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Behavior

ड्रोसोफिला लार्वा में यांत्रिक एनओसी को मापने के लिए एक बेहतर परख और उपकरण

Published: October 29, 2020 doi: 10.3791/61911
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Graduate Program, Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Genetics and Epigenetics Graduate Program, Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह दिखाना है कि ड्रोसोफिला लार्वा में यांत्रिक एनओसी के लिए बेहतर परख कैसे करें। हम यहां परख का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए करते हैं कि ड्रोसोफिला लार्वा में यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता (एलोडिनिया और हाइपरएल्जेसिया) मौजूद है।

Abstract

ड्रोसोफिला में यांत्रिक एनओसी के लिए प्रकाशित परख ने व्यवहार के चर आकलन का नेतृत्व किया है। यहां, हमने ड्रोसोफिला लार्वा, अनुकूलित धातु निकल-टाइटेनियम मिश्र धातु (नितिनोल) फिलामेंट्स के साथ उपयोग के लिए गढ़े। ये यांत्रिक जांच यांत्रिक एनओसी को मापने के लिए कशेरुकी में उपयोग किए जाने वाले वॉन फ्रे फिलामेंट्स के समान हैं। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि इन यांत्रिक जांचों को कैसे बनाया जाए और कैसे उपथरेसहोल्ड (अहानिकर या गैर-हानिकारक सीमा) से सुपरथ्रेसहोल्ड (कम से उच्च हानिकारक रेंज) उत्तेजनाओं तक पूर्ण व्यवहार खुराक-प्रतिक्रिया उत्पन्न की जाए। जांच की उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए, हमने ड्रोसोफिला लार्वा में ऊतक क्षति-प्रेरित अतिसंवेदनशीलता की जांच की। ड्रोसोफिला लार्वा में यांत्रिक एलोडि़यानिया (सामान्य रूप से अहानिकर यांत्रिक उत्तेजना के प्रति अतिसंवेदनशीलता) और हाइपरएल्जेसिया (एक हानिकारक यांत्रिक उत्तेजना के लिए अतिरंजित जवाबदेही) अभी तक स्थापित नहीं किया गया है। यांत्रिक जांच का उपयोग करना जो आम तौर पर अहानिकर या जांच करते हैं जो आमतौर पर एक अपरिवर्तनीय व्यवहार को प्रकाश में लेते हैं, हमने पाया कि ड्रोसोफिला लार्वा ऊतक क्षति के बाद यांत्रिक हाइपरसेंसिटाइजेशन (दोनों एलोडिनिया और हाइपरएल्जेसिया) विकसित करता है। इस प्रकार, यांत्रिक जांच और परख है कि हम यहां वर्णन की संभावना महत्वपूर्ण उपकरण के लिए मौलिक आणविक/यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता के आनुवंशिक तंत्र विच्छेदन होगा ।

Introduction

ड्रोसोफिला लार्वा विभिन्न हानिकारक उत्तेजनाओं के संपर्क में आने पर एक विशिष्ट अपरिवर्तनीय रोलिंग व्यवहार प्रदर्शित करता है: थर्मल1,मैकेनिकल2और रासायनिक3। यह व्यवहार सामान्य लोकोमोशन से स्पष्ट रूप से अलग है। यहां हम एक बेहतर यांत्रिक परख का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग यांत्रिक एनओसी और यांत्रिक संवेदीकरण का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

हाल ही में एक अध्ययन में, हमने नितिनोलतारोंका उपयोग करके वॉन फ्रे-जैसे फिलामेंट्स को गढ़ा। विभिन्न ताकतों और दबावों को लागू करने वाले जांच प्रत्येक जांच बनाने वाले नितिनोल तारों की लंबाई और व्यास को अलग-अलग करके किए गए थे। यांत्रिक जांच को कैलिब्रेट किया गया था और प्रत्येक जांच4के टिप क्षेत्र के आधार पर मापा गया बल मूल्यों (मिलिनेटन, एमएन में) को दबाव (किलोपास्कल, केपीए) में परिवर्तित कर दिया गया था। यांत्रिक जांच के कस्टम निर्माण ने हमें सुपरट्रेसहोल्ड (225 केपीए से 5318 केपीए) दबावों के लिए उपधार (≤200 केपीए) उत्पन्न करने की अनुमति दी, जो सैद्धांतिक रूप से यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है। इन बेहतर यांत्रिक वॉन Frey की तरह तंतुओं का उपयोग करके, हमने दिखाया कि दबाव4,जैसा कि पहले से जांचे गए बल2,5,6 ड्रोसोफिला लार्वा में अपरिवर्तनीय व्यवहार जवाबदेही के साथ अधिक लगातार संबंधित है। यहां वर्णित बेहतर यांत्रिक परख ने एक संरक्षित संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) से संबंधित रिसेप्टर टायरोसिन किनेज की पहचान करने में भी मदद की जो मक्खियों और चूहों में यांत्रिक नोक-ियत कोनियंत्रितकरता है ।

थर्मल (गर्मी और ठंड) और रासायनिक संवेदी तौर-तरीकों3,7,8,9,10की तुलना में ड्रोसोफिला लार्वा में यांत्रिक एलोडिनिया और हाइपरलजेसिया, अतिसंवेदनशीलता के दो तौर-तरीकों का अपेक्षाकृत कम अध्ययन किया जाता है। यह संभवतः विशिष्ट यांत्रिक जांच की कमी के कारण है जो अहानिकर उत्तेजनाओं से लेकर उच्च हानिकारक रेंज2,5,6तक है । एक सामान्य रूप से अहानिकर उत्तेजना जो ड्रोसोफिला लार्वा के बाद विशिष्ट अपरिवर्तनीय रोलिंग व्यवहार को प्रकाश में आती है ऊतक क्षति का अनुभव3,7 को एलोडिनिया के रूप में जाना जाता है। आम तौर पर हानिकारक उत्तेजना के प्रति अतिरंजित रोलिंग प्रतिक्रिया को हाइपरएल्जेसिया 7 के रूप में जानाजाताहै । हानिकारक उत्तेजनाओं को उन लोगों के रूप में परिभाषित किया जाता है जो ऊतक क्षति को प्रकाश में लेते हैं और11को सक्रिय कर सकते हैं । ड्रोसोफिला लार्वा को वितरित हानिकारक उत्तेजनाएं या तो बैरियर एपिडर्मिस, परिधीय नोसिप्टिव संवेदी न्यूरॉन्स3,4,7,या दोनों को नुकसान पहुंचाती हैं।

