Summary
运动恢复评估仍然是实验外周神经研究的基准结果衡量标准。对大鼠前肌的等分测量是评估坐骨神经缺陷重建后功能结果的宝贵工具。本文详细介绍了方法和细微差别。
Abstract
创伤性神经损伤导致大量功能丧失,段神经缺陷往往需要使用自体介置神经移植。由于其可用性和相关的供体侧发病率有限,神经再生领域的许多研究侧重于替代技术,以弥合部分神经间隙。为了研究手术或药理实验治疗方案的结果,大鼠坐骨神经模型经常被用作生物分析。大鼠模型中使用各种结果测量来确定神经再生的程度。目标肌肉的最大输出力仍然是实验疗法临床转化最相关的结果。对大鼠肌肉收缩的等分力测量以前被描述为一种可重复和有效的技术,用于评估大鼠和兔子模型中神经损伤或修复后的运动恢复。在这段视频中,我们将提供这个宝贵的程序的分步指导,以评估使用优化参数的老鼠坐骨神经缺陷模型中头肌前肌肉的功能恢复。除了手术方法和解剖常见的腹神经和头骨前肌腱外,我们将描述必要的手术前准备。将详细介绍了等轴测泰塔尼奇力测量技术。解释确定最佳肌肉长度和刺激脉冲频率,并测量最大的泰太尼肌肉收缩。
Introduction
外周神经外伤后运动功能丧失对患者生活质量和社会经济地位有重大影响。由于4年来手术技术的改善最小,这个病人群体的预后仍然很差。直接端到端无张力硬膜外修复形成黄金标准的手术重建。然而,在神经间隙扩大的情况下,自体神经移植的插位已被证明是优越的5,6。相关的捐赠网站发病率和有限的自体神经移植物的可用性已经强制需要替代技术7,8。
实验动物模型已被用来阐明外周神经再生的机制,并评估各种重建和药理治疗方案8,9的结果。大鼠坐骨神经模型是最常用的动物模型10。它们体积小,便于处理和存放。由于其最高级的神经再生潜力,干预和评估结果之间的时间减少可能导致相对较低的成本11,12。它使用的其他优点包括形态相似于人类神经纤维和大量的比较/历史研究13。虽然应谨慎对待后者,因为研究之间各种不同的结果衡量,使得很难比较结果14、15、16、17、18。
评估神经再生结果的措施范围从电生理学到组织形态学,但这些方法意味着相关性,但不一定直接测量运动功能14,15的恢复。再生神经纤维可能无法建立适当的连接,这可能导致高估功能连接的数量14,15,19,20。最好的和临床上最相关的测量,以证明正确的重新插入末端器官仍然是评估肌肉功能21,22,23。然而,为动物模型创建运动功能评估工具具有挑战性。麦地纳塞利等人首先描述了行走轨迹分析,这是自21、24、25、26、27、28实验中用于评估功能恢复的最常用方法。行走轨迹分析根据对行走大鼠21、29的爪印的测量来量化坐骨功能指数(SFI)。行走轨迹分析的主要局限性,如脚趾收缩、自动变异、打印涂抹以及与其他重新插入措施的关联性差,因此必须使用其他参数来量化功能恢复30、31。
在此前对刘易斯大鼠32和新西兰兔子33的研究中,我们验证了对头骨前部(TA)肌肉的等量泰顿力(ITF)测量,并证明了其在不同类型的神经修复34、35、36、37、38、39后肌肉恢复评估中的有效性。 TA肌肉非常适合,因为它的体积相对较大,内向由坐骨神经的腹膜分支和良好的阐明生化特性40,41,42,43。当肌肉长度(预加载力)和电气参数得到优化时,ITF 提供 32 号大鼠和 33 号兔子的侧向变异性分别为4.4%和7.5%。
本文在大鼠坐骨神经模型中提供了ITF测量的详细方案,包括对必要的手术前规划、手术方法和普通腹股神经和解剖TA肌腱的解剖的透彻描述。使用刺激强度和持续时间的预先确定值,将定义最佳肌肉长度和刺激脉冲频率。使用这四个参数,可以随后持续准确地测量 ITF。
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Protocol
所有动物程序均经机构动物护理和使用委员会(IACUC A334818)批准执行。
1. 力传感器的校准
- 确保计算机正确连接到 USB-6009 多功能 I/O 数据采集 (DAQ) 设备,该设备应连接到力传感器。
注:其他大鼠菌株和物种可能需要不同的负载细胞力转导器,因为预计更高的力为44。 - 将定制夹子从经过修改的手术增压器制成,连接到真空基可调杆臂上的力传感器。
注:定制夹子由手术止音器组成,该钳子用紧固螺丝进行修改,可调节张力(图 1)。 - 将定制的丙烯酸玻璃测试平台放在桌子上,该平台包含两块用于固定大鼠后肢的木块。
注:只要K线能够穿透和固定,其他材料,如聚氨酯也可以代替木材。 - 使用真空基座将夹子、力传感器和可调杆臂组合垂直连接到测试平台上。
- 将挂钩或环固定到夹子上以获得校准重量。
- 打开计算机并打开软件(例如,LabVIEW)。
- 软件打开后,启动用于 ITF 测量的定制虚拟仪器 (VI)(图 2)。
