Summary
בדו"ח זה אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקר ליצור מודל עכבר של אובאיטיס תוך עינית. מודל מבוסס זה, המכונה בדרך כלל אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית (EAU), לוכד היבטים רבים של מחלות אנושיות. במאמר זה נתאר כיצד לגרום ולנטר את התקדמות המחלה באמצעות מספר קריאות.
Abstract
אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית (EAU) מונעת על ידי תאי מערכת החיסון המגיבים לאנטיגנים עצמיים. תכונות רבות של מודל מחלות דלקתיות תוך עיניות לא זיהומיות אלה משחזרות את הפנוטיפ הקליני של אובאיטיס אחורית המשפיעה על בני אדם. EAU שימש באופן אמין כדי לחקור את היעילות של טיפולים דלקתיים חדשניים, את אופן הפעולה שלהם ולחקור עוד יותר את המנגנונים העומדים בבסיס התקדמות המחלה של הפרעות תוך עיניות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט על השראת EAU בעכבר C57BL/6J - אורגניזם המודל הנפוץ ביותר עם רגישות למחלה זו. הערכה קלינית של חומרת המחלה והתקדמותה תודגם באמצעות פונדוסקופיה, בדיקה היסטולוגית ואנגיוגרפיה פלואורסצאין. הליך האינדוקציה כולל הזרקה תת עורית של תחליב המכיל פפטיד (IRBP1-20) מחלבון העין אינטרפוטורצפטור רטינואיד (הידוע גם בשם חלבון קושר רטינול 3), אדג'ובנט שלם של פרוינד (CFA) ותוספת של Mycobacterium tuberculosis. הזרקה של תחליב צמיג זה על העורף ואחריה הזרקה intraperitoneal יחיד של Bordetella pertussis toxin . עם תחילת הסימפטומים (יום 12-14) ובהרדמה כללית, נלקחות תמונות פונדוסקופיות כדי להעריך את התקדמות המחלה באמצעות בדיקה קלינית. ניתן להשוות נתונים אלה ישירות לאלה בנקודות זמן מאוחרות יותר ובשיא המחלה (יום 20-22) עם ניתוח הבדלים. יחד עם זאת, פרוטוקול זה מאפשר לחוקר להעריך הבדלים פוטנציאליים בחדירות כלי הדם ובנזק באמצעות אנגיוגרפיה פלואורסצאין. EAU יכול להיות מושרה בזני עכברים אחרים - הן פראיים או מהונדסים גנטית - ובשילוב עם טיפולים חדשניים המציעים גמישות לחקר יעילות התרופה ו / או מנגנוני המחלה.
Introduction
פרוטוקול זה ידגים כיצד לגרום לאובאיטיס אוטואימונית ניסיונית (EAU) בעכבר C57BL/6J על ידי הזרקה תת-עורית יחידה של אנטיגן רשתית באדג'ובנט מתחלב. שיטות לניטור והערכה של התקדמות המחלה יפורטו באמצעות הדמיה פונדוסקופית ובדיקה היסטולוגית, עם פרמטרים למדידה המתוארים בהן. בנוסף, תידון אנגיוגרפיה פלואורסצאין, טכניקה לבחינת מבנה כלי הדם ברשתית וחדירות.
מודל EAU זה משחזר תכונות מרכזיות של אובאיטיס אחורית לא זיהומית בבני אדם ביחס למאפיינים קליניים-אופתולוגיים והמנגנונים התאיים והמולקולריים הבסיסיים המניעים מחלות. EAU מתווך על ידי תת-קבוצות Th1 ו / או Th17 של לימפוציטים CD4+T תגובתיים עצמיים, כפי שמוצג בניסויי העברה מאומצת ובעכברים מרוקנים IFNγ1. חלק גדול מההבנה שלנו של התפקידים הפוטנציאליים של תאים אלה באובאיטיס מגיע ממחקר EAU2, שבו תאי Th1 ו-Th17 מזוהים בתוך רקמות הרשתית3. לעתים קרובות, EAU משמש כמודל פרה-קליני להערכת התועלת של טיפולים חדשניים בהחלשת המחלה. גישות טיפוליות אשר הצליחו לווסת את מחלת EAU הראו יעילות מסוימת במרפאה והגיעו למעמד מאושר FDA. דוגמאות לכך הן קבוצות של תרופות אימונו-רגולטוריות כגון טיפולים ממוקדי תאי T: ציקלוספורין, FK-506 ורפמיצין 4,5,6. לאחרונה, התערבויות המכוונות למסלולים חדשים נחקרו גם במודל זה כדי לחקור הן את המנגנון והן את ההשפעה על תוצאות המחלה. אלה כוללים מיקוד ויסות שעתוק באמצעות קורא הכרומטין Bromodomain Extra-Terminal חלבונים (BET) ומעכבי P-TEFb3. יתר על כן, גישות קונבנציונליות יותר כגון מעכב VLA-4 הוכיחו לאחרונה דיכוי ב- EAU באמצעות אפנוןשל תאי T CD4+ 7. בנוסף, מיקוד תאי Th17 עם TMP778, אגוניסט הופכי RORγt, נמצא גם כמדכא באופן משמעותי את EAU8. יתר על כן, מודל זה מציע הזדמנות לחקור דלקת אוטואימונית כרונית ברשתית ואת המנגנונים הבסיסיים הנלווים כגון פריימינג לימפוציטים.
