Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka effekterna av hydraulisk sprickbildning på närliggande vattendrag genom att analysera deras vatten- och sedimentmikrobiella samhällen.
Abstract
Hydraulisk spräckning (HF), vanligen kallad "fracking", använder en blandning av högtrycksvatten, sand och kemikalier för att bryta stenar och släppa ut olja och gas. Denna process revolutionerade den amerikanska energiindustrin, eftersom den ger tillgång till resurser som tidigare var ouppnåeliga och nu producerar två tredjedelar av den totala naturgasen i USA. Även om frackning har haft en positiv inverkan på den amerikanska ekonomin, har flera studier belyst dess skadliga miljöeffekter. Särskilt oroande är frackningens inverkan på vattendrag, som är särskilt viktiga på grund av deras oproportionerligt stora inverkan på hela vattendelarens hälsa. Bakterierna i dessa strömmar kan användas som indikatorer på strömhälsa, eftersom bakterierna som finns och deras överflöd i en störd ström förväntas skilja sig från dem i en annars jämförbar men ostörd ström. Därför syftar detta protokoll till att använda bakteriesamhället för att avgöra om strömmar har påverkats av frackning. I detta syfte måste sediment- och vattenprover, från bäckar nära frackning (potentiellt påverkade) och uppströms eller i en annan vattendelare av frackningsaktivitet (obehindrat) samlas in. Dessa prover utsätts sedan för nukleinsyraextraktion, biblioteksberedning och sekvensering för att undersöka mikrobiell samhällssammansättning. Korrelationsanalys och maskininlärningsmodeller kan därefter användas för att identifiera vilka funktioner som är förklarande för variation i samhället, samt identifiering av prediktiva biomarkörer för frackning. Dessa metoder kan avslöja en mängd olika skillnader i de mikrobiella samhällena mellan huvudvattenströmmar, baserat på närheten till frackning, och tjäna som grund för framtida undersökningar om frackningens miljöpåverkan.
Introduction
Hydraulisk spräckning (HF), eller "fracking", är en metod för naturgasutvinning, som har blivit allt vanligare i takt med att efterfrågan på fossila bränslen fortsätter att öka. Denna teknik består av att använda högeffektiv borrutrustning för att injicera en blandning av vatten, sand och kemikalier i metanrika skifferfyndigheter, vanligtvis för att frigöra fångade gaser1.
Eftersom dessa okonventionella avverkningsmetoder är relativt nya är det viktigt att undersöka effekterna av sådana metoder på närliggande vattenvägar. Frackningsverksamhet kräver röjning av stora landområden för utrustningstransport och brunnsdynakonstruktion. Cirka 1,2-1,7 hektar mark måste röjs för varje brunnsdyna2, vilket kan påverka avrinningen och vattenkvaliteten i systemet3. Det råder brist på transparens kring den exakta kemiska sammansättningen av frackningsvätska, inklusive vilka biocider som används. Dessutom tenderar fracking avloppsvatten att vara mycket saltlösning2. Dessutom kan avloppsvattnet innehålla metaller och naturligt förekommande radioaktiva ämnen2. Därför är risken för läckor och spill av frackningsvätska på grund av mänskliga fel eller utrustningsfel oroande.
Vattendragsekosystem är kända för att vara mycket känsliga för förändringar i omgivandelandskap 4 och är viktiga för attupprätthålla biologisk mångfald 5 och korrektnäringscykling 6 inom hela vattendelaren. Mikrober är de vanligaste organismerna i sötvattenströmmar och är därför viktiga för näringscykling, biologisk nedbrytning och primärproduktion. Mikrobiell samhällssammansättning och funktion fungerar som bra verktyg för att få information om ekosystemet på grund av deras känslighet för besvär, och ny forskning har visat tydliga förändringar i observerade bakteriella sammansättningar baserade på närhet till frackningsaktivitet7,8. Till exempel identifierades Beijerinckia, Burkholderiaoch Methanobacterium som berikade i strömmar nära fracking medan Pseudonocardia, Nitrospiraoch Rhodobacter berikades i strömmarna inte nära fracking7.
Nästa generations sekvensering av 16S ribosomal RNA (rRNA) genen är en prisvärd metod för att bestämma bakteriell samhällssammansättning som är snabbare och billigare än hela genomsekvenseringsmetoder9. En vanlig praxis inom molekylär ekologi är att använda den mycket varierande V4-regionen i 16S rRNA-genen för sekvenseringsupplösning, ofta ner till släktnivån med ett brett omfång av identifiering9, eftersom det är idealiskt för oförutsägbara miljöprover. Denna teknik har implementerats i stor utsträckning i publicerade studier och har framgångsrikt använts för att identifiera frackningsåtgärders inverkan på vattenmiljöer7,8. Det är dock värt att notera att bakterier har varierande kopieringsnummer av 16S rRNA-genen, vilket påverkar deras upptäckta överflöd10. Det finns några verktyg för att ta hänsyn till detta, men deras effektivitet är tvivelaktig10. En annan praxis som snabbt växer i prevalens och saknar denna svaghet är metatranscriptomic sekvensering, där allt RNA är sekvenserat, så att forskare kan identifiera både aktiva bakterier och deras gener uttryck.
I motsats till metoder i tidigare publicerade studier7,8,11,12, omfattar detta protokoll därför också provtagning, bevarande, bearbetning och analys för undersökning av mikrobiell samhällsfunktion (metatranscriptomics). Stegen som beskrivs häri gör det möjligt för forskare att se vilken inverkan, om någon, frackning har haft på gener och vägar uttryckta av mikrober i sina strömmar, inklusive antimikrobiella resistensgener. Dessutom förbättras den detaljnivå som presenteras för provtagning. Även om flera av stegen och anteckningarna kan tyckas uppenbara för erfarna forskare, kan de vara ovärderliga för dem som just börjat forskningen.
Häri beskriver vi metoder för provtagning och bearbetning för att generera bakteriegenetiska data som ett sätt att undersöka frackningens inverkan på närliggande bäckar baserat på våra labbs flera års erfarenhet. Dessa data kan användas i nedströmsapplikationer för att identifiera skillnader som motsvarar frackningsstatus.
