Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie ein verbesserter Test für mechanische Nociception in Drosophila Larven durchzuführen. Wir verwenden den Test hier, um zu zeigen, dass mechanische Überempfindlichkeit (Allodynie und Hyperalgesie) in Drosophila Larven existiert.
Abstract
Veröffentlichte Assays für die mechanische Nozieption in Drosophila haben zu variablen Verhaltensbeurteilungen geführt. Hier haben wir für die Verwendung mit Drosophila Larven, kundenspezifische Metall Nickel-Titan-Legierung (Nitinol) Filamente hergestellt. Diese mechanischen Sonden ähneln den von Frey-Filamenten, die bei Wirbeltieren zur Messung der mechanischen Nozieption verwendet werden. Hier zeigen wir, wie diese mechanischen Sonden herzustellen und kalibriert werden und wie eine vollständige Verhaltensdosis-Reaktion von Subthreshold (innocuous or non-noxious range) bis zu suprathreshold (low to high noxious range) Reize erzeugt wird. Um den Nutzen der Sonden zu demonstrieren, untersuchten wir gewebeschädigende induzierte Überempfindlichkeit bei Drosophila Larven. Mechanische Allodynie (Überempfindlichkeit gegen einen normalerweise harmlosen mechanischen Reiz) und Hyperalgesie (übertriebene Reaktionsfähigkeit auf einen schädlichen mechanischen Reiz) sind in Drosophila Larven noch nicht etabliert. Mit mechanischen Sonden, die normalerweise harmlos sind, oder Sonden, die typischerweise ein aversives Verhalten hervorrufen, fanden wir heraus, dass Drosophila-Larven eine mechanische Hypersensibilisierung (sowohl Allodynie als auch Hyperalgesie) nach Gewebeschäden entwickeln. So werden die mechanischen Sonden und Assay, die wir hier veranschaulichen, wahrscheinlich wichtige Werkzeuge sein, um die grundlegenden molekularen/genetischen Mechanismen der mechanischen Überempfindlichkeit zu sezieren.
Introduction
Drosophila Larven zeigen ein charakteristisches aversives Walzverhalten, wenn sie verschiedenen schädlichen Reizen ausgesetzt sind: thermal1, mechanisch2und chemisch3. Dieses Verhalten unterscheidet sich deutlich von der normalen Fortbewegung. Hier beschreiben wir einen verbesserten mechanischen Assay, der zur Beurteilung der mechanischen Nozieption und der mechanischen Sensibilisierung verwendet werden kann.
In einer aktuellen Studie haben wir von Frey-ähnliche Filamente mit Nitinoldrähten4hergestellt. Sonden, die unterschiedliche Kräfte und Drücke ausübten, wurden durch Variation der Längen und Durchmesser der Nitinoldrähte, die jede Sonde bildeten, hergestellt. Mechanische Sonden wurden kalibriert und die gemessenen Kraftwerte (in Millinewton, mN) wurden in Druck (Kilopascal, kPa) umgerechnet, basierend auf der Spitzenfläche jeder Sonde4. Die kundenspezifische Herstellung mechanischer Sonden ermöglichte es uns, unterschwellige (≤200 kPa) bis supraschwellende (225 kPa bis 5318 kPa) Drücke zu erzeugen, die im Prinzip für die Untersuchung der mechanischen Überempfindlichkeit von Vorteil sein könnten. Anhand dieser verbesserten mechanischen von Frey-ähnlichen Filamente zeigten wir, dass Druck4im Gegensatz zur zuvor untersuchten Kraft2,5,6 konsequenter mit der aversiven Verhaltensreaktionbeisfähigkeit bei Drosophila-Larven korreliert. Der hier beschriebene verbesserte mechanische Assay half auch, einen konservierten Vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor (VEGF)-bezogenen Rezeptor-Tyrosinkinase zu identifizieren, der einen Weg signalisiert, der die mechanische Nozizeption bei Fliegen und Ratten reguliert4.
Mechanische Allodynie und Hyperalgesie, zwei Modalitäten der Überempfindlichkeit, sind relativ unterstudiert in Drosophila Larven, im Vergleich zu den thermischen (Wärme und Kälte) und chemischen sensorischen Modalitäten3,7,8,9,10. Dies ist wahrscheinlich auf das Fehlen spezifischer mechanischer Sonden zurückzuführen, die von harmlosen Reizen bis zum hohen schädlichen Bereich2,5,6reichen. Ein normalerweise harmloser Stimulus, der das typische aversive Rollverhalten hervorruft, nachdem Drosophila-Larven Gewebeschäden erleben3,7 wird als Allodynie bezeichnet. Eine übertriebene rollende Reaktion auf einen typisch schädlichen Reiz wird als Hyperalgesie7bezeichnet. Schädliche Reize sind definiert als solche, die Gewebeschäden auslösen und Nozizeptoren11aktivieren können. Schädliche Reize, die Drosophila Larven zugeführt werden, schädigen entweder die Barriereepidermis, die peripheren nozizeptiven sensorischen Neuronen3,4,7oder beides.
