En forbedret analyse og værktøjer til måling af mekanisk nociception i Drosophila Larver

Summary

Målet med denne protokol er at vise, hvordan man udfører en forbedret analyse for mekanisk nociception i Drosophila larver. Vi bruger analysen her til at demonstrere, at mekanisk overfølsomhed (allodynia og hyperalgesi) findes i Drosophila larver.

Abstract

Offentliggjorte assays for mekanisk nociception i Drosophila har ført til variable vurderinger af adfærd. Her har vi fremstillet, til brug med Drosophila larver, tilpassede metal nikkel-titanium legering (nitinol) filamenter. Disse mekaniske sonder ligner von Frey filamenter, der anvendes i hvirveldyr til at måle mekanisk nociception. Her demonstrerer vi, hvordan man laver og kalibrerer disse mekaniske sonder, og hvordan man genererer en fuld adfærdsmæssig dosisrespons fra subthreshold (uskadelig eller ikke-skadelig rækkevidde) til suprathreshold (lavt til højt skadeligt interval) stimuli. For at demonstrere nytten af sonderne undersøgte vi vævsskadeinduceret overfølsomhed hos Drosophila larver. Mekanisk allodyni (overfølsomhed over for en normalt uskadelig mekanisk stimulus) og hyperalgesi (overdreven lydhørhed over for en skadelig mekanisk stimulus) er endnu ikke blevet etableret i Drosophila larver. Ved hjælp af mekaniske sonder, der normalt er uskadelige eller sonder, der typisk fremkalder en afvisende adfærd, fandt vi, at Drosophila larver udvikler mekanisk overfølsomhed (både allodynia og hyperalgesi) efter vævsskader. Således vil de mekaniske sonder og analyse, som vi illustrerer her, sandsynligvis være vigtige værktøjer til at dissekere de grundlæggende molekylære / genetiske mekanismer i mekanisk overfølsomhed.

Introduction

Drosophila larver udviser en karakteristisk aversiv rullende adfærd, når de udsættes for forskellige skadelige stimuli: termisk^1,mekanisk²og kemisk³. Denne adfærd er klart forskellig fra normal bevægelse. Her beskriver vi en forbedret mekanisk analyse, der kan bruges til at vurdere mekanisk nociception og mekanisk sensibilisering.

I en nylig undersøgelse fremstillede vi von Frey-lignende filamenter ved hjælp af nitinoltråde⁴. Sonder, der udøvede forskellige kræfter og tryk, blev lavet ved at variere længder og diametre på de nitinoltråde, der dannede hver sonde. Mekaniske sonder blev kalibreret, og de målte kraftværdier (i millinewton, mN) blev konverteret til tryk (kilopascal, kPa), baseret på spidsen af hver sonde⁴. Custom fabrikation af mekaniske sonder tilladt for os at generere subthreshold (≤200 kPa) til suprathreshold (225 kPa til 5318 kPa) tryk, som i princippet kunne være gavnligt for at studere mekanisk overfølsomhed. Ved hjælp af disse forbedrede mekaniske von Frey-lignende filamenter viste vi, at tryk⁴, i modsætning til den tidligere undersøgte kraft^2,5,6 korrelerer mere konsekvent med aversiv adfærdsmæssig reaktionsevne i Drosophila larver. Den forbedrede mekaniske analyse, der er beskrevet her, hjalp også med at identificere en bevaret vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF)-relateret receptor tyrosin kinase, der signalerer en vej, der regulerer mekanisk nociception i fluer og rotter⁴.

Mekanisk allodyni og hyperalgesi, to modaliteter af overfølsomhed, er relativt understudied i Drosophila larver, sammenlignet med den termiske (varme og kulde) og kemiske sensoriske modaliteter^3,7,8,9,10. Dette skyldes sandsynligvis manglen på specifikke mekaniske sonder, der spænder fra uskadelige stimuli til det høje skadelige område^2,5,6. En normalt uskadelig stimulus, der fremkalder den typiske aversive rullende adfærd efter Drosophila larver oplever vævsskader^3,7 kaldes allodynia. En overdrevet rullende reaktion på en typisk skadelig stimulus er kendt som hyperalgesi⁷. Skadelige stimuli defineres som dem, der fremkalder vævsskader og kan aktivere nociceptorer¹¹. Skadelige stimuli leveret til Drosophila larver beskadiger enten barrieren epidermis, de perifere nociceptive sensoriske neuroner^3,4,7eller begge dele.