Protocol
1. Insamling av sedimentprover för extraktion av nukleinsyra
- Dränk ett sterilt 50 ml koniskt rör i strömvattnet. Använd handskar under provtagning för att undvika att införa oönskad mänsklig kontaminering. Utför detta steg antingen från stranden eller uppåtströms om det är i vattnet.
- Medan det koniska röret är nedsänkt, ta bort locket och använd det för att skopa cirka 3 ml sediment från ett djup av 1 till 3 cm i det koniska röret.
- Ta bort det koniska röret från vattnet och dumpa ut allt vatten, med undantag för ett tunt skikt som täcker sedimentprovet (ca 1 ml).
- Använd en 1000 μL pipett och lämpliga pipettspetsar och tillsätt 3 ml DNA/RNA-konserveringsmedel (se materialförteckning för konserveringsspecifikationerna) i det insamlade provet. Förvara pipettspetsarna i en steril pipettspetslåda och fäst dem först omedelbart före användning och kassera dem efter användning. Vänd det kapade koniska röret 10 gånger för att säkerställa att konserveringsmedlet och provet blandas noggrant.
OBS Steg 1.4 är inte nödvändigt, men det rekommenderas starkt om RNA ska extraheras från sedimenten senare. - Placera proverna på is för resten av provtagningen. När proverna returneras från uppsamlingen ska de förvaras i en frys vid -20 °C om proverna ska användas för 16S-analys (DNA) eller -70 °C, om de ska användas för metatranscriptomisk analys (RNA).
2. Filteruppsamling för extraktion av nukleinsyra
- Ta bort locket på en steril 1 L-flaska. När du vetter uppåtströms eller från stranden, fyll flaskan med strömmande vatten till toppen och dumpa den sedan ut. Upprepa denna process ytterligare två gånger för att konditionering av flaskan. Fyll hela flaskan en fjärde gång och kapa den.
OBS: Om du återanvänder en 1 L-flaska kan den steriliseras genom sköljning med 10% blekmedel i 2 minuter, följt av sköljning tre gånger med avjoniserat vatten och sedan en gång med 70% etanol och slutligen autoklavering med inställningar: 30 min exponeringstid vid 121,1 °C och 15 min torktid. Vid automatisk korrigering bör locket på flaskan vara mycket löst för att undvika att flaskan komprimeras i processen. - En gång på en stabil yta, använd en steril Luer låsspruta och dra upp en full volym. Anslut sedan sprutan till ett sterilt och DNA/RNA-fritt polyeterulfonfilter med en diameter på 1,7 cm med en porstorlek på 0,22 μm och tryck hela volymen genom filtret genom att trycka kolven hela vägen ner. Upprepa denna process tills den totala volymen som samlas in i flaskan (1 L) trycks genom filtret.
OBS: Sprutans volym kan varieras om den totala mängden vatten som trycks genom filtret spåras. I allmänhet är dock 60 ml att föredra. Medan 1 L är idealiskt, anekdotiskt, skulle en volym på minst 200 ml sannolikt fortfarande samla tillräckligt med biomassa (förutsatt ~ 20 000 celler per ml) för utvinning av DNA och RNA. - Ta bort överflödigt vatten från filtret genom att dra upp ungefär 20 ml luft i sprutan och trycka den genom filtret.
OBS: Detta hjälper till att förhindra förlust av konserveringsmedlet om steg 2.4 utförs. - Använd en P1000 mikropipett, tillsätt 2 ml dna/RNA-konserveringsmedel genom att ladda ur det genom filtrets större öppning (där det var fäst vid sprutan) samtidigt som filtret hölls horisontellt. Pipettens spets ska vara inom filtrets pipa när pipetten trycks ned för att säkerställa att konserveringsmedlet kommer in i filtret. Byt tips efter varje användning.
OBS: Som med sedimentuppsamlingen är detta steg inte nödvändigt, men det rekommenderas starkt för ökad nukleinsyrautbyte senare, särskilt för RNA. - Skala av en kvadrat paraffinfilm och linda den tätt runt varje öppning/ände av filtret för att försegla. Placera paraffinfilmen inlindad i en steril provpåse och lägg sedan hela påsen på is under insamlingen.
OBS: Se till att den sida som används för att linda filtret är steril, dvs. - Vid retur från provtagningen ska filter förvaras vid -20 °C för 16S eller -70 °C för meta-transkriptomik.
3. Extraktion och kvantifiering av nukleinsyra
- Rengör arbetsområdet med 10% blekmedel och 70% etanol innan provöverföring påbörjas.
- För sediment (från steg 1,5), använd i allmänhet ~ 0,25 g prov. Flamma steriliserar ett metallverktyg genom att doppa det i en bägare på 70% etanol och bränna av etanolen mellan proverna.
- För filter (från steg 2.6) flyttar du filterpapperet till ett sterilt rör för extraktion. För att göra det, följ stegen nedan.
- Skapa en steril, DNA- och RNA-fri yta genom att vika aluminiumfolie så att den inre delen av vikningen inte utsätts för utemiljön och automatiskt automatiskt väver den vikta biten med inställningarna: 121,1 °C och 5 min torktid.
- Sterilisera ett vise-grepp med 70% etanol och öppen låga. Använd sedan vise-greppet för att bryta upp filterhöljet på den sterila ytan och ta bort kärnan från höljet.
- Använd en steril skalpell för att skära bort filterpapperet från kärnan genom att skära upptill och nedtill och sedan längs sömmen. Vik filterpapperet med sterila pincett och skär sedan filtret i små bitar med skalpellen.
- Placera filterbitarna i ett mikrocentrifugrör för extraktion. Se till att filterpapperet inte kommer i kontakt med ytor som inte är steriliserade eller som kan ha nukleinsyra närvarande, eftersom detta skulle leda till oönskad förorening av provet.
- Utför DNA-isolering enligtbeskrivningen tidigare 13 eller genom att använda ett kommersiellt tillgängligt kolumnbaserat kit (se Materialförteckning ). Stegen för det kommersiella kit som listas beskrivs kortfattat nedan.