In diesem Artikel zeigen wir, wie man von Frey-ähnliche mechanische Sonden, die für Drosophila-Larven geeignet sind, individuell angefertigt und kalibriert. Darüber hinaus zeigen wir, wie diese Sonden verwendet werden, um mechanische nozizeptive Reaktionen bei Drosophila-Larven zu untersuchen. Schließlich demonstrieren wir den Nutzen dieser Sonden weiter, indem wir sie verwenden, um das Vorhandensein von mechanischer Überempfindlichkeit, sowohl Allodynie als auch Hyperalgesie, nach Gewebeschäden bei Drosophila-Larven nachzuweisen (siehe Repräsentative Ergebnisse).
Protocol
1. Mechanische Sondenkonstruktion
- Schneiden Sie jedes Nitinol-Filament (Abbildung 1B), senkrecht zu seiner langen Achse, auf die angegebene Länge (Abbildung 1M–N) mit einem kleinen Drahtschneider (Abbildung 1C). Die Filamente sind in drei verschiedenen voreingestellten Durchmessern(Abbildung 1B) zu sehen.
HINWEIS: Die hier angegebenen Längen sind eine Anleitung, um die angegebenen ungefähren Drücke zu erreichen, mit einem ähnlichen Protokoll für die Konstruktion der Halterung. Letztlich müssen die Filamente unabhängig von der Länge des Filamentschnitts und der Tiefe des Lochs in der Halterung gemessen/kalibriert werden, um den genauen Kraft-/Druckwert zu erhalten. - Untersuchen Sie die Spitze des Filaments unter einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass keine scharfen oder unregelmäßigen Kanten verbleiben, da diese Gewebeschäden an der Haut der Larven verursachen und die Kalibrierung stören könnten.
- Glätten Sie die scharfen Kanten der mechanischen Sonde manuell mit einem Schärfstein, bis keine scharfen Unregelmäßigkeiten bestehen bleiben (Abbildung 1D).
- Machen Sie ein Loch gegen Ende eines hölzernen Popsicle-Sticks (Abbildung 1E) mit einer hypodermischen Nadel (siehe Tabelle der Materialien). Setzen Sie die Nadel mindestens auf halbem Weg durch die Höhe des Popsicle-Sticks ein (Abbildung 1E). Dadurch entsteht eine Kammer zum Einsetzen des Nitinol-Filaments.
- Tragen Sie Holzleim auf ein einzelnes Nitinol-Filament auf (Abbildung 1F) und legen Sie das mit Kleber beschichtete Filament in den Nadelschlitz in einen hölzernen Popsicle-Stick (Abbildung 1G). Trocknen lassen für 5 h.
- Kalibrieren Sie jede mechanische Sonde, indem Sie sie gegen eine Waage drücken, bis sich die mechanische Sonde biegt (Abbildung 1H–L). Dies ist der Punkt der maximalen Kraft, die in Gramm aufgezeichnet werden kann. Je nach Filamentdurchmesser (voreingestellt) und Längen (benutzerbestimmt) kann ein voller Kraft- und Druckbereich erzeugt werden.
- Konvertieren Sie die in Schritt 1.6 aufgezeichnete Masse in Kraft in Millinewton (mN) mit der Formel f = ma (Kraft ist gleich Masse multipliziert mit Gravitationsbeschleunigung). f: Kraft; m: Masse; a: Gravitationsbeschleunigung (9,8 m/s2) (Abbildung 1M).
- Schließlich konvertieren Sie die berechnete Kraft in Druck (Kraft/Fläche) in Kilopascal (kPa), indem Sie die gemessene Kraft durch die Oberfläche der Filamentspitze dividieren (Abbildung 1M). Um die Fläche zu berechnen, konvertieren Sie den Durchmesser der verschiedenen Nitinol-Filamente von Zoll (0,04", 0,06" und 0,08") in Zentimeter. Dann bestimmt die Fläche(wobei r = der Nitinol-Filamentradius) die Fläche bestimmt (siehe Abbildung 1M). Durch die Vorbereitung mehrerer Sonden mit Filamenten unterschiedlicher Durchmesser und Längen wird ein vollständiger Satz erzeugt, der den Reaktionsbereich für Drosophila-Larven überspannt (Beispielsatz in Abbildung 1N).
HINWEIS: Überprüfen Sie jede mechanische Sonde mindestens alle 3–4 Wochen. Weicht der Druck um mehr als ± 3 % von der ursprünglichen Messgröße ab, muss eine neue mechanische Sonde hergestellt werden.
2. Herstellung von Larven
- Erhöhen Sie den Kontrollstamm (w1118) Larvennachkommen oder Larven, die die Transgene ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (zur Visualisierung von Schäden an sensorischen Neuronen) auf Standardnahrung in einem 25 °C-Inkubator enthalten. In der Regel werden die Bestände routinemäßig bei 18 °C gehalten, aber sowohl Eltern als auch Larvennachkommen werden bei 25 °C auf Standard-Maismehlfutter für Experimente aufgezogen.
HINWEIS: Erwachsene Fliegen (fünf Männchen und zehn Weibchen, 1:2 Verhältnis) werden in den Fliegenfläschchen gehalten, um Eiablage zu ermöglichen, für etwa 24 h. Die Zeit nach der Eiablage (AEL) beginnt mit dem Entfernen der Erwachsenen. - Sammeln Sie die dritte Instar-Larven, nach ca. 96 h Eiablage, indem Sie sanft Leitungswasser in die Weichefliegennahrung spritzen, die die Larven enthält. Wandernde Larven, die das Essen verlassen haben, oder die jes vordere oder hintere Spiracles, sind zu groß/alt für diesen Test. Zweite Insternlarven (weniger als 4 mm Länge) sind zu klein.