הקריאות העיקריות למחקרים פרה-קליניים של EAU הן הערכה קלינית על ידי ביצוע הדמיה פונדוסקופית רשתית ובתדירות נמוכה יותר, על ידי הערכת שלמות הרשתית על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT). הערכה היסטופתולוגית של הרשתית ואימונופנוטיפ של תאי הרשתית על ידי ציטומטריית זרימה מתבצעות לאחר מכן בסיום. פונדוסקופיה היא מערכת הדמיה חיה קלה לשימוש המאפשרת הערכה קלינית מהירה וניתנת לשחזור של הרשתית כולה. להערכות אימונוהיסטוכימיות, הטכניקות מבוססות על הכנת קטעי רשתית המאפשרים לנו ללמוד ארכיטקטורת רקמות למידת הדלקת והנזק המבני9. קריטריוני ההערכה ומערכות הניקוד הקונבנציונליות, עבור כל הטכניקות בהן נעשה שימוש, יפורטו במסגרת פרוטוקול זה. היקף הנזק שנרשם באמצעות הדמיה פונדוסקופית נמצא לעתים קרובות בקורלציה הדוקה עם שינויים היסטולוגיים. גישה כפולה זו לניטור והערכת חומרת המחלה מעניקה רגישות רבה יותר ותוצאות מדידה אמינות יותר.
EAU הוא מודל מבוסס היטב ונפוץ לבדיקה פרה-קלינית וחקירה של מחלות עיניים בתיווך מערכת החיסון. מודל זה אמין וניתן לשחזור עם שכיחות מחלה של >95% ומייצר נתונים מקיפים שניתן להשתמש בהם כדי לאמת או לדחות טיפולים חדשים לטיפול במחלה דלקתית תוך עינית המייצגת גורם עיקרי לעיוורון בגיל העבודה ברחבי העולם10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם לחוק הבריטי לבעלי חיים (הליכים מדעיים) משנת 1986, ולהנחיות מוסדיות של הגוף לרווחת בעלי חיים וביקורת אתית (AWERB).
1. דיור עכברי C57BL/6J
- עכברי בית בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים, במחזור אור-חושך של 12 שעות ומזון ומים זמינים עד לליביטום.
- בצע את כל הניסויים על נשים בוגרות C57BL/6J (נקבות נבחרות באופן מועדף מכיוון שיש שכיחות של נשים לגברים 1.4 עד 1 בחולי אובאיטיס). חולקו באופן אקראי נקבות עכברי C57BL/6J בגילאי 6-8 שבועות לפי משקל וגיל. אכנו את העכברים בכלובים מאווררים בנפרד (IVC) בקבוצות של 5-6 עכברים בכל כלוב.
2. חיסון עכברי C57BL/6
- IRBP1-20 - הכנת תחליב CFA
הערה: הכנת תחליב חיונית לשחזור ושכיחות המחלה; ככזה, יש לעשות כל מאמץ לשמור על עקביות לאורך כל תהליך ההכנה ובין הניסויים. בעת הכנת תחליב, הפסד צריך להיות אחראי בחישובים של כל ריאגנטים מראש. אובדן זה יכול להיות בערך פי 1.5 (או 50% יותר מהנפח המוכן), בהתבסס על מספר העכברים המתוכננים לחיסון. אנא ראה את הדוגמה הבאה להלן. כדי לחסן 10 עכברים, להכין 15 עכברים ולהשתמש 400 מיקרוגרם (פפטיד לכל 20 גרם עכבר) x 15 עכברים = 6 מ"ג. כל עכבר צריך לקבל 200 μL לחיסון (3 מ"ל בסך הכל). הנפח הסופי כולל יחס של 1:1 של תמיסת פפטיד ו-CFA, ומכאן 1.5 מ"ל של תמיסת פפטיד ו-1.5 מ"ל של CFA.- הכינו את כל התמיסות הסטריליות בארון זרימה למינרי בטכניקות אספטיות.
- שקול את הכמות הרצויה (400 מיקרוגרם לכל 20 גרם עכבר) של פפטיד ליופילי IRBP1-20 אנושי (LAQGAYRTAVDLESLASQLT). להמיס פפטיד ב-100% DMSO. אחסן מלאי בצורה lyophilized ב -20 °C.
