Summary
Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe een verbeterde test voor mechanische nociceptie in Drosophila-larven kan worden uitgevoerd. We gebruiken de test hier om aan te tonen dat mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) bestaat in Drosophila-larven.
Abstract
Gepubliceerde tests voor mechanische nociceptie in Drosophila hebben geleid tot variabele beoordelingen van gedrag. Hier fabriceerden we, voor gebruik met Drosophila-larven, aangepaste metalen nikkel-titaniumlegering (nitinol) filamenten. Deze mechanische sondes zijn vergelijkbaar met de von Frey filamenten die in gewervelde dieren worden gebruikt om mechanische nociceptie te meten. Hier laten we zien hoe we deze mechanische sondes kunnen maken en kalibreren en hoe we een volledige gedragsdosis-respons kunnen genereren van subthreshold (onschadelijk of niet-schadelijk bereik) tot suprathreshold (laag tot hoog schadelijk bereik) stimuli. Om het nut van de sondes aan te tonen, onderzochten we weefselschade-geïnduceerde overgevoeligheid bij Drosophila-larven. Mechanische allodynie (overgevoeligheid voor een normaal onschadelijke mechanische stimulus) en hyperalgesie (overdreven reactievermogen op een schadelijke mechanische stimulus) zijn nog niet vastgesteld in Drosophila-larven. Met behulp van mechanische sondes die normaal onschadelijk zijn of sondes die meestal een aversief gedrag uitlokken, ontdekten we dat Drosophila-larven mechanische overgevoeligheid (zowel allodynie als hyperalgesie) ontwikkelen na weefselschade. De mechanische sondes en tests die we hier illustreren, zullen dus waarschijnlijk belangrijke instrumenten zijn om de fundamentele moleculaire / genetische mechanismen van mechanische overgevoeligheid te ontleden.
Introduction
Drosophila-larven vertonen een karakteristiek aversief rolgedrag wanneer ze worden blootgesteld aan verschillende schadelijke stimuli: thermisch1, mechanisch2en chemisch3. Dit gedrag onderscheidt zich duidelijk van normale voortbeweging. Hier beschrijven we een verbeterde mechanische test die kan worden gebruikt om mechanische nociceptie en mechanische sensibilisatie te beoordelen.
In een recente studie hebben we von Frey-achtige filamenten vervaardigd met nitinoldraden4. Sondes die verschillende krachten en drukken uitoefenden, werden gemaakt door de lengtes en diameters van de nitinoldraden die elke sonde vormen te variëren. Mechanische sondes werden gekalibreerd en de gemeten krachtwaarden (in millinewton, mN) werden omgezet in druk (kilopascal, kPa), op basis van het tipgebied van elke sonde4. Aangepaste fabricage van mechanische sondes stelde ons in staat om subthreshold (≤200 kPa) tot suprathreshold (225 kPa tot 5318 kPa) drukken te genereren, wat in principe gunstig zou kunnen zijn voor het bestuderen van mechanische overgevoeligheid. Met behulp van deze verbeterde mechanische von Frey-achtige filamenten toonden we aan dat druk4, in tegenstelling tot de eerder onderzochte kracht2,5,6 consistenter correleert met aversieve gedragsresponsiviteit in Drosophila-larven. De verbeterde mechanische test die hier wordt beschreven, hielp ook bij het identificeren van een geconserveerde Vasculaire Endotheliale Groeifactor (VEGF)-gerelateerde receptor tyrosinekinase die een pad signaleert dat mechanische nociceptie bij vliegen en rattenreguleert 4.
Mechanische allodynie en hyperalgesie, twee modaliteiten van overgevoeligheid, zijn relatief onderbelicht in Drosophila-larven, vergeleken met de thermische (warmte en koude) en chemische sensorische modaliteiten3,7,8,9,10. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het gebrek aan specifieke mechanische sondes die zich uitstrekken van onschadelijke stimuli tot het hoge schadelijke bereik2,5,6. Een normaal onschadelijke stimulus die het typische aversieve rolgedrag uitlokt nadat Drosophila-larven weefselschadeervaren 3,7 wordt allodynie genoemd. Een overdreven rollende reactie op een typisch schadelijke stimulus staat bekend als hyperalgesie7. Schadelijke stimuli worden gedefinieerd als stimuli die weefselschade veroorzaken en nociceptoren kunnen activeren11. Schadelijke stimuli die aan Drosophila-larven worden geleverd, beschadigen ofwel de barrière-epidermis, de perifere nociceptieve sensorische neuronen3,4,7of beide.