- Gießen Sie den Inhalt des Softfly Food in eine saubere Petrischale in Standardgröße (100 mm x 15 mm).
- Mit Zangen sortieren Sie mittlere dritte Instern, mittelgroße Larven (siehe Abbildung 2A) von kleineren (zweiter Instar und frühen dritten Instar) oder größeren (späten oder wandernden dritten Instar) Larven. Eine sanfte Manipulation mit Zangen zur Vermeidung von Gewebeschäden an den Larven wird empfohlen.
HINWEIS: Der Transfer mit Zangen basiert hauptsächlich auf Wasserspannung und nicht durch Druck auf die Larven mit den Klingen der Zange. Eine Alternative zur Verwendung von Zangen zum Manövrieren von Larven sind weiche Pinsel. Mit beiden Werkzeugen sollte der Benutzer die Übertragung der Tiere üben, um keine unbeabsichtigten Gewebeschäden zu verursachen, die Verhaltensmessungen erschweren könnten. - Übertragen Sie die mittleren Drittel-Insternlarven mit Zangen in eine kleine Petrischale (30 mm x 15 mm), die einen kleinen Stecker fliegendes Futter enthält, das bei Raumtemperatur mit Wasser befeuchtet ist. Bewahren Sie die Larven in der kleinen Petrischale auf, bis die Experimente durchgeführt werden, aber nicht länger als 20 min.
HINWEIS: Im Allgemeinen wird die Übertragung von 20–30 Larven auf den Futterstecker eine ausreichende Zahl für 20 min Verhaltenstests ergeben.
3. Mechanischer Nociception Assay
- Legen Sie eine mittlere Drittel-Instar-Larve (mit Zangen) auf ein dünnes Pad aus schwarzem oder dunklem Vinyl unter einem hellen Feld-Stereomikroskop. Die dunkle Farbe sorgt für Kontrast, der die Visualisierung der Larve verbessert. Es ist vorzuziehen, ein frei bewegliches Stück dunkles Vinyl zu haben, weil es dem Benutzer ermöglicht, die Larve auszurichten, ohne sie zu berühren oder zu verletzen.
- Setzen Sie die optischen Lichtwellen zwischen den Objektivlinsen des Mikroskops und dem schwarzen oder dunklen Vinyl-Pad; dies ermöglicht eine ausreichende kontrastreiche Beleuchtung, um die Larve zu sehen.
- Larven entsorgen, die nach der Übertragung auf das Pad keine normale Fortbewegung aufweisen. Diese können die normale nozizeptive Verhaltensreaktion stören. Für normale Fortbewegung siehe Video 1.
- Wischen Sie weg, mit einem Papiertuch, jedes überschüssige Wasser um die Larve, die die Larve auf dem Vinyl-Pad schwimmen lassen könnte.
- Richten Sie die Larve aus, indem Sie das dunkle Vinylpad bewegen. Der Kopf/Mund der Larve sollte nach links zeigen, wenn Sie Rechtshänder sind und umgekehrt, wenn Sie Linkshänder sind (Abbildung 2A-B).
- Tragen Sie die gewählte mechanische Sonde, typischerweise für 1-2 s, auf die hintere dorsale Seite der Larve bei etwa dem Bauchsegment A8 auf (siehe Abbildung 2B), bis sich die Sonde beugt und die zuvor gemessene Druckmenge entlockt (Abbildung 2C). Es ist wichtig, dass die Sonde gegen die dorsale Oberfläche der Larve drückt und die Larven am Punkt des Sondenkontakts in das darunter liegende Pad komprimiert.
ANMERKUNG: An der Berührungsstelle zwischen der Spitze des Nitinol-Filaments und der dorsalen Cuticle-Epidermis biegen sich Sonden unter 2.300 kPa, hauptsächlich ohne eindringend in die Nagelhaut und das darunter liegende Gewebe. Solche Sonden beeinflussen selten die Larvensterblichkeit4. Bei höheren Drücken (>5.000 kPa) biegen sich die Sonden sowohl und gelegentlich in die Nagelhaut und das darunter liegende Gewebe ein. Das Punktieren der Larven beeinträchtigt das Überleben der Larven4 und, wenn sie beobachtet werden, werden diese Larven in der Regel aus der Verhaltensanalyse verworfen. - Zeichnen Sie die Verhaltensreaktion für jede Larve auf. Eine positive nozizeptive Reaktion (Video 2) wird angezeigt, wenn die Larve innerhalb von 3 s eine komplette Rolle von 360° entlang der Achse ihres Körpers zeigt. Andere Antworten (Versuchen, sich zu drehen, schnell zu kriechen und zu wackeln) werden für die Zwecke dieses Testes als negativ betrachtet.
