 10 min.
    2. Breng het supernatant (SN1) over in een ultracentrifugebuis en noteer het volume. Verwacht voor een celkorrel van 10 ml een volume van ~ 12 ml voor SN1.
    3. Neem 1/100e volume SN1 (120 μL voor 12 ml SN1) en voeg hetzelfde volume 2x Laemmli-buffer toe, kook gedurende 5 minuten en bewaar bij -20 °C voor verdere analyse.
    4. Resuspend de pellet (P1) in BRB80 (Tabel van materialen) met hetzelfde volume als SN1. Neem 1/100e volume P1 (200 μL voor 20 ml P1) en voeg hetzelfde volume 2x Laemmli-buffer toe, kook gedurende 5 minuten en bewaar bij -20 °C voor verdere analyse.
  2. Eerste polymerisatie in buffer met lage molariteit
    1. Bereid de polymerisatiemix voor door 1 volume SN1 (12 ml), 1/200e volume van 0,2 M GTP (60 μL; eindconcentratie 1 ml) en 0,5 volume voorverwarmde glycerol (6 ml) te combineren in een schroefdopbuis van het juiste volume.
      OPMERKING: Glycerol wordt gebruikt als verdringingsmiddel in de polymerisatiestappen in het hele protocol en wordt dus niet meegenomen in de berekeningen van de concentraties van andere componenten.
    2. Pipetteer de mix op en neer, vermijd voorzichtig de vorming van luchtbellen en breng deze over naar de juiste ultracentrifugebuizen.
      OPMERKING: Terwijl u het mengsel naar de buizen brengt, past u het gewicht van de buizen (in paren) aan. Hierdoor kan de experimenteerder direct overgaan tot de sedimentatie van microtubuli na de polymerisatiestap. Doe dit voor alle polymerisatiestappen in het hele protocol.
    3. Bedek de buizen met parafilm, breng over in een waterbad op 30 °C en incubeer gedurende 20 minuten.
    4. Centrifugeer de buizen bij 150.000 × g, 30 °C gedurende 30 min. Verwijder het supernatant (SN2) en bewaar de pellet van gepolymeriseerde microtubuli (P2).
      OPMERKING: Microtubule pellet kan worden vastgeklikt en bewaard bij -80 °C voor maximaal 1 jaar.
    5. Neem 1/200e volume SN2 (90 μL voor 18 ml SN2) en voeg hetzelfde volume 2x Laemmli-buffer toe, kook gedurende 5 minuten en bewaar bij -20 °C voor verdere analyse.
  3. Eerste depolymerisatie
    1. Depolymeriseer microtubuli door ijskoude BRB80 toe te voegen aan de pellet P2 en laat 5 minuten op ijs staan: voeg voortubuline uit cellen 1/60 e (200 μL) toe en voor tubuline uit de hersenen 1/20e (600 μL) van het volume van de SN1.
      OPMERKING: Het volume ijskoude BRB80 dat tijdens de depolymerisatiestappen aan de pellet wordt toegevoegd, is altijd relatief ten opzichte van het volume van SN1.
    2. Resuspend de microtubule pellet voorzichtig, het vermijden van luchtbellen, totdat de oplossing volledig homogeen is. Gebruik een p1000-tip voor een paar cycli pipetten, gevolgd door een p200-tip om de 5 minuten, gedurende 20 minuten (vijf cycli pipetten). Dit is een cruciale stap voor het succes van de tubulinezuivering.
    3. Breng de oplossing over in de juiste ultracentrifugebuizen en draai gedurende 20 minuten bij 150.000 × g,4 °C. Breng de SN3 over naar een nieuwe ultracentrifugebuis van 1,5 ml. De pellet gevormd na deze centrifugeerstap (P3) bevat neergeslagen eiwitten (microtubuli-geassocieerde eiwitten of MAPs) en niet-gedepolymeriseerde microtubuli. Het supernatant (SN3) bevat oplosbare componenten: gedepolymeriseerde tubuline dimers en MAPs, die zijn losgeraakt van de gedepolymeriseerde microtubuli.
    4. Neem 1-4 μL SN3 en voeg 9 volumes 2x Laemmli buffer toe, kook gedurende 5 min en bewaar bij -20 °C voor verdere analyses.
    5. Resuspend de pellet P3 in BRB80 (in hetzelfde volume van SN3), neem 1-4 μL, en voeg 9 volumes van 2x Laemmli buffer, kook gedurende 5 min, en bewaar bij -20 °C.
  4. Tweede polymerisatie (in buffer met hoge molariteit)
    1. Bereid de polymerisatiemix voor door 1 volume SN3 (200 μL), 1 volume voorverwarmde 1 M PIPES (200 μL, eindconcentratie 0,5 M), 1/100e volume van 0,2 M GTP (2 μL, eindconcentratie 1 mM) en 1 volume voorverwarmde glycerol (200 μL) in een buis van het juiste volume te combineren.
    2. Pipetteer de mix op en neer, vermijd de vorming van luchtbellen en breng het over naar ultracentrifugebuizen.
    3. Bedek de buizen met parafilm, breng ze over in een waterbad op 30 °C en incubeer gedurende 20 minuten.