- Lysa cellerna i provet genom att överföra det till ett pärlrör och utsätta det för en cellstörare i hög hastighet i minst 5 minuter. Centrifug och överför supernatanten till ett sterilt mikrocentrifugrör.
- Tillsätt lysbufferten i supernaten (1:1 volym) och överför till det medföljande filtret (gult). Centrifug filtret.
- Överför filtret till ett nytt sterilt mikrocentrifugrör. Tillsätt preparatbufferten (400 μL), centrifug och kassera flödet igenom.
- Tillsätt tvättbuffert (700 μL), centrifugera och kassera flödet genom. Tillsätt sedan tvättbuffert (400 μL), centrifugera och kassera flödet igen.
- Överför filtret till ett nytt sterilt mikrocentrifugrör. Elute med 50 μL DNase/RNase fritt vatten och låt sitta i 5 min vid rumstemperatur innan centrifugering.
- Under denna under kubationsperioden, förbered III-HRC-filtret genom att placera det i ett uppsamlingsrör och tillsätt HRC-preplösningen (600 μL) till den, följt av ett centrifugeringssteg på 3 min vid 8 000 x g.
- Flytta det beredda filtret till ett sterilt mikrocentrifugrör. Överför det eluterade DNA:t från steg 3.4.5 till detta filter och centrifug vid 16 000 x g i 3 minuter. Flödet genom innehåller det extraherade DNA:t.
- Lagra DNA-extrakt för både sediment och filter vid -20 °C.
OBS: DNA-extrakt kan lagras i cirka 8 år vid -20 °C under förutsättning att stabil temperatur, begränsad ljusexponering och inga skadliga föroreningar14. - Utför RNA-isolering enligt tillverkarens protokoll. Lagra RNA-extrakt vid -80 °C.
- Lysa cellerna i provet genom att överföra det till ett pärlrör och utsätta det för en cellstörare i hög hastighet i minst fem minuter. Centrifug och överför supernatanten till ett sterilt mikrocentrifugrör.
- Tillsätt lysbufferten i supernaten (1:1 volym) och överför till den medföljande kolumnen (gul). Centrifuga kolonnen.
- Tillsätt en lika stor volym på 95-100% etanol till flödet genom och blanda genom att leda upp och ner fem gånger.
- Placera IICG-kolonnen (grön) på ett sterilt mikrocentrifugrör. Överför den blandade lösningen till kolonnen och centrifugen.
- Tillsätt tvättbuffert (400 μL), centrifugera och kassera flödet genom.
- Tillsätt 5 μL DNase I och 75 μL DNA-rötningsbuffert till kolonnen och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Tillsätt förberedelsebuffert (400 μL), centrifugera och kassera flödet igenom.
- Tillsätt tvättbuffert (700 μL), centrifugera och kassera flödet genom. Tillsätt sedan tvättbuffert (400 μL), centrifugera och kassera flödet igen.
- Överför kolonnen till ett nytt sterilt mikrocentrifugrör. Elute med 50 μL DNase/RNase fritt vatten och låt sitta i 5 minuter innan centrifugering.
- Under inkubationsperioden bereder du III-HRC-filtret genom att placera det i ett uppsamlingsrör och tillsätta HRC-preplösningen (600 μL) till den, följt av ett centrifugeringssteg på 3 min vid 8 000 x g.
- Flytta det beredda filtret till ett sterilt mikrocentrifugrör. Överför det eluterade RNA från steg 3.6.9 till detta filter och centrifugera vid 16 000 x g i 3 min. Flödet genom innehåller det extraherade RNA.
OBS: RNA-extrakt kan endast lagras i ett år innan de börjarförsämras 15. Både DNA och RNA extrakt bryts ned genom upprepad frysning-upptining. Vissa protokoll möjliggör extraktion av både DNA och RNA från samma prov16,17.
- Kvantifiera de extraherade DNA- och RNA-proverna med hjälp av en fluorometer eller en spektrofotometer. Se tabell 1, t.ex. fluorometer-DNA-koncentrationsvärden. Ett exempel på kvantifieringsprotokoll för spektrofotometer finns i referens18. Sediment-DNA-koncentrationsvärden med det kit som anges i materialförteckningen varierar i allmänhet från 1 till 40 ng/μL, medan filter-DNA-koncentrationsvärden tenderar att variera från 0,5 till 10 ng/μL. Sediment RNA-koncentrationsvärden med satsen som anges i materialförteckningen varierar i allmänhet från cirka 1 till 20 ng/μL, medan filter RNA-koncentrationsvärden tenderar att vara lägre, vanligtvis från 0,5 till 5 ng/μL.
4. 16S rRNA biblioteksskapande
- Rengör arbetsområdet med 10% blekmedel och 70% etanol. Arbetsområdet bör vara ett slutet utrymme som kan producera laminära flödesförhållanden (laminär flödeshuv).
- Använd DNA-extrakten (från steg 3.5) och förbered prover för 16S rRNA amplicon sekvensering med ett standard PCR-protokoll, såsom det som beskrivs på Earth Microbiomes webbplats som förstärker V4 hypervariabel region med 16S rRNA19 under laminära flödesförhållanden.
- Förbered en 2% agarose gel som beskrivits tidigare och låt den stelna17. Blanda 7 μL PCR-produkt och 13 μL DNase fritt vatten. Tillsätt ett gelbelastningsfärgämne till en slutlig koncentration av 1x. När agarose är stelnad, ladda denna PCR-produktblandning på en 2% agarose gel.
OBS: Alternativt kan en förgjuten gel användas istället, eftersom dessa geler går snabbare och kommer förgjorda. - Kör gelén på 90 V i 60-90 min för att kontrollera bandstorleken på 386 som framgångsrik förstärkning för 16S rRNA V4-ampliconer, med hjälp av Earth Microbiomes protokoll.
5. DNA 16S rRNA biblioteksrening
- Pool 10 μL PCR-produkter för de prover som gav ljusa band och 13 μL för de prover som gav svaga band i ett sterilt mikrocentrifugrör i lämplig storlek.