In dit artikel laten we zien hoe we von Frey-achtige mechanische sondes op maat kunnen fabriceren en kalibreren die geschikt zijn voor Drosophila-larven. Verder laten we zien hoe we deze sondes kunnen gebruiken om mechanische nociceptieve reacties in Drosophila-larven te testen. Ten slotte demonstreren we verder het nut van deze sondes door ze te gebruiken om de aanwezigheid van mechanische overgevoeligheid aan te tonen, zowel allodynie als hyperalgesie, na weefselschade bij Drosophila-larven (zie representatieve resultaten).
Protocol
1. Mechanische sondebouw
- Snijd elke nitinolfilament (figuur 1B), loodrecht op de lange as, tot de opgegeven lengte (figuur 1M–N) met behulp van een kleine draadsnijder (figuur 1C). De filamenten zijn er in drie verschillende vooraf ingestelde diameters (figuur 1B).
OPMERKING: De hier gespecificeerde lengtes zijn een gids om de aangegeven geschatte drukken te bereiken, met behulp van een vergelijkbaar protocol voor de constructie van de houder. Uiteindelijk, ongeacht de lengte van de snede van de gloeidraad en de diepte van het gat in de houder, moeten de filamenten worden gemeten / gekalibreerd op een balans om de exacte kracht / drukwaarde te verkrijgen. - Onderzoek de punt van het filament onder een stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat er geen scherpe of onregelmatige randen achterblijven, omdat deze weefselschade aan de huid van de larven kunnen veroorzaken en de kalibratie kunnen verstoren.
- Maak de scherpe randen van de mechanische sonde handmatig glad met behulp van een slijpsteen totdat er geen scherpe onregelmatigheden blijven bestaan (figuur 1D).
- Maak een gat naar het einde van een houten ijslollystok(figuur 1E)met behulp van een injectienaald (zie Tabel met materialen). Steek de naald minstens halverwege de hoogte van de ijslollystok (figuur 1E). Hierdoor ontstaat een kamer voor het inbrengen van het nitinol filament.
- Breng houtlijm aan op een enkel nitinol filament(figuur 1F)en steek het met lijm bedekte filament in de naaldsleuf in een houten ijslollystok(figuur 1G). Laat ~5 uur drogen.
- Kalibreer elke mechanische sonde door deze tegen een weegschaal te drukken totdat de mechanische sonde buigt (figuur 1H–L). Dit is het punt van maximale kracht dat in grammen kan worden geregistreerd. Afhankelijk van de filamentdiameters (vooraf ingesteld) en lengtes (door de gebruiker bepaald) kan een volledig scala aan krachten en drukken worden gegenereerd.
- Zet de in stap 1.6 geregistreerde massa om in millinewton (mN) met behulp van de formule f = ma (Kracht is gelijk aan massa vermenigvuldigd met zwaartekrachtversnelling). f: kracht; m: massa; a: zwaartekrachtversnelling (9,8 m/s2) (figuur 1M).
- Zet ten slotte de berekende kracht om in druk (kracht/oppervlakte) in kilopascal (kPa) door de gemeten kracht te delen door het oppervlak van de filamenttip (figuur 1M). Om het gebied te berekenen, converteert u de diameter van de verschillende nitinolfilamenten van inches (0,04", 0,06", en 0,08") naar centimeters. Vervolgens bepaalt πr2 (waar, r = de straal van de nitinolgloeidraad) het gebied (zie figuur 1M). Het voorbereiden van meerdere sondes met behulp van filamenten met verschillende diameters en lengtes genereert een volledige set over het responsieve bereik voor Drosophila-larven (monsterset weergegeven in figuur 1N).
OPMERKING: Controleer elke mechanische sonde ten minste om de 3-4 weken. Wanneer de druk meer dan ± 3% afwijkt van de oorspronkelijke maat, moet een nieuwe mechanische sonde worden vervaardigd.
2. Voorbereiding van larven
- Verhoog de regelstam (w1118) larvale nakomelingen of larven die de transgenes ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (voor het visualiseren van schade aan sensorische neuronen) op standaardvoedsel in een incubator van 25 °C bevatten. Meestal worden de bestanden routinematig bij 18 °C gehouden, maar zowel ouders als larvale nakomelingen worden gekweekt bij 25 °C op standaard maïsmeelvoedsel voor experimenten.
OPMERKING: Volwassen vliegen (vijf mannetjes en tien vrouwtjes, verhouding 1:2) worden ongeveer 24 uur in de vliegenflacons bewaard, om het leggen van eieren mogelijk te maken. De tijd na het leggen van eieren (AEL) begint vanaf het moment dat de volwassenen worden verwijderd. - Verzamel de derde instarlarven, na ongeveer 96 uur eieren leggen, door zachtjes kraanwater in het zachte vliegvoer met de larven te spuiten. Zwervende larven die het voedsel hebben verlaten, of die ooit voorste of achterste spiracles hebben gehad, zijn te groot / oud voor deze test. Tweede instarlarven (~ minder dan 4 mm lang) zijn te klein.