    4. Centrifugeer de buizen bij 150.000 × g, 30 °C gedurende 30 min. Verwijder het supernatant (SN4) en bewaar de pellet van gepolymeriseerde microtubuli (P4). De pellet P4 bevat de gepolymeriseerde microtubuli en het supernatant SN4 bevat ongepolymeriseerde tubuline, MAPs en andere oplosbare eiwitten.
      OPMERKING: De microtubulipel na de tweede polymerisatiestap kan worden vastgeklikt en maximaal 1 jaar bij -80 °C worden bewaard.
    5. Neem 1-4 μL en voeg 9 volumes 2x Laemmli buffer toe, kook gedurende 5 min en bewaar bij -20 °C voor verdere analyses.
  5. Tweede depolymerisatie
    1. Depolymeriseer microtubuli door ijskoude BRB80 toe te voegen aan de pellet P4 en laat 5 minuten op ijs staan: voeg voortubuline uit cellen 1/100 e (120 μL) toe en voor tubuline uit de hersenen 1/40e (300 μL) van het volume van de SN1.
    2. Pipet op en neer met een p200 tip om de 5 min, gedurende 20 min (vijf cycli pipetten).
    3. Breng de oplossing over in een ultracentrifugebuis van 1,5 ml en draai gedurende 20 minuten bij 150.000 × g, 4 °C. Breng de SN5 over naar een nieuwe ultracentrifugebuis van 1,5 ml. De pellet gevormd na deze centrifugeerstap (P5) bevat niet-gedepolymeriseerde microtubuli. Het supernatant (SN5) bevat de oplosbare tubuline.
    4. Neem 1-4 μL en voeg 9 volumes 2x Laemmli buffer toe, kook gedurende 5 min en bewaar bij -20 °C voor verdere analyses.
    5. Resuspend de pellet P5 in BRB80 (zelfde volume van SN5), neem 1-4 μL, en voeg 9 volumes van 2x Laemmli buffer toe, kook gedurende 5 min, en bewaar bij -20 °C voor verdere analyses.
  6. Derde polymerisatie (in buffer met lage molariteit)
    1. Bereid de polymerisatiemix voor: 1 volume SN5 (120 μL), 1/200e volume van 0,2 M GTP (0,6 μL, eindconcentratie is 1 mM) en 0,5 volume voorverwarmde glycerol (60 μL) in een buis met het juiste volume.
    2. Pipetteer de mix op en neer, vermijd voorzichtig de vorming van luchtbellen en breng deze over naar de juiste ultracentrifugebuizen.
    3. Bedek de buizen met parafilm, breng ze over in een waterbad op 30 °C en incubeer gedurende 20 minuten.
    4. Centrifugeer de buizen bij 150.000 × g, 30 °C gedurende 30 min. De pellet (P6) bevat gepolymeriseerde microtubuli en de supernatant SN6 bevat kleine hoeveelheden niet-gepolymeriseerde tubuline.
      OPMERKING: Microtubulikorrels kunnen worden vastgeklikt en tot 1 jaar bij -80 °C worden bewaard.
    5. Neem 1-4 μL en voeg 9 volumes 2x Laemmli buffer toe, kook gedurende 5 min en bewaar bij -20 °C voor verdere analyses.
  7. Derde depolymerisatie
    1. Depolymeriseer microtubuli door ijskoude BRB80 toe te voegen aan de pellet P6 en laat 5 minuten op ijs staan: voeg voortubuline uit cellen 1/100 e (120 μL) toe en voeg voor tubuline uit de hersenen 1/40e (300 μL) van het volume van de SN1 toe.
    2. Pipet op en neer met een p200 tip om de 5 min, gedurende 20 min (vijf cycli pipetten).
    3. Breng de oplossing over naar de juiste ultracentrifugebuizen en draai gedurende 20 minuten bij 150.000 × g, 4 °C. Breng de SN7 over naar een nieuwe ultracentrifugebuis van 1,5 ml. De pellet (P7) bevat kleine hoeveelheden niet-gedepolymeriseerde microtubuli. Het supernatant (SN7) bevat uitsluitend gedepolymeriseerde microtubuli (oplosbare tubuline).
    4. Neem 1-4 μL en voeg 9 volumes 2x Laemmli buffer toe, kook gedurende 5 min en bewaar bij -20 °C voor verdere analyses.
    5. Resuspend de pellet P7 in BRB80 (zelfde volume van SN7), neem 1-4 μL, en voeg 9 volumes van 2x Laemmli buffer toe, kook gedurende 5 min, en bewaar bij -20 °C voor verdere analyses.
    6. Kwantificeer de hoeveelheid tubuline (zie Representatieve resultaten) en aliquot SN7 in kleine hoeveelheden, snap-freeze, en bewaar bij -80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het belangrijkste doel van deze methode is om hoogwaardige, assemblage-competente tubuline te produceren in hoeveelheden die voldoende zijn om herhaalde in vitro experimenten met de gezuiverde componenten uit te voeren. Microtubuli die uit deze tubuline worden geassembleerd, kunnen worden gebruikt bij reconstitutietests op basis van de totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopietechniek met dynamische of stabiele microtubuli, in experimenten waarbij microtubulidynamiek, interacties met MAPs of moleculaire motoren en krachtgeneratie door de motoren worden getest25. Ze kunnen ook worden gebruikt in microtubule-MAP co-pelleting assays en solid-state NMR spectroscopie28.