HINWEIS: Larven, die mit einem subschwelligen mechanischen Stimulus (200 kPa) stimuliert wurden, lösten nicht die typische nozizeptive oder rollende Reaktion aus (Video 3). Einige Larven zeigten schnelle Vorwärts- oder leichte Berührungsreaktionen wie Veränderungen in der Bewegungsrichtung. - Entsorgen Sie die Larve und bereiten Sie die nächste für den Test vor, indem Sie die Schritte 3.1 bis 3.7 wiederholen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1–3.7, bis die gewünschte Anzahl von Larven erreicht ist (drei bis sechs Sätze n = 10 Larven wurden hier für jede Sonde verwendet).
HINWEIS: Bei Verwendung mechanischer Sonden mit niedrigerem Druck (174–462 kPa) nimmt der Test mehr Zeit pro Larve in Anspruch. Dies liegt daran, dass die Spitze der längeren Filamente mehr oszilliert, was es schwieriger macht, die Larve in der Mitte des A8-Segments zu stechen. Bei diesen Sonden ist Übung notwendig.
4. Konfokale Mikroskopie zur Beurteilung der neuronalen Morphologie
- Legen Sie eine Larve (vom Genotyp ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP zur Kennzeichnung sensorischer Neuronen) zuvor mit einem Nitinol-Filament in eine Etherisierungskammer in einem Coplin-Glas mit einem 10 ml Becher mit einer Mitglas mit einem Getränk von 1 ml Diethylether. Lassen Sie die Larve in der Kammer für 5 min sitzen.
HINWEIS: Ein detailliertes Protokoll für die Ätherisierung ist in einer früheren Studie enthalten, die von unserer Gruppe12veröffentlicht wurde. - Spülen Sie die Larve sanft aus der Etherisierungskammer in eine kleine Petrischale.
- Bereit für einen Mikroskopschlitten, zwei kleine Abdeckungen (22 x 22 mm) und einen langen Abdeckrutsch (22 x 54 mm) (siehe Materialtabelle).
- Fügen Sie kleine Tropfen Ether:Öl-Lösung (1:5 Verhältnis von Ethylether zu Halocarbon-Öl-Lösung, siehe Tabelle der Materialien) an beiden Enden des Dias, dann legen Sie die kleinen Decklippen auf die kleinen Tröpfchen. Diese Anordnung schafft eine kleine Raumlücke, in die die Larve passen kann.
HINWEIS: Drücken Sie die kleinen Abdeckungen gegen das Mikroskopschlitten, bis es schwierig zu rutschen ist. - Fügen Sie einige Tropfen Äther: Öllösung auf der Mitte des Mikroskopschlittens hinzu und legen Sie die Larve dann mit Zangen auf die Mitte des Mikroskopschlittens (zwischen den kleinen Abdeckungen). Stellen Sie sicher, dass die Anteroposterior-Achse der Larve parallel zur kurzen Seite des Schlittens verläuft und dass die Rückenseite nach oben zeigt.
- Bedecken Sie die Larven mit dem langen Deckelschlupf auf der Larve und den beiden kleineren Decklippen.
HINWEIS: Drücken Sie großzügig den langen Deckelschlupf, bis die Larve fast flach ist. - Bildsegment A8 der Larve mit einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle)mit Laserwellenlänge 488 (GFP).
HINWEIS: Stellen Sie die Larve sofort ab, da die Anästhesisierung über Äther schnell verblässt (ca. 5–10 min) und die Larve aufwacht und sich bewegt, was die weitere Bildgebung erschwert. - Erfassen Sie Z-Stack-Bilder mit einer Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln mit einer 20-fachen numerischen Blende (NA) 0,7-Trockenobjektiv mit 1x Zoom, Schrittgröße von 1,5 m.
5. Quantifizierung von Gewebeschäden
- Sammeln und konvertieren Sie die Stapelbilder der Z-Serie aus Abschnitt 4.8 in eine einzelne Z-Projektion (eine Abflachung mehrerer Bilder, die auf verschiedenen Brennebenen aufgenommen wurden, in ein einzelnes zusammengesetztes Bild). Dies kann mit kommerziell erhältlicher Software (z.B. Olympus Fluoview) oder einer gleichwertigen Open-Source-Plattform, z.B. Fidschi/Bild J. Speichern Sie die einzelne Z-Projektion im TIFF-Format durchgeführt werden.
- Öffnen Sie das Bildanalyseprogramm Fidschi/ImageJ.
- Klicken Sie in der Menüleiste auf Datei, und wählen Sie Öffnen aus dem angezeigten Fenster aus.
- Wählen Sie die gespeicherte Einzelbildprojektion aus, die im TIFF-Format gespeichert ist und analysiert werden soll.
- Klicken Sie in der Menüleiste auf Bearbeiten, und wählen Sie die Option Invertieren aus dem angezeigten Fenster aus.
- Klicken Sie in der Menüleiste auf das Bild, dann wählen Sie Anpassenaus aus dem angezeigten Fenster aus, und wählen Sie schließlich die Option Helligkeit/Kontrast aus.
- Wählen Sie die Option Freihandform aus der Werkzeugleiste aus, um den Bereich der Lücke zu messen (falls vorhanden).
- Klicken Sie in der Menüleiste auf Analysieren, und wählen Sie die Option Messen aus. Dadurch wird der Bereich der Lücke oder Wunde angezeigt.