הערה: כדי להבטיח שהאבקה מומסת במלואה, כל פתית חייב ליצור מגע עם DMSO תחילה ולא להראות שום סימן של מוצק שיורית. הוסף PBS במנות קטנות כדי להגיע לנפח הסופי. אין לערבב עם מערבולת, במקום זאת להשתמש תסיסה עדינה עם פיפטה. הריכוז הסופי של DMSO לא יעלה על 1% מנפח הכנת הפפטיד הכולל. הכנת האמולסיה בצינור פלסטיק של 20 מ"ל עם תחתית מחודדת אמורה לאפשר נגישות טובה יותר של DMSO לאבקה הליופילית. - הוסף תמיסת פפטיד DMSO-PBS ביחס של 1:1 v/v ל- CFA שכבר בתוספת 1.5 מ"ג / מ"ל הרג Mycobacterium tuberculosis, כדי לתת ריכוז סופי של 2.5 מ"ג / מ"ל. הוסיפו טיפתית, פיפטו בעדינות ובתדירות גבוהה ליצירת תחליב צמיג ומפוזר באופן שווה.
- אווררו את תמיסת הפפטיד ואת CFA באמצעות פיפטה של 1000 μL (מוגדרת ל-700 μL כדי למנוע אובדן נוסף) ופיפטה כדי ליצור מרקם סמיך וקרמי. טכניקה זו כוללת שימוש בפיפטה כדי לשאוף שוב ושוב למעלה ולמטה עד הגעה לעובי הרצוי. לקבלת תוצאות מיטביות, יש לוודא כי תמיסת האנטיגן והאדג'ובנט מעורבבים היטב לפני ההזרקה.
- הזרקה תוך צפקית של רעלן שעלת
- יש להשהות 1.5 מיקרוגרם רעלן Bordetella pertussis ב-100 μL של חומר RPMI 1640 בתוספת 1% סרום עכבר11.
- בצע את הזרקת i.p. עם מזרק סטרילי ומחט 23G.
הערה: על מנת למנוע הפרעות לאתר ההזרקה, יש לתת את רעלן השעלת לפני הזרקת האנטיגן. - העבירו באופן זמני כל עכבר לכלוב נפרד כדי לקבל זריקה אחת של 100 μL i.p. של רעלן Bordetella pertussis .
- הזרקה תת עורית של תחליב IRBP
- לאחר מכן, להזריק את תחליב IRBP תת עורית. תהליך זה דורש שני מטפלים בבעלי חיים הלבושים כראוי עם הגנה בהתאם לתקנות הבריאות והבטיחות.
- בקש מאדם מיומן אחד לרסן קלות את העכבר על גבי הכלוב בתנוחה דמוית קשקוש, כאשר בטנו פונה כלפי מטה בעוד האדם המיומן השני צובט את העור כדי ליצור מבנה דמוי אוהל על העורף שבו ניתן להחדיר את המחט לחריץ בין האצבע לאגודל.
זהירות: קיימת סכנה של פגיעה במקל מחט. - לאחר מיקום המחט, הזריקו 200 μL של תחליב IRBP. בעת הסרת המחט, סובב את ראש המחט כדי לסגור את העור לפני שליפתו החוצה והפעל לחץ לאחר מכן על אתר ההזרקה כדי למנוע ריפלוקס של התחליב.
אזהרה: אסור שהתחליב יבוא במגע עם עור העכבר או פרוותו מכיוון שהדבר עלול לגרום לגירוי ובמקרים חמורים יותר, לנגע להתפתח. במקרה כזה, יש לנגב את האזור באופן מיידי ויסודי באמצעות 70% אתנול ולאחר מכן לייבש אותו.
הערה: אם בלוטות הלימפה המתנקזות נדרשות לבדיקה בסוף המחקר, אתר ההזרקה יהיה שונה. במקרה זה, יש להזריק 100 μL לשני צידי האגף באופן תת עורי. זה ייצור תגובה חזקה יותר בבלוטות הלימפה המפשעות המתנקזות, אשר ניתן לכרות בזמן הקציר. עם זאת, אם התוצאה המיועדת היא אך ורק לפתח EAU, זריקה אחת של 200 μL בחלק האחורי של הצוואר עדיפה כדי למנוע אי נוחות מאתרי הזרקה מרובים.
3. הערכה קלינית - בדיקת פונדוס עכבר
הערה: יש לדרג מחלה קלינית באמצעות בדיקת פונדוס, באמצעות הדמיה חיה בשדה בהיר באמצעות פונדוסקופ ותוכנת Discover המשמשת להדמיה.