De verrijking en zuiverheid van tubuline tijdens het zuiveringsproces kan worden gecontroleerd met behulp van een coomassie-bevlekte SDS-polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) gel, bij voorkeur de 'TUB' SDS-PAGE gels, die de scheiding van α- en β-tubulinen mogelijk maken, die als één band in klassieke gelsco-migreren 32. Lysaten die in verschillende stappen worden verzameld (met uitzondering van de allerlaatste depolymerisatie, zie protocol) worden in vergelijkbare hoeveelheden op de gel geladen om het succes van tubulinezuivering te beoordelen (Figuur 2A)24. Het uiteindelijke tubulinemonster, dat zeer kostbaar is, wordt alleen op de gel geladen voor de bepaling van de tubulineconcentratie. Het is normaal om wat tubuline te verliezen tijdens herhaalde cycli van polymerisatie en depolymerisatie. Een lager dan verwachte opbrengst van de uiteindelijke gezuiverde tubuline kan te wijten zijn aan ofwel (i) onvolledige depolymerisatie van microtubuli, gevisualiseerd door de aanwezigheid van een belangrijke hoeveelheid tubuline in de fracties P3, P5 en P7, of (ii) een inefficiënte tubulinepolymerisatie in microtubuli, in welk geval een lagere hoeveelheid tubuline aanwezig is in fracties P2, P4 en P6 en hoger in fractiesSN2, SN2en SN2. Als de tubuline verloren gaat tijdens polymerisatiestappen (lagere hoeveelheden P2 en P4) (i) zorg dan voor voldoende tubulineconcentratie tijdens polymerisatie (ii) gebruik een verse hoeveelheid GTP en/of (iii) bevestig de temperatuur van de polymerisatiereactie opnieuw. Als de tubuline verloren gaat tijdens depolymerisatiestappen (lagere hoeveelheden SN3 en SN5), verhoog dan de tijd en pipetteer de mix op ijs.