注: 图2 包含VI片段中的LabVIEW代码。此 VI 片段可以拖到 LabVIEW 中的块图上。它将自动转换为图形代码。对于此实验,采样率设置为 2000 Hz,每次迭代需要读取 25 个样本。 - 按下左上角的白色箭头并选择 新校准,运行 VI。新的窗口将打开。
- 以零重量启动校准过程(仅用附加的挂钩或环夹),并按 "确定"。
- 连续添加 10、20、30 和 50 克重量,并在每个重量测量之间按 确定 。
- 收集所有五个测量结果后,单击 "进程"。
- 只有在 VI 上的图形显示正线性曲线(图 3)时,才接受值。
- 在测试平台上水平重新定位夹、力传感器和可调杆臂组合。这将是用于测量 ITF 的位置。
- 单击 "零", 窗口将自动关闭。
2. 动物主题
- 使用体重在300-500克之间的雄性刘易斯大鼠。
注:为了比较神经再生,在对照组和实验组中必须使用相同的大鼠菌株,因为自成片的重量和发生率取决于应变,并且会极大地影响ITF 10、32、45、46、47的结果。
3. 手术准备
- 手术前准备所有所需的手术器械(材料表)。
- 称体重动物以确定所需的麻醉量。
- 通过将老鼠放入含3%异氟素的室内毒气中来诱导麻醉。
- 通过腹膜注射,用十份氯胺酮(100毫克/mL)和单份西拉津(100毫克/mL)的鸡尾酒对大鼠进行深度麻醉,剂量为1mL/kg。根据对脚趾挤压的反应和观察呼吸速率来监测麻醉的深度。
- 氯胺酮/xylazine鸡尾酒初始剂量后约30分钟,在内皮内给予0.3-0.6 mL/kg体重的补充剂量,以在整个过程中保持足够的麻醉,这被定义为低呼吸速率和对脚趾捏的缺席反应。
注意:重要的是要精心管理所需的麻醉,因为过量不能抵消。 - 用电动剪子小心地剃掉老鼠的后肢。
- 将大鼠置于加热垫上的易发位置,以将体温保持在 37 °C。 可选使用直肠温度计监测体温。
- 将 5 mL 的 0.9% 氯化钠 (NaCl) 皮下注射到大鼠颈部松弛的皮肤中,在整个过程中保持足够的水化状态。
- 由于此程序的非生存性质,手术场和器械不需要无菌。外科医生应使用个人防护设备 (PPE), 并建议手术窗格正确可视化解剖结构。
4. 普通腹神经的手术方法
- 将大鼠放在右侧或左侧侧卧位置,具体取决于首先测量哪一侧。
- 使用手术 15 号刀片在大分流器开始,在大腿后部皮肤上创建一个与股骨平行的 2-3 厘米切口。
- 识别二头肌股骨肌肉和臀部最大和大块的横向肌肉之间的平面,并用切除术剪刀进行钝切除术,以分离这些肌肉并暴露潜在的坐骨神经。
- 定位坐骨神经的三叉,并放置一个缩回器,以获得更好的访问。坐骨神经的三个分支包括常见的腹膜神经、头骨神经和听觉神经。
- 使用弯曲的显微外科钳分离坐骨神经的常见腹腔神经分支(通常是最腹腔分支)。
注意:在不确定的情况下,用手术神经刺激器轻轻刺激孤立的神经,并观察运动反应。刺激常见的腹膜神经会导致爪子的复发。
5. 解剖头骨前肌腱
- 为了暴露TA肌肉及其插入,在小腿前侧弯曲皮肤,从膝盖关节开始,下降到后爪的平庸侧。
- 使用手术刀片15号解剖周围组织的解剖TA肌腱。
- 使用蚊钳,直截了当地解剖TA肌肉肌腱的插入,并尽可能切开肌腱。保持近邻TA肌肉不受干扰,保持神经血管足疗。
注意:定期(大约每5分钟),用加热0.9%NaCl(37°C)湿润TA肌肉,以防止冷却和干燥。
6. 等轴测泰塔尼奇力测量
- 根据双极电极电缆的颜色将双极电极电缆和地面电缆连接到双极刺激器设备。
- 将双极电极电缆的另一端连接到子极电极上。
注:参考电极(红色、阳极)应放置磁体,并靠近主动电极(黑色、阴极)。 - 将动物与加热垫一起转移到测试平台。
- 用两根1毫米的Kirskner线穿过脚踝,用两根1毫米的Kirskner线将老鼠的后肢固定在木块上,并用分离股骨的侧向纵容避开膝盖的后侧。
注意:避免血管损伤的卵柱动脉和静脉,这是位于多面体的股骨。 - 使用真空底座将带有自定义夹子的支架连接到测试平台上。
- 将解剖 TA 肌肉肌腱固定在紧贴在力传感器上的夹子上。
注意:夹子和力传感器应与 TA 肌肉的路线平行定位。 - 将缩回器放在大鼠的后大腿上,以便进入常见的腹神经。
注意:坐骨神经及其分支应保持湿润与加热0.9%NaCl(37 °C),以防止冷却和干燥。 - 将地面电缆插入周围的肌肉(例如,巨大的横向肌肉)。
注:草SD9刺激器需要地面电缆来减少电气物件。较新的刺激器可能不需要额外的地面电缆。 - 将常见的腹神经钩到子极上,并使用平台上的支架固定其位置(图 4)。
注意:确保只有常见的腹神经被钩住到子电极。 - 优化肌肉长度
- 打开双极刺激器设备并调整设置如下:方形单相脉冲,延迟2毫秒,刺激脉冲持续时间0.4毫秒,刺激强度2 V。