- Giet de inhoud van het zachte vliegvoer uit in een schone petrischaal van standaardformaat (100 mm x 15 mm).
- Sorteer met behulp van een tang middelgrote, middelgrote larven (zie figuur 2A)uit kleinere (tweede instar en vroege derde instar) of grotere (late of zwervende derde instar) larven. Zachte manipulatie met een tang om weefselschade aan de larven te voorkomen, wordt aanbevolen.
OPMERKING: De overdracht met behulp van een tang is meestal gebaseerd op waterspanning en niet door druk uit te oefenen op de larven met de messen van de tang. Een alternatief voor het gebruik van tang voor het manoeuvreren van larven zijn zachte verfborstels. Met beide tools moet de gebruiker oefenen met het overbrengen van de dieren, om geen onbedoelde weefselschade te veroorzaken die gedragsmetingen kan bemoeilijken. - Breng de middelste derde instarlarven met behulp van een tang over in een kleine Petrischaal (30 mm x 15 mm) met een kleine plug van vliegvoer bevochtigd met water op kamertemperatuur. Bewaar de larven in de kleine Petrischaal totdat de experimenten zijn uitgevoerd, maar niet langer dan 20 minuten.
OPMERKING: Over het algemeen geeft het overbrengen van 20-30 larven naar de voedselplug een voldoende aantal voor 20 minuten gedragstests.
3. Mechanische nociceptietest
- Plaats een middelste derde instar larve (met behulp van een tang) op een dun pad van zwart of donker vinyl onder een heldere veld stereomicroscoop. De donkere kleur zorgt voor contrast dat de visualisatie van de larve verbetert. Het verdient de voorkeur om een vrij beweegbaar stuk donker vinyl te hebben, omdat het de gebruiker in staat stelt om de larve uit te lijnen zonder deze aan te raken of pijn te doen.
- Plaats de optische vezellichten tussen de microscoop objectieve lenzen en de zwarte of donkere vinyl pad; dit zal voldoende verlichting met hoog contrast mogelijk maken voor het zien van de larve.
- Gooi larven weg die geen normale voortbeweging vertonen na overdracht naar de pad. Deze kunnen interfereren met de normale nociceptieve gedragsreactie. Zie Video 1voor normale voortbeweging.
- Veeg met behulp van een keukenpapier het overtollige water rond de larve weg dat ervoor kan zorgen dat de larve op het vinylkussen drijft.
- Oriënteer de larve door het donkere vinylkussen te verplaatsen. Het hoofd/de mond van de larve moet naar links wijzen als u rechtshandig bent en vice versa als u linkshandig bent (figuur 2A–B).
- Breng de gekozen mechanische sonde, meestal gedurende 1-2 s, aan op de achterste rugzijde van de larve bij ongeveer buiksegment A8 (zie figuur 2B),totdat de sonde buigt en de eerder gemeten hoeveelheid druk uitlokt (figuur 2C). Het is belangrijk dat de sonde tegen het dorsale oppervlak van de larve drukt en de larven samendrukt in de onderliggende pad op het punt van sondecontact.
OPMERKING: Op het contactpunt tussen de punt van het nitinolfilament en de dorsale nagelriem-epidermis, sondes lager dan 2.300 kPa, voornamelijk buigen zonder de nagelriem en onderliggende weefsels binnen te dringen. Dergelijke sondes hebben zelden invloed op larvalemortaliteit 4. Bij hogere drukken (> 5.000 kPa) buigen en dringen de sondes af en toe door in de nagelriem en onderliggende weefsels. Doorprikken van de larven schaadt larvale overleving4 en, indien waargenomen, worden deze larven meestal weggegooid uit gedragsanalyse. - Noteer de gedragsrespons voor elke larve. Een positieve nociceptieve respons (Video 2) wordt aangegeven als de larve een volledige rol van 360° langs de as van zijn lichaam binnen 3 s vertoont. Andere reacties (proberen om te draaien, snel kruipen en wiebelen) worden als negatief beschouwd voor deze test.
OPMERKING: Larven gestimuleerd met een subthreshold mechanische stimulus (200 kPa) lokte niet de typische nociceptieve of rollende respons uit (Video 3). Sommige larven vertoonden snelle voorwaartse of lichte aanraakreacties, zoals veranderingen in de bewegingsrichting. - Gooi de larve weg en bereid de volgende voor op de test, waarbij stap 3.1 tot en met 3.7 wordt herhaald.
- Herhaal stap 3.1–3.7 totdat het gewenste aantal larven is bereikt (hier werden drie tot zes sets n = 10 larven gebruikt voor elke sonde).