इस लेख में, हम यह प्रदर्शित करते हैं कि कैसे ड्रोसोफिला लार्वा के लिए उपयुक्त वॉन फ्रे-जैसे यांत्रिक जांच को कस्टम और कैलिब्रेट करें। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि ड्रोसोफिला लार्वा में यांत्रिक नोसिमेटिव प्रतिक्रियाओं को परखने के लिए इन जांचों का उपयोग कैसे किया जाए। अंत में, हम ड्रोसोफिला लार्वा (प्रतिनिधि परिणामदेखें) में ऊतक क्षति के बाद, एलोडिनिया और हाइपरलेजेसिया दोनों यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए उनका उपयोग करके इन जांचों की उपयोगिता को प्रदर्शित करते हैं।

Protocol

1. मैकेनिकल जांच निर्माण

  1. प्रत्येक नितिनोल फिलामेंट(चित्रा 1B),अपनी लंबी धुरी के लंबवत, निर्दिष्ट लंबाई(चित्रा 1एम-एन)को एक छोटे तार कटर(चित्रा 1C)का उपयोग करके काटें। फिलामेंट्स तीन अलग-अलग प्री-सेट व्यास(चित्रा 1B)में आते हैं।
    नोट: यहां निर्दिष्ट लंबाई माउंट के निर्माण के लिए एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए अनुमानित दबावों को प्राप्त करने के लिए एक गाइड हैं। अंततः, तंतु में कटौती की लंबाई की परवाह किए बिना, और माउंट में छेद की गहराई, तंतु मापा जाना चाहिए/सटीक बल/दबाव मूल्य प्राप्त करने के लिए एक संतुलन पर अंशांकित ।
  2. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत फिलामेंट की नोक की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई तेज या अनियमित किनारे न रहें क्योंकि ये लार्वा की त्वचा को ऊतक क्षति पहुंचा सकते हैं और अंशांकन में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  3. मैन्युअल रूप से एक तेज पत्थर का उपयोग करके यांत्रिक जांच के तेज किनारों को चिकना करें जब तक कि कोई तेज अनियमितता नहीं बनी हो(चित्रा 1D)।
  4. एक हाइपोडर्मिक सुई (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके लकड़ी के पॉप्सिकलस्टिक (चित्रा 1E)के अंत की ओर एक छेद बनाएं। पॉप्सिकलस्टिक (चित्रा 1E)की ऊंचाई के माध्यम से कम से कम आधे रास्ते में सुई डालें। यह नितिनोल फिलामेंट के सम्मिलन के लिए एक कक्ष बनाता है।
  5. एक एकल नितिनोल फिलामेंट(चित्रा 1F)पर लकड़ी के गोंद को लागू करें और लकड़ी के पॉप्सिकलस्टिक (चित्रा 1G)में सुई स्लॉट में गोंद-लेपित फिलामेंट डालें। ~ 5 घंटे के लिए सूखने की अनुमति दें।
  6. प्रत्येक यांत्रिक जांच को एक पैमाने के खिलाफ दबाकर तब तक कैलिब्रेट करें जब तक कि यांत्रिक जांच झुकती न हो(चित्रा 1एच-एल)। यह अधिकतम बल का बिंदु है जिसे ग्राम में दर्ज किया जा सकता है। फिलामेंट व्यास (पूर्व-सेट) और लंबाई (उपयोगकर्ता-निर्धारित) के आधार पर बलों और दबावों की एक पूरी श्रृंखला उत्पन्न की जा सकती है।
  7. फॉर्मूला एफ = एमए (बल गुरुत्वाकर्षण त्वरण द्वारा गुणा द्रव्यमान के बराबर है) का उपयोग करके मिलिनेटन (एमएएन) में बल के लिए चरण 1.6 में दर्ज द्रव्यमान को परिवर्तित करें। च: बल; मीटर: बड़े पैमाने पर; क: गुरुत्वाकर्षण त्वरण (9.8 मीटर /s2)(चित्रा 1M)।
  8. अंत में, फिलामेंट टिप(चित्रा 1M)के सतह क्षेत्र द्वारा मापा बल विभाजित करके किलोपास्कल (केपीए) में गणना बल को दबाव (बल/क्षेत्र) में परिवर्तित करें। क्षेत्र की गणना करने के लिए, इंच (0.04", 0.06", और 0.08") से विभिन्न नितिनोल फिलामेंट्स के व्यास को सेंटीमीटर में परिवर्तित करें। फिर,2 (जहां, आर = नितिनोल फिलामेंट त्रिज्या) क्षेत्र निर्धारित करता है (चित्रा 1Mदेखें)। विभिन्न व्यास और लंबाई के तंतुओं का उपयोग करके कई जांच तैयार करने से ड्रोसोफिला लार्वा (चित्र 1एनमें दिखाया गया नमूना) के लिए उत्तरदायी रेंज में फैले एक पूर्ण सेट उत्पन्न होंगे।
    नोट: प्रत्येक यांत्रिक जांच की जांच कम से कम हर 3-4 सप्ताह में करें। जब दबाव मूल उपाय से ± 3% से अधिक से विचलित होता है, तो एक नई यांत्रिक जांच गढ़ी जानी चाहिए ।