Representative Results
Wir entwickelten kundenspezifische mechanische Sonden mit Nitinol-Filamenten (Abbildung 1A,N), um mechanisch evozierte Verhaltensweisen auszulösen und erzeugten eine vollständige Verhaltensdosis-Reaktionskurve mit harmlosen und schädlichen mechanischen Sonden unterschiedlicher Intensität (Abbildung 2D), die zeigen, dass diese Sonden verwendet werden können, um die Basislinie (in Ermangelung einer Verletzung) mechanische Nozieption zu untersuchen.
Unsere Verhaltenstestergebnisse ergaben, dass Sonden, die Drücke unter 200 kPa (ca. 1,57 mN) ausüben (Abbildung 1M), wenn sie auf Drosophila-Larven angewendet werden, keine aversive rollende Reaktion hervorrufen (Abbildung 2D und Video 3). Wie erwartet, lösten diese subschwelligen oder nicht schädlichen mechanischen Sonden (175 kPa oder 200 kPa) keine sichtbaren neuronalen Gewebeschäden aus (Abbildung 2E). Da sie keine Schäden verursachen, könnten solche Sonden nützlich sein, um mechanische Allodynie (Überempfindlichkeit gegenüber einem normalerweise nicht-schädlichen mechanischen Reiz) zu beurteilen. Umgekehrt lösten suprathreshold oder schädliche Sonden (von 462 kPa bis 5.116 kPa) eine erhöhte Verhaltensreaktion (Abbildung 2D) in dosisabhängiger Weise aus – wobei die höheren Drücke stärkere Verhaltensreaktionen hervorriefen. Wie erwartet, induzierte der suprathreshold mechanische Druck auch dosisabhängige Gewebeschäden an den peripheren sensorischen Neuronen selbst (Abbildung 2E). Der gemessene Bereich der Gewebeschäden (in m2 ± Standardabweichung), der von vier Larven pro Gruppe entnommen wurde, betrug: 2.051,03 ± 703,81 (462 kPa), 5.102,29 ± 1.004,67 (2.283 kPa) und 12.238,83 ± 3.724,11 (5.116 kPa). So könnten Drücke von mehr als oder gleich 462 kPa (ca. 63 mN), die eine aversive Rollenreaktion (in 25% oder mehr der Larven) evozieren und sichtbare neuronale Gewebeschäden verursachen (Abbildung 2E), geeignet sein, mechanische Hyperalgesie (Überempfindlichkeit gegen normalerweise schädliche mechanische Reize) zu untersuchen. Nozizeptive mechanische Sonden (≥462 kPa) verursachen immer Gewebeschäden (n = 10, qualitativ bewertet), provozieren aber nicht immer eine aversive Rollenreaktion.
Zur Beurteilung der mechanischen Überempfindlichkeit (Allodynie und Hyperalgesie) haben wir ein gut etabliertes Drosophila-Larvenmodell der nozizeptiven Sensibilisierung verwendet, das ultraviolettes Licht (UV) bestrahlung verwendet, um Gewebeschäden zu induzieren7,12. Dieser Assay hat dazu beigetragen, die genetischen und zellulären Mechanismen der thermischen nozizeptiven Überempfindlichkeit8,9,10,13,14,15zu sezieren. Um festzustellen, ob die UV-Behandlung mechanische Allodynie verursacht, wurden mitteldritte Instar-Kontrolle (w1118) Larven verspottet oder UV-bestrahlt (15–20 mJ/cm2) (Abbildung 3A). Anschließend wurden die Larven bei 2 h, 4 h, 8 h, 16 h und 24 h nach der Behandlung mit einer normalerweise unterschwelligen mechanischen Sonde (200 kPa, 1,57 mN) verhaltensauffällig getestet. Ungefähr 20 % der Larven reagierten bereits 2 h nach UV-Behandlung, während 50 % bei 4 h anreagierten, verglichen mit 6,6 % bzw. 8,3 % mit UV-bestrahlten Tieren(Abbildung 3B). Dies deutet darauf hin, dass UV-induzierte Gewebeschäden mechanische Allodynie bei 4 h nach der Bestrahlung verursachen. Zu späteren Zeitpunkten (8 h, 16 h, und 24 h) lag die Verhaltensreaktion der UV-behandelten Larven im Bereich von 16%-20% Respondern (durchschnittlicher Mittelwert von n = 3–6 Sätzen von je 10 Larven), leicht erhöht (aber statistisch signifikant) im Vergleich zur verspotteten Kontrollgruppe (im Bereich von 3%–6% der Responder, durchschnittlicher Mittelwert von n = 3–6 Sätzen von je 10 Larven) (3B).