OPMERKING: Bij gebruik van mechanische sondes met een lagere druk (174-462 kPa) zal de test meer tijd per larve innemen. Dit komt omdat de punt van langere filamenten meer oscilleert, waardoor het moeilijker wordt om de larve in het midden van het A8-segment te porren. Oefenen is noodzakelijk met deze sondes.
4. Confocale microscopie om neuronale morfologie te beoordelen
- Plaats een larve (van genotype ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP om sensorische neuronen te labelen) eerder gestimuleerd met een nitinolfilament in een etherisatiekamer in een Coplin-pot met een bekerglas van 10 ml met een katoenen bal gedrenkt in ~ 1 ml diethylether. Laat de larve ~5 minuten in de kamer zitten.
OPMERKING: Een gedetailleerd protocol voor etherisatie is opgenomen in een eerdere studie gepubliceerd door onze groep12. - Spoel de larve voorzichtig uit de etherisatiekamer tot een kleine Petrischaal.
- Zorg voor één microscoopschuif, twee kleine afdeklipjes (22 x 22 mm) en één lange afdeklip (22 x 54 mm) (zie Materialentabel).
- Voeg kleine druppels ether:olieoplossing (1:5 verhouding van ethyl ether tot halocarbon olie oplossing, zie Tabel met materialen)toe aan beide uiteinden van de dia en plaats vervolgens de kleine coverslips op de kleine druppeltjes. Deze opstelling creëert een kleine ruimtekloof waar de larve in past.
OPMERKING: Druk de kleine dekenslipjes tegen de microscoopschuif totdat deze moeilijk uit te glijden zijn. - Voeg wat druppels ether toe: olieoplossing in het midden van de microscoopschuif en plaats de larve vervolgens met behulp van een tang op het midden van de microscoopschuif (tussen de kleine dekenslips). Zorg ervoor dat de voorste as van de larve evenwijdig is aan de korte zijde van de glijbaan en dat de rugzijde naar boven gericht is.
- Bedek de larven met de lange deklip bovenop de larve en de twee kleinere dekenslips.
OPMERKING: Druk royaal op de lange dekenslip totdat de larve bijna vlak is. - Afbeeldingssegment A8 van de larve met behulp van een confocale microscoop (zie Tabel met materialen)met behulp van lasergolflengte 488 (GFP).
OPMERKING: Beeld de larve onmiddellijk in, omdat de verdovende werking via ether snel zal vervagen (~ 5-10 minuten) en de larve wakker wordt en beweegt, wat verdere beeldvorming zal bemoeilijken. - Leg Z-stack beelden vast met een resolutie van 1024 x 1024 pixels met behulp van een 20x numeriek diafragma (NA) 0,7 droge objectieve lens bij 1x zoom, stapgrootte van 1,5 μm.
5. Kwantificering van weefselschade
- Verzamel en converteer de stackafbeeldingen uit de Z-serie, uit sectie 4.8, in één Z-projectie (een afvlakking van meerdere afbeeldingen die op verschillende brandpuntsvlakken zijn gemaakt in één samengestelde afbeelding). Dit kan worden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare software (bijv. Olympus Fluoview) of een gelijkwaardig open source-platform, bijvoorbeeld Fiji/Image J. Sla de enkele Z-projectie op in het TIFF-formaat.
- Open het beeldanalyseprogramma Fiji/ImageJ.
- Klik op Bestandin de menubalk en selecteer Openen in het venster dat wordt weergegeven.
- Selecteer de opgeslagen projectie van één afbeelding, opgeslagen in de TIFF-indeling, die moet worden geanalyseerd.
- Klik op Bewerkenin de menubalk en selecteer de optie Omkeren in het venster dat wordt weergegeven.
- Klik op de afbeeldingin de menubalk en selecteer Vervolgens Aanpassenin het weergegeven venster en selecteer ten slotte de optie Helderheid/contrast.
- Selecteer de optie Vorm uit de vrije hand op de gereedschapsbalk om het gebied van de opening (indien aanwezig) te meten.
- Klik op Analyserenin de menubalk en selecteer de optie Meten. Dit geeft het gebied van de opening of wond weer.
Representative Results
We ontwikkelden mechanische sondes op maat, met behulp van nitinolfilamenten(figuur 1A,N),om mechanisch opgeroepen gedrag op te wekken en genereerden een volledige gedragsdosisresponscurve met behulp van zowel onschadelijke als schadelijke mechanische sondes van verschillende intensiteit (figuur 2D) die aantonen dat deze sondes kunnen worden gebruikt om de mechanische nociceptie van de basislijn (bij afwezigheid van letsel) te bestuderen.