2. लार्वा की तैयारी

  1. नियंत्रण तनाव बढ़ाएं(डब्ल्यू1118)लार्वा संतान या लार्वा जिसमें ट्रांसजीन पीपीके-Gal4>UAS-mCD8-GFP (संवेदी न्यूरॉन्स को नुकसान की कल्पना करने के लिए) एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में मानक भोजन पर। आमतौर पर, स्टॉक नियमित रूप से 18 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है लेकिन माता-पिता और लार्वा संतान दोनों को प्रयोगों के लिए मानक कॉर्नमील भोजन पर 25 डिग्री सेल्सियस पर पाला जाता है।
    नोट: वयस्क मक्खियों (पांच पुरुषों और दस महिलाओं, 1:2 अनुपात) मक्खी शीशियों में रखा जाता है, अंडे बिछाने की अनुमति देने के लिए, के बारे में 24 घंटे के लिए । अंडे बिछाने (एईएल) के बाद का समय तब से शुरू होता है जब वयस्कों को हटा दिया जाता है।
  2. अंडे बिछाने के लगभग 96 घंटे के बाद, लार्वा युक्त नरम फ्लाई भोजन में नल के पानी को धीरे-धीरे फुहार करके, तीसरे इंस्टार लार्वा को इकट्ठा करें। भटक लार्वा है कि भोजन छोड़ दिया है, या जो पूर्वकाल या पीछे सर्पिल कभी है, इस परख के लिए बहुत बड़े/पुराने हैं । दूसरा इंस्टार लार्वा (लंबाई में 4 मिमी से कम) बहुत छोटा है।
  3. नरम फ्लाई फूड की सामग्री को एक साफ मानक आकार पेट्री डिश (100 मिमी x 15 मिमी) में डालें।
  4. संदंश का उपयोग करना, मिड थर्ड इंस्टार, मध्यम आकार, लार्वा (चित्रा 2 एदेखें) छोटे (दूसरे इंस्टार और शुरुआती तीसरे इंस्टार) या बड़े (देर से या भटकने वाले तीसरे स्टार) लार्वा से सॉर्ट करें। लार्वा को किसी भी ऊतक क्षति से बचने के लिए संदंश के साथ कोमल हेरफेर की सिफारिश की जाती है।
    नोट: संदंश का उपयोग कर हस्तांतरण ज्यादातर पानी के तनाव पर आधारित है और संदंश के ब्लेड के साथ लार्वा पर दबाव लागू करने से नहीं। लार्वा पैंतरेबाज़ी के लिए संदंश के उपयोग का एक विकल्प नरम पेंट ब्रश है। या तो उपकरण के साथ, उपयोगकर्ता को जानवरों को स्थानांतरित करने का अभ्यास करना चाहिए, ताकि अनपेक्षित ऊतक क्षति का कारण न बन सके जो व्यवहार माप को जटिल बना सके।
  5. मध्य तीसरे इंस्टार लार्वा को स्थानांतरित करें, संदंश का उपयोग करके, एक छोटे पेट्री डिश (30 मिमी x 15 मिमी) में, जिसमें कमरे के तापमान पर पानी के साथ गीला फ्लाई फूड का एक छोटा प्लग होता है। लार्वा को छोटे पेट्री डिश में तब तक रखें जब तक कि प्रयोग न हो जाएं, लेकिन 20 मिनट से अधिक समय तक न करें।
    नोट: आम तौर पर, खाद्य प्लग में 20-30 लार्वा स्थानांतरित करने से 20 मिनट के व्यवहार परख के लिए पर्याप्त संख्या मिलेगी।

3. मैकेनिकल एनओसी परख

  1. एक उज्ज्वल क्षेत्र स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत काले या गहरे विनाइल के पतले पैड पर एक मध्य-तीसरे इंस्टार लार्वा (संदंश का उपयोग करके) रखें। गहरा रंग विपरीत प्रदान करता है जो लार्वा के दृश्य में सुधार करता है। डार्क विनाइल का स्वतंत्र रूप से चल टुकड़ा होना बेहतर है क्योंकि यह उपयोगकर्ता को इसे छूने या चोट पहुंचाए बिना लार्वा को संरेखित करने की अनुमति देता है।
  2. माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस और काले या गहरे विनाइल पैड के बीच ऑप्टिकल फाइबर रोशनी रखो; यह लार्वा देखने के लिए पर्याप्त उच्च विपरीत रोशनी की अनुमति देगा।
  3. पैड में स्थानांतरण के बाद सामान्य लोकोमोशन प्रदर्शित नहीं करने वाले लार्वा को त्यागें। ये सामान्य न्यसीप्टिव व्यवहार प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप कर सकते हैं। सामान्य लोकोमोशन के लिए, देखें वीडियो 1।
  4. एक कागज तौलिया का उपयोग करके, लार्वा के आसपास का कोई अतिरिक्त पानी, जो लार्वा को विनाइल पैड पर तैरने का कारण बन सकता है, दूर पोंछें।
  5. डार्क विनाइल पैड को हिलाकर लार्वा को ओरिएंट करें। लार्वा का सिर/मुंह बाईं ओर इंगित करना चाहिए यदि आप दाएं हाथ के हैं और इसके विपरीत यदि आप बाएं हाथ(चित्रा 2ए-बी)हैं ।
  6. चुने हुए यांत्रिक जांच को लागू करें, आमतौर पर 1-2 एस के लिए, लगभग पेट खंड A8 (चित्रा 2Bदेखें) पर लार्वा के पीछे पृष्ठीय पक्ष पर, जब तक कि जांच झुकता न हो और दबाव की पहले मापी गई मात्रा(चित्रा 2 सी)प्राप्त न हो जाए। यह महत्वपूर्ण है कि जांच लार्वा की पृष्ठीय सतह के खिलाफ दबाती है और जांच संपर्क के बिंदु पर लार्वा को अंतर्निहित पैड में संकुचित करती है।
    नोट: नितिनोल फिलामेंट और पृष्ठीय क्यूटिकल-एपिडर्मिस की नोक के बीच संपर्क के बिंदु पर, 2,300 केपीए से कम जांच करता है, मुख्य रूप से क्यूटिकल और अंतर्निहित ऊतकों को मर्मित किए बिना मोड़ता है। इस तरह की जांच शायद ही कभी लार्वा मृत्यु दर को प्रभावित करती है4. उच्च दबाव (>5,000 kPa) जांच दोनों मोड़ और, कभी कभी, क्यूटिकल और अंतर्निहित ऊतकों में प्रवेश करती है। लार्वा का पंचर लार्वा अस्तित्व 4 को ख़राब करता है और, यदि देखा जाता है, तो इन लार्वाों को आमतौर पर व्यवहार विश्लेषण से छोड़ दियाजाता है।
  7. प्रत्येक लार्वा के लिए व्यवहार प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करें। एक सकारात्मक अस्वीकार्य प्रतिक्रिया(वीडियो 2)इंगित की जाती है कि लार्वा 3 एस के भीतर अपने शरीर की धुरी के साथ 360 डिग्री का पूरा रोल दिखाता है। अन्य प्रतिक्रियाएं (बारी, तेजी से रेंगने और विगलिंग का प्रयास) इस परख के प्रयोजनों के लिए नकारात्मक मानी जाती हैं।
    नोट: एक उपथरेहोल्ड यांत्रिक उत्तेजना (200 केपीए) के साथ उत्तेजित लार्वा ने विशिष्ट नोसिपेप्टिव या रोलिंग प्रतिक्रिया(वीडियो 3)को प्रकाश में नहीं लिया। कुछ लार्वा ने आंदोलन की दिशा में परिवर्तन जैसे तेजी से आगे या हल्के स्पर्श प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया।
  8. लार्वा को त्यागें और परख के लिए अगले एक को तैयार करें, चरण 3.1 को 3.7 से दोहराएं।
  9. लार्वा की वांछित संख्या तक पहुंचने तक 3.1-3.7 दोहराएं (प्रत्येक जांच के लिए यहां एन = 10 लार्वा के तीन से छह सेट का उपयोग किया गया था)।
    नोट: कम दबाव यांत्रिक जांच (174-462 kPa) का उपयोग करते समय, परख लार्वा प्रति अधिक समय लगेगा। इसका कारण यह है कि लंबे समय तक तंतुओं की नोक अधिक दोलन करती है, जिससे A8 सेगमेंट के केंद्र में लार्वा को प्रहार करना कठिन हो जाता है। इन जांचों के साथ अभ्यास आवश्यक है।