注意:延迟决定同步脉冲和脉冲前缘交付之间的时间。 - 选择 参数测试 ,并在 VI 中打开 触发器集合 。
- 通过调整连接到力传感器的杠杆臂来增加肌肉长度(预加载)。
- 从 10 g 的预加载开始,使用 10 克的增量,直到确定最大活动肌肉力量。
- 对于每个预加载,使用双极刺激器设备上的按钮,直接在对方之后应用两个单抽搐。输出将在屏幕上可见,大鼠应显示爪子的后缀。
注意:在刺激神经之前,请始终使用棉尖施用器去除神经周围任何多余的 0.9% NaCl,以确保信号不会传到周围的组织。 - 要停止测量,请在 VI 中再次点击 触发器集合 。
- 如果程序自动检测到两个峰值输出力,请单击 "接受"。如果程序不自动选择这些输出力,请按 下拒绝 并手动选择峰值。两个峰值输出力将平均达到平均峰值输出力(图 5)。
- 通过从平均峰值输出力中减去预加载来计算活动肌肉力。
- 写下每个预加载的活性力,以可视化趋势并识别最大活动力(图 6)。还可用于电子表格。
- 打开双极刺激器设备并调整设置如下:方形单相脉冲,延迟2毫秒,刺激脉冲持续时间0.4毫秒,刺激强度2 V。
- 测量等轴测泰塔尼奇力
- 在确定理想的肌肉长度后,让肌肉在开始泰塔尼奇肌肉收缩前5分钟在零预加载时休息。
- 同时,从 参数测试 切换到VI 上的频率测试 ,并在双极刺激装置上将刺激强度调整为10V。
- 将延迟和刺激脉冲持续时间分别保持在 2 毫秒和 0.4 毫秒。
- 使用从 30 Hz 开始的增量 30 Hz 开始的增量测量等轴测泰塔尼奇肌肉力,直到观察到最大力高原。
- 单击 "触发器"集合 并设置为预先确定的最佳肌肉长度。
- 按下双极刺激装置上的 重复 按钮,诱导泰塔尼奇刺激最多 5 秒,或直到明确观察到力峰值。
注意:在刺激神经之前,请始终使用棉尖施用器去除神经周围任何多余的 0.9% NaCl,以确保信号不会传到周围的组织。 - 要收集数据,再次按 "触发"集合 并记录最大输出力。如果程序不自动检测峰值最大输出力,请按 下拒绝 并手动选择峰值。
- 在开始下一次太子肌收缩之前,让肌肉在零预装前5分钟再次休息。
注意:定期(大约每5分钟),用加热0.9%NaCl(37°C)湿润TA肌肉,以防止冷却和干燥。 - 继续增加刺激频率,直到达到最大力高原。力高原将被定义为最大等轴测泰塔尼奇力。
注意:此步骤后,从步骤 4 开始,取出 K 线、钉针或缝合皮肤,并将整个过程重复到反向后肢。
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Representative Results
用于测量 ITF 测量的五个参数。这些包括肌肉张力(预加载力)、刺激强度(电压)、刺激脉冲频率、0.4毫秒的刺激持续时间和2毫秒的延迟。在测量 ITF 之前,在参数测试期间,必须使用两次强度为 2 V 的单抽搐肌肉收缩来确定最佳肌肉张力。这些刺激会导致爪子的多螺旋,并在 VI (图 5) 中的图形上产生输出信号。理想情况下,这些单抽搐曲线具有代表收缩期的快速垂直上升,然后直接具有显示放松期的较慢的垂直下降周期。该程序将平均这两个峰值输出力,但活动力必须通过从平均输出力中减去预加载力来手动计算。例如,在图 5中,10 g 的预加载导致两个峰值输出力为 411.09 克(4.03 N) 和 379.78 克(3.73 N),平均峰值输出力为 395.43 克(3.88 N)。当每个预加载的活跃力在图形中绘图时,可以识别出最大活动力。这些活动力通常产生钟形曲线,刘易斯大鼠300-500克的最大活力应约为30-40克(0.29-0.39 N)(图6)。
对于频率测试期间的泰塔尼奇刺激,刺激强度增加到超最大电压(10 V),以确保使用增加频率的所有 TA 肌肉运动单元的最大激活。最佳的泰太尼曲线急剧增加和减少,具有缓慢下降的高原相位,振荡最小。 图 7 描绘了一个以 30 Hz 的刺激频率的泰塔尼奇曲线为例,其等轴测泰塔尼奇力为 803.25 克(7.88 N)。最高力高原被定义为最大 ITF。
图1:由手术止气器制成的定制夹子图像,用拧紧的螺丝进行修改,可调节张力。请单击此处查看此图的较大版本。
图2:LabVIEW上用于等轴测泰顿力测量的虚拟仪器的图形代码。请点击这里查看此图的较大版本。
图3:力传感器校准。 用五个重量(0、10、20、30 和 50 g)成功校准力传感器应导致正线性曲线。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4:等轴测泰人力测量实验设置的原理图概述。( 经梅奥医学教育和研究基金会许可使用:保留所有权利。转载自: 申, R. H. 等人。大鼠前部头骨的等量泰塔尼力测量方法。 显微外科。 28 (6), 452-457 (2008)). 请单击此处查看此图的较大版本。