I denne artikel demonstrerer vi, hvordan man tilpasser og kalibrerer von Frey-lignende mekaniske sonder, der passer til Drosophila larver. Desuden viser vi, hvordan man bruger disse sonder til at analysere mekaniske nociceptive reaktioner i Drosophila larver. Endelig demonstrerer vi yderligere nytten af disse sonder ved at bruge dem til at demonstrere tilstedeværelsen af mekanisk overfølsomhed, både allodyni og hyperalgesi, efter vævsskader i Drosophila larver (se repræsentative resultater).

Protocol

1. Mekanisk sonde konstruktion

1. Skær hver nitinolfilament (Figur 1B), vinkelret på dens lange akse, til den angivne længde (Figur 1M-N) ved hjælp af en lille trådskærer (Figur 1C). Filamenter fås i tre forskellige forudindstillede diametre (Figur 1B).
   BEMÆRK: De længder, der er angivet her, er en guide til at opnå det omtrentlige tryk, der er angivet, ved hjælp af en lignende protokol til konstruktion af holderen. I sidste ende, uanset længden af glødetråden skåret, og dybden af hullet i holderen, filamenter skal måles / kalibreres på en balance for at opnå den nøjagtige kraft / trykværdi.
2. Undersøg spidsen af glødetråden under et stereomikroskop for at sikre, at der ikke er skarpe eller uregelmæssige kanter tilbage, da disse kan forårsage vævsskader på larvernes hud og forstyrre kalibreringen.
3. Udjævn de skarpe kanter på den mekaniske sonde manuelt ved hjælp af en slibesten, indtil der ikke er nogen skarpe uregelmæssigheder (Figur 1D).
4. Lav et hul mod slutningen af en popsiclestav af træ (Figur 1E) ved hjælp af en hypodermisk nål (se Materialetabel). Indsætning af nålen mindst halvvejs gennem popsicle stickens højde (Figur 1E). Dette skaber et kammer til indsættelse af nitinolglødetråden.
5. Påfør trælim på en enkelt nitinolglødetråd (Figur 1F), og sæt den limbelagte glødetråd ind i nålestikket i en popsiclepind af træ (Figur 1G). Lad det tørre i ~ 5 timer.
6. Kalibrere hver mekanisk sonde ved at trykke den mod en skala, indtil den mekaniske sonde bøjer (Figur 1H-L). Dette er det punkt med maksimal kraft, der kan registreres i gram. Afhængigt af glødetrådens diametre (forudindstillet) og længder (brugerbestemt) kan der genereres et komplet udvalg af kræfter og tryk.
7. Den masse, der er registreret i trin 1.6, konverteres til kraft i millinewton (mN) ved hjælp af formlen f = ma (Kraften er lig med masse ganget med gravitationsacceleration). f: kraft; m: masse; a: gravitationsacceleration (9,8 m/s²⁾(figur 1M).
8. Til sidst omregnes den beregnede kraft til tryk (kraft/område) i kilopascal (kPa) ved at dividere den målte kraft med glødetrådens overfladeareal(figur 1M). For at beregne området skal du konvertere diameteren af de forskellige nitinolfilamenter fra tommer (0,04", 0,06" og 0,08") til centimeter. Derefter bestemmer^{πr 2} (hvor r = nitinolfilamentradius) området (se figur 1M). Forberedelse af flere sonder ved hjælp af filamenter med forskellige diametre og længder vil generere et komplet sæt, der spænder over det responsive område for Drosophila larver (prøvesæt vist i figur 1N).
   BEMÆRK: Kontroller hver mekanisk sonde mindst hver 3-4 uger. Når trykket afviger med mere end ± 3% fra den oprindelige foranstaltning, skal en ny mekanisk sonde fremstilles.