4. न्यूरोनल आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. एक लार्वा (जीनोटाइप पीपीके-Gal4>UAS-mCD8-GFP के संवेदी न्यूरॉन्स लेबल के लिए) पहले एक कोप्लिन जार के अंदर एक ईथराइजेशन कक्ष में एक नितिनोल फिलामेंट के साथ उत्तेजित होता है जिसमें एक 10 एमएल बीकर होता है जिसमें एक कपास की गेंद होती है जिसमें ~1 एमएल डाइथाइल ईथर से भिगोया जाता है। लार्वा ~ 5 मिनट के लिए कक्ष में बैठने दें।
    नोट: हमारे समूह12द्वारा प्रकाशित पिछले अध्ययन में ईथराइजेशन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है ।
  2. लार्वा धीरे ईथराइजेशन कक्ष से एक छोटे पेट्री डिश में कुल्ला।
  3. तैयार एक माइक्रोस्कोप स्लाइड, दो छोटे कवरस्लिप (22 x 22 मिमी), और एक लंबे कवरस्लिप (22 x 54 मिमी) (सामग्री की तालिकादेखें) है।
  4. ईथर की छोटी बूंदें जोड़ें: तेल समाधान (हेलोकार्बन तेल समाधान के लिए एथिल ईथर का 1:5 अनुपात, सामग्री की तालिकादेखें) स्लाइड के दोनों सिरों पर, फिर छोटी बूंदों के शीर्ष पर छोटे कवरस्लिप रखें। यह व्यवस्था एक छोटी सी जगह अंतर बनाती है जहां लार्वा फिट हो सकता है।
    नोट: माइक्रोस्कोप स्लाइड के खिलाफ छोटे कवरस्लिप दबाएं जब तक कि फिसलना मुश्किल न हो जाए।
  5. ईथर की कुछ बूंदें जोड़ें: माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच में तेल समाधान और फिर माइक्रोस्कोप स्लाइड (छोटे कवर्लिक के बीच) के केंद्र पर, संदंश का उपयोग करते हुए लार्वा रखें। सुनिश्चित करें कि लार्वा की एंटेरोपोस्टर धुरी स्लाइड के छोटे पक्ष के समानांतर है और पृष्ठीय पक्ष का सामना करना पड़ रहा है।
  6. लार्वा को लार्वा के शीर्ष पर रखे गए लंबे कवरस्लिप और दो छोटे कवरस्लिप के साथ कवर करें।
    नोट: उदारता से लंबे कवरस्लिप को तब तक दबाएं जब तक कि लार्वा लगभग सपाट न हो जाए।
  7. लेजर वेवलेंथ 488 (जीएफपी) का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके लार्वा का छवि खंड A8।
    नोट: लार्वा को तुरंत इमेज करें क्योंकि ईथर के माध्यम से एनेस्थेटाइजेशन जल्दी से फीका हो जाएगा (~ 5-10 मिनट) और लार्वा जाग जाएगा और आगे इमेजिंग को जटिल बना देगा।
  8. 1x ज़ूम पर 20x न्यूमेरिकल अपर्चर (एनए) 0.7 ड्राई ऑब्जेक्टिव लेंस, 1.5 माइक्रोन के स्टेप साइज का उपयोग करके 1024 x 1024 पिक्सल के रेजोल्यूशन पर जेड-स्टैक इमेज कैप्चर करें।

5. ऊतक क्षति का मात्रा

  1. धारा 4.8 से जेड-सीरीज स्टैक छवियों को एक जेड प्रोजेक्शन में इकट्ठा करें और परिवर्तित करें (विभिन्न फोकल विमानों पर ली गई कई छवियों को एक समग्र छवि में सपाट करें)। यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर (जैसे, ओलंपस फ्लोरव्यू) या किसी भी समकक्ष ओपन सोर्स प्लेटफॉर्म, जैसे, फिजी/इमेज जे का उपयोग करके प्रदर्शन किया जा सकता है।
  2. इमेज एनालिसिस प्रोग्राम फिजी/इमेजजे खोलें ।
  3. मेनू बार से फ़ाइलपर क्लिक करें, और प्रदर्शित विंडो से ओपन चुनें।
  4. संग्रहीत एकल छवि प्रक्षेपण का चयन करें, झगड़ा प्रारूप में सहेजा, विश्लेषण किया जाएगा ।
  5. मेनू बार से एडिटपर क्लिक करें, और प्रदर्शित विंडो से इनवर्ट विकल्प चुनें।
  6. मेनू बार से, छविपर क्लिक करें, फिर प्रदर्शित विंडोसे समायोजितकरें, और अंत में ब्राइटनेस/कंट्रास्ट विकल्प का चयन करें।
  7. गैप (यदि कोई हो) के क्षेत्र को मापने के लिए टूल बार से फ्रीहैंड शेप विकल्प चुनें।
  8. विश्लेषणपर क्लिक करें, मेनू बार से, और उपाय विकल्प का चयन करें । यह अंतर या घाव के क्षेत्र को प्रदर्शित करेगा।

Representative Results

हमने नितिनोल फिलामेंट्स(चित्रा 1,एन)का उपयोग करके अनुकूलित यांत्रिक जांच विकसित की है, यांत्रिक रूप से पैदा किए गए व्यवहार को प्रकाश में लाने के लिए और अलग-अलग तीव्रता(चित्रा 2डी)दोनों की अहानिकर और हानिकारक यांत्रिक जांच का उपयोग करके एक पूर्ण व्यवहार खुराक प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न किया है जो यह प्रदर्शित करता है कि इन जांचों का उपयोग बेसलाइन (चोट की अनुपस्थिति में) यांत्रिक नोक-्टिलेशन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

हमारे व्यवहार परख परिणाम निर्धारित किया है कि जांच २०० kPa (~ १.५७ एमएन)(चित्रा 1M)से नीचे दबाव डालती है, जब Drosophila लार्वा के लिए लागू किया, एक aversive रोलिंग प्रतिक्रिया भड़काने नहीं है(चित्रा 2D और वीडियो 3)। जैसा कि अपेक्षित था, इन उप-हानिकारक यांत्रिक जांच (175 केपीए या 200 केपीए) ने दृश्यमान न्यूरोनल ऊतक क्षति(चित्रा 2E)को प्रकाश में नहीं लिया। क्योंकि वे नुकसान को प्रेरित नहीं करते हैं, इस तरह की जांच यांत्रिक एलोडिनिया (सामान्य रूप से गैर-हानिकारक यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए अतिसंवेदनशीलता) का आकलन करने के लिए उपयोगी हो सकती है। इसके विपरीत, सुप्राथहोल्ड या हानिकारक जांच (462 केपीए से 5,116 केपीए तक), एक संवर्धित व्यवहार प्रतिक्रिया(चित्रा 2डी)को खुराक निर्भर तरीके से प्राप्त किया गया- उच्च दबावों के साथ मजबूत व्यवहार प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करना। जैसा कि प्रत्याशित है, सुप्राथहोल्ड मैकेनिकल प्रेशर ने खुद को परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स(चित्रा 2E)के लिए खुराक-निर्भर ऊतक क्षति को भी प्रेरित किया। ऊतक क्षति के मापा क्षेत्र(μm 2 ± मानक विचलन में) प्रत्येक समूह के लिए चार लार्वा से लिया गया: २,०५१.०३ ± ७०३.८१ (४६२ kPa), ५,१०२.०२.०.०२. 29 ± 1,004.67 (2,283 kPa), और 12,238.83 ± 3,724.11 (5,116 kPa) । इस प्रकार, 462 केपीए (~ 63 एमएन) से अधिक या उसके बराबर दबाव, जो एक अपरिवर्तनीय रोलिंग प्रतिक्रिया (लार्वा के 25% या उससे अधिक में) पैदा करता है और दृश्यमान न्यूरोनल ऊतक क्षति(चित्रा 2E)का कारण बनता है, यांत्रिक हाइपरलेजेसिया (सामान्य रूप से हानिकारक यांत्रिक उत्तेजना के लिए अतिसंवेदनशीलता) का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है। Nociceptive यांत्रिक जांच (≥462 kPa) हमेशा ऊतक क्षति प्रेरित (एन = 10, गुणात्मक मूल्यांकन) लेकिन हमेशा एक aversive रोलिंग प्रतिक्रिया भड़काने नहीं है ।

यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता (एलोडिनिया और हाइपरलेजेसिया) का मूल्यांकन करने के लिए, हमने नकसीर संवेदीकरण के एक अच्छी तरह से स्थापित ड्रोसोफिला लार्वा मॉडल का उपयोग किया जो ऊतक क्षति7,12को प्रेरित करने के लिए पराबैंगनी प्रकाश (यूवी) विकिरण का उपयोग करता है। इस परख ने थर्मल अक्षेसिव अतिसंवेदनशीलता 8 , 9 , 10 , 13,14,15के आनुवंशिक और सेलुलर तंत्र को विच्छेदन करने में मददकीहै । यह निर्धारित करने के लिए कि क्या यूवी उपचार यांत्रिक एलोडिनिया का कारण बनता है, मिड थर्ड-इनस्टार कंट्रोल(w1118)लार्वा नकली-विकिरणित या यूवी-विकिरणित (15-20 mJ/सेमी2)(चित्रा 3 ए)थे। फिर, लार्वा का सामान्य रूप से उपथरेहोल्ड मैकेनिकल जांच (200 केपीए, 1.57 एमएन) के साथ 2 घंटे, 4 घंटे, 8 एच, 16 एच और 24 घंटे के बाद उपचार पर व्यवहारपूर्वक परीक्षण किया गया। लगभग 20% लार्वा ने यूवी उपचार के बाद 2 घंटे के रूप में जवाब दिया, जबकि 50% ने क्रमशः 6.6% और 8.3% नकली यूवी-विकिरणित जानवरों की तुलना में 4 घंटे में जवाब दिया(चित्रा 3 B)। यह इंगित करता है कि यूवी-प्रेरित ऊतक क्षति 4 घंटे के बाद विकिरण पर यांत्रिक एलोडिनिया का कारण बनता है। बाद के समय बिंदुओं (8 एच, 16 एच, और 24 एच) यूवी-इलाज लार्वा की व्यवहार प्रतिक्रिया 16%-20% उत्तरदाताओं (एन = 3-6 प्रत्येक लार्वा के औसत मतलब) की सीमा में थी, नकली-विकिरणित नियंत्रण समूह (3%-6% उत्तरदाताओं की सीमा में) की तुलना में थोड़ा बढ़ा (लेकिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं) एन का औसत मतलब = 10 लार्वा प्रत्येक के 3-6 सेट)(चित्रा 3B)।

मैकेनिकल हाइपरएल्जेसिया की जांच करने के लिए, एक सुपरराथहोल्ड दबाव (462 केपीए, 3.63 एमएन) जो आम तौर पर ~ 20% लार्वा(चित्रा 2D)में एक अपरिवर्तनीय रोलिंग प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है और न्यूरोनल ऊतक क्षति(चित्रा 2E)का कारण बनता है, का उपयोग किया जाता था। हमने यूवी-प्रेरित ऊतक क्षति(चित्रा 3 ए)के साथ या बिना लार्वा के पृष्ठीय पक्ष पर 462 केपीए जांच लागू की। हमने पाया कि यूवी उपचार के बाद 4 एच, 8 एच और 16 एच पर जांच किए गए लार्वा ने एवर्सिव रोलिंग रिस्पांस में महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई, जिसमें 4 एच व्यवहार अतिसंवेदनशीलता (~ 60% उत्तरदायी) का शिखर है; नकली यूवी-विकिरणित जानवरों ने ~ 27% अपरिवर्तनीय प्रतिक्रिया(चित्रा 3C) दिखाया। यांत्रिक एलोडिनिया के समान, 8 घंटे, 16 घंटे और यूवी-उपचारित जानवरों के 24 घंटे (36%-42% की सीमा में) पर व्यवहार प्रतिक्रिया गैर-उपचारित लार्वा (20%-26% की सीमा में) से सांख्यिकीय रूप से अविवेच्य था। देर से तीसरे इंस्टार चरण में लार्वा ने मध्य तीसरे इंस्टार चरण की तुलना में बेसलाइन व्यवहार प्रतिक्रिया की थोड़ी कमी दिखाई। हम परिकल्पना करते हैं कि यह या तो लार्वा(चित्रा 2 ए)के बढ़े हुए आकार या शरीर को कवर करने वाले क्यूटिकल की बढ़ी हुई मोटाई से हो सकता है। यह तथ्य यह समझा सकता है कि विकास के बाद के चरण में यूवी उपचार अधिक यांत्रिक संवेदीकरण को प्रेरित क्यों नहीं करता है, जैसा कि 4 एच पोस्ट यूवी उपचार मनाया गया है।