Onze gedragstestresultaten stelden vast dat sondes die drukken uitoefenen onder 200 kPa (~1,57 mN) (figuur 1M),wanneer toegepast op Drosophila-larven, geen aversieve rolreactie veroorzaken(figuur 2D en video 3). Zoals verwacht hebben deze subthreshold of niet-schadelijke mechanische sondes (175 kPa of 200 kPa) geen zichtbare neuronale weefselschade veroorzaakt (figuur 2E). Omdat ze geen schade veroorzaken, kunnen dergelijke sondes nuttig zijn om mechanische allodynie (overgevoeligheid voor een normaal niet-schadelijke mechanische stimuli) te beoordelen. Omgekeerd lokten suprathreshold of schadelijke sondes (van 462 kPa tot 5.116 kPa) een verhoogde gedragsrespons uit (figuur 2D) op een dosisafhankelijke manier - waarbij de hogere druk sterkere gedragsreacties opriep. Zoals verwacht, veroorzaakte suprathreshold mechanische druk ook dosisafhankelijke weefselschade aan de perifere sensorische neuronen zelf (figuur 2E). Het gemeten gebied van weefselschade (inμm 2 ± standaarddeviatie) van vier larven voor elke groep was: 2.051,03 ± 703,81 (462 kPa), 5.102,03 29 ± 1.004,67 (2.283 kPa) en 12.238,83 ± 3.724,11 (5.116 kPa). Zo kunnen drukken groter dan of gelijk aan 462 kPa (~63 mN), die een aversieve rolreactie oproepen (bij 25% of meer van de larven) en zichtbare neuronale weefselschade veroorzaken (figuur 2E), geschikt zijn om mechanische overgevoeligheid (overgevoeligheid voor normaal schadelijke mechanische stimuli) te bestuderen. Nociceptieve mechanische sondes (≥462 kPa) veroorzaken altijd weefselschade (n = 10, kwalitatief geëvalueerd), maar veroorzaken niet altijd een aversieve rolreactie.
Om mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) te evalueren, gebruikten we een gevestigd Drosophila larval model van nociceptieve sensibilisatie dat ultraviolet licht (UV) bestraling gebruikt om weefselschade op te wekken7,12. Deze test heeft bijgedragen tot het ontleden van de genetische en cellulaire mechanismen van thermische nociceptieve overgevoeligheid8,9,10,13,14,15. Om te bepalen of UV-behandeling mechanische allodynie veroorzaakt, waren larven van de middelste derde instar (w1118) bespot of UV-bestraald (15-20 mJ/cm2) (figuur 3A). Vervolgens werden de larven gedragsmatig getest op 2 uur, 4 uur, 8 uur, 16 uur en 24 uur nabehandeling met een normaal ondergrondse mechanische sonde (200 kPa, 1,57 mN). Ongeveer 20% van de larven reageerde al na 2 uur na de UV-behandeling, terwijl 50% reageerde na 4 uur, vergeleken met respectievelijk 6,6% en 8,3% nep-UV-bestraalde dieren(figuur 3B). Dit geeft aan dat UV-geïnduceerde weefselschade mechanische allodynie veroorzaakt bij 4 uur na bestraling. Op latere tijdstippen (8 uur, 16 uur en 24 uur) lag de gedragsrespons van de met UV behandelde larven tussen 16%-20% responders (gemiddeld gemiddelde van n = 3–6 sets van elk 10 larven), iets toegenomen (maar niet statistisch significant) in vergelijking met de mock-bestraalde controlegroep (in het bereik van 3%–6% van de responders, gemiddeld gemiddelde van n = 3–6 verzamelingen van elk 10 larven) (Figuur 3B).
Om mechanische hyperalgesie te onderzoeken, werd een suprathresholddruk (462 kPa, 3,63 mN) gebruikt, die normaal gesproken een aversieve rolreactie induceert bij ~ 20% van de larven (figuur 2D) en neuronale weefselschade veroorzaakt (figuur 2E). We hebben de 462 kPa-sonde op de rugzijde van larven aangebracht met of zonder UV-geïnduceerde weefselschade (figuur 3A). We ontdekten dat larven die na de UV-behandeling werden onderzocht bij 4 uur, 8 uur en 16 uur een significante toename van de aversieve rolrespons vertoonden, waarbij 4 uur de piek van de gedragsovergevoeligheid was (~ 60% responsief); nep-UV-bestraalde dieren vertoonden een ~ 27% van de aversieve respons (figuur 3C). Vergelijkbaar met mechanische allodynie, de gedragsrespons bij 8 uur, 16 uur en 24 uur van met UV behandelde dieren (in het bereik van 36%–42%) statistisch niet te onderscheiden was van de niet-behandelde larven (tussen 20%-26%). Larven in het late derde instar-stadium lieten een lichte afname van de gedragsrespons bij aanvang zien in vergelijking met de middelste derde instar-fase. We veronderstellen dat dit kan zijn door de grotere grootte van de larven (figuur 2A) of de verhoogde dikte van de nagelriem die het lichaam bedekt. Dit feit zou kunnen verklaren waarom de UV-behandeling in een later stadium van ontwikkeling geen grotere mechanische sensibilisatie veroorzaakt, zoals waargenomen 4 uur na de UV-behandeling.
Samen geven onze resultaten aan dat Drosophila-larven zowel mechanische allodynie als mechanische hyperalgesie ontwikkelen na UV-geïnduceerde weefselschade. De piektijd van mechanische allodynie en hyperalgesie is hetzelfde, 4 uur na UV-behandeling; mechanische hyperalgesie heeft echter een meer uitgesproken temporele staart naarmate deze langzamer terugkeert naar de uitgangswaarde in vergelijking met mechanische allodynie.
Figuur 1: Ontwikkeling van een Von Frey-achtig hulpmiddel om mechanische nociceptie in Drosophila-larven te evalueren. (A) Afbeelding van een mechanische sonde die wordt gebruikt om mechanische nociceptie in Drosophila-larven te bestuderen. (B) Nitinolfilamenten en hun relatieve diameters worden op relatieve schaal weergegeven. (C) Afbeelding van de diagonale draadsnijder die wordt gebruikt om de nitinolfilamenten te snijden. (D) Het gladstrijken van de scherpe randen van het gesneden nitinol filament met een slijpsteen. (E) Injectienaald die wordt gebruikt om een gat te maken in de houten ijslollystokgreep van de sonde. De punt van de naald moet ten minste de helft van de hoogte van de handgreepstok bereiken voor een veilige plaatsing van de gloeidraad. (F–G) Bevestiging van het nitinol filament door lijmen in een houten ijslolly stick handvat met insertie gat. (H–L) Kalibratie van mechanische sondes door ze tegen een weegschaal te drukken. (M) Waarden van kracht (in mN) en druk (in kPa) gegenereerd door verschillende mechanische sondes. De lengte van elk nitinolfilament dat wordt gebruikt om de sondes te construeren (P1-P10; P: sonde) is gedetailleerd in centimeters (cm). (N) Een beeld van een complete set mechanische sondes, variërend van 174 kPa tot 5.116 kPa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mechanische nociceptietest: Von Frey-achtige filamenten genereren een dosisresponscurve van aversief rolgedrag en veroorzaken weefselschade aan sensorische neuronen. (A) Foto's van de verschillende stadia (tweede en derde instar) van Drosophila larven. Schaalbalk: 2 mm. (B) Cartoon van de dorsale weergave van de derde instar Drosophila larven. De rode stip geeft het buiksegment aan waar de mechanische sonde wordt toegepast. T: thoracaal segment; A: buiksegment. Andere anatomische oriëntatiepunten worden gelabeld. (C) Cartoon van de test: Een mechanische sonde wordt op de rugzijde van de larve aangebracht totdat deze tegen het oppervlak eronder buigt en vervolgens gedurende 2 s wordt vastgehouden. Als de druk voldoende hoog is, lokt dit een aversieve rollende reactie uit bij het loslaten. (D) Gedragsdosisrespons; elke blauwe stip vertegenwoordigt het percentage larven dat, met aversief rollen, reageerde op de mechanische stimulatie binnen een set van 10 dieren. Vioolplot van het percentage aversief rolgedrag veroorzaakt door verschillende mechanische sondes. kPa: kilopascals. Doospercelen vertegenwoordigen mediaan (groen), snorharen (rood) vertegenwoordigen de 10e en 90e percentielen. (E) Weefselschade: Derde instarlarven (van genotype ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP om nociceptieve sensorische neuronen te labelen) werden onderzocht in dorsaal segment A8 met de aangegeven drukken. Fluorescerend gelabelde gekoppelde ddaC klasse IV sensorische neuronen (over de dorsale middellijn) werden vervolgens onderzocht (zie rubrieken 4 en 5). Witte gebieden (rode sterretjes) vertegenwoordigen openingen of weefselschade. Schaalbalk: 100 μm. In deel B wordt de larve weergegeven in de dorsale weergave, terwijl het in C de zijdelingse weergave is. Mechanische sondes die tegen de dorsale nagelriem-epidermiszijde van de larve worden gedrukt, produceren een depressieachtige zak op het contactpunt van de punt van de sonde en de omliggende gebieden. De effen zwarte lijn die naar de ventrale kant is gebogen, is de bovenkant van de zak, terwijl de gestreepte grijze zijlijn de zijzijde en de onderkant van de zak vertegenwoordigt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Mechanische overgevoeligheid na UV-beschadiging. (A) Schematisch van het experimentele ontwerp om sensibilisatie te testen. Midden derde instar werden mock behandeld (niet-UV) of UV bestraald. De mechanische nociceptietest werd vervolgens uitgevoerd op verschillende tijdstippen (2 uur, 4 uur, 8 uur, 16 uur en 24 uur) na schijnbehandeling of bestraling. (B) Mechanische allodynie: Het percentage larven dat aversief rollen vertoont na het tasten met een normaal onderhuidse of niet-schadelijke mechanische stimulus (200 kPa, 1,57 mN) op de aangegeven tijdstippen na schijnbehandeling of UV-bestraling. (C) Mechanische hyperalgesie: Het percentage larven dat aversief rollen vertoont na het tasten met een normaal suprathreshold of schadelijke mechanische stimulus (462 kPa, 3,63 mN) op de aangegeven tijdstippen na schijnbehandeling of UV-bestraling. Foutbalken geven het gemiddelde +/- SEM aan. Tweezijdige ongepaarde t-testwerd gebruikt voor statistische analyse: *p < 0,05, **p < 0,01; ns: niet significant. Elke rode stip, in panelen B en C, vertegenwoordigt het gemiddelde aandeel van 10 larven, n = 3-6 sets per tijdspunt/toestand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Normale voortbeweging van Drosophila-larven. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Schadelijke mechanische stimulatie van Drosophila-larven. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 3: Subthreshold mechanische stimulatie van Drosophila larven. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
We hebben een gevestigde mechanische test1,2,16 gewijzigd met behulp van aangepaste mechanische sondes vervaardigd uit nitinolfilamenten. Deze metaallegering stelt ons in staat om filamenten met een kleinere diameter te gebruiken die geschikt zijn voor de grootte van de Drosophila-larven. Monofilamenten op basis van vislijns hebben tot op heden het gebied van de mechanische vlieg nociceptie gedomineerd2,5,6,16. Onze nitinol filamenten behouden hun vorm en gemeten druk gedurende ongeveer ~ 3-5 maanden (in onze ervaring). Door de lengte en diameter van de nitinolfilamenten te variëren, kan de gebruiker een breed scala aan drukken genereren, variërend van subthreshold tot een bijna volledige rolrespons. Met name het maken van subthreshold-sondes is eenvoudiger met de nitinolfilamenten met een kleinere diameter. Met behulp van deze sondes ontdekten we dat druk, in plaats van kracht, consistentere nocifensieve gedragsreactiesoproept 4. We laten hier met behulp van een gevestigde UV-geïnduceerde nociceptieve sensibilisatiemodel7,10,13zien dat deze filamenten ook een nuttig hulpmiddel zijn voor het bestuderen van mechanische overgevoeligheid - allodynie en hyperalgesie.
Eerdere studies met behulp van mechanische sondes vervaardigd uit de vislijn hebben geleid tot een zekere variabiliteit in gedragsresponsiviteit2,6,16,17. Verschillende factoren kunnen hier rekening mee houden. Ten eerste, omdat druk de belangrijke variabele is, is het polijsten van de filamenttip zodat deze afgerond is en geen scherpe randen heeft, van cruciaal belang. Ten tweede is het rapporteren van drukwaarden in plaats van alleen kracht belangrijk voor de reproduceerbaarheid van de experimenten, omdat verschillende mechanische sondes die vergelijkbare krachten genereren ongelijksoortige drukken kunnen uitlokken4. Ten derde is het van cruciaal belang om slechts één mechanische stimulatie per larve toe te passen met behulp van schadelijke sondes, omdat dergelijke sondes een dosisafhankelijke weefselschade veroorzaken bij de epidermale4 en sensorische neuronale niveaus(figuur 2E). Een tweede of daaropvolgende schadelijke mechanische stimulus, nadat weefselschade is geïnduceerd, kan de functie van de aangetaste perifere sensorische neuronen mogelijk aantasten en een veranderde gedragsrespons uitlokken. In een andere studie vertoonden larven die tweemaal werden gestimuleerd met schadelijke mechanische sondes meestal een verbeterde gedragsrespons5, wat wijst op de ontwikkeling van een acute mechanische sensibilisatie (hyperalgesie), die het gevolg zou kunnen zijn van de weefselschade veroorzaakt door de eerste schadelijke mechanische stimulus. Omgekeerd rapporteerden andere auteurs6 een gemengde (verhoogde of verminderde) gedragsrespons, wat erop wijst dat de veranderde gedragsrespons te wijten kan zijn aan schade / disfunctie van het neuronale weefsel. Het slechts één keer stimuleren van elke larve elimineert mogelijke variatie in gedragsreacties als gevolg van sensibilisatie of weefselschade. Ten vierde hebben we segment A8 mechanisch gestimuleerd, wat posterieurer is dan eerdere studies (voorkeursgebieden A3-A4)2,5,16. Sondes tussen ~3.900 kPa en 5.300 kPa toegepast op segment A2 of A8 lieten geen gedragsverschillenzien 4. Bovendien is A8, in vergelijking met A2-A4, gemakkelijker te stimuleren met mechanische sondes die lagere drukken genereren (<300 kPa) omdat de larve dunner is in dit gebied en dus gemakkelijker kan worden samengeperst. Andere studies toonden aan dat schadelijke mechanische stimulatie van het achterste uiteinde van de larve (geleverd door een stijve insectenspeld, vastgehouden met een tang) meestal voorwaartse voortbeweging opriep, in plaats van een aversieve of rollende respons18. Deze verschillende gedragsrespons kan te wijten zijn aan verschillen in de eigenschappen van de gebruikte materialen (buigbaar nitinolfilament versus onbedrukbare insectenspeld) of aan verschillende druk die aan de larven wordt geleverd (de drukwaarde van de insectenspeld werd niet gerapporteerd).