- Kontrollera koncentrationen av den resulterande poolen med hjälp av en fluorometer eller spektrofotometer och förbered en 2% agarose gel som tidigare. Helst bör poolen ha en koncentration på minst 10 ng/μL, och de flesta prover borde ha haft en koncentration på cirka 25 ng/μL.
- Koncentration och volym tillåter, ladda runt 150-200 ng i en brunn på 2% agarose gel.
- Kör gelén i 60-90 min på 90 volt.
- Rena det poolade biblioteket genom att köra en 2% agarose gel.
- Ta bort DNA-bandet på 386 bp från gelén och rena det poolade biblioteket med ett kommersiellt tillgängligt kit enligt beskrivningen tidigare20. Eluera det renade DNA:t med 30 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8,5). Utför detta steg i ett annat område än DNA- eller RNA-extraktion för att förhindra framtida förorening, eftersom skärning av gelén kommer att sprida PCR-ampliconer på både experimenteraren och det omgivande området.
- Kontrollera koncentrationen av den renade poolen med hjälp av en fluorometer eller spektrofotometer. Om reningen gick bra bör koncentrationen vara minst hälften av den oanvända poolens. I allmänhet bör den slutliga koncentrationen variera från 5 till 20 ng/μL.
- Skicka de renade biblioteken för nästa generations sekvensering. Se till att de hålls kalla under transporten genom att inkludera torris i fraktcontainern.
6. SKAPANDE och rening av RNA-bibliotek
- Flera kommersiella kit kan användas för att skapa RNA-bibliotek. För vilken som används, följ tillverkarens protokoll som skrivet medan du arbetar i en steril laminär flödesmiljö. En mycket sammanfattad version av protokollet för kit i materialförteckningen presenteras nedan21.
- Gör den första sträng cDNA-syntesen master mix (8 μL nukleasfritt vatten och 2 μL av First Strand Synthesis Enyzme Mix) och tillsätt den i provet. Placera provet i termocyklisten med de villkor som anges i protokollet.
- Gör den andra strängen cDNA syntes master mix (8 μL av andra strängsyntes reaktionsbuffert, 4 μL andra strängsyntes enzymblandning och 48 μL nukleasfritt vatten) på is och tillsätt den till provet. Placera i en termocyklist inställd på 16 °C i en timme.
- Rena reaktionen genom att tillsätta de medföljande pärlorna (144 μL) och utföra två 80% etanoltvättar (200 μL).
- Elute med den medföljande TE-bufferten (53 μL) och överför 50 μL av supernatanten till ett rent PCR-rör. Placera PCR-röret på is.
- Gör slutpreparatets huvudblandning (7 μL av end prep reaktionsbuffert och 3 μL end prep enzymblandning) på is och lägg den i PCR-röret. Placera PCR-röret i en termocyklist med de villkor som anges i protokollet.
- Blanda lösningarna Diluted Adapter (2,5 μL), Ligation Master Mix (30 μL) och Ligation Enhancer (1 μL) på is. Tillsätt de blandade lösningarna i provet och placera i en termocyklist i 15 min vid 20 °C.
- Rena reaktionen genom att tillsätta de medföljande pärlorna (87 μL) och utföra etanoltvättar (200 μL) och eluering som tidigare, förutom att bara lägga till 17 μL TE.
- Lägg till index (10 μL) och Q5 Master Mix (25 μL) -lösningen och placera den i en termocyklist med de villkor som beskrivs i protokollet.
- Rena reaktionen genom att tillsätta de medföljande pärlorna (45 μL) och utföra ytterligare två etanoltvättar (200 μL) och eluera med 23 μL TE. Överför 20 μL till ett rent PCR-rör.
- Kontrollera biblioteken för detekterbara koncentrationer av RNA med hjälp av en Bioanalyzer, fluorometer eller spektrofotometer.
- Slå samman de metatranscriptomic biblioteken i ett ungefärligt equimolar förhållande.
- Rena biblioteket enligt samma protokoll för 16S-bibliotekets rening, förutom punktskattefragment mellan 250 och 400 bp. Medan 16S-biblioteket hade ett distinkt band som representerade den förstärkta regionen, är resultatet här ett smutskastning.
- Kontrollera koncentrationen av det renade biblioteket som tidigare.
- Skicka det renade biblioteket med torris till en sekvenseringsanläggning.
OBS: Alternativt kan RNA-extrakt skickas till ett universitet eller privat företag för biblioteksförberedelse och sekvensering.
7. Mikrobiell samhällsanalys
- När sekvenseringen är klar får du åtkomst till exempeldata. Ladda ner den till en användbar dator.
Obs: Helst bör enheten ha minst 16 gigabyte RAM. En diskussion om datorkrav (för Qiime2) finns i https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808. - Använd programvara, till exempel mothur, QIIME2 och R, för att analysera 16S rRNA-data. Se här https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ exempel QIIME2 16S analyshandledning.
- För metadata från metatranscriptomics (RNA) använder du HUMAnN2 och ATLAS för att avgöra vilka gener och vägar som finns i proverna.
OBS: Ett exempel på metatranscriptomics pipeline som kulminerar i mångfald och slumpmässig skogsanalys presenteras i filen Kompletterande information. Alla kommandon körs via kommandoraden, t.ex. Terminal för Mac-användare.
Representative Results
Framgången för DNA- och RNA-extraktioner kan utvärderas med hjälp av en mängd olika utrustningar och protokoll. I allmänhet anses varje påvisbar koncentration av endera vara tillräcklig för att dra slutsatsen att extraktionen var framgångsrik. Att undersöka tabell 1 då, alla extraktioner, förutom en, skulle kallas framgångsrika. Misslyckande i detta steg beror ofta på låg initial biomassa, dåligt provbevarande eller mänskliga fel under extraktionen. När det gäller filter kan extraktionen ha varit framgångsrik även om koncentrationen är under detektion. Om dessa extrakt inte ger band för PCR (om de gör 16S) eller en detekterbar koncentration efter biblioteksberedning (metatranscriptomics), så misslyckades de sannolikt verkligen.