एक साथ लिया, हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि ड्रोसोफिला लार्वा यूवी-प्रेरित ऊतक क्षति के बाद यांत्रिक एलोडिनिया और मैकेनिकल हाइपरएल्जेसिया दोनों विकसित करते हैं। मैकेनिकल एलोडिनिया और हाइपरएल्जेसिया का पीक टाइम यूवी उपचार के बाद 4 एच है; हालांकि, मैकेनिकल हाइपरएल्जेसिया में अधिक स्पष्ट अस्थायी पूंछ होती है क्योंकि यह यांत्रिक एलोडिनिया की तुलना में धीरे-धीरे बेसलाइन पर लौटता है।

Figure 1
चित्रा 1: ड्रोसोफिला लार्वा में यांत्रिक एनओसी का मूल्यांकन करने के लिए वॉन फ्रे-जैसे उपकरण का विकास। ड्रोसोफिला लार्वा में यांत्रिक एनओसी का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली यांत्रिक जांच की तस्वीर। (ख)नितिनोल फिलामेंट्स और उनके सापेक्ष व्यास को सापेक्ष पैमाने पर दिखाया गया है । (ग)नितिनोल फिलामेंट्स को काटने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले विकर्ण तार कटर की तस्वीर । (घ)कटे नितिनोल फिलामेंट के तेज किनारों को तेज पत्थर से चौरसाई करना। (ई)हाइपोडर्मिक सुई जांच के लकड़ी के पॉप्सिकल स्टिक हैंडल में छेद करने के लिए इस्तेमाल की जाती है । सुई की नोक को सुरक्षित फिलामेंट प्रविष्टि के लिए हैंडल स्टिक की कम से कम आधी ऊंचाई तक पहुंचने की आवश्यकता होती है। (एफ-जी) एक लकड़ी के पॉप्सिकल स्टिक में चिपकाकर नितिनोल फिलामेंट का लगाव सम्मिलन छेद के साथ हैंडल करता है। (एच-एल) उन्हें एक पैमाने के खिलाफ दबाकर यांत्रिक जांच का अंशांकन। (एम)बल के मूल्य (एमएन में) और दबाव (केपीए में) विभिन्न यांत्रिक जांच द्वारा उत्पन्न। प्रत्येक नितिनोल फिलामेंट की लंबाई जांच (पी 1-पी 10) का निर्माण करने के लिए उपयोग की जाने वाली थी; पी: जांच) सेंटीमीटर (सेमी) में विस्तृत है। (N)174 केपीए से लेकर 5,116 केपीए तक की यांत्रिक जांच के एक पूर्ण सेट की तस्वीर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: यांत्रिक nociception परख: वॉन Frey की तरह तंतु एक खुराक-aversive रोलिंग व्यवहार की प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न और संवेदी न्यूरॉन्स को ऊतक क्षति का कारण । (A) ड्रोसोफिला लार्वा के विभिन्न चरणों (दूसरे और तीसरे इंस्टार) की तस्वीरें । स्केल बार: तीसरे इंस्टार ड्रोसोफिला लार्वा के पृष्ठीय दृश्य का 2 मिमी(बी)कार्टून। लाल बिंदु पेट खंड को इंगित करता है जहां यांत्रिक जांच लागू की जाती है। टी: वक्ष खंड; ए: पेट खंड। अन्य शारीरिक स्थलों को लेबल किया गया है। (ग)परख का कार्टून: लार्वा के पृष्ठीय पक्ष पर एक यांत्रिक जांच लागू की जाती है जब तक कि यह नीचे की सतह के खिलाफ झुकता है और फिर 2 एस के लिए आयोजित किया जाता है। यदि दबाव पर्याप्त रूप से अधिक है, तो यह रिलीज पर एक अपरिवर्तनीय रोलिंग प्रतिक्रिया प्राप्त करता है। (घ)व्यवहार खुराक प्रतिक्रिया; प्रत्येक नीली बिंदी लार्वा के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है जो 10 जानवरों के एक सेट के भीतर यांत्रिक उत्तेजना के लिए, अपरिवर्तनीय रोलिंग के साथ जवाब देती है। विभिन्न यांत्रिक जांच द्वारा प्रेरित अपरिवर्तनीय रोलिंग व्यवहार के प्रतिशत की वायलिन साजिश। केपीए: किलोपास्कल। बॉक्स प्लॉट्स मीडियन (ग्रीन), मूंछ (लाल) का प्रतिनिधित्व करते हैं 10 वें और 90 वें शतमक का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ई)ऊतक क्षति: तीसरे इंस्टार लार्वा (जीनोटाइप पीपीके-Gal4>UAS-mCD8-GFP लेबल nociceptive संवेदी न्यूरॉन्स) संकेत दबाव के साथ पृष्ठीय खंड A8 में जांच की गई । फ्लोरोसेंटली लेबलेड डीडीएसी चतुर्थ श्रेणी संवेदी न्यूरॉन्स (पृष्ठीय मिडलाइन के पार) की जांच की गई (अनुभाग 4 और 5 देखें)। सफेद क्षेत्र (लाल तारक) अंतराल या ऊतक क्षति का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार: 100 माइक्रोन। पैनल बी में, लार्वा को पृष्ठीय दृश्य में दिखाया गया है, जबकि सी में यह पार्श्व दृश्य है। लार्वा के पृष्ठीय क्यूटिकल-एपिडर्मिस पक्ष के खिलाफ दबाई गई यांत्रिक जांच जांच की नोक और आसपास के क्षेत्रों के संपर्क के बिंदु पर एक अवसाद जैसी जेब का उत्पादन करती है। वेंट्रल साइड की ओर घुमावदार ठोस काली रेखा जेब के ऊपर है, जबकि धराशायी ग्रे पार्श्व रेखा पार्श्व पक्ष और जेब के नीचे का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: यूवी क्षति के बाद यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता। {संवेदीकरणका परीक्षण करने के लिए प्रायोगिक डिजाइन की योजनाबद्ध। मिड थर्ड इंस्टार को मॉक ट्रीट (नॉन-यूवी) या यूवी किरणित किया गया । इसके बाद मॉक ट्रीटमेंट या विकिरण के बाद मैकेनिकल एनओसीशनेशन परख को अलग-अलग समय बिंदुओं (2 घंटे, 4 घंटे, 8 घंटे, 16 घंटे और 24 घंटे) पर किया गया। (ख) मैकेनिकल एलोडिनिया: मॉक-ट्रीटमेंट या यूवी विकिरण के बाद संकेतित समय बिंदुओं पर सामान्य रूप से उपधारित या गैर-हानिकारक यांत्रिक प्रोत्साहन (200 केपीए, 1.57 एमएन) के साथ जांच करने के बाद अपरिवर्तनीय रोलिंग का प्रदर्शन करने वाले लार्वा का प्रतिशत। (ग)मैकेनिकल हाइपरएल्जेसिया: मॉक-ट्रीटमेंट या यूवी विकिरण के बाद संकेतित समय बिंदुओं पर सामान्य रूप से सुपरराथहोल्ड या हानिकारक यांत्रिक उत्तेजना (462 केपीए, 3.63 एमएन) के साथ जांच करने के बाद अविवेकी रोलिंग प्रदर्शित करने वाले लार्वा का प्रतिशत। त्रुटि सलाखों का मतलब है +/-SEM संकेत मिलता है । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए दो पूंछ वाले अकर्पित टी-टेस्टका उपयोग किया गया: * पी < ०.०५, * * पी < ०.०१; एनएस: महत्वपूर्ण नहीं है। प्रत्येक लाल डॉट, पैनल बी और सी में, 10 लार्वा के औसत अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है, n = 3-6 सेट प्रति टाइमपॉइंट/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: ड्रोसोफिला लार्वा का सामान्य लोकोमोशन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2: ड्रोसोफिला लार्वा की हानिकारक यांत्रिक उत्तेजना। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 3: ड्रोसोफिला लार्वा की उपथरेहोल्ड यांत्रिक उत्तेजना। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हमने नितिनोल फिलामेंट्स से निर्मित अनुकूलित यांत्रिक जांच का उपयोग करके एक स्थापित यांत्रिकपरख1,2,16 को संशोधित किया। यह धातु अलॉय हमें छोटे व्यास फिलामेंट्स का उपयोग करने की अनुमति देता है जो ड्रोसोफिला लार्वा के आकार के लिए उपयुक्त हैं। मछली पकड़ने की रेखा पर आधारित मोनोफिलमेंट्स ने आज तक 2 ,5, 6,16तक फ्लाई मैकेनिकल एनओसी के क्षेत्र में दबदबा कायम किया है। हमारे नितिनोल फिलामेंट्स लगभग ~ 3-5 महीनों (हमारे अनुभव में) के लिए अपने आकार और मापा दबाव बनाए रखते हैं। नितिनोल फिलामेंट्स की लंबाई और व्यास को अलग करके, उपयोगकर्ता उपधार से लगभग पूर्ण रोलिंग प्रतिक्रिया तक फैले दबावों की एक विस्तृत श्रृंखला उत्पन्न कर सकता है। विशेष रूप से, उपधारित जांच करना छोटे व्यास नितिनोल फिलामेंट्स के साथ सरल है। इन जांचों का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि दबाव, बल के बजाय, अधिक सुसंगत नोकिसेंसिव व्यवहार प्रतिक्रियाएं4प्रकाश में लाना । हम यहां एक अच्छी तरह से स्थापित यूवी-प्रेरित निषेध संवेदीकरण मॉडल7,10,13का उपयोग करके प्रदर्शित करते हैं कि ये तंतुओं यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता-एलोडिनिया और हाइपरलेजेसिया का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण भी हैं।