Zur Untersuchung der mechanischen Hyperalgesie wurde ein suprathresholdr Druck (462 kPa, 3,63 mN) verwendet, der normalerweise bei 20 % der Larven(Abbildung 2D) eine aversive Rollenreaktion induziert und neuronale Gewebeschäden verursacht (Abbildung 2E). Wir haben die 462 kPa-Sonde auf die Dorsalseite von Larven mit oder ohne UV-induzierte Gewebeschädigung aufgetragen (Abbildung 3A). Wir fanden heraus, dass Larven, die nach der UV-Behandlung bei 4 h, 8 h und 16 h untersucht wurden, eine signifikante Zunahme der aversiven Rollenreaktion zeigten, wobei 4 h der Höhepunkt der Verhaltensüberempfindlichkeit war (ca. 60% ansprechbar); UV-bestrahlte Tiere zeigten eine aversive Reaktion von 27 % (Abbildung 3C). Ähnlich wie bei mechanischer Allodynie ist die Verhaltensreaktion bei 8 h, 16 h und 24 h von UV-behandelten Tieren (im Bereich von 36%–42%) statistisch nicht von den nicht behandelten Larven zu unterscheiden war (im Bereich von 20%–26%). Larven im späten drittelgroßen Instar-Stadium zeigten eine leichte Abnahme der Ausgangsverhaltensreaktion im Vergleich zum mittleren Drittel in der Star-Phase. Wir vermuten, dass dies entweder durch die erhöhte Größe der Larven (Abbildung 2A) oder die erhöhte Dicke der Nagelhaut, die den Körper bedeckt, sein könnte. Diese Tatsache könnte erklären, warum die UV-Behandlung in einem späteren Entwicklungsstadium keine größere mechanische Sensibilisierung induziert, wie 4 h nach der UV-Behandlung beobachtet.
Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Drosophila-Larven sowohl mechanische Allodynie als auch mechanische Hyperalgesie nach UV-induzierten Gewebeschäden entwickeln. Die Spitzenzeit der mechanischen Allodynie und Hyperalgesie ist die gleiche, 4 h nach UV-Behandlung; jedoch hat die mechanische Hyperalgesie einen ausgeprägteren zeitlichen Schwanz, da sie langsamer zur Ausgangsbasis zurückkehrt als die mechanische Allodynie.
Abbildung 1: Entwicklung eines Von Frey-ähnlichen Werkzeugs zur Bewertung der mechanischen Nozieption bei Drosophila-Larven. (A) Bild einer mechanischen Sonde zur Untersuchung der mechanischen Nozieption bei Drosophila-Larven. (B) Nitinol-Filamente und ihre relativen Durchmesser werden relativ maßstabsgetreu dargestellt. (C) Bild des diagonalen Drahtschneiders, der zum Schneiden der Nitinolfilamente verwendet wird. (D) Glätten der scharfen Kanten des geschnittenen Nitinol-Filaments mit einem Schärfstein. (E) Hypodermische Nadel verwendet, um ein Loch in den hölzernen Popsicle Stick Griff der Sonde zu machen. Die Spitze der Nadel muss mindestens die Hälfte der Höhe des Griffstocks erreichen, um das Filament einzufügen. (F-G) Befestigung des Nitinol-Filaments durch Verkleben in einen hölzernen Popsicle-Stickgriff mit Einsteckloch. (H–L) Kalibrierung mechanischer Sonden durch Drücken gegen eine Waage. (M) Werte der Kraft (in mN) und des Drucks (in kPa), die von verschiedenen mechanischen Sonden erzeugt werden. Die Länge jedes Nitinol-Filaments, das zum Bau der Sonden verwendet wird (P1–P10; P: Sonde) ist in Zentimetern (cm) detailliert. (N) Ein Bild eines kompletten Satzes mechanischer Sonden von 174 kPa bis 5.116 kPa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mechanischer Nozieptionstest: Von Frey-ähnliche Filamente erzeugen eine Dosis-Wirkungs-Kurve aversiver Rollverhalten und verursachen Gewebeschäden an sensorischen Neuronen. (A) Bilder der verschiedenen Stadien (zweite und dritte Instar) von Drosophila Larven. Maßstabsleiste: 2 mm. (B) Karikatur der dorsalen Ansicht der dritten Instar Drosophila Larven. Der rote Punkt zeigt das Bauchsegment an, in dem die mechanische Sonde aufgebracht wird. T: Brustsegment; A: Bauchsegment. Andere anatomische Sehenswürdigkeiten sind beschriftet. (C) Karikatur des Assays: Eine mechanische Sonde wird auf die dorsale Seite der Larve aufgetragen, bis sie sich gegen die darunter liegenden Oberfläche biegt und dann für 2 s gehalten wird. Wenn der Druck ausreichend hoch ist, löst dies bei der Freisetzung eine aversive rollende Reaktion aus. (D) Verhaltensdosis-Reaktion; jeder blaue Punkt stellt den Prozentsatz der Larven dar, die mit aversivem Rollen auf die mechanische Stimulation innerhalb eines Satzes von 10 Tieren reagierten. Geigendiagramm des Prozentsatzes des aversiven Walzverhaltens, das durch verschiedene mechanische Sonden induziert wird. kPa: Kilopascal. Box-Plots stellen median (grün), Schnurrhaare (rot) das 10. und 90. Perzentil dar. (E) Gewebeschäden: Dritte Instarlarven (vom Genotyp ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP zur Kennzeichnung nozizeptiver sensorischer Neuronen) wurden im Dorsalsegment A8 mit den angegebenen Drücken untersucht. Fluoreszierend beschriftet gepaarte ddaC Klasse IV sensorische Neuronen (über die dorsale Mittellinie) wurden dann untersucht (siehe Abschnitte 4 und 5). Weiße Bereiche (rote Sternchen) stellen Lücken oder Gewebeschäden dar. Maßstabsleiste: 100 m. In Panel B wird die Larve in der dorsalen Ansicht dargestellt, während es in C die seitliche Ansicht ist. Mechanische Sonden, die gegen die dorsale Cuticle-Epidermis-Seite der Larve gedrückt werden, erzeugen eine sendenkende ähnliche Tasche an der Kontaktstelle der Spitze der Sonde und der umliegenden Bereiche. Die durchgezogene schwarze Linie, die zur ventralen Seite gekrümmt ist, ist die Oberseite der Tasche, während die gestrichelte graue Seitenlinie die seitliche Seite und die Unterseite der Tasche darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mechanische Überempfindlichkeit nach UV-Schäden. (A) Schematic des experimentellen Entwurfs, um