- עם תחילת המחלה (יום 12-14), מרדימים עכברים בהרדמה כללית באמצעות שילוב של קטמין (50 מ"ג / מ"ל) ודומיטור (מדטומידין; 1 מ"ג / מ"ל). לדלל 1-חלק שולט; 1.5 חלקים קטמין ו 2.5 חלקים מים סטריליים בהזרקה, ולאחר מכן להזריק 100 μL לכל 30 גרם intraperitoneally. השתמש מזרקים סטריליים 1 מ"ל ומחטים 23G עבור שילוב לעיל של הרדמה.
- לאחר מכן, לפקח על העכבר כדי לוודא כי כל הרפלקסים אבדו וכי הוא אינו מגיב לגירויים.
- מיד לאחר קבלת זריקת I.P. ובזמן שהעכבר עדיין מוחזק בקשקוש, יש למרוח 1% טרופיקמיד ו-2.5% פנילפרין באופן מקומי על כל עין להרחבת האישונים. המטרה היא לכסות לחלוטין את הקרנית בשתי התמיסות המרחיבות. ייתכן שיחלפו מספר דקות עד שהאישון יורחב במלואו.
- לאחר מכן, יש למרוח בנדיבות על משחת הויסקוטרות של העין ולשמור לאורך כל תהליך ההדמיה על מנת לשמור על העין משומנת במלואה ורוויית לחות.
- בינתיים, פתח את התוכנה (למשל, Discover), והגדר את הפונדוסקופ (למשל, מיקרון) כדי לצלם תמונות תחת brightfield. הקצו לכל עכבר תיקייה ותייגו תמונות עם R או L בהתאם לכל עין מצולמת.
- הרכיבו את העכבר על במה ייעודית להדמיה חיה ומקמו את המיקרוסקופ לגישה מלאה לרשתית.
- כדי לקבל ייצוג מדויק של המחלה, צלם תמונות של כל אזור הרשתית, המכסה את כל פינות הפריפריה בנוסף לדיסק האופטי. כדי להשיג זאת, התאימו את העינית לכל אורכה. זה חיוני עבור העין להישאר משומן לחלוטין בכל עת לאורך תהליך ההדמיה; ודא זאת על ידי מילוי משחת העין בקצב קבוע.
- עיין בסעיף 4 (להלן) בשלב זה לביצוע אנגיוגרפיה פלואורסצאין.
- לאחר השלמת כל ההדמיות, יש לדלל את חומר ההרדמה נגד טשטוש (5 מ"ג/מ"ל אנטיסדאן) במים הניתנים להזרקה ולתת במינון 0.1 מ"ג/ק"ג i.p. החזירו את העכבר לכלוב והניחו אותו על מחצלת שחוממה מראש עם גישה לתזונה רטובה עד להחלמה. החלמה מלאה מאופיינת בתנועת כל הגוף ובהליכה סביב הכלוב בהליכה יציבה, הנמשכת בדרך כלל מספר שעות.
- בנקודת הסיום הניסויית המיועדת (למשל, יום 21-23), חזור על שלבים 4.1-4.5 וצלם שוב את כל אזור הרשתית, תוך כיסוי הדיסק האופטי וכל פינות הפריפריה כדי ללכוד ייצוג מדויק של המחלה.
4. אנגיוגרפיה פלואורסצאין
- כדי למדוד את דליפת כלי הדם בבעלי חיים אלה, בזמן הרדמה, יש לתת לכל עכבר זריקה של 2% פלואורסצאין תת עורית בחלק האחורי של הצוואר ולמקם כך שהרשתית תהיה מרוכזת במרכז התמונה החיה.
- הגדר את הפונדוסקופ למסנן עירור אור כחול ב 465-490 ננומטר. האור שנלכד מפלואורסצאין נרגש הוא בין 520-530 ננומטר.
- לאחר 1.5 דקות לאחר הזרקת פלואורסצאין, צלם תמונה של כל רשתית וחזור שוב לאחר 7 דקות.
הערה: תזמון הוא קריטי עבור אירועים אלה, אם לא ניתן ללכוד את שניהם אז רק תמונה של עין אחת.
5. ניקוד מחלות קליניות
- בססו את ההערכה הקלינית על חומרת הקריטריונים הבאים: דלקת דיסק אופטי, איזוק כלי דם, חדירת רקמת רשתית ונזק מבני.
- העניקו לכל אחד מהפרמטרים הללו ציון בסולם מ-0 עד 5 והסך הכולל מייצג מחלה קלינית לכל העין, עם ציון מקסימלי של 20 לכל עין. טבלה 1 יכולה לשמש כמדריך לקריטריוני ניקוד.
6. היסטולוגיה וניקוד היסטולוגי
- לאחר המתת העכברים על ידי נקע צוואר הרחם, לחנך את העיניים על ידי הפרדת העפעפיים זה מזה לגישה קלה לעין כולה.
- לאחר מכן, הניחו מלקחיים מעוקלים מאחורי הגלובוס מתוך כוונה לתפוס את רקמת החיבור המסלולית ואת עצב הראייה. היזהר להימנע מלחץ על כדור הארץ.