2. Forberedelse af larver

1. Hæv kontrolstammen (w¹¹¹⁸) larveafkom eller larver, der indeholder transgenene ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (til visualisering af skader på sensoriske neuroner) på standardfødevarer i en 25 °C inkubator. Typisk holdes bestandene rutinemæssigt ved 18 °C, men både forældre og larveafkom opdrættes ved 25 °C på almindelige majsmelsfødevarer til forsøg.
   BEMÆRK: Voksne fluer (fem hanner og ti hunner, 1:2 ratio) holdes i flueglasset for at tillade æglægning i ca. 24 timer. Tiden efter æglægning (AEL) begynder fra det tidspunkt, hvor de voksne fjernes.
2. Saml de tredje instar larver, efter ca. 96 timers æglægning, ved forsigtigt at sprøjte ledningsvand ind i den bløde fluemad, der indeholder larverne. Vandrende larver, der har forladt maden, eller som har everted forreste eller bageste spirakler, er for store / gamle til denne analyse. Anden instar larver (~ mindre end 4 mm i længden) er for små.
3. Hæld indholdet af den bløde fluemad ud i en ren petriskål i standardstørrelse (100 mm x 15 mm).
4. Brug pincet, sortere midten af tredje instar, mellemstore, larver (se figur 2A) fra mindre (anden instar og tidlig tredje instar) eller større (sent eller vandrer tredje instar) larver. Skånsom manipulation med pincet for at undgå vævsskader på larverne anbefales.
   BEMÆRK: Overførslen ved hjælp af pincet er hovedsagelig baseret på vandspænding og ikke ved at lægge pres på larverne med tangens knive. Et alternativ til brugen af pincet til manøvrering af larver er bløde pensler. Med begge værktøjer bør brugeren øve sig i at overføre dyrene for ikke at forårsage utilsigtet vævsskade, der kan komplicere adfærdsmæssige målinger.
5. Overfør den midterste tredjedel instar larver, ved hjælp af pincet, i en lille petriskål (30 mm x 15 mm) indeholdende et lille stik af fluefoder fugtet med vand ved stuetemperatur. Hold larverne i den lille petriskål, indtil forsøgene er udført, men ikke længere end 20 minutter.
   BEMÆRK: Generelt vil overførsel af 20-30 larver til fødevarestikket give et tilstrækkeligt antal til 20 minutters adfærdsmæssige assays.

3. Mekanisk nociceptionsanalyse

1. Placer en midt-tredjedel instar larve (ved hjælp af pincet) på en tynd pad af sort eller mørk vinyl under et lyst felt stereomikroskop. Den mørke farve giver kontrast, der forbedrer visualiseringen af larven. Det er at foretrække at have et frit bevægeligt stykke mørk vinyl, fordi det giver brugeren mulighed for at justere larven uden at røre eller såre den.
2. Sæt de optiske fiberlys mellem mikroskopet objektive linser og den sorte eller mørke vinyl pad; dette vil give tilstrækkelig høj kontrast belysning for at se larven.
3. Kassér larver, der ikke udviser normal bevægelse efter overførsel til puden. Disse kan forstyrre den normale nociceptive adfærdsmæssige reaktion. For normal bevægelse, se Video 1.
4. Tør væk, ved hjælp af et køkkenrulle, overskydende vand omkring larven, der kan forårsage larven til at flyde på vinyl pad.
5. Orientere larven ved at flytte den mørke vinyl pad. Larvens hoved/mund skal pege mod venstre, hvis du er højrehåndet og omvendt, hvis du er venstrehåndet(figur 2A-B).
6. Påfør den valgte mekaniske sonde, typisk i 1-2 s, på larvens bageste dorsale side ved ca. abdominalsegment A8 (se figur 2B), indtil sonden bøjer og fremkalder den tidligere målte trykmængde (Figur 2C). Det er vigtigt, at sonden presser mod larvens dorsale overflade og komprimerer larverne ind i den underliggende pude på sondekontaktpunktet.
   BEMÆRK: Ved kontaktpunktet mellem spidsen af nitinolglødetråden og den dorsale kutikula-epidermis bøjes sonder under 2.300 kPa hovedsageligt uden at trænge ind i neglebåndet og det underliggende væv. Sådanne sonder påvirker sjældent larvedødeligheden⁴. Ved højere tryk (>5.000 kPa) bøjer sonderne både og lejlighedsvis ind i neglebåndet og det underliggende væv. Punktering af larverne forringer larveoverlevelse^4, og hvis de observeres, kasseres disse larver typisk fra adfærdsanalyse.
7. Registrer adfærdsresponset for hver larve. Et positivt nociceptivt respons (Video 2) er angivet, hvis larven viser en komplet rulle på 360° langs kroppens akse inden for 3 s. Andre svar (forsøger at vende, hurtig gennemgang, og vrikke) betragtes som negative med henblik på denne analyse.
   BEMÆRK: Larver stimuleret med en subthreshold mekanisk stimulus (200 kPa) ikke fremkalde den typiske nociceptive eller rullende respons (Video 3). Nogle larver udviste hurtige frem- eller lette berøringsresponser såsom ændringer i bevægelsesretningen.
8. Kassér larven og forbered den næste til analyse, gentag trin 3.1 til 3.7.
9. Gentag trin 3.1-3.7, indtil det ønskede antal larver er nået (tre til seks sæt n = 10 larver blev brugt her for hver sonde).
   BEMÆRK: Ved brug af mekaniske sonder med lavere tryk (174-462 kPa) tager analysen længere tid pr. larve. Dette skyldes, at spidsen af længere filamenter svinger mere, hvilket gør det sværere at stikke larven i midten af A8-segmentet. Praksis er nødvendig med disse sonder.