Om 16S-protokollet följs indikerar ljusa band efter PCR-förstärkning, som ses i brunnarna 4 och 6 i figur 1, framgång, medan brist på band, som ses i de andra brunnarna i den översta raden, indikerar misslyckande. Dessutom skulle ett ljust band i gelbanan som innehåller en negativ PCR-kontroll också tyda på ett fel, eftersom det skulle vara riskabelt att anta att den förorening som påverkar de negativa kontrollerna inte påverkade proverna.
För både 16S- och metatranscriptomik kan sekvenseringens framgång utvärderas genom att titta på antalet erhållna sekvenser (figur 2). 16S-prover bör ha minst 1 000 sekvenser, och minst 5 000 är idealiska (figur 2A). På samma sätt bör metatranscriptomiska prover ha minst 500 000 sekvenser, och minst 2 000 000 är idealiska (figur 2B). Prover med färre sekvenser än dessa minimiprover bör inte användas för analyser, eftersom de kanske inte korrekt representerar deras bakteriesamhälle. Prover som faller mellan minimi och ideal kan dock fortfarande användas, även om resultaten bör tolkas mer försiktigt om många prover faller inom detta intervall.
Framgången för efterföljande nedströmsanalys kan fastställas helt enkelt på grundval av om de förväntade utdatafilerna erhölls eller inte. I vilket fall som helst bör program, såsom QIIME2 och R (figur 3), möjliggöra utvärdering av potentiella betydande skillnader mellan bakteriesamhällena baserat på frackning. Uppgifterna för figur 3 erhölls genom insamling av sedimentprover från 21 olika platser vid tretton olika bäckar för 16S- och metatranscriptomikanalys. Av dessa 21 anläggningar var tolv av dem nedströms frackningsverksamhet och klassificerades som HF+, och nio av dem var antingen uppströms frackningsverksamhet eller i en vattendelare där frackning inte förekom. Dessa strömmar klassificerades som HF-. Förutom förekomsten av frackningsaktivitet var strömmarna annars jämförbara.
Dessa skillnader kan ske i form av konsekventa kompositionsförskjutningar baserade på frackningsstatus. Om så vore fallet skulle HF+- och HF-prover förväntas samlas vid sidan av varandra i ett PCoA-område, vilket är fallet i figur 3A och figur 3B. För att bekräfta att dessa uppenbara förändringar inte bara är en artefakt av ordinationsmetoden behövs ytterligare statistisk analys. Till exempel visade ett PERMANOVA22-test på avståndsmatrisen som figur 3A och figur 3B bygger på betydande kluster baserat på frackningsstatus, vilket innebär att separationen som observerats i området överensstämmer med skillnader mellan provernas bakteriesamhällen, i stället för en artefakt av ordination. Ett betydande permanova- eller ANOSIM-resultat är en stark indikation på konsekventa skillnader mellan HF+ och HF- prover, vilket skulle tyda på att HF+-proverna påverkades av frackning, medan ett högt p-värde skulle tyda på att proverna inte påverkades. Metatranscriptomic data kan också visualiseras och utvärderas med samma metoder.
Att undersöka differentiella egenskaper (mikrober eller funktioner) kan avslöja bevis för att prover också har påverkats. En metod för att bestämma differentiella funktioner är att skapa en slumpmässig skogsmodell. Den slumpmässiga skogsmodellen kan användas för att se hur väl provernas frackningsstatus kan klassificeras korrekt. Om modellen presterar bättre än förväntat av en slump skulle det vara ytterligare bevis på skillnader beroende på frackningsstatus. Dessutom skulle de viktigaste prediktorerna avslöja vilka egenskaper som var viktigast för att korrekt differentiera prover(figur 3C). Dessa egenskaper skulle då också ha haft konsekvent olika värden baserade på frackningsstatus. När dessa differentierade funktioner har fastställts kan litteraturen granskas för att se om de tidigare har associerats med fracking. Det kan dock vara utmanande att hitta studier som bestämde differentiella funktioner, eftersom de flesta bara har använt 16S rRNA-kompositionsdata. För att utvärdera konsekvenserna av differentiella funktioner skulle därför en möjlig metod vara att se om de tidigare har associerats med potentiell resistens mot biocider som vanligen används i frackningsvätska eller om de skulle kunna bidra till att tolerera mycket saltlösningsförhållanden. Att undersöka den funktionella profilen för en taxon av intresse skulle dessutom kunna avslöja bevis för frackings inverkan (figur 3D). Om till exempel en taxon identifieras som differentiär genom den slumpmässiga skogsmodellen kan dess antimikrobiella resistensprofil i HF+-prover jämföras med dess profil i HF- prover och om de skiljer sig mycket kan det tyda på att frackningsvätska som innehåller biocider kom in i strömmen.
| ExempelID | Koncentration (ng/μL) |
| 1 | 1.5 |
| 2 | 1.55 |
| 3 | 0.745 |
| 4 | 0.805 |
| 5 | 7.82 |
| 6 | 0.053 |
| 7 | 0.248 |
| 8 | 0.945 |
| 9 | 1.82 |
| 10 | 0.804 |
| 11 | 0.551 |
| 12 | 1.69 |
| 13 | 4.08 |
| 14 | Below_Detection |
| 15 | 7.87 |
| 16 | 0.346 |
| 17 | 2.64 |
| 18 | 1.15 |
| 19 | 0.951 |
Tabell 1: Exempel på DNA-koncentrationer baserade på fluorometer 1x DS DNA högkänslighetsanalys. Extraktioner för alla dessa prover, med undantag för 14, skulle anses vara framgångsrika på grund av att de har påvisbara mängder DNA.
Bild 1: Exempel e-gel med PCR-produkter. Gelén var förfläckad och visualiserades under ett UV-ljus, vilket fick alla DNA som finns på den att glöda. PCR fungerade för proverna i brunnarna 4 och 6 i första raden, eftersom de båda hade ett enda ljust band av förväntad storlek (baserat på stegen). PCR för proverna i de andra sex brunnarna misslyckades, eftersom de inte gav några band. Den positiva kontrollen (första brunnen, andra raden) hade ett ljust band, vilket indikerar att PCR utfördes korrekt, och de negativa kontrollerna (brunnarna 6 och 7, andra raden) hade inga band, vilket indikerar att proverna inte var förorenade. Om ett negativt hade ett band som var lika ljust som proverna, skulle PCR ha ansetts vara ett misslyckande eftersom det skulle vara riskabelt att anta att proverna hade ampliconer som inte bara var resultatet av förorening. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Antaletexempelsekvenser. Nästan alla dessa 16S-prover hade över 1000 sekvenser. De mycket få som hade mindre än 1 000 sekvenser bör uteslutas från nedströmsanalyser, eftersom de inte hade tillräckligt med sekvenser för att korrekt representera sina bakteriesamhällen. Flera sekvenser hade mellan 1 000 och 5 000 sekvenser; Även om de inte är idealiska, skulle de fortfarande vara användbara eftersom de överstiger det minsta, och de flesta prover överstiger det idealiska minimumet på 5 000 också. (B) Metatranscriptomics exempel räknas. Alla prover överskred både det minsta (500 000) och det ideala minsta (2 000 000) antalet sekvenser. Därför var sekvenseringen framgångsrik för dem alla, och de kunde alla användas i nedströmsanalys. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Exempelanalys. (A) PCoA-plot baserat på koordinater beräknade med en viktad Unifrac avståndsmatris skapad och visualiserad genom QIIME2. B)PCoA-tomten baserad på koordinater beräknade med den viktade Unifrac-avståndsmatrisen som exporteras från QIIME2. Koordinaterna visualiserades med hjälp av Phyloseq- och ggplot2-paketen i R. Metadata vektorer monterades på tomten med hjälp av Vegan-paketet. Varje punkt representerar ett provs bakteriesamhälle, med närmare punkter som indikerar mer liknande samhällssammansättningar. Klustring baserad på frackningsstatus för dessa 16S sedimentprover observerades (PERMANOVA, p=0,001). Dessutom visar vektorerna att HF+-proverna tenderade att ha högre halter av barium, bromid, nickel och zink, vilket motsvarade olika bakteriell samhällssammansättning jämfört med HF- proverna. C)Plot av bästa prediktorer för en slumpmässig skogsmodell som testade var bakteriela överflöd kunde användas för att förutsäga frackningsstatus bland proverna. Den slumpmässiga skogsmodellen skapades via R med hjälp av randomForest-paketet. De 20 bästa prediktorerna visas liksom de resulterande minskningarna av orenhet (mått på antalet HF+ och HF- prover grupperade tillsammans) i form av genomsnittlig minskning av Gini-index när de används för att separera prover. (D) Cirkeldiagram som visar burkholderiales-profilens antimikrobiella resistensprofil baserat på metatranscriptomic data. Sekvenser kommenterades först med Kraken2 för att avgöra vilken taxa de tillhörde. BLAST användes sedan med dessa kommenterade sekvenser och MEGARes 2.0-databasen för att avgöra vilka antimikrobiella resistensgener (i form av "MEG_#") som uttrycktes aktivt. Antimikrobiella resistensgener uttryckta av medlemmar av Burkholderiales extraherades sedan för att se vilka som var mest utbredda bland den taxan. Medan mer kostsam och tidskrävande, metatranscriptomics tillåter funktionella analyser, såsom detta som inte kan göras med 16S-data. Kraken2 användes särskilt för denna exempelanalys, istället för HUMAnN2. Kraken2 är snabbare än HUMAnN2; det ger dock bara kompositionsinformation, istället för sammansättning, bidrag och funktioner (gener) och vägar som HUMAnN2 gör. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande fil: En exempel på metatranscriptomics pipeline. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
De metoder som beskrivs i detta dokument har utvecklats och förfinats under flera studier som publicerats av vår grupp mellan 2014 och 20187,8,10 ochhar använts framgångsrikt i ett samarbetsprojekt för att undersöka frackningens inverkan på vattensamhällen i ett treårigt projekt som snart kommer att skicka in ett papper för publicering. Dessa metoder kommer att fortsätta att användas under återstoden av projektet. Dessutom beskriver annan aktuell litteratur som undersöker frackningens inverkan på strömmar och ekosystem liknande metoder för provtagning, bearbetning och analys7,8,10,11. Emellertid använde ingen av dessa papper metatranscriptomic analys, vilket gör detta dokument den första att beskriva hur dessa analyser kan användas för att klargöra frackings inverkan på närliggande strömmar. Dessutom är de metoder som presenteras här för provtagning mer detaljerade, liksom de åtgärder som vidtagits för att undvika kontaminering.
Ett av de viktigaste stegen i vårt protokoll är inledande provtagning och bevarande. Fältprovtagning och insamling kommer med vissa utmaningar, eftersom det kan vara svårt att upprätthålla en aseptisk eller steril miljö under insamlingen. Under detta steg är det viktigt att undvika att förorena prover. För att göra detta bör handskar bäras, och endast sterila behållare och verktyg bör tillåtas komma i kontakt med prover. Prover bör också omedelbart placeras på is efter insamling för att mildra nedbrytningen av nukleinsyran. Att tillsätta ett kommersiellt konserveringsmedel för nukleinsyra vid insamling kan också öka nukleinsyrautbytet och göra det möjligt att lagra prover under längre perioder efter insamlingen. När nukleinsyraextraktion utförs är det viktigt att använda lämplig mängd prov, för mycket kan täppa till spinnfilter som används för extraktion (för de protokoll som använder dem) men för lite kan resultera i låga utbyten. Var noga med att följa instruktionerna för vilken sats som används.