- לקיבוע, יש להכניס את העין ל-4% גלוטראלדהיד למשך 15 דקות לפחות כדי למזער את היפרדות הרשתית, ולאחר מכן להעביר ל-10% פורמלדהיד למשך 24 שעות לפחות. 1-2 מ"ל של קיבוע ייתן נפח מספיק כדי לכסות שתי עיניים.
- ביצוע הטבעה בפרפין, חתך על מיקרוטום וצביעה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. עובי חתך 3-4 מיקרומטר מומלץ לכל סוג של צביעה.
- לבצע בדיקה היסטולוגית של העיניים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עבור צביעת Hematoxylin ו Eosin (H&E).
- הקצאת ציונים בסולם של 0-4, על פי הקריטריונים לניקוד EAU בהתבסס על מידת חדירת תאי החיסון בתוך הרשתית והכורואיד, הפרעה בשכבות הרשתית, מידת היווצרות הגרנולומה ומידת היפרדות הרשתית, דבר המצביע על נזק לרשתית, כפי שתואר קודם לכן (Agarwal 2013) וסוכם בטבלה 211.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שלב אחר שלב לגרימת מודל של אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית (EAU) על ידי חיסון עכברים בפפטיד רשתית uveitogenic הנגזר מ- IRBP. הערכת המחלה באמצעות גישות בשימוש נרחב ונגישות מכוסה, אם כי אלה אינן בלעדיות וניתן להוסיף אותן, או להחליף אותן חלקית, על ידי טכניקות הדמיה אחרות. הסימנים הראשונים של EAU בעכברי C57BL/6J יכולים להיות מזוהים שבועיים לאחר החיסון ושיא המחלה הגיע תוך שלושה שבועות, כפי שמודגם באיור 1. שינויים פונדוסקופיים מסווגים במהלך התקדמות המחלה כשינויים דלקתיים, הכוללים רקמת רשתית, דלקת בכלי הדם ובדיסק האופטי, ונזק מבני ברשתית (איור 2), בנוסף לשינויים היסטולוגיים המבוססים על חדירת תאי מערכת החיסון ונזק מבני. שינויים קליניים והיסטופתולוגיים אלה ניתנים לזיהוי עד 85 יום לאחר החיסון, ומדורגים ומקבלים ניקוד להערכה כדי לחקור את התקדמות המחלה. על מנת למנוע הטיה לא מכוונת בניקוד החזותי האיכותי, התמונות צריכות להיות מוערכות על ידי יותר ממומחה אחד והציונים דורשים להיות עיוורים לקבוצות הטיפול.
אנו מראים כאן כיצד מערכות הניקוד הקליניות וההיסטולוגיות (טבלה 1 וטבלה 2) מנחות מדענים לכמת את חומרת ה-EAU , לאמת את יעילות הטיפולים ולחקור את מנגנון הפעולה התרופתית. דליפת כלי דם היא גם תכונה פתולוגית של המודל ו uveitis האדם. אנו מראים דוגמאות של דליפת כלי דם של פלואורסצאין (איור 3) כשיטה נוספת להערכת מחלות במודל זה.
איור 1. ציר זמן סכמטי של התקדמות המחלה הקלינית וההיסטולוגית ב- IRBP1-20 המושרה EAU. ציר זמן המסמן את תחילת החדירה וההתקדמות של IRBP1-20 גרם ל- EAU לקראת שיא המחלה. מהחיסון, הסימנים הראשונים של מחלה קלינית, כפי שזוהו על ידי הדמיה פונדוסקופית וניתוח היסטופתולוגי, נופלים בין הימים 12-14. לאחר מכן המחלה תמשיך להתקדם, על פי פרמטרים אלה, עד שיגיע לשיא בסביבות היום ה-21-23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. תמונות פונדוסקופיות מייצגות בקורלציה עם חתכים היסטולוגיים בשלבים שונים של מחלת EAU