Voor de kwantificering van gezuiverd tubuline voert u de monsters samen met de bekende hoeveelheden runderserumalbumine (BSA, 0,5 μg – 1 μg – 2 μg – 4 μg) (figuur 3A) uit op SDS-PAGE. Gels zijn gekleurd met Coomassie briljant blauw, gescand en de intensiteiten van BSA- en tubulinebanden worden gemeten door kwantitatieve densitometrie (figuur 3B) zoals beschreven bij https://openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ. Houd er rekening mee dat dezelfde analyse kan worden uitgevoerd in Fiji, een verbeterde versie van ImageJ33. Waarden uit de BSA-banden werden gebruikt om de lineaire regressievergelijking te bepalen, die werd gebruikt om de hoeveelheid eiwit in de tubulinebanden te berekenen. Alleen tubulinebandintensiteiten binnen het bereik van de BSA-curve worden gebruikt om de tubulineconcentratie te bepalen. Op basis van de berekende tubulineconcentratie worden aliquots van de gewenste hoeveelheden tubuline bereid, in vloeibare stikstof ingevroren en opgeslagen bij -80 °C. We verkrijgen meestal ongeveer ~ 2 mg tubuline uit vier spinnerflessen HeLa S3-suspensieculturen (~ 15 g cellen), ~ 250 μg tubuline uit tien gerechten met een diameter van 15 cm (~ 1,2 g cellen) en ~ 1 mg tubuline uit 1 g muishersenweefsel.