die Sensibilisierung zu testen. In der Mitte des dritten Insterns wurden mockbehandelt (nicht UV) oder UV-bestrahlt. Der mechanische Nociception-Assay wurde dann zu verschiedenen Zeitpunkten (2 h, 4 h, 8 h, 16 h und 24 h) nach Scheinbehandlung oder Bestrahlung durchgeführt. (B) Mechanische Allodynie: Der Anteil der Larven, die nach der Sondierung mit einem normalerweise unterschwelligen oder nicht schädlichen mechanischen Stimulus (200 kPa, 1,57 mN) zu den angegebenen Zeitpunkten nach Dermockbehandlung oder UV-Bestrahlung aversives Walzen aufweisen. (C) Mechanische Hyperalgesie: Der Anteil der Larven, die nach der Sondierung mit einem normalerweise suprathresholdn oder schädlichen mechanischen Stimulus (462 kPa, 3,63 mN) zu den angegebenen Zeitpunkten nach Dermock-Behandlung oder UV-Bestrahlung aversives Walzen aufweisen. Fehlerbalken geben mittelwert +/- SEM an. Für die statistische Analyse wurde ein zweischwanzungepaarter t-Testverwendet: *p < 0,05, **p < 0,01; ns: nicht signifikant. Jeder rote Punkt in den Panels B und C stellt den mittleren Anteil von 10 Larven, n = 3–6 Sätze pro Zeitpunkt/Bedingung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Normale Fortbewegung von Drosophila Larven. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Schädliche mechanische Stimulation der Drosophila-Larven. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: Subschwellige mechanische Stimulation von Drosophila-Larven. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Discussion
Wir modifizierten einen etablierten mechanischen Assay1,2,16 mit kundenspezifischen mechanischen Sonden aus Nitinol-Filamenten hergestellt. Diese Metalllegierung ermöglicht es uns, Filamente mit kleinerem Durchmesser zu verwenden, die der Größe der Drosophila-Larven entsprechen. Angellinien-basierte Monofilamente haben das Feld der fliegenden mechanischen Nociception bis heutedominiert 2,5,6,16. Unsere Nitinol-Filamente behalten ihre Form und ihren gemessenen Druck für ca. 3-5 Monate (unserer Erfahrung nach). Durch Variation der Länge und des Durchmessers der Nitinol-Filamente kann der Anwender eine breite Palette von Drücken erzeugen, die von der Unterschwelle bis zu einem nahezu vollständigen Rollverhalten reichen. Insbesondere ist die Herstellung von Unterschwellensonden mit den kleineren Nitinol-Filamenten mit kleinerem Durchmesser einfacher. Mit diesen Sonden fanden wir heraus, dass Druck, anstatt Kraft, konsistenterenocifensive Verhaltensreaktionen 4 hervorruft. Wir zeigen hier anhand eines etablierten UV-induzierten nozizeptiven Sensibilisierungsmodells7,10,13, dass diese Filamente auch ein nützliches Werkzeug zum Studium der mechanischen Überempfindlichkeit sind – Allodynie und Hyperalgesie.
Frühere Studien mit mechanischen Sonden aus Angelschnur hergestellt haben zueiner gewissen Variabilität in der Verhaltensreaktion 2,6,16,17geführt. Mehrere Faktoren können dies erklären. Erstens, da Druck die wichtige Variable ist, ist das Buffing der Filamentspitze, so dass sie abgerundet ist und keine scharfen Kanten hat, entscheidend. Zweitens ist die Meldung von Druckwerten und nicht nur Kraft für die Reproduzierbarkeit der Experimente wichtig, da verschiedene mechanische Sonden, die ähnliche Kräfte erzeugen, unterschiedliche Drücke erzeugen können4. Drittens ist es wichtig, nur eine mechanische Stimulation pro Larve mit schädlichen Sonden anzuwenden, da solche Sonden eine dosisabhängige Gewebeschädigung auf epidermalen4 und sensorischen neuronalen Ebenen verursachen (Abbildung 2E). Ein zweiter oder nachfolgender schädlicher mechanischer Stimulus, nachdem Gewebeschäden induziert wurden, könnte die Funktion der betroffenen peripheren sensorischen Neuronen beeinträchtigen und eine veränderte Verhaltensreaktion auslösen. In einer anderen Studie zeigten Larven, die zweimal mit schädlichen mechanischen Sonden stimuliert wurden, meist eine verbesserte Verhaltensreaktion5, was auf die Entwicklung einer akuten mechanischen Sensibilisierung (Hyperalgesie) hindeutet, die durch die Gewebeschädigung resultieren könnte, die durch den ersten schädlichen mechanischen Reiz hervorgerufen wird. Umgekehrt berichteten andere Autoren6 von einer gemischten (erhöhten oder verringerten) Verhaltensreaktion, was darauf hindeutet, dass die veränderte Verhaltensreaktion auf Schäden/Dysfunktion des neuronalen Gewebes zurückzuführen sein könnte. Die Stimulierung jeder Larve nur einmal eliminiert mögliche Abweichungen in Verhaltensreaktionen, die entweder durch Sensibilisierung oder Gewebeschäden entstehen. Viertens stimulierten wir mechanisch das Segment A8, das hintere als frühere Studien (bevorzugte Bereiche A3–A4)2,5,16ist. Sonden zwischen 3.900 kPa und 5.300 kPa, die auf segment A2 oder A8 angewendet wurden, zeigten keine Verhaltensunterschiede4. Darüber hinaus ist A8 im Vergleich zu A2–A4 mit mechanischen Sonden, die niedrigere Drücke erzeugen (<300 kPa), leichter zu stimulieren, da die Larve in dieser Region dünner und somit leichter komprimiert wird. Andere Studien zeigten, dass die schädliche mechanische Stimulation des hinteren Endes der Larve (geliefert durch einen starren Insektenstift, gehalten mit Zangen) meist eine Vorwärtsbewegung hervorrief, anstatt eine aversive oder rollende Reaktion18. Diese unterschiedliche Verhaltensreaktion könnte auf Unterschiede in den Eigenschaften der verwendeten Materialien (biegsames Nitinol-Filament vs. inkompressibleinsektenstiftende) oder auf unterschiedliche Drücke an die Larven zurückzuführen sein (der Druckwert des Insektenstifts wurde nicht gemeldet).