המושרה IRBP1-20 בעכברי C57BL/6J. תמונות פונדוסקופיות קליניות ורקמות תואמות של C57BL/6J מאותו בעל חיים שחוסן בפפטיד IRBP 1-20. (A ו-B) תמונות פונדוסקופיות וקטעי עין היסטולוגיים שהתקבלו מעכברים בריאים ומוזרק CFA. ברשתית אין סימן לדלקת ובקטעי היסטולוגיה מקבילים נראות שכבות רשתית שהשתמרו. (C) תמונה פונדוסקופית של העין המתקבלת מעכבר C57BL/6J 14 יום לאחר החיסון מדגימה סימנים קלאסיים של EAU, המציגה נפיחות דיסק אופטי חמורה בשלב מוקדם של המחלה, היסטולוגיה מתאימה מראה חדירה של תאי מערכת החיסון לחלל הזגוגית. (D) תמונות פונדוסקופיות של העין שהתקבלו מעכבר C57BL/6J 21 יום לאחר החיסון מראות סימנים של אזיקי כלי דם וחדירה לאוכלוסיות חיסוניות. נתוני היסטולוגיה מראים שינויים מבניים חמורים על ידי קיפול רשתית (חיצים צהובים). V = כלי שיט, O = דיסק אופטי, R = רשתית, L = עדשה, ויט = זגוגית, iO = דיסק אופטי מודלק, iV = כלי מודלק, iR = רשתית דלקתית, i = תאים חודרים בזגוגית, RFs = קפלי רשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תמונות מייצגות של אנגיוגרפיה פלואורסצנטית שצולמו באמצעות מערכת הדמיה מיקרון III בשיא המחלה. עכברי C57BL/6J הוזרקו תת עורית עם 2% פלואורסצאין ותמונות שצולמו בנקודות זמן שונות לאחר מחזור הנותב. (A) CFA עכבר בקרה בלבד שנלקח 1.5 ו -7 דקות לאחר מתן פלואורסצאין. (B) תמונות מייצגות של עכברים מחוסנים IRBP1-20 שצולמו 1.5 ו-7 דקות, בהתאמה, לאחר קבלת פלואורסצאין. חץ לבן מציין דליפת כלי שיט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| הציון | דיסק אופטי | כלי דם ברשתית | חדירת רקמת הרשתית | נזק מבני | ||||
| 1 | דלקת מינימלית | 1-4 אזיקים קלים | 1-4 נגעים קטנים או נגע ליניארי אחד | נגעים ברשתית או ניוון רשתית המערבים 1/4 עד 3/4 אזור הרשתית | ||||
| 2 | דלקת קלה | >4 אזיקים קלים או 1-3 אזיקים בינוניים | 5-10 נגעים קטנים או 2-3 נגעים ליניאריים | ניוון רשתית פאן עם נגעים קטנים מרובים (צלקות) או <3 נגעים ליניאריים (צלקות) | ||||
| 3 | דלקת בינונית | >3 אזיקים בינוניים | >10 נגעים קטנים או >3 נגעים ליניאריים | ניוון רשתית פאן עם >3 נגעים ליניאריים או נגעים קונפלואנטיים (צלקות) | ||||
| 4 | דלקת חמורה | >1 איזוק חמור | מפגש נגעים ליניארי | היפרדות רשתית עם קיפול | ||||
| 5 | * לא נראה לעין (לבן או ניתוק קיצוני) | * לא נראה לעין (לבן או ניתוק קיצוני) | * לא נראה לעין (לבן או ניתוק קיצוני) | * לא נראה לעין (לבן או ניתוק קיצוני) | ||||
טבלה 1. סולם ניקוד קליני קונבנציונלי להערכת חומרת המחלה הקלינית של EAU . טבלה המציגה קריטריונים המשמשים להערכת מידת חומרת המחלה בעכברים שחוסנו ב-IRBP1-20. הציונים חולקו על פי סימני ההיכר שתוארו לעיל הנראים בתמונות הפונדוס, כל עין קיבלה ציון כולל מתוך עשרים. * בשל הסתרה והיפרדות רשתית בתוך החדר האחורי לא ניתן להעריך. הטבלה הותאמה באישור Xu H., et al., 20088.
| כיתה | קריטריונים |
| 0 | אין שינוי |
| 0.5 (עקבות) | חדירת תאים דלקתיים קלה. ללא נזק לרקמות |
| 1 | חדירה; קפלי רשתית וניתוקי רשתית מוקדיים; מעט גרנולומות קטנות בכורואיד וברשתית, פריוסקוליטיס |
| 2 | חדירה מתונה; קפלי רשתית, ניתוקים ונזק לתאי פוטורצפטור מוקדיים; גרנולומות קטנות עד בינוניות, פריוסקוליטיס ווסקוליטיס |
| 3 | חדירה בינונית עד כבדה; קיפול רשתית נרחב עם ניתוקים, נזק מתון לתאי קולטני אור; נגעים גרנולומטיים בגודל בינוני; ניאו-וסקולריזציה תת-רשתית |
טבלה 2. ניקוד היסטולוגי EAU
טבלה המציגה קריטריונים המשמשים להערכת חומרת EAU בהתבסס על תכונות היסטופתולוגיות של המחלה. הציונים חולקו על פי סימני ההיכר שתוארו לעיל על צביעת H&E, כל עין קיבלה ציון כולל מתוך ארבע. הטבלה הותאמה באישור Agarwal et al. 201311.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים ניסיוניים של בעלי חיים הם כלים הכרחיים לחקר פתוגנזה של מחלות ולבדיקה פרה-קלינית של פרדיגמות טיפוליות חדשות. בפרוטוקול הנוכחי, דנו במתודולוגיה להשראת, ניטור וניקוד EAU, מודל ניסיוני של אובאיטיס דלקתית תוך עינית. מודל EAU זה כולל שכיחות מחלה של יותר מ -95% כאשר כל ההליכים מבוצעים על פי הפרוטוקול המתואר כאן, ומביא להתפתחות של EAU כרוני, מונופאזי. כדי להגיע לרמת היארעות זו, אנו מדגישים את חשיבות הכנת האנטיגן והזרקת התחליב, שניהם מפורטים לעיל. המאפיינים העיקריים של EAU בבעלי חיים הם דלקת רשתית ו / או כורואידית, דלקת כלי דם ברשתית, הרס קולטני אור ואובדן ראייה, כולם מייצגים תכונות קלינאופתולוגיות חיוניות רבות של אובאיטיס אחורית אנושית12. חלק ניכר מההבנה של המנגנונים התאיים והמולקולריים הבסיסיים המעורבים באובאיטיס נגזר ממודל ה-EAU המושרה כמתואר כאן. EAU יכול להיות מושרה בעכברים13 וחולדות11 על ידי חיסון פעיל עם אנטיגנים ברשתית המוכרים על ידי לימפוציטים. אנטיגנים אלה ברשתית לובשים צורות רבות; IRBP (לעכברים) או אנטיגן מסיס ברשתית (S-Ag) לחולדות. גרימת EAU על רקע C57BL/6J יוצרת צורה כרונית יותר של המחלה, כאשר שיא הפתולוגיה נצפה שלושה שבועות לאחר החיסון. לשם השוואה, מריחת אנטיגן רשתית על רקע B10RIII14 גורמת לצורה חריפה-מונופאזית וחמורה קלינית של EAU כאשר שיא הפתולוגיה מופיע בדרך כלל תוך שבועיים מהזירוז, והמחלה שוככת בשבוע 3.
אפיטופים שונים של IRBP נבדקו בעכברי C57BL/6J ופפטיד IRBP1-20 הוכח כמודל הניתן לשחזור עם רמות שכיחות וחומרה גבוהות. לאחרונה אפיטופ אובאיטוגני חדש של IRBP, שאריות חומצות אמינו 651 עד 670 של IRBP אנושי דווחו כגורמים ל- EAU עם שכיחות קלינית גבוהה יותר וביטוי מחלה קשה11 וניתן להשתמש בהם בהעדפה אם זה יעמוד ביעדים המדעיים. מאחר שההשפעה של מיקרוביוטה קומנסלית של המעי והפעלת קולטני תאי T אוטו-תגובתיים (TCRs) ידועה כמפריעה להתפרצות המחלה בעת יישום אנטיגנים שונים15, אנו ממליצים למתחילים בתחום זה להשתמש בפפטידים hIRBP 1-20 או hIRBP651-670 במינון בין 300-500 מיקרוגרם על מנת להשיג מודל אמין. ואכן, השונות במודל זה תועדה במקומות אחרים עם דוחות המדגישים את חשיבות ההבדלים בין מערכות הדיור לבין המיקרוביום, אשר עשויים להשפיע על חומרת המחלה והיארעות15. לכן, פחות או יותר אנטיגן פפטידי רעלן שעלת עשוי להידרש.
ישנם מספר מודלים אחרים אליהם ניתן לבצע את הניתוח המתואר שלנו. אלה כוללים uveitis ספונטני המתקדם בעכברים טרנסגניים (R161H) קולטן תאי IRBP T (TCR), שבו דלקת עיניים מתפתחת על ידי 5-6 שבועות של גיל16. EAU יכול גם להיות מושרה באופן מאומץ על ידי העברת תאים uveitogenic effector CD4 + T. תאי CD4+T מופעלים וספציפיים ל-IRBP שמקורם בעכברים דרוכים יכולים לשמש כמקור לתאי השפעה 3,11. מודל זה מייצג את שלב ההשפעה של המחלה תוך הימנעות מהמורכבות של שימוש ב- CFA במודל הזירוז.
בהמשך לכך, ישנם יתרונות רבים לשימוש במודלים דלקתיים עיניים ככלים מתאימים לחקר מחלות דלקתיות אחרות, בפרט, אלה עם פתולוגיה של תת-קבוצה Th1 ו- Th17. היתרונות העיקריים לשימוש במודל זה הם השיטות הלא פולשניות והניתנות לכימות למעקב אחר התפתחות המחלה והתקדמותה, שהן פונדוסקופיה ואנגיוגרפיה. מערכות הדמיה לא פולשניות אלה מאפשרות גישה קלה לרקמות עצביות, שאחרת היו מוסתרות מאחורי מחסומים אנטומיים מגנים. שיטות נוספות למעקב אחר התקדמות המחלה כוללות יישום של הדמיית OCT, שהיא רגישה יותר מהדמיה פונדוסקופית באיתור חדירות תאיות, במיוחד בשלב המוקדם של הופעת EAU . הטכניקה מאפשרת הדמיות חתך רב שכבתיות ואופקיות של הרשתית לאורך ובאופן לא פולשני. In vivo הדמיית OCT מוסיפה מידע על עובי הרשתית שלא ניתן היה להשיג בבדיקות פונדוסקופיות והיסטולוגיות17. יותר ויותר, הזמינות של טכניקות הדמיה לא פולשניות מתוחכמות עוד יותר, כגון אופטיקה אדפטיבית, סריקת לייזר, אופטלמוסקופיה וכלי הדמיה רב-מודאליים, יקדמו עוד יותר את יכולתנו לחקור מחלה זו במכרסמים קטנים. יתר על כן, היכולת לנתח ולבודד אוכלוסיות תאים תושבות ומסתננות לצורך ניתוח מעמיק יותר של אימונופנוטיפים, תוך שימוש בטכניקות כגון ציטומטי זרימה, מעניקה הזדמנויות רבות לספק מידע תובנה.
ישנן מספר מערכות ניקוד מבוססות המבוססות על קריטריונים קליניים שהתקבלו מפונדוסקופיה 8,9,18. בעוד אלה שונים מעט בין מרכזי מחקר עיניים, כולם אמינים, בקורלציה עם תכונות היסטופתולוגיות ומסוגלים לשקף במדויק את חומרת המחלה. במחקר הנוכחי, אנו מתייחסים לשיטת הניקוד שפותחה על ידי Xu et al.8. מערכת זו מציעה גישת הערכה מפורטת יותר עם מספר רב יותר של פרמטרים למדידה קלינית. הוא כולל ציון מקסימלי של 20 אשר מציג חלון רחב יותר לניקוד מאשר מערכות חלופיות המוגבלות למקסימום של 5. זה חשוב יותר לחקירה נוספת בתוך גישות טיפוליות. עם זאת, מזעור טעויות המפעיל הוא קריטי בעת שימוש במערך פרמטרים כה מעודן ומפורט ועשוי לדרוש הכשרה זהירה של המפעיל ותיקוף עצמאי של הפרשנות.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת EAU בעכברות C57BL/6 נקבות מכיוון שיש שכיחות מוגברת של נשים : גברים 1.4:1 המציגים עם אובאיטיס במסגרת הקלינית. עם זאת, יש לקחת בחשבון את מין העכברים המשמשים לגרימת מחלה אוטואימונית, שכן הדבר עשוי להשפיע על סביבת הציטוקינים11, וגם לחשוף הבדלים חשובים באופן שבו הם מגיבים להתערבות טיפולית. שיקול נוסף הוא גיל העכברים בעת השראת המחלה. לדוגמה, חקרנו תלות בגיל של רגישות בעכברי B10RIII והגענו למסקנה שלעכברים מעל 8 שבועות של חיים יש שכיחות נמוכה יותר של EAU (מחקר שלא פורסם מהקבוצה שלנו).
לסיכום, מודלים של בעלי חיים של מחלות תוך עיניות סיפקו כלי רב ערך לחקר אובאיטיס אחורית אנושית והקלו על פיתוח טיפולים חדשניים כגון CsA. עם זאת, אף מודל של בעלי חיים כשלעצמו אינו משחזר את הספקטרום המלא של האובאיטיס האנושית, שכן לכל אחד מהם מאפיינים ייחודיים שהופכים אותו מתאים לחקר היבטים מסוימים של המחלה. מודל EAU זה מושרה על ידי אוטואימוניות באמצעות יישום של פפטיד IRBP בתוספת אדג'ובנטים המפעילים תגובות חיסוניות מולדות. עם זאת, לא ידוע אם כל הצורות של אובאיטיס אחורית בבני אדם הן אוטואימוניות ואם חיקוי אנטיגני הוא גורם מעורר. בנוסף, לא ברור אם יש קשר עם זיהום בהפעלת uveitis אנושי. עם זאת, המודל המתואר כאן הוא מודל גנרי שימושי וניתן לשחזור שניתן להשתמש בו כדי ללקט מידע שימושי לגבי אטיולוגיה, פתוגנזה וטיפול במחלה מסכנת ראייה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם בעבודה זו.
Acknowledgments
JG זכתה במימון UCL Impact Studentship ו-Rosetrees Trust לתמיכה ב-CB. VC קיבלה מענק שיתוף פעולה מחקרי מחברת Akari Therapeutics Inc. ברצוננו להודות למכון UCL לרפואת עיניים, ליחידת השירות הביולוגי ובמיוחד לגב' אליסון או'הרה ולצוותה על תמיכתם הטכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V.
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