मछली पकड़ने की रेखा से निर्मित यांत्रिक जांचों का उपयोग करने वाले पिछले अध्ययनों से व्यवहार जवाबदेही 2 , 6 ,16,17में एक निश्चित परिवर्तनशीलता हुई है । इसके लिए कई कारक हो सकते हैं। सबसे पहले, क्योंकि दबाव महत्वपूर्ण चर है, फिलामेंट टिप की बफिंग ताकि यह गोल हो और किसी भी तेज किनारों नहीं है महत्वपूर्ण है। दूसरा, केवल बल के बजाय दबाव मूल्यों की रिपोर्टिंग प्रयोगों की पुन: उत्पन्न क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि समान ताकतों को उत्पन्न करने वाली विभिन्न यांत्रिक जांच असमान दबाव4प्राप्त कर सकती हैं। तीसरा, हानिकारक जांच का उपयोग करके प्रति लार्वा केवल एक यांत्रिक उत्तेजना लागू करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि इस तरह की जांच एपिडर्मल4 और संवेदी न्यूरोनल स्तर(चित्रा 2E)पर खुराक-निर्भर ऊतक क्षति का उत्पादन करती है। ऊतक क्षति को प्रेरित करने के बाद एक दूसरा या बाद में हानिकारक यांत्रिक उत्तेजना, प्रभावित परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स के कार्य को क़यास कर सकती है और एक परिवर्तित व्यवहार प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकती है। एक अन्य अध्ययन में, लार्वा ने दो बार हानिकारक यांत्रिक जांच के साथ उत्तेजित किया, ज्यादातर एक बढ़ी हुई व्यवहार प्रतिक्रिया5प्रदर्शित की, जो एक तीव्र यांत्रिक संवेदीकरण (हाइपरएल्जेसिया) के विकास का सुझाव देता है, जो पहले हानिकारक यांत्रिक उत्तेजना द्वारा उत्तेजित ऊतक क्षति से परिणाम हो सकता है। इसके विपरीत, अन्य लेखकों6 एक मिश्रित (वृद्धि हुई है या कमी) व्यवहार प्रतिक्रिया की सूचना दी, यह दर्शाता है कि बदल व्यवहार प्रतिक्रिया नुकसान के कारण हो सकता है/ प्रत्येक लार्वा को उत्तेजित करने से केवल एक बार व्यवहार प्रतिक्रियाओं में संभावित विचरण समाप्त हो जाता है जिसके परिणामस्वरूप संवेदीकरण या ऊतक क्षति होती है। चौथा, हमने यांत्रिक रूप से सेगमेंट A8 को उत्तेजित किया, जो पिछले अध्ययनों (पसंदीदा क्षेत्रों A3-A4)2,5,16की तुलना में अधिकपीछेहै। खंड A2 या A8 पर लागू ~ 3,900 केपीए और 5,300 केपीए के बीच जांच में कोई व्यवहार संबंधी अंतर नहीं दिखा4. इसके अलावा, A2-A4 की तुलना में A8, यांत्रिक जांच के साथ उत्तेजित करना आसान है जो कम दबाव (<300 kPa) उत्पन्न करता है क्योंकि लार्वा इस क्षेत्र में पतला है और इस प्रकार अधिक आसानी से संकुचित होता है। अन्य अध्ययनों से पता चला है कि लार्वा के पीछे के छोर की हानिकारक यांत्रिक उत्तेजना (एक कठोर कीट पिन द्वारा वितरित, संदंश के साथ आयोजित) ज्यादातर एक अपरिवर्तनीय या रोलिंग प्रतिक्रिया18के बजाय आगे लोकोमोशन पैदा करती है। यह अलग व्यवहार प्रतिक्रिया उपयोग की गई सामग्रियों (बेंडेबल नितिनोल फिलामेंट बनाम असंपीड़ित कीट पिन) या लार्वा को वितरित विभिन्न दबावों के कारण हो सकती है (कीट पिन के दबाव मूल्य की रिपोर्ट नहीं की गई थी)।