Die Entwicklung eines mechanischen Nociception Assays für Drosophila Larven hat es dem Feld ermöglicht zu entdecken, dass verschiedene mechanische sensorische Ionenkanäle und neuronale Schaltkreise die mechanische Nozieption5,6,16,17vermitteln. Jedoch, die Untersuchung der mechanischen Überempfindlichkeit (Allodynie und Hyperalgesie) ist verzögert, im Vergleich zur Sensibilisierung der anderen sensorischen Modalitäten - Hitze7,8,10,13,14, kalt9, und chemische3. Diese Verzögerung kann zum Teil auf das Fehlen geeigneter mechanischer Sonden zurückzuführen sein, die einen vollständigen Ansprechbereich erzeugen können, der den Unterschwellgegenüber bis zu den suprathresholddrücken überspannt. Von besonderer Bedeutung, insbesondere für die Beurteilung der mechanischen Allodynie, sind Unterschwellensonden, die nicht eine aversive rollende Reaktion von unverletzten Larven hervorrufen. Die Bedeutung unserer verbesserten mechanischen Sonden besteht darin, dass sie so hergestellt werden können, dass sie harmlose Reize (Unterschwelle 174 kPa–200 kPa) oder den niedrigen bis hohen schädlichen Bereich (suprathreshold 225 kPa bis 5.116 kPa) überspannen. Hier zeigen wir mit den Nitinol von Frey-ähnlichen Filamenten, dass Drosophila-Larven nach UV-Bestrahlung sowohl mechanische Allodynie als auch mechanische Hyperalgesie entwickeln. Die mechanische Sensibilisierung zeigt einige Unterschiede im Vergleich zur thermischen Sensibilisierung. Sowohl der Beginn als auch der Höhepunkt der mechanischen Sensibilisierung ist früher (ca. 4 h) im Vergleich zur thermischen (Wärme-)Sensibilisierung (8 h für Hyperalgesie und 24 h für Allodynie)7. Darüber hinaus sind die mechanische Allodynie und Hyperalgesie gleichzeitig (beide Spitzenwert bei 4 h). Während sich die Wärmesensibilisierung (Allodynie und Hyperalgesie) zu späteren Zeitpunkten7vollständig auflöst, zeigte die mechanische Überempfindlichkeit einen langen Schwanz, der leicht über der Ausgangsbasis blieb. Die KalteSensibilisierung in Drosophila beinhaltet einen Wechsel in kalt evozierten Verhaltensweisen9 und das Aufkommen neuer kaltevokierter Verhaltensweisen – ein Phänomen, das bei mechanischer Stimulation nicht beobachtet wird. Diese Unterschiede in Beginn, Dauer und beobachteten Verhaltensweisen deuten darauf hin, dass jede sensorische Modalität durch unterschiedliche Signalwege gesteuert werden kann. Die Kombination des hier beschriebenen Sensibilisierungs-Assays mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen, die in Drosophila zur Verfügung stehen, sollte eine präzise genetische Zerlegung der beobachteten mechanischen Überempfindlichkeit (Allodynie und Hyperalgesie) ermöglichen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Thomas Wang für die Entwicklung des Prototyps von Frey Filamenten, Patrick J. Huang für die Verbesserung des mechanischen Sondentests, des Bloomington Drosophila Stock Center für die Steuerung (w1118) und ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP-Fliegenbestände n. Chr. sowie Galko-Labormitgliedern für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von R21NS087360 und R35GM126929 zu MJG unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
| Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
| Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
| Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
| Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
| Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
| Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
| Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
| Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
| Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
| Microscope Cover Glass 22x22 | Fisher | 12-545-B | |
| Microscope Cover Glass 22x40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
| Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
| Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
| Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
| Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
| Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
| W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
| ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |
References
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