Om de verrijking van een bepaald tubuline-isotype of -modificatie te bevestigen, kan ~0,1 μg van de gezuiverde tubuline worden geïmmunteerd met behulp van de respectieve antilichamen34,35. De controle tubuline zal variëren afhankelijk van de tubuline van belang. Voor tubuline gemodificeerd in vitro met een modificerend enzym, gebruik niet-behandelde tubuline als controle. Voor tubuline die in de cellulose wordt gewijzigd door de overexpressie van een modificerend enzym, gebruikt u tubuline dat is gezuiverd uit cellen die het enzym niet als controle uitdrukken (figuur 4A). Controle tubuline voor tubuline gezuiverd van knock-out-muis hersenen zal tubuline van wilde type muizen (Figuur 4B). In alle immunoblotanalyses wordt een gelijke belasting van tubuline geverifieerd met behulp van een PTM-onafhankelijk anti-α-tubulineantilichaam (12G10).

Figure 1
Figuur 1: Tubulinezuivering uit verschillende bronnen met behulp van polymerisatie-depolymerisatiecycli. (A) Verschillende bronnen van tubuline worden met behulp van specifieke strategieën gelysed. HeLa S3 cellen gekweekt in suspensie worden gelysed met behulp van een Franse pers; HEK-293 cellen worden gelyseerd door repetitieve pipetten. Aanhangende cellen werden gelyseerd met behulp van korte pulsen van sonicatie en muishersenweefsel met behulp van een weefselhomogenisator. (B) Schematische weergave van de opeenvolgende stappen van het tubulinezuiveringsprotocol met behulp van cycli van koude-depolymerisatie en warmpolymerisatie. Na lysis en lysaatverheldering worden microtubuli gepolymeriseerd en geplet. Microtubuli worden vervolgens gedepolymeriseerd en vervolgens gepolymeriseerd in een buffer met hoge molariteit, waardoor microtubuli-geassocieerde eiwit (MAP) co-sedimentatie met de microtubuli wordt voorkomen. MAP-vrije microtubuli worden vervolgens gedepolymeriseerd en kunnen verder worden onderworpen aan een derde cyclus van polymerisatie-depolymerisatie om sporen van de buffer met hoge molariteit te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Evaluatie van het succes van de tubulinezuivering. Monsters verzameld bij verschillende stappen van het tubuline zuiveringsprotocol werden uitgevoerd op een 'TUB' natrium dodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gel (zie protocol voor details) en gekleurd met Coomassie briljant blauw. (A) Bij een succesvolle tubulinezuivering worden α- en β-tubulinen gedurende het hele proces geleidelijk verrijkt. Na de tweede polymerisatie is de microtubulipellet (P4) vrijwel vrij van verontreiniging door andere eiwitten of microtubuli-geassocieerde eiwitten (MCP's). Merk op dat het normaal is om wat tubuline te verliezen tijdens de procedure. (B) Bij een mislukte tubulinereiniging is de uiteindelijke tubulineopbrengst laag en blijft tubuline na depolymerisatie in de pellet of in het supernatant na polymerisatie (rode dozen). In het hier getoonde voorbeeld polymeriseert tubuline niet efficiënt in beide polymerisatiestappen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Kwantificering van de gezuiverde tubuline met behulp van Coomassie-bevlekte natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gels en densitometrie. (A) Coomassie-bevlekte SDS-PAGE gel met bekende hoeveelheden runderserumalbumine (BSA; 0,5, 1, 2 en 4 μg, grijze gradiëntlijn) en verschillende volumes (respectievelijk 0,5 en 1 μL, lichte en donkere kleuren) van gezuiverd tubuline. In het getoonde voorbeeld werden tyrosinated tubulin (HeLa S3 tubulin, light and dark orange) en detyrosinated tubulin (HeLa S3 tubulin behandeld met carboxypeptidase A, licht en donkerblauw) op de gel geladen. (B) BSA-banden van (A) werden gekwantificeerd met behulp van ImageJ (in willekeurige eenheden, AU) en uitgezet op de hoeveelheid geladen eiwit (grijze tot zwarte punten). Deze punten werden gebruikt om de lineaire regressielijn (de grijze gradiëntlijn) en vergelijking te berekenen, die werden gebruikt om de hoeveelheden eiwit in de tubulinemonsters (lichte en donkeroranje en blauwe punten) op de gel te berekenen. Dit vergemakkelijkte de berekening van de concentratie van de tubulinemonsters. Merk op dat de punten die buiten de BSA-standaardcurve liggen, niet mogen worden gebruikt om de concentratie te bepalen (donkeroranje en blauwe punten). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Immunoblot analyse van gezuiverd tubuline met verschillende PTM's. (A) Tubulinen gezuiverd uit HEK-293 cellen: wild type, of cellen die te veel TTLL5 of TTLL7 uitdrukten, werden geanalyseerd op de specifieke verrijking van polyglutamylatie met behulp van het GT335-antilichaam. Terwijl TTLL5-overexpressie de polyglutamylatie op α- en β-tubuline verhoogt, verrijkt TTLL7-overexpressie specifiek β-tubulineglutamylatie. (B) Tubuline gezuiverd uit hersenweefsels van wild type en ttll1-/- muizen werden geanalyseerd op patronen van glutamylatie. Let op de sterke vermindering van polyglutamylatie van tubuline van ttll1-/- muizen, die de belangrijkste hersenen glutamylase TTLL136missen . 'TUB'-gels werden gebruikt om α- en β-tubuline te scheiden. Een gelijke hoeveelheid tubulinebelasting werd bevestigd door 12G10, een anti-α-tubuline-antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven methode biedt een platform om snel hoogwaardige, assemblage-competente tubuline in middelgrote hoeveelheden te genereren uit cellijnen en enkele muizenhersenen. Het is gebaseerd op het gouden-standaardprotocol van tubulinezuivering van runderhersenen die vele jaren in het veld worden gebruikt16,17. Een bijzonder voordeel van de aanpak is het gebruik van suspensieculturen van HeLa S3-cellen, die, eenmaal vastgesteld, grote hoeveelheden cellen opleveren terwijl ze weinig hands-on tijd vereisen. Dit maakt het protocol relatief eenvoudig uit te voeren in elk celbiologielab, terwijl andere tubulinezuiveringsmethoden18,19,32,37 specifieke apparatuur en expertise vereisen en dus meestal worden gebruikt door laboratoria met een sterke achtergrond in eiwitzuivering. Bij het produceren van kleinere hoeveelheden tubuline uit aanhangende cellijnen kan een verscheidenheid aan cellijnen worden gebruikt. We hebben met succes tubuline gezuiverd van HeLa, U-2 OS en HEK-293 cellen. Als een grootschalige zuivering nodig is, kunnen geoogste cellen of hersenen worden vastgepakt in de lysisbuffer en worden opgeslagen bij -80 °C, en kunnen meerdere celkorrels of hersenen worden samengevoegd om grotere hoeveelheden tubuline te zuiveren.

Tubuline gezuiverd van cellijnen is vrijwel vrij van tubuline PTMs. Deze Tyr-tubulin kan gemakkelijk worden omgezet in ontdooide (deTyr-) tubuline in één eenvoudige stap25. Om tubuline met andere PTM's te produceren, kunnen specifieke tubuline-modificerende enzymen worden overexpressie in cellen voorafgaand aan tubulinezuivering. Bovendien helpt het gebruik van cellijnen van menselijke oorsprong als bron van materiaal om potentiële problemen tussen verschillende soorten te voorkomen bij het bestuderen van interacties tussen microtubuli en menselijke MCP's. Verder kan tubuline uit niet-vertaalde (zoals HEK293) of getransformeerde (zoals HeLa) cellen informatie geven over de effecten van microtubuli-gerichte geneesmiddelen (bijv. taxanen) op normale- versus tumorcelmicrotubuli.

Ten slotte vergemakkelijkt ons protocol de zuivering van tubuline uit enkele muizenhersenen. Aangezien een toenemend aantal muismodellen van tubulinemutaties en modificaties wordt gegenereerd, maakt dit protocol een directe analyse mogelijk van de eigenschappen en interacties van microtubuli met gewijzigde tubuline-isotypesamenstelling38,39,40 of tubuline-PTM 's31,41.

De aanpak is gebaseerd op cycli van polymerisatie en depolymerisatie. Specifieke tubuline-isotypes of tubuline met bepaalde PTM's die van invloed zijn op de montage- en demontage-eigenschappen van microtubuli kunnen dus leiden tot een onevenredig verlies of vermindering van dergelijke tubulinevormen tijdens het zuiveringsproces. Niettemin hebben we aangetoond dat belangrijke tubuline-PTM's, zoals acetylatie, detyrosinatie, glutamylatie en glycylatatie, gedurende het hele tubulinezuiveringsproces op de microtubuli worden vastgehouden24. Er zij echter op gewezen dat voor kwantitatieve analyses van de tubulinesamenstelling in cellen of weefsels de tog-kolomgebaseerde tubulinezuiveringsbenadering geschikter is omdat deze een onpartijdige, polymerisatieonafhankelijke tubulinezuivering mogelijk zou maken18. Ondanks de beperking biedt ons protocol een groot voordeel bij het genereren van grote hoeveelheden hoogwaardige tubuline die kunnen worden gebruikt in nauwgezette in vitro reconstitutie-experimenten. In het bijzonder vergemakkelijkt het het gebruik van PTM-rijke hersentubuline in routine-experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de ANR-10-IDEX-0001-02, de LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 en het Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ wordt ondersteund door het Institut Curie, het Franse National Research Agency (ANR) kent ANR-12-BSV2-0007 en ANR-17-CE13-0021 toe, het Institut National du Cancer (INCA) subsidie 2014-PL BIO-11-ICR-1, en de Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) subsidie DEQ20170336. MMM wordt ondersteund door de Fondation Vaincre Alzheimer grant FR-16055p, en door de France Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. JAS werd ondersteund door het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. SB werd ondersteund door de FRM-subsidie FDT201805005465.

We danken alle leden van het Janke lab, in het bijzonder J. Souphron, evenals G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) en A. Gautreau (Ecole Polytechnique) voor hulp bij het opstellen van het protocol. We willen de dierenfaciliteit van het Institut Curie bedanken voor hulp bij het fokken en verzorgen van muizen.

Het antilichaam 12G10, ontwikkeld door J. Frankel en M. Nelson, werd verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C. Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. Correia, J. J., Wilson, L. , Academic Press. 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

Tags

Biochemie Nummer 165 Microtubuli in vitro reconstitutie tubuline tubulinezuivering polymerisatie microtubulidynamiek tubulinecode tubuline-isotypes suspensiecultuur tubuline posttranslationele modificaties
Zuivering van tubuline met gecontroleerde posttranslationele modificaties en isotypes uit beperkte bronnen door polymerisatie-depolymerisatiecycli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bodakuntla, S., Jijumon, A. S.,… More

Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter