Summary
Bu yazıda, araştırmacının göz içi üveitinin fare modelini oluşturmasını sağlayan bir protokol sunuyoruz. Daha yaygın olarak deneysel otoimmün üveit (EAU) olarak adlandırılan bu yerleşik model, insan hastalığının birçok yönünü yakalar. Burada, birkaç okuma kullanarak hastalığın ilerlemesinin nasıl indükleneceğini ve izleneceğini açıklayacağız.
Abstract
Deneysel Otoimmün Üveit (EAU), kendi kendine antijenlere yanıt veren immün hücreler tarafından yönlendirilir. Bu enfeksiyöz olmayan, göz içi inflamatuar hastalık modelinin birçok özelliği, insanları etkileyen posterior üveitin klinik fenotipini özetlemektedir. EAU, yeni inflamatuar terapötiklerin etkinliğini, etki biçimlerini incelemek ve göz içi bozuklukların hastalık ilerlemesini destekleyen mekanizmaları daha fazla araştırmak için güvenilir bir şekilde kullanılmıştır. Burada, bu hastalığa duyarlılığı olan en yaygın kullanılan model organizma olan C57BL / 6J farede EAU indüksiyonu hakkında ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Hastalığın şiddeti ve progresyonunun klinik değerlendirmesi fundoskopi, histolojik inceleme ve floresein anjiyografi ile gösterilecektir. İndüksiyon prosedürü, oküler protein interfotoreseptör retinoid bağlayıcı proteinden (retinol bağlayıcı protein 3 olarak da bilinir), Complete Freund's Adjuvant'tan (CFA) bir peptid (IRBP1-20) içeren bir emülsiyonun deri altı enjeksiyonunu içerir ve öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis ile desteklenir. Bu viskoz emülsiyonun boynun arkasına enjeksiyonunu, Bordetella boğmaca toksininin tek bir intraperitoneal enjeksiyonu izler. Semptomların başlangıcında (12-14. gün) ve genel anestezi altında, klinik muayene yoluyla hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için fundoskopik görüntüler alınır. Bu veriler, daha sonraki zaman noktalarında ve pik hastalıkta (20-22. gün) analiz edilen farklılıklarla doğrudan karşılaştırılabilir. Aynı zamanda, bu protokol, araştırmacının floresein anjiyografi kullanarak damar geçirgenliği ve hasarındaki potansiyel farklılıkları değerlendirmesini sağlar. EAU, diğer fare suşlarında (hem vahşi tipte hem de genetiği değiştirilmiş olarak) indüklenebilir ve ilaç etkinliğini ve / veya hastalık mekanizmalarını incelemek için esneklik sunan yeni tedavilerle birleştirilebilir.
Introduction
Bu protokol, C57BL / 6J farede Deneysel Otoimmün Üveitin (EAU) emülsifiye bir adjuvanda retinal antijenin tek bir deri altı enjeksiyonu ile nasıl indükleneceğini gösterecektir. Hastalığın ilerlemesini izleme ve değerlendirme yöntemleri, fundoskopik görüntüleme ve histolojik inceleme ile detaylandırılacak ve ölçüm parametreleri ana hatlarıyla belirtilecektir. Ayrıca retinal kan damarı yapısını ve geçirgenliğini incelemek için kullanılan bir teknik olan floresein anjiyografi tartışılacaktır.
Bu EAU modeli, insanlarda enfeksiyöz olmayan posterior üveitin klinik patolojik özellikleri ve hastalığı yönlendiren temel hücresel ve moleküler mekanizmalar açısından merkezi özelliklerini özetlemektedir. EAU, evlat edinilmiş transfer deneylerinde ve IFNγ tükenmiş farelerde gösterildiği gibi, kendi kendine reaktif CD4 + T lenfositlerin Th1 ve / veyaTh17 alt kümeleri tarafından aracılık edilir. Üveitte bu hücrelerin potansiyel rolleri hakkındaki anlayışımızın çoğu, retina dokularında hem Th1 hem de Th17 hücrelerinin tespit edildiği EAU2'yi incelemekten kaynaklanmaktadır3. Genellikle, EAU hastalığı hafifletmede yeni tedavilerin yararını değerlendirmek için klinik öncesi bir model olarak kullanılır. EAU hastalığını başarılı bir şekilde modüle eden terapötik yaklaşımlar klinikte bir miktar etkinlik göstermiş ve FDA onaylı statüye ulaşmıştır. Bunların örnekleri, T hücre hedefleme tedavileri gibi immünoregülatör ilaç gruplarıdır: siklosporin, FK-506 ve rapamisin 4,5,6. Son zamanlarda, bu modelde hem mekanizmayı hem de hastalık sonucu üzerindeki etkisini araştırmak için yeni yolları hedefleyen müdahaleler de araştırılmıştır. Bunlar, kromatin okuyucu Bromodomain Ekstra-Terminal (BET) proteinleri ve P-TEFb inhibitörleri3 aracılığıyla transkripsiyonel düzenlemeyi hedeflemeyi içerir. Ayrıca, VLA-4 inhibitörü gibi daha geleneksel yaklaşımlar son zamanlarda efektör CD4 + T hücrelerinin modülasyonu yoluyla EAU'da baskılanma göstermiştir7. Ek olarak, bir RORγt ters agonisti olan TMP778 ile Th17 hücrelerini hedeflemenin de EAU8'i önemli ölçüde baskıladığı bulunmuştur. Ayrıca, bu model retinadaki kronik otoimmün inflamasyonu ve lenfosit primasyonu gibi eşlik eden altta yatan mekanizmaları incelemek için bir fırsat sunmaktadır.
EAU preklinik çalışmaları için birincil okumalar, retinal fundoskopi görüntülemesi yapılarak ve daha az sıklıkla, Optik Koherens Tomografi (OCT) ile retina bütünlüğünün değerlendirilmesi yoluyla klinik değerlendirmedir. Daha sonra retinal histopatolojik değerlendirme ve retina hücrelerinin akım sitometrisi ile immünofenotiplenmesi terminasyonda yapılır. Fundoskopi, tüm retinanın hızlı ve tekrarlanabilir klinik değerlendirmesine olanak tanıyan, kullanımı kolay bir canlı görüntüleme sistemidir. İmmünohistokimyasal değerlendirmeler için, teknikler, inflamasyon ve yapısal hasar derecesi için doku mimarisini incelememize izin veren retinal kesitlerin hazırlanmasına dayanmaktadır9. Kullanılan tüm teknikler için değerlendirme kriterleri ve geleneksel puanlama sistemleri bu protokolde özetlenecektir. Fundoskopik görüntüleme kullanılarak kaydedilen hasarın boyutu genellikle histolojik değişikliklerle yakından ilişkilidir. Hastalığın ciddiyetini izlemeye ve değerlendirmeye yönelik bu ikili yaklaşım, daha fazla hassasiyet ve daha güvenilir ölçüm sonuçları sağlar.
EAU preklinik testler ve immün aracılı göz hastalığının araştırılması için iyi kurulmuş, yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Bu model, %95 > hastalık insidansı ile güvenilir ve tekrarlanabilir olup, dünya çapında çalışma yaşı körlüğünün önemli bir nedenini temsil eden göz içi inflamatuar hastalığın tedavisi için yeni tedavileri doğrulamak veya reddetmek için kullanılabilecek kapsamlı veriler üretir10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, 1986 tarihli İngiltere Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası ve kurumsal Hayvan Refahı ve Etik İnceleme Organı (AWERB) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Muhafaza C57BL / 6J fareler
- Ev fareleri belirli bir patojen içermeyen ortamda, 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsünde ve yiyecek ve su mevcut ad libitumda.
- Yetişkin dişi C57BL / 6J üzerinde tüm deneyleri yapın (üveit hastalarında kadınların erkeklere 1.4 ila 1 arasında bir insidansı olduğu için dişiler tercihen seçilir). 6-8 haftalık dişi C57BL / 6J farelerini ağırlık ve yaşa göre randomize edin. Fareleri, kafes başına 5-6 farelik gruplar halinde ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde (IVC) barındırın.
2. C57BL/6 farelerin bağışıklanması
- IRBP1-20 - CFA Emülsiyon Hazırlama
NOT: Emülsiyon preparatı, hastalığın tekrarlanabilirliği ve insidansı için esastır; Bu nedenle, hazırlık süreci boyunca ve deneyler boyunca tutarlılığı korumak için her türlü çaba gösterilmelidir. Emülsiyonu hazırlarken, önceden tüm reaktiflerin hesaplamalarında kayıp hesaba katılmalıdır. Bu kayıp, aşılama için planlanan fare sayısına bağlı olarak yaklaşık 1.5x (veya hazırlanan hacmin% 50'si ekstra) olabilir. Lütfen aşağıdaki örneğe bakın. 10 fareyi bağışıklamak için 15 fare hazırlayın ve 400 μg (20 g fare başına peptid) x 15 fare = 6 mg kullanın. Her fare bağışıklama için 200 μL almalıdır (toplam 3 mL). Son hacim, 1: 1 oranında peptid çözeltisi ve CFA, dolayısıyla 1.5 mL peptid çözeltisi ve 1.5 mL CFA'dan oluşur.- Tüm steril çözeltileri aseptik teknikler kullanarak laminer bir akış kabininde hazırlayın.
- İstenilen miktarda (20 g fare başına 400 μg) insan IRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) liyofilize peptidi tartın. Peptitleri% 100 DMSO'da çözün. Stoğu liyofilize formda -20 °C'de saklayın.
NOT: Tozun tamamen çözündüğünden emin olmak için her pul önce DMSO ile temas etmeli ve artık katı belirtisi göstermemelidir. Son birime ulaşmak için PBS'yi küçük bölümler halinde ekleyin. Bir vorteks ile karıştırmayın, bunun yerine bir pipetle nazik ajitasyon kullanın. DMSO'nun nihai konsantrasyonu, toplam peptid hazırlama hacminin% 1'ini geçmemelidir. Emülsiyonun konik tabanlı 20 mL'lik bir plastik tüp içinde hazırlanması, DMSO'nun liyofilize toza daha iyi erişilebilmesini sağlamalıdır. - DMSO-PBS peptid çözeltisini 1: 1 v / v'de CFA'ya ekleyin, bu da 1.5 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon vermek için 1.5 mg / mL öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis ile desteklenmiştir. Viskoz ve eşit olarak dağıtılmış bir emülsiyon oluşturmak için damla damla, nazikçe ve sık sık pipetleme ekleyin.
- Peptit çözeltisini ve CFA'yı 1000 μL'lik bir pipet (daha fazla kaybı önlemek için 700 μL'ye ayarlanmış) ve kremsi kalın bir kıvam oluşturmak için pipet kullanarak havalandırın. Bu teknik, istenen kalınlığa ulaşana kadar tekrar tekrar yukarı ve aşağı aspire etmek için pipetin kullanılmasını içerir. Optimal sonuçlar için, enjekte etmeden önce antijen çözeltisinin ve adjuvanın iyice karıştırıldığından emin olun.
- Boğmaca toksininin intraperitoneal enjeksiyonu
- 1.5 μg Bordetella boğmaca toksinini 100 μL RPMI 1640 ortamında %1fare serumu 11 ile desteklenmiş olarak askıya alın.
- İ.P. enjeksiyonunu steril bir şırınga ve 23G iğne ile gerçekleştirin.
NOT: Enjeksiyon bölgesinde rahatsızlık oluşmasını önlemek için, antijen enjekte edilmeden önce boğmaca toksini uygulanmalıdır. - Tek bir 100 μL i.p. Bordetella boğmaca toksini enjeksiyonu almak için her fareyi geçici olarak ayrı bir kafese aktarın.
- IRBP emülsiyonunun deri altı enjeksiyonu
- Daha sonra, IRBP emülsiyonunu deri altından enjekte edin. Bu süreç, sağlık ve güvenlik düzenlemelerine göre koruma ile uygun şekilde giyinmiş iki hayvan işleyicisi gerektirir.
- Eğitimli bir kişinin, kafesin üstündeki fareyi hafifçe tırmık benzeri bir pozisyonda, midesi aşağı bakacak şekilde tutmasını sağlarken, diğer eğitimli kişi, iğnenin parmak ve başparmak arasındaki yuvaya yerleştirilebileceği boynun arkasında çadır benzeri bir yapı oluşturmak için cildi sıkıştırır.
DİKKAT: İğne çubuğu yaralanması tehlikesi vardır. - İğne yerleştirildikten sonra, IRBP emülsiyonunun 200 μL'sini enjekte edin. İğneyi çıkarırken, dışarı çekmeden önce cildi kapatmak için iğne kafasını döndürün ve emülsiyonun reflüsünü önlemek için enjeksiyon bölgesine daha sonra basınç uygulayın.
DİKKAT: Emülsiyon fare derisi veya kürkü ile temas etmemelidir, çünkü bu tahrişe ve daha ciddi vakalarda bir lezyonun gelişmesine neden olabilir. Bu durumda, alan% 70 etanol kullanılarak derhal ve iyice silinmeli ve daha sonra kurutulmalıdır.
NOT: Drenaj lenf düğümleri çalışmanın sonunda muayene için gerekliyse, enjeksiyon bölgesi farklı olacaktır. Bu durumda, kanadın her iki tarafına deri altından 100 μL enjekte edin. Bu, drenaj yapan kasık lenf düğümlerinde, hasat sırasında eksize edilebilen daha güçlü bir yanıt üretecektir. Bununla birlikte, amaçlanan sonuç yalnızca EAU'yu geliştirmekse, çoklu enjeksiyon bölgelerinden rahatsızlık duymamak için boynun arkasına 200 μL'lik tek bir enjeksiyon tercih edilir.
3. Klinik Değerlendirme - Fare Fundus Muayenesi
NOT: Klinik hastalık, fundus muayenesi kullanılarak, bir fundoskop ve görselleştirme için kullanılan Discover yazılımı kullanılarak parlak alan canlı görüntüleme yoluyla puanlandırılmalıdır.