图 5: 代表单抽搐曲线优化肌肉长度。 对于每个预加载测量,应用两个单抽搐。这些单抽搐曲线具有快速垂直上升(收缩期),然后是垂直下降(放松期)。两个峰值输出力将平均达到平均峰值输出力。在 Lewis 大鼠的示例中,10 g 的预加载会导致两个峰值输出力为 411.09 克(4.03 N) 和 379.78 克(3.73 N),平均峰值输出力为 395.43 g(3.88 N)。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6:最佳肌肉长度(预加载)。 活动肌肉力可以通过从平均峰值输出力中减去预加载来计算。应记录每个预加载的活跃肌肉力,直到可见活动肌肉力下降。预加载产生最高的活动肌肉力将用于测量等轴测的泰塔尼奇力。刘易斯大鼠体重300-500克的最佳预装量应约为30-40克(0.29-0.39 N)(N=10)。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7:代表等轴测泰塔尼奇力曲线。 最佳的泰太尼曲线急剧增加,然后有一个缓慢下降的高原阶段,然后急剧下降。最高力高原被定义为最大 ITF。此示例描绘了刺激频率为 30 Hz 的泰塔尼奇曲线,等轴测泰塔尼奇力为 803.25 克(7.88 N)。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议描述了一个先前验证的方法,以获得准确的最大ITF测量TA肌肉在老鼠模型32。实验性神经重建治疗后最大力量的恢复是临床环境的主要兴趣,因为它证明神经不仅再生,而且与目标肌肉建立工作联系。ITF可用于小神经间隙模型,如大鼠坐骨神经模型32,并且通过对协议的一些修改,它也可以用于更大的神经间隙兔子模型33。
应考虑采取若干关键步骤,以确保一致和可靠的最大等轴测量肌肉力测量。仔细选择麻醉类型,以防止骨骼肌肉副作用的重要性,以前已经描述了32,33。异丙酮的使用已经证明肌肉力量的时间依赖性下降,这可以解释为它的能力,诱导血小球菌视网膜刺激释放钙33,48。氯胺酮/西拉津对肌肉力量的影响已被证明是最小的,根据我们的经验和以前的研究32。分离TA肌肉肌腱的安全依附到力传感器上对于精确测量也非常重要。应防止或直接纠正肌腱的滑动或撕裂。因此,由手术止气器制成的定制夹子,并使用紧固螺丝进行修改。其他研究小组已经描述了一种干燥肌腱约30分钟的技术,以机械地加强肌腱和夹子49之间的接口。为了保持肌肉的耐力,关键是避免TA肌肉和肌腱干燥与温暖的0.9%NaCl,并实施每次太子刺激之间的5分钟休息期。休息期基于磷原系统的活性,也称为直接能量来源,对爆炸性肌肉收缩很重要。它由腺苷三磷酸盐 (ATP) 和肌酸磷酸盐活性组成,提供能量,最大活性少于 10 秒。它需要大约3-5分钟来补充100%的磷原50。
我们认识到此视频中描述的方法的局限性。该过程的非生存性质不允许随着时间的推移进行串行测量。此外,它是一个详细和耗时的测试协议。在 1 到 2 小时的测试时间内,神经和肌肉会经历大量刺激,这可能导致肌肉疲劳,ITF 可能会减少。然而,与兔子33相比,这在老鼠模型中已经证明不那么突出了。
总之,本视频中描述的 ITF 测量是实验外周神经研究中量化运动恢复的宝贵工具。当提出其他结果措施,如电生理学和组织形态学时,可以提供神经功能的全球评估。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家神经系统疾病和中风研究所的支持,该研究所获得第1号RO1 NS 102360奖。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA | G130203 | |
1 mm Kirshner wires | Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ | N/A | |
Adson Tissue Forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-6801226 | |
Bipolar electrode cables | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
Bipolar stimulator device | Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