I likhet med fältinsamling är det också viktigt att undvika eller minimera kontaminering under utvinning av nukleinsyra och provberedning, särskilt vid arbete med prover med låg nukleinsyrautbyte, såsom suboptimala sedimentprover (prover som innehåller en stor mängd grus eller stenar) eller vattenprover. Därför, som med provuppsamling, bör handskar bäras under alla dessa steg för att minska föroreningen. Dessutom bör alla arbetsytor som används under labbprocedurer steriliseras i förväg genom att torka med en 10% blekmedelslösning, följt av en 70% etanollösning. För rörningssteg (3-6) bör filterspetsar användas för att undvika förorening på grund av själva pipetten, med spetsar som ändras varje gång de rör vid en icke-steril yta. Alla verktyg som används för labbarbete, inklusive pipetter, bör torkas av före och efter med blekmedels- och etanollösningarna. För att utvärdera kontaminering bör extraktionsämnen och negativ (steril vätska) inkluderas under varje uppsättning nukleinsyraextraktioner och PCR-reaktioner. Om kvantifiering efter extraktioner visar en påvisbar mängd DNA/RNA i negativerna, kan extraktioner upprepas om det finns tillräckligt med prov kvar. Om negativa prover för PCR visar förstärkning bör felsökning utföras för att bestämma källan och sedan ska proverna köras igen. För att ta hänsyn till låga föroreningsnivåer rekommenderas att extraktionsämnen och PCR-negativ sekvenseras så att föroreningarna kan identifieras och avlägsnas vid behov under beräkningsanalysen. Omvänt kan PCR-förstärkning också misslyckas på grund av en mängd olika orsaker. För miljöprover är hämning av PCR-reaktionen ofta den skyldige, vilket kan bero på en mängd olika ämnen som stör Taq-polymeras23. Om hämning misstänks kan PCR-vatten (se materialförteckning)användas för att späda ut DNA-extrakten.
Detta protokoll har några anmärkningsvärda begränsningar och potentiella svårigheter. Provtagning kan vara utmanande för både vatten- och sedimentprover. För att få tillräckligt med biomassa måste helst 1 L strömvatten skjutas genom ett filter. Filtrets porer måste vara små för att fånga mikrober men kan också fånga sediment. Om mycket sediment finns i vattnet på grund av den senaste tidens nederbörd kan filtret täppa till vilket gör det svårt att trycka hela volymen genom filtret. För sedimentuppsamling kan det vara utmanande att uppskatta sedimentdjupet under insamlingen. Dessutom är det viktigt att se till att sedimentet som samlas in huvudsakligen är jord, eftersom småsten och stenar kommer att leda till lägre nukleinsyrautbyte och kanske inte är en korrekt representation av det mikrobiella samhället. Slutligen är det också viktigt att prover hålls på is efter insamling, särskilt om ett konserveringsmedel inte används.
Även om detta protokoll täcker både metatranscriptomics och 16S lab protokoll, bör det betonas att dessa två metoder är mycket olika i både processen och i den typ av data de tillhandahåller. 16S rRNA-genen är en allmänt riktad region, mycket bevarad i bakterier och arkéer, och användbar för att karakterisera bakteriesamhället i ett prov. Även om det är ett målinriktat och specifikt tillvägagångssätt är upplösningen på artnivå ofta ouppnåelig, och det är svårt att karakterisera nysspionerade arter eller stammar. Kontrarily är metatranscriptomics ett bredare tillvägagångssätt som fångar alla aktiva gener och mikrober som finns i ett prov. Medan 16S endast tillhandahåller data för identifiering, kan metatranscriptomics tillhandahålla funktionella data såsom uttryckta gener och metaboliska vägar. Båda är värdefulla och när de kombineras kan de avslöja vilka bakterier som finns och vilka gener de uttrycker.
Detta dokument beskriver metoder för fält insamling och prov bearbetning för både 16S rRNA och metatranscriptomic analyser i samband med studier fracking. Dessutom specificerar den insamlingsmetoder för högkvalitativt DNA / RNA från prover med låg biomassa och för långtidslagring. De metoder som beskrivs här är kulmen på våra erfarenheter av provtagning och bearbetning i våra ansträngningar att lära oss hur frackning påverkar närliggande strömmar genom att undersöka strukturen och funktionen hos deras mikrobiella samhällen. Mikrober reagerar snabbt på störningar, och följaktligen vilka mikrober som finns och vilka gener de uttrycker kan ge information om frackningens effekter på ekosystemen. Sammantaget kan dessa metoder vara ovärderliga i vår förståelse för hur frackning påverkar dessa viktiga ekosystem.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja erkänna finansieringskällorna för de projekt som ledde till utvecklingen av dessa metoder, med dessa källor: Howard Hughes Medical Institute (http://www.hhmi.org) genom Precollege and Undergraduate Science Education Program, liksom av National Science Foundation (http://www.nsf.gov) genom NSF-utmärkelser DBI-1248096 och CBET-1805549.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 Proof Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A4094 | 400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol). Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1356-100 | 100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel. |
| Disinfecting Bleach | Walmart (Clorox) | No catalog number | Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures |
| DNA gel loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample |
| DNA ladder | MilliporeSigma | D3937-1VL | A ladder should be run on every gel/e-gel |
| DNA/RNA Shield (2x) | Zymo Research | R1200-125 | 3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter) |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302-10 | Used for staining user-made e-gels |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-06 | 0.5 µL per PCR reaction |
| Isopropanol | MilliporeSigma | 563935-1L | Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). |
| PCR-grade water | MilliporeSigma | 3315932001 | 13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used) |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000012 | 10 µL per PCR reaction |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-07 | 0.5 µL per PCR reaction |
| TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) | Thermo Fisher Scientific | B52 | 1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel) |
| 1 L bottle | Thermo Fisher Scientific | 02-893-4E | One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses) |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | MilliporeSigma | BR780400-450EA | 5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol) |
| 2% Agarose e-gel | Thermo Fisher Scientific | G401002 | Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel) |
| 50 mL Conicals | CellTreat | 229421 | 1 50 mL conical needed per sediment samples |
| 500 mL Beaker | MilliporeSigma | Z740580 | Only 1 needed (for flame sterilization) |