- Hastalığın başlangıcında (12-14. gün), hem Ketamin (50 mg / mL) hem de Domitor (Medetomidin; 1 mg / mL) kombinasyonunu kullanarak genel anestezi altında fareleri sakinleştirin. 1 parçalı Domitor'u seyreltin; 1.5 parça Ketamin ve 2.5 parça steril enjekte edilebilir su, daha sonra intraperitoneal olarak 30 g başına 100 μL enjekte edin. Yukarıdaki anestezi kombinasyonu için 1 mL steril şırıngalar ve 23G iğneler kullanın.
- Bunu takiben, tüm reflekslerin kaybolduğundan ve uyaranlara yanıt vermediğinden emin olmak için fareyi izleyin.
- İ.P. enjeksiyonunu aldıktan hemen sonra ve fare hala bir pürüz içinde tutulurken, pupilla genişlemesi için her göze topikal olarak% 1 tropikamid% ve% 2.5 fenilefrin uygulayın. Korneayı her iki dilatasyon çözeltisiyle tamamen kaplamayı hedefleyin. Öğrencinin tamamen genişlemesi birkaç dakika sürebilir.
- Daha sonra, göz viskoziyatı merhemine cömertçe uygulayın ve gözü tamamen yağlanmış ve nemli tutmak için görüntüleme işlemi boyunca koruyun.
- Bu arada, yazılımı açın (örneğin, Keşfet) ve fundoskopu (örneğin, Micron) parlak alan altında görüntü yakalamak için ayarlayın. Her bir fareye bir klasör ayırın ve fotoğraflanan her göze göre görüntüleri R veya L ile etiketleyin.
- Fareyi canlı görselleştirme için amaca yönelik olarak oluşturulmuş bir sahneye monte edin ve mikroskopu retinaya tam erişim için konumlandırın.
- Hastalığın doğru bir temsilini elde etmek için, optik diske ek olarak çevrenin tüm köşelerini kaplayan tüm retina bölgesinin görüntülerini alın. Bunu başarmak için, göz merceğini baştan sona ayarlayın. Gözün görüntüleme işlemi boyunca her zaman tamamen yağlanmış kalması çok önemlidir; göz merhemini sabit bir oranda doldurarak bunu sağlayın.
- Floresein anjiyografi yapmak için bu aşamada bölüm 4'e (aşağıda) bakınız.
- Tüm görüntüleme tamamlandıktan sonra, anestezik reversal anti-sedasyonu (5 mg / mL Antisedan) enjekte edilebilir suda seyreltin ve 0.1 mg / kg i.p'de uygulayın. Fareyi bir kafese geri döndürün ve iyileşene kadar ıslak ıslatılmış bir diyete erişimi olan önceden ısıtılmış bir paspasa yerleştirin. Tam iyileşme, tüm vücut hareketi ve kafesin etrafında sabit yürüyüşle yürümek, tipik olarak birkaç saat sürmek ile karakterizedir.
- Belirlenen deneysel bitiş noktasında (örneğin, 21-23. gün), 4.1-4.5 adımlarını tekrarlayın ve hastalığın doğru bir temsilini yakalamak için optik diski ve çevrenin tüm köşelerini kaplayan tüm retina bölgesinin fotoğraflarını tekrar çekin.
4. Floresein anjiyografi
- Bu hayvanlarda damar sızıntısını ölçmek için, anestezi altındayken, her fareye boynun arkasına deri altından% 2'lik bir floresein enjeksiyonu yapın ve retina canlı görüntünün ortasında merkezileştirilecek şekilde konumlandırın.
- Fundoskopu 465-490 nm'de mavi ışık uyarma filtresine ayarlayın. Uyarılmış floreseinden yakalanan ışık 520-530 nm arasındadır.
- Floresein enjeksiyonundan 1,5 dakika sonra, her retinanın fotoğrafını çekin ve 7 dakikada tekrar edin.
NOT: Bu olaylar için zamanlama çok önemlidir, eğer her ikisini de yakalayamazsa, sadece bir gözü görüntüleyin.
5. Klinik Hastalık Puanlaması
- Klinik değerlendirmeyi aşağıdaki kriterlerin ciddiyetine dayandırın: optik disk iltihabı, retinal damar kelepçelenmesi, retina dokusuna sızma ve yapısal hasar.
- Bu parametrelerin her birine 0'dan 5'e kadar bir ölçekte bir puan verin ve kolektif toplam, göz başına elde edilebilecek maksimum 20 puan ile tüm göz için klinik hastalığı temsil eder. Tablo 1 , puanlama kriterleri için bir kılavuz olarak kullanılabilir.
6. Histoloji ve Histolojik Puanlama
- Servikal çıkık ile fareleri ötenazi yaptıktan sonra, tüm göze kolay erişim için göz kapaklarını birbirinden ayırarak gözleri enüklee edin.
- Daha sonra, yörüngesel bağ dokusunu ve optik siniri kavramak amacıyla kavisli forsepsleri dünyanın arkasına yerleştirin. Dünyayı sıkmaktan kaçınmaya dikkat edin.
- Fiksasyon için, retina dekolmanı en aza indirmek için gözü en az 15 dakika boyunca% 4 glutaraldehit içine yerleştirin ve daha sonra en az 24 saat boyunca% 10 formaldehit'e aktarın.
- Parafine gömme, mikrotom üzerinde bölümleme ve standart protokollere göre boyama işlemini gerçekleştirin. Her türlü boyama için 3-4 μm kesit kalınlığı önerilir.
- Hematoksilin ve Eozin (H&E) boyama için standart protokolleri kullanarak gözlerin histolojik incelemesini yapın.
- Retina ve koroid içindeki immün hücre infiltrasyonunun derecesine, retina tabakalarının bozulmasına, granülom oluşum derecesine ve retina dekolmanının derecesine bağlı olarak, daha önce tarif edildiği gibi (Agarwal 2013) retina hasarını gösteren retina dekolmanı derecesine dayanarak, EAU skorlaması kriterlerine göre 0-4 ölçeğinde puanlar atayın (Agarwal 2013) ve Tablo 211'de özetlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, IRBP'den türetilen bir uveitojenik retinal peptid ile fareleri bağışıklayarak deneysel otoimmün üveit (EAU) modelini indüklemek için adım adım bir yöntem tanımlamaktayız. Yaygın olarak kullanılan ve kolayca erişilebilen yaklaşımların kullanıldığı hastalığın değerlendirilmesi, bunlar münhasır olmamasına ve diğer görüntüleme tekniklerine eklenebilmesine veya kısmen değiştirilmesine rağmen, ele alınmaktadır. C57BL/6J farelerde EAU belirtileri, Şekil 1'de gösterildiği gibi bağışıklamadan iki hafta sonra tespit edilebilir ve üç hafta içinde ulaşılan pik hastalık tespit edilebilir. Fundoskopik değişiklikler, hastalığın ilerlemesi sırasında, infiltrasyon immün hücrelere ve yapısal hasara bağlı histolojik değişikliklere ek olarak, retina dokusu, vasküler ve optik disk inflamasyonu ve retinal yapısal hasarı içeren inflamatuar değişiklikler olarak sınıflandırılır (Şekil 2). Bu klinik ve histopatolojik değişiklikler, bağışıklamadan sonraki 85 güne kadar tespit edilebilir ve değerlendirme için derecelendirilir ve puanlanır, hastalığın ilerlemesini incelemeyi önerir. Nitel görsel skorlamada kasıtsız önyargıların önüne geçmek için görüntülerin birden fazla uzman tarafından değerlendirilmesi ve skorerlerin tedavi gruplarına kör edilmesi gerekmektedir.
Burada klinik ve histolojik skorlama sistemlerinin (Tablo 1 ve Tablo 2) bilim insanlarına EAU şiddetini ölçmek, tedavilerin etkinliğini doğrulamak ve ilaç etki mekanizmasını araştırmak için nasıl rehberlik ettiğini gösteriyoruz. Vasküler sızıntı da modelin ve insan üveitinin patolojik bir özelliğidir. Bu modelde hastalığın değerlendirilmesinde başka bir yöntem olarak floreseinin vasküler kaçak örneklerini (Şekil 3) gösteriyoruz.
Şekil 1. IRBP1-20 ile indüklenen EAU'da klinik ve histolojik hastalık progresyonunun şematik zaman çizelgesi. IRBP1-20'nin infiltrasyonunun başlangıcını ve ilerlemesini gösteren bir zaman çizelgesi, EAU'yu zirve hastalığına doğru indükledi. Bağışıklamadan itibaren, fundoskopik görüntüleme ve histopatolojik analiz ile tespit edilen klinik hastalığın ilk belirtileri 12-14. günler arasındadır. Hastalık daha sonra, bu parametrelere göre, 21-23. gün civarında bir zirveye ulaşılana kadar ilerlemeye devam edecektir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. C57BL/6J farelerde IRBP1-20 ile indüklenen EAU hastalığının farklı evrelerinde histolojik kesitlerle