ड्रोसोफिला लार्वा के लिए यांत्रिक नोक - प्रदान की परख के विकास ने क्षेत्र को यह पता लगाने में सक्षम बनाया है कि विभिन्न यांत्रिक संवेदी आयन चैनल और तंत्रिका सर्किट यांत्रिक नोक-्योमी 5 ,6,16,17में मध्यस्थता करते हैं । हालांकि, यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता (एलोडिनिया और हाइपरलेजेसिया) का अध्ययन अन्य संवेदी तौर-अन्यतरीकों- गर्मी7,8,10, 13, 14,ठंड9औररासायनिक3के संवेदीकरण की तुलना में पिछड़ गया है। यह अंतराल उपयुक्त यांत्रिक जांच के अभाव के कारण हो सकता है जो सुपरट्रेसहोल्ड दबावों के लिए उपथरेहोल्ड में फैले एक पूर्ण प्रतिक्रिया रेंज उत्पन्न कर सकता है। विशेष महत्व के, विशेष रूप से यांत्रिक एलोडिनिया का आकलन करने के लिए, उपधारित जांच है जो अघायल लार्वा से एक प्रतिकूल रोलिंग प्रतिक्रिया प्राप्त नहीं करते हैं। हमारे बेहतर यांत्रिक जांच का महत्व यह है कि उन्हें अहानिकर उत्तेजनाओं (उपथरेसहोल्ड ~ 174 केपीए-200 केपीए) या कम से उच्च हानिकारक रेंज (~ 225 केपीए से ~ 5,116 केपीए) तक फैलाया जा सकता है। यहां, हम नितिनोल वॉन फ्रे जैसे फिलामेंट्स का उपयोग करके प्रदर्शित करते हैं कि ड्रोसोफिला लार्वा यूवी विकिरण के बाद यांत्रिक एलोडिनिया और मैकेनिकल हाइपरएल्जेसिया दोनों विकसित करते हैं। थर्मल संवेदीकरण की तुलना में यांत्रिक संवेदीकरण कुछ अंतर दिखाता है। यांत्रिक संवेदीकरण की शुरुआत और शिखर दोनों पहले (~ 4 एच) थर्मल (गर्मी) संवेदीकरण (हाइपरएल्जेसिया के लिए ~ 8 एच और एलोडिनिया के लिए ~ 24 घंटे) की तुलना में7है। इसके अलावा, मैकेनिकल एलोडिनिया और हाइपरएल्जेसिया सहवर्ती (दोनों पीक ~ 4 एच पर) हैं। इसके अलावा, जबकि गर्मी संवेदीकरण (एलोडिनिया और हाइपरलजेसिया) बाद के समय बिंदुओं पर पूरी तरह से हल करता है7,यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता ने एक लंबी पूंछ का प्रदर्शन किया जो बेसलाइन से थोड़ा ऊपर रहा। ड्रोसोफिला में ठंड संवेदीकरण में ठंड-पैदा किए गए व्यवहार में एक स्विचशामिल है और नए ठंडे-पैदा किए गए व्यवहारों का उद्भव होता है- एक ऐसी घटना जो यांत्रिक उत्तेजना के साथ नहीं देखी जाती है। शुरुआत, अवधि और देखे गए व्यवहारों में ये अंतर बताते हैं कि प्रत्येक संवेदी मोडलिटी को विभिन्न सिग्नलिंग रास्तों द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। ड्रोसोफिला में उपलब्ध शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ यहां वर्णित संवेदीकरण परख के संयोजन से यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता (एलोडिनिया और हाइपरलेजेसिया) के सटीक आनुवंशिक विच्छेदन की अनुमति मिलनी चाहिए।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रोटोटाइप वॉन Frey तंतुओं के विकास के लिए थॉमस वांग का शुक्रिया अदा करते हैं, पैट्रिक जे हुआंग यांत्रिक जांच परख में सुधार के लिए, ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर फॉर द कंट्रोल(डब्ल्यू1118)और पीपीके-Gal4>UAS-mCD8-GFP फ्लाई स्टॉक्स, और गैल्को लैब के सदस्यों को पांडुलिपि को गंभीर रूप से पढ़ने के लिए। इस काम को आर21एनएस087360 और आर35जीएम126929 से एमजेजी को सपोर्ट मिला।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker Fisher Scientific 02-540C Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.
Black (Arkansas) bench stone Dan’s Whetstone SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/
Confocal microscope Olympus FV1000 Any equivalent confocal microscope will do
Coplin Jar Fisher Scientific 08-816 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816
Diethyl ether Fisher Scientific E138-500 For anesthetizing larvae.
Etherization chamber This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.
Fiber Optic Light Guide Schott AG A08575 Schott Dual Gooseneck 23 inch
Forceps Fine Science Tool FS-1670 For transferring larvae
Glue Aleene's N/A Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue)
https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue
Graspable holder Loew Cornell N/A Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100ML
Hypodermic needle 30G 1/2"L Fisher Scientific NC1471286 BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires
Large Petridish Falcon 351007 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Microscope (Zeiss) Stemi 2000 Carl Zeiss, Inc. NT55-605 Any equivalent microscope will do
Microscope Cover Glass 22x22 Fisher 12-545-B
Microscope Cover Glass 22x40 Corning 2980-224 Tickness 1 1/2
Microscope Slides Globe Scientific Inc. 1358Y
Mini Diagonal Cutter Fisher Scientific S43981 For cutting nitinol filaments
Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” Mailin Co N/A Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered.
https://malinco.com/
Piece of black vinyl Office Depot N/A We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva
Small Petridish Falcon 351008 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Spatula Fisher Scientific 21-401-10 Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish
Wipes Fisher Scientific 06-666A Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.
W1118 Bloomington Drosophila Stock Center 3605 Control strain for behavioral assays
ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP Bloomington Drosophila Stock Center 8749 Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons

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References

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व्यवहार अंक 164 तंत्रिका विज्ञान ड्रोसोफिला,लार्वा यांत्रिक जांच वॉन फ्रे फिलामेंट्स मैकेनिकल एनोफिसशन मैकेनिकल संवेदीकरण यांत्रिक एलोडिनिया मैकेनिकल हाइपरएल्जेसिया व्यवहार परख
<em>ड्रोसोफिला</em> लार्वा में यांत्रिक एनओसी को मापने के लिए एक बेहतर परख और उपकरण
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Lopez-Bellido, R., Galko, M. J. An… More

Lopez-Bellido, R., Galko, M. J. An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (164), e61911, doi:10.3791/61911 (2020).

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