| Aluminum foil | Walmart (Reynolds KITCHEN) | No number | Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters (one folded piece per filter to avoid cross-contamination) |
| Autoclave | Gettinge | LSS 130 | Only one needed |
| Centrifuge | MilliporeSigma | EP5404000138-1EA | Only 1 needed |
| Cooler | ULINE | S-22567 | Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling. |
| Disruptor Genie | Bio-Rad | 3591456 | Only one needed |
| Electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1664000EDU | Only 1 needed |
| Electrophoresis power supply | Bio-Rad | 1645050 | Only 1 needed |
| Freezer (-20 C) | K2 SCIENTIFIC | K204SDF | One needed to store DNA extracts |
| Freezer (-80 C) | K2 SCIENTIFIC | K205ULT | One needed to store RNA extracts |
| Gloves | Thermo Fisher Scientific | 19-020-352 | The catalog number is for Medium gloves. |
| Heat block | MilliporeSigma | Z741333-1EA | Only one needed |
| Lab burner | Sterlitech | 177200-00 | Only one needed |
| Laminar Flow Hood | AirClean Systems | AC624LFUV | Only 1 needed |
| Library purification kit | Qiagen | 28704 | One kit has enough for 50 reactions |
| Magnet Plate | Alpaqua | A001219 | Only one needed |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004061 | Only one needed |
| Micropipette (1000 µL volume) | Pipette.com | L-1000 | Only 1 needed |
| Micropipette (2 µL volume) | Pipette.com | L-2 | Only 1 needed |
| Micropipette (20 µL volume) | Pipette.com | L-20 | Only 1 needed |
| Micropipette (200 µL volume) | Pipette.com | L-200R | Only 1 needed |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads | New England BioLabs Inc. | E7775S | One kit has enough reagents for 24 samples. |
| Parafilm | MilliporeSigma | P7793-1EA | 2 1" x 1" squares are needed per filter |
| PCR Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | One tube needed per reaction |
| Pipette tips (for 1000 µL volume) | Pipette.com | LF-1000 | Pack of 576 tips |
| Pipette tips (for 20 µL volume) | Pipette.com | LF-20 | Pack of 960 tips |
| Pipette tips (for 200 µL volume) | Pipette.com | LF-250 | Pack of 960 tips |
| PowerWulf ZXR1+ computer cluster | PSSC Labs | No number | This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed. |
| Qubit fluorometer starter kit | Thermo Fisher Scientific | Q33239 | Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific | 14-357Q | Only one needed |
| Sterile blades | AD Surgical | A600-P10-0 | One needed per filter |
| Sterivex-GP Pressure Filter Unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | 1 filter needed per water sample |
| Thermocycler | Bio-Rad | 1861096 | Only one needed |
| Vise-grip | Irwin | 2078500 | Only one needed (for cracking open the filters) |
| Vortex-Genie 2 | MilliporeSigma | Z258415-1EA | Only 1 needed |
| WHIRL-PAK bags | ULINE | S-22729 | 1 needed per filter |
| ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2002 | One kit has enough reagents for 50 samples. |
References
- The process of unconventional natural gas production. US EPA. , Available from: https://www.epa.gov/uog/process-unconventional-natural-gas-production (2013).
- Brittingham, M. C., Maloney, K. O., Farag, A. M., Harper, D. D., Bowen, Z. H. Ecological risks of shale oil and gas development to wildlife, aquatic resources, and their habitats. Environmental Science & Technology. 48 (19), 11034-11047 (2014).
- McBroom, M., Thomas, T., Zhang, Y. Soil erosion and surface water quality impacts of natural gas development in East Texas, USA. Water. 4 (4), 944-958 (2012).
- Maloney, K. O., Weller, D. E. Anthropogenic disturbance, and streams: land use and land-use change affect stream ecosystems via multiple pathways. Freshwater Biology. 56 (3), 611-626 (2011).
- Meyer, J. L., et al. The contribution of headwater streams to biodiversity in river networks1. JAWRA Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 86-103 (2007).
- Alexander, R. B., Boyer, E. W., Smith, R. A., Schwarz, G. E., Moore, R. B. The role of headwater streams in downstream water quality. Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 41-59 (2007).
- Ulrich, N., et al. Response of aquatic bacterial communities to hydraulic fracturing in Northwestern Pennsylvania: A five-year study. Scientific Reports. 8 (1), 5683 (2018).
- Chen See, J. R., et al. Bacterial biomarkers of Marcellus shale activity in Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 9, 1697 (2018).
- Rausch, P., et al. Comparative analysis of amplicon and metagenomic sequencing methods reveals key features in the evolution of animal metaorganisms. Microbiome. 7 (1), 133 (2019).
- Louca, S., Doebeli, M., Parfrey, L. W. Correcting for 16S rRNA gene copy numbers in microbiome surveys remains an unsolved problem. Microbiome. 6 (1), 41 (2018).
- Trexler, R., et al. Assessing impacts of unconventional natural gas extraction on microbial communities in headwater stream ecosystems in Northwestern Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 5, 522 (2014).
- Mumford, A. C., et al. Shale gas development has limited effects on stream biology and geochemistry in a gradient-based, multiparameter study in Pennsylvania. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (7), 3670-3677 (2020).
- JoVE Core Biology DNA Isolation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/cn/science-education/10814/dna-isolation (2020).
- Oxford Gene Technology DNA Storage and Quality. OGT. , Available from: https://www.ogt.com/resources/literature/403_dna_storage_and_quality (2011).
- ThermoFisher SCIENTIFIC Technical Bulletin #159: Working with RNA. Thermoscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html (2020).
- QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/multianalyte-and-virus/allprep-dnarna-mini-kit/#orderinginformation (2020).
- ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit. Zymo Research. , Available from: https://www.zymoresearch.com/products/zymobiomics-dna-rna-miniprep-kit (2020).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- 16S Illumina amplicon protocol: Earth microbiome project. Earth microbiome project. , Available from: https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/ (2018).
- Gel Purification: Binding, washing and eluting a sample | Protocol. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/v/5063/gel-purification (2020).
- New England Biolabs protocol for the use with NEBNext Poly(A) mRNA magnetic isolation module (E7490) and NEBNext Ultra II RNA library prep kit for Illumina (E7770, E7775). New England Biolabs. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2017/03/04/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-rrna-depleted-rna-and-nebnext-ultra-ii-rna-library-prep-ki (2020).
- Anderson, M. J. Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA). Wiley StatsRef: Statistics Reference Online. , 1-15 (2017).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