korelasyon gösteren temsili fundoskopik görüntüler. IRBP 1-20 peptid ile aşılanmış aynı hayvandan C57BL/6J'nin klinik fundoskopik ve karşılık gelen doku görüntüleri. (A ve B) sağlıklı ve CFA enjekte edilen farelerden elde edilen fundoskopik görüntüler ve gözün histolojik kesitleri. Retinada inflamasyon belirtisi yoktur ve buna karşılık gelen histoloji bölümleri korunmuş retina tabakalarını gösterir. (C) Bağışıklamadan 14 gün sonra C57BL/6J fareden elde edilen gözün fundoskopik görüntüsü, hastalığın erken evresinde şiddetli optik disk şişmesi ile kendini gösteren klasik EAU belirtileri gösterirken, buna karşılık gelen histoloji, bağışıklık hücrelerinin vitreus boşluğuna sızdığını gösterir. (D) Bağışıklamadan 21 gün sonra C57BL/6J fareden elde edilen gözün fundoskopik görüntüleri, damar kelepçelenmesi ve bağışıklık popülasyonlarına sızma belirtileri gösterir. Histoloji verileri, retinal katlanma (sarı oklar) ile ciddi yapısal değişiklikler göstermektedir. V= damar, O= optik disk, R=retina, L=lens, Vit=vitreus,iO= iltihaplı optik disk, iV= iltihaplı damar, iR= iltihaplı retina, i= vitreustaki hücrelere sızan, RF'ler=retinal kıvrımlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Pik hastalıkta Micron III görüntüleme sistemi kullanılarak çekilen floresan anjiyografinin temsili görüntüleri. C57BL/6J farelere deri altından% 2 floresein enjekte edildi ve izleyicinin dolaşımından sonra çeşitli zaman noktalarında alınan görüntüler alındı. (A) CFA, floresein uygulamasından 1,5 ve 7 dakika sonra alınan fareyi yalnızca kontrol eder. (B) IRBP1-20 bağışıklanmış farelerin temsili görüntüleri, floresein alındıktan sonra sırasıyla 1.5 ve 7 dakika çekilmiştir. Beyaz ok, damar sızıntısını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Puan | Optik Disk | Retinal Damarlar | Retina Dokusu İnfiltrasyonu | Yapısal Hasar | ||||
| 1 | Minimal Enflamasyon | 1-4 hafif kelepçeleme | 1-4 küçük lezyon veya 1 lineer lezyon | Retina lezyonları veya retina alanının 1/4 ila 3/4'ünü tutan retinal atrofi | ||||
| 2 | Hafif inflamasyon | >4 hafif kelepçeleme veya 1-3 orta derecede kelepçeleme | 5-10 küçük lezyon veya 2-3 lineer lezyon | Çok sayıda küçük lezyon (skar) veya <3 lineer lezyon (skar) ile pan retinal atrofi | ||||
| 3 | Orta derecede inflamasyon | >3 orta derecede manşet | >10 küçük lezyon veya >3 lineer lezyon | >3 lineer lezyonlar veya konfluent lezyonlar (skarlar) ile pan retinal atrofi | ||||
| 4 | Şiddetli inflamasyon | >1 şiddetli kelepçeleme | Lineer lezyon konfluent | Katlanır retina dekolmanı | ||||
| 5 | * Görünür değil (beyaz dışarı veya aşırı ayrılma) | * Görünür değil (beyaz dışarı veya aşırı ayrılma) | * Görünür değil (beyaz dışarı veya aşırı ayrılma) | * Görünür değil (beyaz dışarı veya aşırı ayrılma) | ||||
Tablo 1. EAU klinik hastalık şiddetini değerlendirmek için konvansiyonel klinik skorlama ölçeği. IRBP1-20 ile bağışıklanmış farelerde hastalık şiddetinin derecesini değerlendirmek için kullanılan kriterleri gösteren tablo. Puanlar, fundus görüntülerinde görülebilen yukarıda özetlenen özelliklere göre tahsis edildi, her göze yirmi üzerinden toplam puan verildi. * Arka kamoda içindeki infiltrasyon ve retina dekolmanı obsürasyonu nedeniyle değerlendirilemez. Xu H., et al., 20088'in izniyle uyarlanmış tablo.