Cotton-tip Applicators | Cardinal Health, Waukegan, IL, USA | C15055-006 | |
Curved Mosquito forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-1201112 | |
Force Transducer MDB-2.5 | Transducer Techniques, Temecula, CA | N/A | |
Gauze Sponges 4x4 | Covidien, Mansfield, MA, USA | 2733 | |
Ground cable | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
Isoflurane chamber | N/A | N/A | Custom-made |
Ketamine | Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ | 42023-115-10 | |
LabView Software | National Instruments, Austin, TX | ||
Loop | N/A | N/A | Custom-made |
Microsurgical curved forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JFA-5B | |
Microsurgical scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | SAS-15R-8-18 | |
Microsurgical straight forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JF-3 | |
Retractor | ASSI, Westbury, NY, USA | AG-124426 | |
Scalpel Blade No. 15 | Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA | 371115 | |
Slim Body Skin Stapler | Covidien, Mansfield, MA, USA | 8886803512 | |
Subminiature electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | N/A | |
Surgical Nerve Stimulator | Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA | 9094 | |
Terrell Isoflurane | Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA | H961J19A | |
Testing platform | N/A | N/A | Custom-made |
Tetontomy Scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | ASIM-187 | |
Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S407992 | |
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
Vacuum Base Holder | Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal | N/A | Attached clamp is custom-made |
Weight (10 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820010.4 | |
Weight (20 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820020.4 | |
Weight (50 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820050.4 | |
Xylazine | Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada | 1XYL002 |
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