4. Confocal mikroskopi til vurdering af neuronal morfologi

1. Placer en larve (af genotype ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP at mærke sensoriske neuroner) tidligere stimuleret med en nitinol filament i en æterisering kammer inde i en Coplin krukke, der indeholder en 10 mL bæger transporterer en bomuldskugle gennemblødt med ~ 1 mL diethyl æter. Lad larven sidde i kammeret i ~ 5 min.
   BEMÆRK: En detaljeret protokol for æterisering leveres i en tidligere undersøgelse offentliggjort af vores gruppe¹².
2. Skyl larven forsigtigt fra æteriseringskammeret i en lille petriskål.
3. Har klar et mikroskop dias, to små coverslips (22 x 22 mm), og en lang coverslip (22 x 54 mm) (se Tabel over materialer).
4. Der tilsættes små dråber ether:olieopløsning (1:5-forholdet mellem ethylether og halocarbonolieopløsning, se Materialetabel) i begge ender af diaset, og læg derefter de små coverlips oven på de små dråber. Dette arrangement skaber et lille mellemrum, hvor larven kan passe.
   BEMÆRK: Tryk de små coverlips mod mikroskopets rutsjebane, indtil det er svært at glide.
5. Tilsæt nogle dråber æter:olieopløsning midt på mikroskopdiaset, og placer derefter larven ved hjælp af pincet på midten af mikroskopdiaset (mellem de små coverlips). Sørg for, at larvens anteroposteriorakse er parallel med den korte side af diaset, og at den dorsale side vender op.
6. Dæk larverne med den lange coverslip placeret oven på larven og de to mindre coverslips.
   BEMÆRK: Tryk generøst på den lange overdækning, indtil larven er næsten flad.
7. Billedsegment A8 af larven ved hjælp af et konfokalt mikroskop (se Materialetabel) ved hjælp af laserbølgelængde 488 (GFP).
   BEMÆRK: Billede larven straks, fordi bedøvelse via æter vil falme hurtigt (~ 5-10 min) og larven vil vågne op og bevæge sig, hvilket vil komplicere yderligere billeddannelse.
8. Tag Z-stack billeder med en opløsning på 1024 x 1024 pixels ved hjælp af en 20x numerisk blænde (NA) 0,7 tør mållinse ved 1x zoom, trinstørrelse på 1,5 μm.

5. Korantitation af vævsskader

1. Indsamle og konvertere Z-serien stak billeder, fra afsnit 4,8, til en enkelt Z projektion (en udfladning af flere billeder taget på forskellige brændplaner i et enkelt sammensat billede). Dette kan udføres ved hjælp af kommercielt tilgængelig software (f.eks. Olympus Fluoview) eller en tilsvarende open source-platform, f.eks.
2. Åbn billedanalyseprogrammet Fiji/ImageJ.
3. Klik på Filerpå menulinjen, og vælg Åbn i det vindue, der vises.
4. Vælg den gemte enkeltbilledprojektion, der er gemt i TIFF-format, og som skal analyseres.
5. Klik på Redigerpå menulinjen, og vælg indstillingen Inverter i det vindue, der vises.
6. Klik på Billedepå menulinjen, vælg derefter Justeri det vindue, der vises, og vælg til sidst indstillingen Lysstyrke/kontrast.
7. Vælg indstillingen Frihåndsfigur på værktøjslinjen for at måle arealet af mellemrummet (hvis der er nogen).
8. Klik på Analyserpå menulinjen, og vælg indstillingen Mål. Dette vil vise arealet af hullet eller såret.

Representative Results

Vi udviklede tilpassede mekaniske sonder ved hjælp af nitinol filamenter (Figur 1A, N), for at fremkalde mekanisk fremkaldt adfærd og genererede en fuld adfærdsmæssig dosisresponskurve ved hjælp af både uskadelige og skadelige mekaniske sonder af varierende intensitet ( Figur2D), der viser, at disse sonder kan bruges til at studere baseline (i mangel af skade) mekanisk nociception.