| Derece | Kriter |
| 0 | Değişiklik yok |
| 0.5 (izleme) | Hafif inflamatuar hücre infiltrasyonu. Doku hasarı yok |
| 1 | Infiltrasyon; retinal kıvrımlar ve fokal retina dekolmanı; koroid ve retinada birkaç küçük granülom, perivaskülit |
| 2 | Orta derecede sızma; retinal kıvrımlar, dekolmanı ve fokal fotoreseptör hücre hasarı; küçük ve orta boy granülomlar, perivaskülit ve vaskülit |
| 3 | Orta ila ağır infiltrasyon; dekolmanı ile geniş retinal katlama, orta derecede fotoreseptör hücre hasarı; orta büyüklükte granülomatöz lezyonlar; subretinal neovaskülarizasyon |
Tablo 2. Histolojik skorlama EAU
Hastalığın histopatolojik özelliklerine dayanarak EAU'nun şiddetini değerlendirmek için kullanılan kriterleri gösteren tablo. Puanlar, H&E boyamasında yukarıda özetlenen özelliklere göre tahsis edildi, her göze dört üzerinden toplam bir puan verildi. Tablo Agarwal et al. 201311'in izniyle uyarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneysel hayvan modelleri, hastalık patogenezini incelemek ve yeni terapötik paradigmaların klinik öncesi testlerini incelemek için gerekli araçlardır. Bu protokolde, göz içi inflamatuar üveitin deneysel bir modeli olan EAU'yu indüklemek, izlemek ve puanlamak için bir metodolojiyi tartıştık. Bu EAU modeli, tüm prosedürler burada özetlenen protokole göre yapıldığında hastalık insidansı% 95'ten fazladır ve kronik, monofazik EAU'nun gelişmesiyle sonuçlanır. Bu insidans seviyesine ulaşmak için, her ikisi de yukarıda ayrıntılı olarak açıklanan antijen hazırlama ve emülsiyon enjeksiyonunun önemini vurguluyoruz. Hayvanlarda EAU'nun temel özellikleri retina ve/veya koroidal inflamasyon, retina vasküliti, fotoreseptör yıkımı ve görme kaybıdır ve bunların hepsi insan posterior üveitinin birçok temel klinikopatolojik özelliğini temsil eder12. Üveitte yer alan temel hücresel ve moleküler mekanizmaların anlaşılmasının çoğu, burada açıklandığı gibi indüklenmiş EAU modelinden türetilmiştir. EAU farelerde13 ve sıçanlarda11 lenfositler tarafından tanınan retinal antijenlerle aktif immünizasyon yoluyla indüklenebilir. Bu retinal antijenler birçok form alır; IRBP (fareler için) veya sıçanlar için retinada çözünür antijen (S-Ag). Bir C57BL / 6J arka planında EAU'yu indüklemek, hastalığın daha kronik bir formunu oluşturur ve aşılamadan üç hafta sonra gözlenen pik patoloji görülür. Buna karşılık, retinal antijenin bir B10RIII arka plan14'e uygulanması, zirve patolojisinin tipik olarak indüksiyondan sonraki iki hafta içinde ortaya çıktığı ve hastalığın 3. haftaya kadar azaldığı akut-monofazik ve klinik olarak şiddetli bir EAU formunu indükler.
C57BL / 6J farelerde farklı IRBP epitopları test edilmiştir ve IRBP1-20 peptidinin yüksek insidans ve şiddet seviyelerine sahip tekrarlanabilir bir model olduğu kanıtlanmıştır. Son zamanlarda IRBP'nin yeni bir uveitojenik epitopu, insan IRBP'sinin 651 ila 670 amino asit kalıntılarının, daha yüksek klinik insidans ve ciddi hastalık tezahürü11 ile EAE'yi indüklediği bildirilmiştir ve bunun bilimsel hedefleri karşılaması durumunda tercih edilebilir. Bağırsak kommensal mikrobiyotasının etkisinin ve otoreaktif T hücre reseptörlerinin (TCR'ler) aktivasyonunun, farklı antijenler15 uygulanırken hastalığın başlangıcına müdahale ettiği bilindiğinden, bu alanda yeni başlayanlar için güvenilir bir model elde etmek için 300-500 μg arasında titre edilmiş bir dozda hIRBP1-20 veya hIRBP651-670 peptitleri kullanmalarını öneririz. Gerçekten de, bu modeldeki değişkenlik, barınma sistemleri ile mikrobiyom arasındaki farklılıkların önemini vurgulayan raporlarla başka yerlerde belgelenmiştir ve bu da hastalığın şiddetini ve insidansını etkileyebilir15. Bu nedenle, az ya da çok peptid antijeni ve boğmaca toksini gerekebilir.
Tarif ettiğimiz analizin yapılabileceği bir dizi başka model var. Bunlar, oküler inflamasyonun16 haftalıkken geliştiği IRBP T hücre reseptörü (TCR) transgenik (R161H) farelerde ilerleyen spontan üveiti içerir. EAU ayrıca uveitojenik efektör CD4 + T hücrelerinin aktarılmasıyla da uyarılabilir. Aktive edilmiş, astarlanmış farelerden türetilen IRBP'ye özgü CD4 + T hücreleri, efektör hücrelerin kaynağı olarak kullanılabilir 3,11. Bu model, indüklenebilir modelde CFA kullanmanın karmaşıklığından kaçınırken, hastalığın efektör fazını temsil eder.
Buna ek olarak, oküler inflamatuar modelleri, diğer enflamatuar hastalıkları, özellikle de efektör Th1 ve Th17 alt kümesi patolojisi olanları araştırmak için uygun araçlar olarak kullanmanın birçok avantajı vardır. Bu modeli kullanmanın başlıca avantajları, fundoskopi ve anjiyografi olan hastalık gelişimini ve ilerlemesini izlemek için invaziv olmayan ve ölçülebilir yöntemlerdir. Bu non-invaziv görüntüleme sistemleri, aksi takdirde koruyucu anatomik bariyerlerin arkasına gizlenecek olan nöronal dokulara kolay erişim sağlar. Hastalığın ilerlemesini izlemek için ek yöntemler, özellikle EAU başlangıcının erken aşamasında, hücresel infiltrasyonların saptanmasında fundoskopik görüntülemeden daha hassas olan OCT görüntülemenin uygulanmasını içerir. Bu teknik, retinanın uzunlamasına ve non-invaziv bir şekilde çok katmanlı çapraz ve yatay kesitsel görselleştirmelerine izin verir. İn vivo OCT görüntüleme, fundoskopik ve histolojik incelemelerle elde edilemeyen retina kalınlığı hakkında bilgi ekler17. Giderek artan bir şekilde, adaptif optik taramalı lazer oftalmoskopi ve multimodal görüntüleme araçları gibi daha sofistike non-invaziv görüntüleme tekniklerinin mevcudiyeti, bu hastalığı küçük kemirgenlerde araştırma kapasitemizi daha da artıracaktır. Ayrıca, immünofenotiplerin daha derin analizi için yerleşik ve sızan hücre popülasyonlarını disseke etme ve izole etme yeteneği, akış sitometi gibi teknikleri kullanarak, anlayışlı bilgi sunmak için büyük fırsatlar sunar.
Fnonoskopi8,9,18'den elde edilen klinik kriterlere dayanan birkaç yerleşik skorlama sistemi vardır. Bunlar oftalmoloji araştırma merkezleri arasında biraz farklılık gösterse de, hepsi güvenilirdir, histopatolojik özelliklerle ilişkilidir ve hastalığın ciddiyetini doğru bir şekilde yansıtabilir. Bu çalışmada, Xu ve ark.8 tarafından geliştirilen puanlama sistemine atıfta bulunuyoruz. Bu sistem, daha fazla sayıda klinik ölçüm parametresi ile daha ayrıntılı bir değerlendirme yaklaşımı sunar. Puanlama için maksimum 5 ile sınırlı alternatif sistemlerden daha geniş bir pencere açan maksimum 20 puandan oluşur. Bu, terapötik yaklaşımlar içinde daha fazla araştırma için daha önemlidir. Bununla birlikte, operatör hatasını en aza indirmek, bu kadar rafine ve ayrıntılı bir parametre kümesi kullanıldığında kritik öneme sahiptir ve operatörün dikkatli bir şekilde eğitilmesini ve yorumun bağımsız olarak doğrulanmasını gerektirebilir.
Burada, kadın C57BL / 6 farelerde EA'yı indüklemek için bir protokol sunuyoruz, çünkü kadınların insidansında artış var: klinik ortamda üveit ile başvuran erkekler 1.4: 1. Bununla birlikte, otoimmün hastalığı indüklemek için kullanılan farelerin cinsiyeti, sitokin ortamı11'i etkileyebileceği ve ayrıca terapötik müdahaleye cevap verme şekillerinde önemli farklılıklar ortaya çıkarabileceği için düşünülmelidir. Diğer bir husus, farelerin hastalık indüksiyonundaki yaşıdır. Örneğin, B10RIII farelerde duyarlılığın yaşa bağımlılığını inceledik ve 8 haftalık yaşamın üzerindeki farelerin daha düşük bir EAU insidansına sahip olduğu sonucuna vardık (grubumuzdan yayınlanmamış çalışma).
Sonuç olarak, göz içi hastalığının hayvan modelleri, insan posterior üveitini incelemek için paha biçilmez bir araç sağlamış ve CsA gibi yeni tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Bununla birlikte, hiçbir hayvan modeli kendi başına insan üveitinin tüm spektrumunu yeniden üretmez, çünkü her biri hastalığın belirli yönlerini incelemek için uygun kılan benzersiz özelliklere sahiptir. Bu EAU modeli, doğuştan gelen immün yanıtları tetikleyen adjuvanlarla desteklenmiş IRBP peptidinin uygulanması yoluyla otoimmünite ile indüklenir. Bununla birlikte, insanlarda posterior üveitin tüm formlarının otoimmün olup olmadığı ve antijenik taklitçiliğin tetikleyici bir faktör olup olmadığı bilinmemektedir. Ek olarak, insan üveitini tetiklemede enfeksiyonla bir ilişki olup olmadığı açık değildir. Bununla birlikte, burada açıklanan model, bu görmeyi tehdit eden hastalığın etiyolojisi, patogenezi ve tedavisi ile ilgili yararlı bilgiler toplamak için kullanılabilecek yararlı ve tekrarlanabilir bir jenerik modeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bu eserle beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
JG, CB'yi desteklemek için UCL Etki Öğrenciliği ve Rosetrees Trust fonu ile ödüllendirildi. VC, Akari Therapeutics Inc.'den bir araştırma işbirliği hibesi alıyordu. UCL Oftalmoloji Enstitüsü, Biyolojik Hizmet Birimi, özellikle Bayan Alison O'Hara ve ekibine teknik destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V.
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