De ontwikkeling van een mechanische nociceptietest voor Drosophila-larven heeft het veld in staat gesteld te ontdekken dat verschillende mechanische sensorische ionkanalen en neurale circuits mechanische nociceptiebemiddelen 5,6,16,17. De studie van de mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) is echter achtergebleven, vergeleken met de sensibilisatie van de andere zintuiglijke modaliteiten — warmte7,8,10,13,14, koud9en chemisch3. Deze vertraging kan deels te wijten zijn aan de afwezigheid van geschikte mechanische sondes die een volledig responsbereik kunnen genereren dat subthreshold tot suprathreshold-drukken omvat. Van bijzonder belang, vooral voor het beoordelen van mechanische allodynie, zijn subthreshold-sondes die geen aversieve rollende reactie van niet-gewonde larven uitlokken. Het belang van onze verbeterde mechanische sondes is dat ze kunnen worden vervaardigd om onschadelijke stimuli (subthreshold ~ 174 kPa – 200 kPa) of het lage tot hoge schadelijke bereik (suprathreshold ~ 225 kPa tot ~ 5.116 kPa) te overspannen. Hier demonstreren we met behulp van de nitinol von Frey-achtige filamenten dat Drosophila-larven zowel mechanische allodynie als mechanische hyperalgesie ontwikkelen na UV-bestraling. De mechanische sensibilisatie vertoont enkele verschillen in vergelijking met thermische sensibilisatie. Zowel het begin als de piek van mechanische sensibilisatie is eerder (~ 4 uur) in vergelijking met thermische (warmte) sensibilisatie (~ 8 uur voor hyperalgesie en ~ 24 uur voor allodynie)7. Bovendien zijn de mechanische allodynie en hyperalgesie gelijktijdig (beide pieken bij ~ 4 uur). Bovendien, terwijl warmtesensibilisatie (allodynie en hyperalgesie) op latere tijdstippen7volledig verdwijnt, vertoonde mechanische overgevoeligheid een lange staart die iets boven de uitgangswaarde bleef. Koudesensibilisatie in Drosophila omvat een schakelaar in koud opgeroepen gedrag9 en de opkomst van nieuw koud opgeroepen gedrag - een fenomeen dat niet wordt waargenomen met mechanische stimulatie. Deze verschillen in begin, duur en waargenomen gedrag suggereren dat elke zintuiglijke modaliteit kan worden bestuurd door verschillende signaleringsroutes. Het combineren van de hier beschreven sensibilisatietest met de krachtige genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila zou een nauwkeurige genetische dissectie van de waargenomen mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) mogelijk moeten maken.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Thomas Wang voor de ontwikkeling van het prototype von Frey filamenten, Patrick J. Huang voor het verbeteren van de mechanische sondetest, het Bloomington Drosophila Stock Center voor de besturing (w1118) en ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP vliegvoorraden, en Galko lableden voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door R21NS087360 en R35GM126929 aan MJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
| Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
| Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
| Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
| Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
| Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
| Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
| Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
| Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
| Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
| Microscope Cover Glass 22x22 | Fisher | 12-545-B | |
| Microscope Cover Glass 22x40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
| Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
| Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
| Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
| Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
| Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
| W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
| ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |
References
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. Painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).
- Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. An assay for chemical nociception in Drosophila larvae. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).
- Lopez-Bellido, R., et al. Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates. Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).
- Hu, C., et al. Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior. Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).
- Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception. Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1. PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. eLife. 4, 10735 (2015).
- Cervero, F., Merskey, H. What is a noxious stimulus. Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).
- Follansbee, T. L., et al. Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway. Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).
- Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).
- Jo, J., et al. Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization. Cell Death & Disease. 8 (5), 2786 (2017).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception. Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).
- Takagi, S., et al. Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila. Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).