Vores adfærdsmæssige analyseresultater fastslog, at sonder, der udøver pres under 200 kPa (~ 1,57 mN) (Figur 1M), når de påføres Drosophila larver, ikke fremkalder en afvisende rullende respons (Figur 2D og Video 3). Som forventet fremkaldede disse subthreshold eller ikke-skadelige mekaniske sonder (175 kPa eller 200 kPa) ikke synlige neuronale vævsskader (Figur 2E). Fordi de ikke fremkalder skade, kan sådanne sonder være nyttige til at vurdere mekanisk allodyni (overfølsomhed over for en normalt ikke-skadelig mekanisk stimuli). Omvendt fremkaldte suprathreshold eller skadelige sonder (fra 462 kPa til 5.116 kPa) et forstærket adfærdsrespons (Figur 2D) på en dosisafhængig måde - med det højere tryk, der fremkalder stærkere adfærdsmæssige reaktioner. Som forventet, suprathreshold mekanisk tryk også induceret dosis-afhængige vævsskader på de perifere sensoriske neuroner selv (Figur 2E). Det målte område med vævsskader (i^{μm 2} ± standardafvigelse) taget fra fire larver for hver gruppe var: 2.051,03 ± 703,81 (462 kPa), 5.102,03 29 ± 1.004,67 (2.283 kPa) og 12.238,83 ± 3.724,11 (5.116 kPa). Således kan tryk, der er større end eller lig med 462 kPa (~63 mN), som fremkalder en afvisende rullerespons (i 25% eller mere af larverne) og forårsage synlige neuronale vævsskader (Figur 2E), være egnede til at studere mekanisk hyperalgesi (overfølsomhed over for normalt skadelige mekaniske stimuli). Nociceptive mekaniske sonder (≥462 kPa) fremkalder altid vævsskader (n = 10, evalueres kvalitativt), men fremkalder ikke altid en afvisende rullende respons.

For at evaluere mekanisk overfølsomhed (allodyni og hyperalgesi) brugte vi en veletableret Drosophila larvemodel af nociceptiv sensibilisering, der bruger ultraviolet lys (UV) bestråling til at fremkalde vævsskader^7,12. Denne analyse har bidraget til at dissekere de genetiske og cellulære mekanismer af termisk nociceptiv overfølsomhed^{8,9,10,13,14,15}. For at afgøre, om UV-behandling forårsager mekanisk allodyni, blev der i midten af tredje instarkontrol (w¹¹¹⁸) fundet larver mock-bestrålet eller UV-bestrålet (15-20 mJ/cm²) (Figur 3A). Derefter blev larverne testet adfærdsmæssigt ved 2 timer, 4 timer, 8 timer, 16 timer og 24 timer efter behandling med en normalt subthreshold mekanisk sonde (200 kPa, 1,57 mN). Ca. 20% af larverne reagerede så tidligt som 2 timer efter UV-behandling, mens 50% svarede ved 4 timer, sammenlignet med henholdsvis 6,6% og 8,3% mock UV-bestrålede dyr (Figur 3B). Dette indikerer, at UV-induceret vævsskade forårsager mekanisk allodyni ved 4 timers postbestråling. På et senere tidspunkt (8 timer, 16 timer og 24 timer) var uv-behandlede larvers adfærdsmæssige reaktion i intervallet 16%-20% respondere (gennemsnitligt gennemsnit af n = 3-6 sæt af 10 larver hver), lidt øget (men ikke statistisk signifikant) sammenlignet med den mock-bestrålede kontrolgruppe (i intervallet 3%-6% af respondenterne, gennemsnitligt gennemsnit af n = 3-6 sæt af 10 larver hver)(Figur 3B).

For at undersøge mekanisk hyperalgesi blev der anvendt et suprathresholdtryk (462 kPa, 3,63 mN), der normalt fremkalder en aversiv rullerespons i ~ 20% af larverne (Figur 2D) og forårsager neuronal vævsskade (Figur 2E). Vi påførte 462 kPa-sonden på den dorsale side af larver med eller uden UV-induceret vævsskade (Figur 3A). Vi fandt ud af, at larver probed ved 4 timer, 8 timer og 16 timer efter UV-behandling viste en betydelig stigning i den aversive rullende respons, med 4 timer er toppen af adfærdsmæssige overfølsomhed (~ 60% lydhør); mock UV-bestrålede dyr viste en ~ 27% af aversive respons(Figur 3C). Svarende til mekanisk allodyni, adfærdsrespons ved 8 timer, 16 timer og 24 timer af UV-behandlede dyr (i intervallet 36%-42%) statistisk set ikke kunne skelnes fra de ikke-behandlede larver (i intervallet 20%-26%). Larver på den sene tredje instar fase viste et lille fald i baseline adfærdsmæssige reaktion sammenlignet med den midterste tredje instar fase. Vi hypotese dette kunne være enten ved den øgede størrelse af larverne(Figur 2A)eller den øgede tykkelse af kutikula, der dækker kroppen. Denne kendsgerning kunne forklare, hvorfor UV-behandlingen på et senere udviklingsstadium ikke fremkalder større mekanisk sensibilisering, som observeret 4 timer efter UV-behandling.

Samlet set viser vores resultater, at Drosophila larver udvikler både mekanisk allodyni og mekanisk hyperalgesi efter UV-induceret vævsskade. Spidsbelastningstiden for mekanisk allodyni og hyperalgesi er den samme, 4 timer efter UV-behandling; dog, mekanisk hyperalgesi har en mere udtalt tidsmæssige hale, da det vender tilbage til baseline langsommere i forhold til mekanisk allodyni.

Figur 1: Udvikling af et Von Frey-lignende værktøj til at evaluere mekanisk nociception i Drosophila larver. (A) Billede af en mekanisk sonde, der anvendes til at studere mekanisk nociception i Drosophila larver. (B) Nitinol filamenter og deres relative diametre er vist til relativ skala. (C) Billede af den diagonale trådskærer, der anvendes til at skære nitinolfilamenter. (D) Udjævning af de skarpe kanter af den udskårne nitinolglødetråde med en slibesten. (E) Hypodermisk nål bruges til at lave et hul i træ popsicle stick håndtag af sonden. Spidsen af nålen skal nå mindst halvdelen af højden af håndtaget stick for sikker glødetråd indsættelse. (F-G) Fastgørelse af nitinol filament ved limning i en træ ispind stick håndtag med indsættelse hul. (H-L) Kalibrering af mekaniske sonder ved at trykke dem mod en skala. (M) Kraftværdier (i mN) og tryk (i kPa) genereret af forskellige mekaniske sonder. Længden af hver nitinolglødetråd, der bruges til at konstruere sonderne (P1-P10; P: sonde) er detaljeret i centimeter (cm). (N) Et billede af et komplet sæt mekaniske sonder, der spænder fra 174 kPa til 5.116 kPa. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Mekanisk nociceptionsanalyse: Von Frey-lignende filamenter genererer en dosisresponskurve af aversiv rullende adfærd og forårsager vævsskader på sensoriske neuroner. (A) Billeder af de forskellige stadier (anden og tredje instar) af Drosophila larver. Skala bar: 2 mm. (B) Tegneserie af den dorsale udsigt over den tredje instar Drosophila larver. Den røde prik angiver abdominalsegmentet, hvor den mekaniske sonde påføres. T: thoraxsegment; A: abdominal segment. Andre anatomiske vartegn er mærket. (C) Tegnet af analysen: En mekanisk sonde påføres larvens dorsale side, indtil den bøjer mod overfladen nedenfor og derefter holdes i 2 s. Hvis trykket er tilstrækkeligt højt, fremkalder dette en afvisende rullende respons ved frigivelse. (D) Adfærdsmæssig dosisrespons; hver blå prik repræsenterer procentdelen af larver, der reagerede med aversiv rulning på den mekaniske stimulering inden for et sæt på 10 dyr. Violin plot af procent af aversive rullende adfærd fremkaldt af forskellige mekaniske sonder. kPa: kilopascals. Kasseplotter repræsenterer median (grøn), whiskers (rød) repræsenterer 10. og 90. percentiler. (E) Vævsskader: Tredje instar larver (af genotype ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP at mærke nociceptive sensoriske neuroner) blev undersøgt på dorsale segment A8 med det angivne tryk. Fluorescerende mærket parret ddaC klasse IV sensoriske neuroner (på tværs af dorsal midterlinjen) blev derefter undersøgt (se afsnit 4 og 5). Hvide områder (røde stjerner) repræsenterer huller eller vævsskader. Skalastang: 100 μm. I panel B vises larven i dorsalvisningen, mens det i C er sidevisningen. Mekaniske sonder presset mod den dorsale kutikula-epidermis side af larven producere en depression like-lomme på kontaktpunktet af spidsen af sonden og de omkringliggende områder. Den solide sorte linje buet mod ventral side er toppen af lommen, mens den stiplede grå lateral linje repræsenterer sidesiden og bunden af lommen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Mekanisk overfølsomhed efter UV-skader. (A)Skematisk over forsøgsdesignet til test af sensibilisering. Midten af tredje instar blev mock behandlet (ikke-UV) eller UV bestrålet. Den mekaniske nociceptionsanalyse blev derefter udført på forskellige tidspunkter (2 timer, 4 timer, 8 timer, 16 timer og 24 timer) efter mock behandling eller bestråling. (B) Mekanisk allodyni: Procentdelen af larver, der udviser aversiv rulning efter sondering med et normalt subthreshold eller ikke-skadelig mekanisk stimulus (200 kPa, 1,57 mN) på det angivne tidspunkt efter mock-behandling eller UV-bestråling. (C) Mekanisk hyperalgesi: Procentdelen af larver, der udviser aversiv rulning efter sondering med et normalt suprathreshold eller skadelig mekanisk stimulus (462 kPa, 3,63 mN) på det angivne tidspunkt efter mock-behandling eller UV-bestråling. Fejllinjer angiver middelværdien +/- SEM. Tosidet uparret t-test blev anvendt til statistisk analyse: *p < 0,05, **p < 0,01; ns: ikke signifikant. Hver rød prik, i panelerne B og C, repræsenterer den gennemsnitlige andel af 10 larver, n = 3-6 sæt pr. tidspunkt/tilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: Normal bevægelse af Drosophila larver. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: Skadelig mekanisk stimulering af Drosophila larver. Klik her for at downloade denne video.

Video 3: Subthreshold mekanisk stimulation af Drosophila larver. Klik her for at downloade denne video.

Discussion

Vi ændrede en etableret mekanisk analyse^1,2,16 ved hjælp af tilpassede mekaniske sonder fremstillet af nitinol filamenter. Denne metallegering giver os mulighed for at bruge filamenter med mindre diameter, der passer til Størrelsen af Drosophila larverne. Fiskeliniebaserede monofilamenter har domineret området for mekanisk flueforbud til dato^2,5,6,16. Vores nitinol filamenter bevare deres form og målt tryk i ca ~ 3-5 måneder (efter vores erfaring). Ved at variere længden og diameteren af nitinol filamenter, kan brugeren generere en bred vifte af tryk spænder fra subthreshold til en næsten komplet rullende respons. Især gør subthreshold sonder er enklere med mindre diameter nitinol filamenter. Ved hjælp af disse sonder fandt vi, at tryk snarere end kraft fremkalder mere konsekvente nocifensive adfærdsmæssige reaktioner⁴. Vi demonstrerer her ved hjælp af en veletableret UV-induceret nociceptiv sensibiliseringsmodel^7,10,13, at disse filamenter også er et nyttigt værktøj til at studere mekanisk overfølsomhed - allodyni og hyperalgesi.

Tidligere undersøgelser ved hjælp af mekaniske sonder fremstillet af fiskelinjen har ført til en vis variation i adfærdsmæssig lydhørhed^2,6,16,17. Flere faktorer kan tegne sig for dette. For det første fordi tryk er den vigtige variabel, er polering af glødetrådens spids, så den er afrundet og ikke har skarpe kanter, kritisk. For det andet er rapportering af trykværdier snarere end kun kraft vigtig for eksperimenternes reproducerbarhed, fordi forskellige mekaniske sonder, der genererer lignende kræfter, kan fremkalde forskellige tryk⁴. For det tredje er det afgørende kun at anvende én mekanisk stimulering pr. larve ved hjælp af skadelige sonder, fordi sådanne sonder forårsager en dosisafhængig vævsskade ved de epidermale⁴ og sensoriske neuronale niveauer (Figur 2E). En anden eller efterfølgende skadelig mekanisk stimulus, efter vævsskader er blevet induceret, kunne tænkes at forringe funktionen af de berørte perifere sensoriske neuroner og fremkalde en ændret adfærdsmæssig reaktion. I en anden undersøgelse stimulerede larver to gange med skadelige mekaniske sonder viste for det meste en forbedret adfærdsmæssig^{reaktion 5}, hvilket tyder på udvikling af en akut mekanisk sensibilisering (hyperalgesi), som kan skyldes vævsskader fremkaldt af den første skadelige mekaniske stimulus. Omvendt rapporterede andre forfattere⁶ en blandet (øget eller nedsat) adfærdsmæssig reaktion, hvilket indikerer, at den ændrede adfærdsmæssige reaktion kan skyldes skade / dysfunktion af det neuronale væv. Stimulering af hver larve kun én gang eliminerer mulig varians i adfærdsmæssige reaktioner som følge af enten sensibilisering eller vævsskader. For det fjerde stimulerede vi mekanisk segment A8, som er mere bageste end tidligere undersøgelser (foretrukne områder A3-A4)^2,5,16. Sonder mellem ~ 3.900 kPa og 5.300 kPa anvendt på enten segment A2 eller A8 viste ingen adfærdsmæssige forskelle⁴. Derudover er A8 sammenlignet med A2-A4 lettere at stimulere med mekaniske sonder, der genererer lavere tryk (<300 kPa), fordi larven er tyndere i denne region og dermed lettere komprimeres. Andre undersøgelser viste, at skadelig mekanisk stimulering af larvens bageste ende (leveret af en stiv insektstift, holdt med pincet) for det meste fremkaldte fremadrettet bevægelse snarere end et afvisende eller rullende^{respons 18}. Denne anderledes adfærdsmæssige reaktion kan skyldes forskelle i egenskaberne af de anvendte materialer (bøjelig nitinol filament vs ukomprimerbar insektstift) eller til forskellige tryk leveret til larverne (trykværdien af insektstiften blev ikke rapporteret).

Udviklingen af en mekanisk nociception assay for Drosophila larver har gjort det muligt for feltet at opdage, at forskellige mekaniske sensoriske ionkanaler og neurale kredsløb mægle mekanisk nociception^5,6,16,17. Men undersøgelsen af den mekaniske overfølsomhed (allodynia og hyperalgesi) har haltet, sammenlignet med sensibilisering af de andre sensoriske modaliteter-varme^7,8,10,13,14, kold⁹, og kemiske³. Denne forsinkelse kan til dels skyldes fraværet af egnede mekaniske sonder, der kan generere et fuldt responsområde, der spænder over subthreshold til suprathreshold-tryk. Af særlig betydning, især for vurdering af mekanisk allodyni, er subthreshold sonder, der ikke fremkalder en afvisende rullende respons fra uskadte larver. Betydningen af vores forbedrede mekaniske sonder er, at de kan fremstilles til at spænde over uskadelige stimuli (subthreshold ~ 174 kPa-200 kPa) eller den lave til høje skadelige rækkevidde (suprathreshold ~ 225 kPa til ~ 5.116 kPa). Her demonstrerer vi ved hjælp af nitinol von Frey-lignende filamenter, at Drosophila larver udvikler både mekanisk allodyni og mekanisk hyperalgesi efter UV-bestråling. Den mekaniske sensibilisering viser nogle forskelle i forhold til termisk sensibilisering. Både debut og toppen af mekanisk sensibilisering er tidligere (~ 4 h) i forhold til termisk (varme) sensibilisering (~ 8 timer for hyperalgesi og ~ 24 h for allodynia)⁷. Derudover er den mekaniske allodyni og hyperalgesi samtidig (begge topper ved ~ 4 timer). Desuden, mens varme sensibilisering (allodynia og hyperalgesi) løser helt på et senere tidspunkt punkt⁷, mekanisk overfølsomhed udstillet en lang hale, der forblev lidt over baseline. Kold sensibilisering i Drosophila indebærer et skift i kold-fremkaldt adfærd⁹ og fremkomsten af nye kold-fremkaldt adfærd-et fænomen, der ikke observeres med mekanisk stimulation. Disse forskelle i debut, varighed og observeret adfærd tyder på, at hver sensorisk modalitet kan styres af forskellige signalveje. Ved at kombinere sensibiliseringsanalysen, der er beskrevet her, med de kraftfulde genetiske værktøjer, der er tilgængelige i Drosophila, bør det give mulighed for en præcis genetisk dissektion af den mekaniske overfølsomhed (allodyni og hyperalgesi) observeret.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker	Fisher Scientific	02-540C	Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.
Black (Arkansas) bench stone	Dan’s Whetstone	SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C	Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/
Confocal microscope	Olympus	FV1000	Any equivalent confocal microscope will do
Coplin Jar	Fisher Scientific	08-816	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816
Diethyl ether	Fisher Scientific	E138-500	For anesthetizing larvae.
Etherization chamber			This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.
Fiber Optic Light Guide	Schott AG	A08575	Schott Dual Gooseneck 23 inch
Forceps	Fine Science Tool	FS-1670	For transferring larvae
Glue	Aleene's	N/A	Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue
Graspable holder	Loew Cornell	N/A	Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100ML
Hypodermic needle 30G 1/2"L	Fisher Scientific	NC1471286	BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires
Large Petridish	Falcon	351007	60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Microscope (Zeiss) Stemi 2000	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do
Microscope Cover Glass 22x22	Fisher	12-545-B
Microscope Cover Glass 22x40	Corning	2980-224	Tickness 1 1/2
Microscope Slides	Globe Scientific Inc.	1358Y
Mini Diagonal Cutter	Fisher Scientific	S43981	For cutting nitinol filaments
Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008”	Mailin Co	N/A	Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/
Piece of black vinyl	Office Depot	N/A	We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva
Small Petridish	Falcon	351008	35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish
Spatula	Fisher Scientific	21-401-10	Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish
Wipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.
W1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605	Control strain for behavioral assays
ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP	Bloomington Drosophila Stock Center	8749	Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons