Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

쥐의 티비아리스 전방 근육의 최대 동면 성 파타닉 힘 측정

Published: June 26, 2021 doi: 10.3791/61926
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Orthopedic Surgery, Mayo Clinic, 2Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Health Sciences, Department of Plastic Surgery, Nijmegen, The Netherlands

Summary

모터 회복의 평가는 실험적인 말초 신경 연구에서 벤치마크 결과 측정으로 남아 있습니다. 쥐의 티볼리스 전방 근육의 동면 파탄력 측정은 경련성 신경 결함의 재구성 후 기능적 결과를 평가하는 귀중한 도구입니다. 방법과 뉘앙스는이 문서에 자세히 설명되어 있습니다.

Abstract

외상성 신경 상해는 상당한 기능적인 손실 귀착되고 세그먼트 신경 결함은 수시로 자가 간 신경 이식의 사용을 필요로 합니다. 그들의 제한된 가용성 및 관련 기증자 측 이환율 때문에, 신경 재생 의 필드에 있는 많은 연구 결과는 세그먼트 신경 격차를 다리를 내기 위하여 대체 기술에 집중합니다. 외과 또는 약리학적 실험 치료 옵션의 결과를 조사하기 위해 쥐 시차 신경 모델은 종종 생체 분석으로 사용됩니다. 쥐 모델에는 신경 재생의 정도를 결정하는 다양한 결과 측정이 있습니다. 대상 근육의 최대 출력 력은 실험 요법의 임상 번역을 위한 가장 관련성이 높은 결과로 남아 있습니다. 파상성 근육 수축의 동급력 측정은 이전에 쥐와 토끼 모델 모두에서 신경 부상 또는 수리 후 모터 회복을 평가하기위한 재현 가능하고 유효한 기술로 설명되었습니다. 이 비디오에서는 최적화된 매개 변수를 사용하여 쥐 좌골 신경 결함 모델에서 티비알리스 전방 근육의 기능적 회복을 평가하는 이 귀중한 절차의 단계별 지침을 제공할 것입니다. 우리는 일반적인 관상 신경 및 티볼리스 전방 근육 힘줄의 외과 접근 그리고 해부 이외에 필요한 외과 전 준비를 설명할 것입니다. 등대식 파탄력 측정 기법이 상세합니다. 최적의 근육 길이 와 자극 펄스 주파수를 결정하고 최대 파상풍 근육 수축을 측정하는 것이 입증된다.

Introduction

외상성 말초 신경 손상에 따른 운동 기능의 상실은 환자의 삶의 질과 사회경제적 상태에 큰 영향을 미친다1,2,3. 이 참을성 있는 인구의 예후는4년 동안 외과 기술에 있는 최소한의 개선 때문에 가난한 남아 있습니다. 직접 엔드 투 엔드 장력 없는 상신성 수리금 은제 수술 재건을 형성합니다. 그러나, 자가 신경 이식의 확장된 신경 간격 의 상호 처리가 있는 경우에우수한것으로 입증되었습니다5,6. 관련 기증자 부위 이환율 및 자가 신경 이식의 제한된 가용성은 대체 기술에 대한 필요성을부과했다7,8.

실험적인 동물 모델은 말초 신경 재생의 메커니즘을 해명하고 다양한 재건 및 약리학적 치료 옵션의 결과를 평가하는 데 사용되어 왔다8,9. 쥐 상골 신경 모델은 가장 자주 사용되는 동물모델(10)이다. 그들의 작은 크기는 쉽게 처리하고 집을 수 있습니다. 그들의 최상급 신경 재생 잠재력으로 인해, 결과의 내정간섭 그리고 평가 사이 감소된 시간은 상대적으로 더 낮은 비용11,12귀착될 수 있습니다. 그 사용의 다른 장점은 인간 신경 섬유에 형태학적 유사성과 비교 / 역사적 연구의 높은 수를 포함한다13. 후자는 신중하게 접근해야하지만, 연구 사이의 다양한 결과 측정으로 결과14,15,16,17,18을비교하기가 어렵다.

신경 재생 범위를 평가하는 결과 측정은 전기생리학에서 히스토모홈에 이르기까지 다양하지만, 이러한 방법은 상관관계를 암시하지만 반드시 직접 운동기능(14,15)의반환을 측정하지는 않는다. 재생 신경 섬유기능 연결 의 수의 과대 평가를 일으킬 수있는 적절한 연결을하지 않을 수 있습니다14,15,19,20. 최종 장기의 올바른 재관전을 입증하기 위한 가장 우수하고 임상적으로 가장 관련성이 가장 좋은 측정은 근육기능(21,22,23)에대한 평가를 유지한다. 그러나 동물 모델에 대한 모터 기능 평가 도구를 만드는 것은 어려운 일입니다. Medinaceli 외. 먼저 실험적인 말초 신경 연구에서 기능적 회복을 평가하는 가장 자주 사용되는 방법인 워킹 트랙 분석을 설명하였으며,21,24,25,26,27, 28. 보행 트랙 분석은 걷는 쥐21,29에서발자국의 측정을 기반으로 좌골 기능 지수 (SFI)를 정량화한다. 발가락 수축, 자동 절단, 인쇄의 번짐 및 다른 재관전 측정과 의 상관 관계가 좋지 않은 것과 같은 보행 트랙 분석의 주요 한계는 기능적회복(30)및31의정량화를 위한 다른 파라미터의 사용을 필요로 한다.

루이스쥐(32)와 뉴질랜드 토끼(33)의 이전 연구에서, 우리는 티비알리스 전방(TA) 근육에 대한 등도성 파상력(ITF) 측정을 검증하고 신경 수리34,35,36,37,38,39의다양한 유형의 신경 회복 후 근육 회복평가에서 그 효과를 입증하였다. TA 근육은 상대적으로 큰 크기 때문에 잘 적합, sciatic 신경의 연속 적 분지및 잘 해명 생화 확성 특성에 의해 내부40,41,42,43. 근육 길이(preload force) 및 전기 파라미터가 최적화되면 ITF는쥐(32)와 토끼(33)에서각각 4.4%와 7.5%의 좌우 가변성을 제공한다.

이 문서는 쥐 강차 신경 모델에서 ITF 측정의 상세한 프로토콜을 제공합니다, 필요한 사전 수술 계획의 철저한 설명을 포함, 수술 접근 및 일반적인 관상 신경및 해부 TA 근육 힘줄. 자극 강도 및 지속 시간에 미리 정해진 값을 사용하여 최적의 근육 길이 및 자극 펄스 주파수가 정의됩니다. 이 네 가지 매개 변수를 사용하면 ITF를 일관되고 정확하게 측정할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

모든 동물 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC A334818)의 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 힘 변환기의 교정

  1. 컴퓨터가 USB-6009 다기능 I/O 데이터 수집(DAQ) 장치에 제대로 연결되어 있는지 확인하여 힘 변환기에 연결해야 합니다.
    참고: 다른 쥐 균주 및 종은 더 높은 힘이 44로예상되기 때문에 다른 로드 셀 힘 트랜스듀서가 필요할 수 있다.
  2. 진공 베이스 조절 레버 암에 장착된 포스 트랜스듀서에 변형된 수술 용 헤모스타에서 제작된 맞춤형 클램프를 부착합니다.
    참고: 맞춤형 클램프는 장력 조정을 허용하는 조임 나사로 변형된 수술 용 이모로구성됩니다(그림 1).
  3. 쥐 뒷다리를 고정하기 위한 두 개의 나무 블록이 있는 맞춤형 아크릴 유리 테스트 플랫폼을 테이블에 배치합니다.
    참고: 우레탄과 같은 다른 재료는 K-와이어가 침투하여 고정할 수 있는 한 나무 대신 사용할 수 있습니다.
  4. 클램프, 강제 변환기 및 조절 가능한 레버 암 조합을 진공 베이스를 사용하여 테스트 플랫폼에 수직으로 부착합니다.
  5. 교정 가중치에 대한 후크 또는 루프를 클램프에 고정합니다.
  6. 컴퓨터를 켜고 소프트웨어(예: LabVIEW)를 엽니다.
  7. 소프트웨어가 열리면 ITF 측정을 위한 맞춤형 가상 기기(VI)를시작합니다(그림 2).
    참고: 그림 2에는 VI 스니펫에 LabVIEW 코드가 포함되어 있습니다. 이 VI 스니펫은 LabVIEW의 블록 다이어그램으로 드래그할 수 있습니다. 자동으로 그래픽 코드로 변환됩니다. 이 실험을 위해 샘플링 속도는 각 반복에 대해 읽을 25개의 샘플이 있는 2000Hz에서 설정되었습니다.
  8. 왼쪽 상단 모서리에 있는 흰색 화살표를 눌러 VI를 실행하고 새 교정을 선택합니다. 새 창이 열립니다.
  9. 0 무게(연결된 후크 또는 루프가 있는 클램프만)로 교정 프로세스를 시작하고 확인을누릅니다.
  10. 연속적으로 10, 20, 30 및 50 그램의 무게를 추가하고 각 체중 측정 사이에 확인을 누릅니다.
  11. 다섯 가지 측정값이 모두 수집되면 프로세스를클릭합니다.
  12. VI의 그래프가 양수 선형곡선(그림 3)을표시하는 경우에만 값을 수락합니다.
  13. 클램프, 강제 변환기 및 조절 가능한 레버 암 조합을 테스트 플랫폼에서 수평으로 재배치합니다. ITF를 측정하는 데 사용되는 위치입니다.
  14. 0을 클릭하면 창이 자동으로 닫힙니다.

2. 동물 과목

  1. 300-500 g 사이의 무게 남성 루이스 쥐를 사용.
    참고: 신경 재생의 비교를 위해, 자동 절제술의 무게와 발생률이 변형에 의존적이고 ITF10,32,45,46,47의결과에 엄청난 영향을 미칠 수 있기 때문에 대조군과 실험 군 모두에서 동일한 쥐 균주를 사용하는 것이 필수적이다.

3. 외과 적 준비

  1. 수술 전에 필요한 모든 수술 기구를 준비하십시오(재료의 표).
  2. 동물을 계량하여 필요한 양의 마취를 결정합니다.
  3. 산소에 3%의 이소플루란으로 가스가 있는 챔버에 쥐를 배치하여 마취를 유도한다.
  4. 10부 짜리 케타민(100 mg/mL)과 1부 자일라진(100 mg/mL)의 칵테일을 사용하여 쥐를 1mL/kg의 체중1mL/kg의 투여량으로 사용하여 쥐를 심층 투여합니다. 발가락 핀치에 대한 반응과 호흡 속도를 관찰하여 마취의 깊이를 모니터링합니다.
  5. 케타민/자일라진 칵테일의 초기 투여 후 약 30분 후, 케타민(100 mg/mL)의 체중 0.3-0.6mL/kg의 추가 용량을 투여하여 전체 절차 전반에 걸쳐 적절한 마취를 유지하며, 이는 낮은 호흡률과 핀치에 대한 부재 반응으로 정의된다.
    주의: 과다 복용으로 는 상쇄 될 수 없기 때문에 필요한 마취를 꼼꼼하게 관리하는 것이 중요합니다.
  6. 전기 클리퍼를 사용하여 쥐의 뒷다리를 조심스럽게 면도하십시오.
  7. 37°C에서 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 쥐를 놓습니다. 선택적으로, 직장 온도계를 사용하여 체온을 모니터링할 수 있다.
  8. 5mL의 염화나트륨(NaCl)을 쥐의 목에 걸쳐 느슨한 피부에 피하하여 시술 전반에 걸쳐 적절한 수분 공급을 유지한다.
  9. 이 절차의 비 생존 특성으로 인해 외과 분야와 계측기는 멸균될 필요가 없습니다. 외과 의사는 개인 보호 장비 (PPE)를 사용해야하며 외과 용 루페는 해부학 구조의 적절한 시각화를 권장합니다.

4. 일반적인 회내 신경에 외과 접근

  1. 쥐를 먼저 측정할 측면에 따라 오른쪽 또는 왼쪽 측면 재배치 위치에 놓습니다.
  2. 수술 번호 15 블레이드를 사용하여 더 큰 트로챈터에서 시작하는 대퇴골과 평행한 후부 허벅지의 피부에 2-3cm 절개를 만듭니다.
  3. 이두근 여성근과 글루푸스 막시무스와 광두측기 근육 사이의 평면을 확인하고 이러한 근육을 분리하고 근본적인 좌골 신경을 노출하기 위해 동방신기 가위를 사용하여 무딘 해부를 수행합니다.
  4. 상골 신경의 삼중을 찾아 더 나은 접근을 얻기 위해 재트랙터를 배치합니다. 상시 신경의 3개의 가지는 일반적인 관상 신경, 티비알리스 신경 및 sural 신경을 포함합니다.
  5. 곡선된 미세 수술 집게를 사용하여 상골 신경의 일반적인 복리동맥 신경 분기 (일반적으로 가장 복부 분기)를 격리합니다.
    참고: 불확실성의 경우 외과 신경 자극기로 고립 된 신경을 부드럽게 자극하고 운동 반응을 관찰하십시오. 일반적인 복막 신경의 자극은 발의 dorsiflexion에 있는 결과.

5. 해부 티볼리스 전방 근육 힘줄의 해부

  1. TA 근육과 삽입을 노출시키기 위해 무릎 관절에서 시작하여 뒷발의 메디오도르산 쪽으로 내려가는 하반신의 전방 측면에서 피부를 절개하십시오.
  2. 수술 블레이드 No. 15와 메스를 사용하여 주변 조직에서 해부 TA 근육 힘줄을 해부.
  3. 모기 집게를 사용하여 TA 근육 힘줄을 삽입쪽으로 무뚝뚝하게 해부하고 가능한 한 해반으로 힘줄을 자른다. 근위 TA 근육을 방해하지 않고 신경 혈관 혈통을 보존하십시오.
    참고: 정기적으로(약 5분마다) 냉각 및 건조를 방지하기 위해 0.9% NaCl(37°C)으로 TA 근육을 촉촉하게 합니다.

6. 이소메트릭 파탄력 측정

  1. 양극성 전극 케이블과 접지 케이블을 양극성 자극기 장치에 연결합니다.
  2. 양극 전극 케이블의 다른 쪽 끝을 소형 전극에 부착합니다.
    참고: 기준 전극(적색, 양극)은 탈경과 활성 전극(블랙, 음극) 근접형을 배치해야 합니다.
  3. 가열 패드와 함께 동물을 테스트 플랫폼으로 옮기습니다.
  4. 쥐의 뒷다리를 나무 블록에 고정하여 발목을 통과하는 두 개의 1mm Kirschner 와이어와 무릎의 후방 측면을 피하는 단두골의 측면 콘딜을 사용하십시오.
    주의: 대퇴골 콘딜에 등대적으로 위치한 포라이트 동맥과 정맥에 혈관 손상을 피하십시오.
  5. 진공 베이스를 사용하여 사용자 지정 클램프가 있는 홀더를 테스트 플랫폼에 연결합니다.
  6. 포스 트랜스듀서에 부착된 클램프에 탈단 TA 근육 힘줄을 고정합니다.
    참고: 클램프 및 힘 트랜스듀서는 TA 근육의 경과와 평행하게 배치되어야 합니다.
  7. 일반적인 회음 신경에 접근하기 위하여 쥐의 후방 허벅지에 재트랙터를 놓습니다.
    참고: 상주 신경과 그 가지는 냉각 및 건조를 방지하기 위해 가열 된 0.9 % NaCl (37 °C)로 촉촉하게 유지되어야합니다.
  8. 주변 근육에 접지 케이블을 삽입하십시오(예: 광대스 측삭 근육).
    참고: 잔디 SD9 자극기는 전기 적 유물을 줄이기 위해 접지 케이블이 필요합니다. 최신 자극기는 추가 접지 케이블이 필요하지 않을 수 있습니다.
  9. 일반적인 복종 신경을 하위 소형 전극에 연결하고 플랫폼의 홀더를 사용하여 위치를 수정합니다(도4).
    참고: 일반적인 복종 신경만 하위 소형 전극에 매여 있는지 확인합니다.
  10. 근육 길이의 최적화
    1. 양극성 자극기 장치를 켜고 다음과 같이 설정을 조정하십시오: 정사각형 단면 펄스, 지연 2 ms, 자극 펄스 지속 시간 0.4 ms, 자극 강도 2 V.
      참고: 지연은 펄스 동기화와 펄스의 선행 가장자리 전달 사이의 시간을 결정합니다.
    2. 매개 변수 테스트를 선택하고 VI에서 트리거 컬렉션을 켭니다.
    3. 힘 변환기에 부착된 레버 암을 조정하여 근육 길이(preload)를 늘립니다.
    4. 10g의 프리로드에서 시작하여 최대 활성 근육력이 결정될 때까지 10g의 증분을 사용하십시오.
    5. 각 프리로드에 대해 양극성 자극기 장치의 버튼을 사용하여 서로 두 개의 단일 트위치를 서로 직접 적용합니다. 출력은 화면에 표시되며 쥐는 발의 dorsiflexion을 표시해야합니다.
      참고 : 신경을 자극하기 전에, 항상 신호를 주변 조직에 실시하지 않도록 면 기울어진 어플리케이터를 사용하여 신경을 둘러싼 모든 초과 0.9 %의 NaCl을 제거합니다.
    6. 측정을 중지하려면 VI에서 트리거 컬렉션을 다시 누르십시오.
    7. 프로그램이 자동으로 두 개의 피크 출력 힘을 감지하면 수락을 클릭합니다. 프로그램이 이러한 출력 힘을 자동으로 선택하지 않는 경우 Decline를 누르고 수동으로 피크를 선택합니다. 두 피크 출력 힘은 평균 피크 출력력(그림 5)으로평균됩니다.
    8. 평균 피크 출력 력에서 프리로드를 빼서 활성 근육 력을 계산합니다.
    9. 추세를 시각화하고 최대 활성력을 인식하기 위해 각 프리로드에 대한 활성 힘을 적어 둡니다(그림6). 스프레드시트도 사용할 수 있습니다.
  11. 등대식 파탄력 측정
    1. 이상적인 근육 길이를 결정한 후, 파탄 근육 수축을 시작하기 전에 5 분 동안 제로 프리로드에서 근육을 쉬게하십시오.
    2. 한편, 파라미터 테스트에서 VI의 주파수 테스트로 전환하고 양극성 자극기 장치에서 자극 강도를 10V로 조정한다.
    3. 각각 2ms 및 0.4 ms에서 지연 및 자극 펄스 지속 시간을 유지합니다.
    4. 최대 힘 고원이 관찰될 때까지 30Hz의 증분으로 30Hz에서 시작하여 증가하는 자극 주파수를 사용하여 동위원소 파탄 근육력을 측정합니다.
    5. 트리거 컬렉션을 클릭하고 미리 정해진 최적의 근육 길이로 설정합니다.
    6. 양극성 자극기 장치의 반복 버튼을 눌러 최대 5초 동안 또는 힘 피크가 명확하게 관찰될 때까지 테탄자극을 유도한다.
      참고 : 신경을 자극하기 전에, 항상 신호를 주변 조직에 실시하지 않도록 면 기울어진 어플리케이터를 사용하여 신경을 둘러싼 모든 초과 0.9 %의 NaCl을 제거합니다.
    7. 데이터를 수집하려면 트리거 수집을 다시 누르고 최대 출력 힘을 문서화합니다. 프로그램이 최대 출력 력을 자동으로 감지하지 못하는 경우 Decline를 누르고 수동으로 피크를 선택합니다.
    8. 다음 파탄 근육 수축을 시작하기 전에 5 분 동안 제로 프리로드에서 근육이 다시 쉬게하십시오.
      참고: 정기적으로(약 5분마다) 냉각 및 건조를 방지하기 위해 0.9% NaCl(37°C)으로 TA 근육을 촉촉하게 합니다.
    9. 최대 힘 고원에 도달할 때까지 자극 주파수를 계속 늘릅니다. 힘 고원은 최대 등색 파탄력으로 정의됩니다.
      참고: 이 단계 후, K-와이어를 제거, 스테이플 또는 봉합 피부를 봉합하고 4 단계에서 시작, 반대 뒷다리에 전체 절차를 반복.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ITF 측정을 측정하는 데 5개의 매개 변수가 사용됩니다. 여기에는 근육 장력(preload force), 자극 강도(전압), 자극 펄스 주파수, 0.4 ms의 자극 지속 시간 및 2ms의 지연이 포함됩니다. ITF를 측정하기 전에, 최적의 근육 장력은 파라미터 테스트 중에 2V의 강도에서 두 개의 단일 트위치 근육 수축을 사용하여 결정되어야 한다. 이러한 자극은 발의 등등 플렉시션을 유발하고VI(도 5)에서그래프에 출력 신호를 생성한다. 이러한 단일 트위치 곡선은 수축 기간을 직접 나타내는 빠른 수직 상승스윙을 가지며, 이완 기간을 보여주는 느린 수직 감소 기간이 뒤따릅니다. 이 프로그램은 이 두 개의 피크 출력 힘을 평균하지만, 활성 력은 평균 출력 력에서 프리로드 힘을 빼서 수동으로 계산해야 합니다. 도 5의예에서, 10g의 예는 411.09g(4.03 N) 및 379.78g(3.73 N)의 2개의 피크 출력 력을 초래하며, 이는 평균 피크 출력 력 395.43g(3.88 N)으로 평균이다. 각 프리로드의 활성 힘이 그래프의 플롯인 경우 최대 활성 힘을 식별할 수 있습니다. 이러한 활성 력은 일반적으로 종 모양의 곡선을 생성하고 300-500 g의 루이스 쥐에 대한 최대 활성 력은 약 30-40g (0.29-0.39 N)(도6)이어야한다.

주파수 테스트 중 파탄성 자극의 경우, 자극 강도는 증가 주파수를 사용하여 모든 TA 근육 모터 유닛의 최대 활성화를 보장하기 위해 초라 최대 전압(10 V)으로 증가합니다. 최적의 파탄 곡선은 급격히 증가하고 감소하며 진동을 최소화하여 고원 상이 서서히 감소합니다. 도 7은 803.25g(7.88 N)의 등도 파탄력을 가진 30Hz의 자극 주파수에서 파탄 곡선의 예를 나타낸다. 가장 높은 힘 고원은 최대 ITF로 정의됩니다.

Figure 1
그림 1: 외과 적 hemostat에서 유행하고 장력 조정을 허용하는 조임 나사로 변형 된 맞춤형 클램프의 이미지.

Figure 2
그림 2: LabVIEW에서 등등 측정 파탄력 측정을 위한 가상 계측기의 그래픽 코드를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 힘 변환기의 교정. 5개의 가중치(0, 10, 20, 30 및 50g)를 가진 힘 변환기를 성공적으로 보정하면 양수 선형 곡선이 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 등극성 파탄력 측정을 위한 실험 용 설정에 대한 회로도 개요. (마요 의료 교육 및 연구 재단의 허가를 받아 저작권이 있으며 사용됨; 모든 권리 보유. 에서 전각 : 신, R. H. 외. 쥐에서 티비알리스 전방의 등도 성 파탄력 측정 방법. 미세 수술. 28 (6), 452-457 (2008)). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 근육 길이의 최적화를 위한 대표적인 단일 트위치 곡선입니다. 각 프리로드 측정에 대해 두 개의 단일 트위치가 적용됩니다. 이러한 단일 트위치 곡선은 수직 상승(수축 기간)이 세이그다음에 수직 감소(이완 기간)를 갖습니다. 두 개의 피크 출력 힘은 평균 피크 출력 력으로 평균됩니다. 루이스 쥐를 가진 이 예에서는, 10g의 프리로드는 411.09 g (4.03 N) 및 379.78 g (3.73 N)의 2개의 피크 출력 힘을 초래하며, 이는 평균 피크 출력 력 395.43g(3.88 N)으로 평균이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 최적의 근육 길이 (프리로드). 활성 근육 력은 평균 피크 출력 력에서 프리로드를 빼서 계산할 수 있습니다. 활성 근육력의 저하가 보일 때까지 각 프리로드에 대한 활성 근육 력을 문서화해야 합니다. 가장 높은 활성 근육력을 산출하는 프리로드는 동위 동면 파탄력을 측정하는 데 사용됩니다. 300-500 g의 루이스 쥐에 대한 최적의 프리로드는 약 30-40g (0.29-0.39 N) (N =10)여야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 대표적인 등분성 파탄력 곡선. 최적의 파상풍 곡선이 급격히 증가한 다음, 고원 상이 서서히 감소하고 급격히 감소합니다. 가장 높은 힘 고원은 최대 ITF로 정의됩니다. 이 예제에서는 803.25g(7.88 N)의 등도 성 파탄력을 가진 30Hz의 자극 주파수에서 파상풍 곡선을 묘사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 프로토콜은 쥐모델(32)에서TA 근육의 정확한 최대 ITF 측정값을 획득하기 위한 이전에 검증된 방법을 설명합니다. 실험신경 재건 치료 후 최대 강도의 회복은 신경이 재생뿐만 아니라 대상 근육과 작업 연결을 했다는 것을 증명하기 때문에 임상 설정에 대한 주요 관심사입니다. ITF는 쥐 상골 신경모델(32)과같은 작은 신경 갭 모델에서 사용될 수 있으며, 프로토콜에 대한 몇 가지 변형과 함께, 또한 더 큰 신경 갭 토끼모델(33)에도사용될 수 있다.

일관되고 신뢰할 수 있는 최대 등대 측정을 보장하기 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 골격 근 부작용을 방지 하기 위해 마취의 종류를 신중 하 게 선택 의 중요성은 이전에 설명 되었습니다32,33. 이소플루란의 사용은 근육력의 시간 의존적 감소를 입증하였는데, 이는 칼슘33,48의세포질 자극 방출을 유도하는 능력에 의해 설명될 수 있다. 케타민/자일라진이 근육력에 미치는 영향은 우리의 경험과 이전 연구32에기초하여 최소한의 것으로 입증되었습니다. 힘 변환기에 탈단 TA 근육 힘줄의 안전한 부착은 정확한 측정에 매우 중요합니다. 힘줄의 미끄러짐 또는 찢어짐을 방지하거나 직접 수정해야 합니다. 따라서, 맞춤형 클램프는 외과 용 hemostat에서 생성되고 조임 나사로 수정되었습니다. 다른 연구 그룹은 힘줄과클램프(49)사이의 인터페이스를 기계적으로 강화하기 위해 약 30분 동안 힘줄을 건조시키는 기술을 기술했다. 근육의 지구력을 유지하기 위해서는 따뜻한 0.9 % NaCl로 TA 근육과 힘줄의 탈수를 피하고 각 파상화 사이의 5 분 휴식 기간을 구현하는 것이 중요합니다. 휴식 기간은 폭발성 근육 수축에 중요한 즉각적인 에너지원으로알려진 인산염 시스템의 활성을 기반으로 합니다. 그것은 아데노신 트리호스페이트 (ATP) 및 크레아틴 인산염 활성으로 구성되어 있으며 최대 활동의 10 초 미만 에너지를 제공합니다. 인산염 의 100%를 보충하기 위해서는 약 3-5분이 필요하다50.

이 비디오에 설명된 메서드의 한계를 인식하고 있습니다. 절차의 생존이 아닌 특성은 시간이 지남에 따라 직렬 측정을 허용하지 않습니다. 또한 상세하고 시간이 많이 소요되는 테스트 프로토콜입니다. 동안 1 받는 시간 테스트 시간, 신경과 근육 ITF에 잠재적인 감소와 근육 피로 발생할 수 있는 자극의 상당한 수를 겪고. 그러나 이것은 토끼(33)에비해 쥐 모델에서 덜 눈에 띄는 것으로 입증되었습니다.

결론적으로, 이 비디오에 설명된 ITF 측정은 모터 회복을 정량화하기 위한 실험적인 말초 신경 연구에서 귀중한 도구입니다. 전기 생리학 및 히스토모홈트리와 같은 다른 결과 측정값을 제시하면 신경 기능에 대한 글로벌 평가가 제공될 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 간행물에 보고된 연구는 상 번호 RO1 NS 102360의 밑에 건강의 국가 학회의 신경장애 그리고 치기의 국가 학회에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA G130203
1 mm Kirshner wires Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ N/A
Adson Tissue Forceps ASSI, Westbury, NY, USA MTK-6801226
Bipolar electrode cables Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Bipolar stimulator device Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Cotton-tip Applicators Cardinal Health, Waukegan, IL, USA C15055-006
Curved Mosquito forceps ASSI, Westbury, NY, USA MTK-1201112
Force Transducer MDB-2.5 Transducer Techniques, Temecula, CA N/A
Gauze Sponges 4x4 Covidien, Mansfield, MA, USA 2733
Ground cable Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Isoflurane chamber N/A N/A Custom-made
Ketamine Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ 42023-115-10
LabView Software National Instruments, Austin, TX
Loop N/A N/A Custom-made
Microsurgical curved forceps ASSI, Westbury, NY, USA JFA-5B
Microsurgical scissors ASSI, Westbury, NY, USA SAS-15R-8-18
Microsurgical straight forceps ASSI, Westbury, NY, USA JF-3
Retractor ASSI, Westbury, NY, USA AG-124426
Scalpel Blade No. 15 Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA 371115
Slim Body Skin Stapler Covidien, Mansfield, MA, USA 8886803512
Subminiature electrode Harvard Apparatus, Holliston, MA N/A
Surgical Nerve Stimulator Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA 9094
Terrell Isoflurane Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA H961J19A
Testing platform N/A N/A Custom-made
Tetontomy Scissors ASSI, Westbury, NY, USA ASIM-187
Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S407992
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device National Instruments, Austin, TX 779026-01
Vacuum Base Holder Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal N/A Attached clamp is custom-made
Weight (10 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820010.4
Weight (20 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820020.4
Weight (50 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820050.4
Xylazine Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada 1XYL002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The incidence of peripheral nerve injury in extremity trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87 (5), 381-385 (2008).
  2. Huckhagel, T., Nuchtern, J., Regelsberger, J., Lefering, R., TraumaRegister, D. G. U. Nerve injury in severe trauma with upper extremity involvement: evaluation of 49,382 patients from the TraumaRegister DGU(R) between 2002 and 2015. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 26 (1), 76 (2018).
  3. Tapp, M., Wenzinger, E., Tarabishy, S., Ricci, J., Herrera, F. A. The Epidemiology of Upper Extremity Nerve Injuries and Associated Cost in the US Emergency Departments. Annals of Plastic Surgery. 83 (6), 676-680 (2019).
  4. Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: a review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 698256 (2014).
  5. Terzis, J., Faibisoff, B., Williams, B. The nerve gap: suture under tension vs. graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 56 (2), 166-170 (1975).
  6. Millesi, H. Forty-two years of peripheral nerve surgery. Microsurgery. 14 (4), 228-233 (1993).
  7. Wood, M. D., Kemp, S. W., Weber, C., Borschel, G. H., Gordon, T. Outcome measures of peripheral nerve regeneration. Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger. 193 (4), 321-333 (2011).
  8. Alvites, R., et al. Peripheral nerve injury and axonotmesis: State of the art and recent advances. Cogent Medicine. 5 (1), 1466404 (2018).
  9. Diogo, C. C., et al. The use of sheep as a model for studying peripheral nerve regeneration following nerve injury: review of the literature. Journal of Neurology Research. 39 (10), 926-939 (2017).
  10. Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
  11. Brenner, M. J., et al. Role of timing in assessment of nerve regeneration. Microsurgery. 28 (4), 265-272 (2008).
  12. Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: a systematic review. Laboratory investigation. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
  13. Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
  14. Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Selection of the appropriate parameter to measure neural regeneration. Annals of Plastic Surgery. 23 (3), 197-202 (1989).
  15. Munro, C. A., Szalai, J. P., Mackinnon, S. E., Midha, R. Lack of association between outcome measures of nerve regeneration. Muscle Nerve. 21 (8), 1095-1097 (1998).
  16. Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Journal of Neurology Research. 26 (2), 186-194 (2004).
  17. Hadlock, T. A., Koka, R., Vacanti, J. P., Cheney, M. L. A comparison of assessments of functional recovery in the rat. Journal of the Peripheral Nervous System. 4 (3-4), 258-264 (1999).
  18. Kanaya, F., Firrell, J. C., Breidenbach, W. C. Sciatic function index, nerve conduction tests, muscle contraction, and axon morphometry as indicators of regeneration. Plastic and Reconstructive Surgery. 98 (7), 1264-1271 (1996).
  19. Nichols, C. M., et al. Choosing the correct functional assay: a comprehensive assessment of functional tests in the rat. Behavioural Brain Research. 163 (2), 143-158 (2005).
  20. Terzis, J. K., Smith, K. J. Repair of severed peripheral nerves: comparison of the "de Medinaceli" and standard microsuture methods. Experimental Neurology. 96 (3), 672-680 (1987).
  21. de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
  22. Doi, K., Hattori, Y., Tan, S. H., Dhawan, V. Basic science behind functioning free muscle transplantation. Clinics in Plastic Surgery. 29 (4), (2002).
  23. Vathana, T., et al. An Anatomic study of the spinal accessory nerve: Extended harvest permits direct nerve transfer to distal plexus targets. Clinical Anatomy. 20 (8), 899-904 (2007).
  24. Chaiyasate, K., Schaffner, A., Jackson, I. T., Mittal, V. Comparing FK-506 with basic fibroblast growth factor (b-FGF) on the repair of a peripheral nerve defect using an autogenous vein bridge model. Journal of Investigative Surgery. 22 (6), 401-405 (2009).
  25. Lee, B. K., Kim, C. J., Shin, M. S., Cho, Y. S. Diosgenin improves functional recovery from sciatic crushed nerve injury in rats. Journal of Exercise Rehabilitation. 14 (4), 566-572 (2018).
  26. Lubiatowski, P., Unsal, F. M., Nair, D., Ozer, K., Siemionow, M. The epineural sleeve technique for nerve graft reconstruction enhances nerve recovery. Microsurgery. 28 (3), 160-167 (2008).
  27. Luis, A. L., et al. Use of PLGA 90:10 scaffolds enriched with in vitro-differentiated neural cells for repairing rat sciatic nerve defects. Tissue Engineering, Part A. 14 (6), 979-993 (2008).
  28. Shabeeb, D., et al. Histopathological and Functional Evaluation of Radiation-Induced Sciatic Nerve Damage: Melatonin as Radioprotector. Medicina. 55 (8), Kaunas. (2019).
  29. Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 83 (1), 129-138 (1989).
  30. Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the Sciatic Functional Index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
  31. Lee, J. Y., et al. Functional evaluation in the rat sciatic nerve defect model: a comparison of the sciatic functional index, ankle angles, and isometric tetanic force. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (5), 1173-1180 (2013).
  32. Shin, R. H., et al. Isometric tetanic force measurement method of the tibialis anterior in the rat. Microsurgery. 28 (6), 452-457 (2008).
  33. Giusti, G., et al. Description and validation of isometric tetanic muscle force test in rabbits. Microsurgery. 32 (1), 35-42 (2012).
  34. Bulstra, L. F., et al. Functional Outcome after Reconstruction of a Long Nerve Gap in Rabbits Using Optimized Decellularized Nerve Allografts. Plastic and Reconstructive Surgery. 145 (6), 1442-1450 (2020).
  35. Giusti, G., et al. The influence of vascularization of transplanted processed allograft nerve on return of motor function in rats. Microsurgery. 36 (2), 134-143 (2016).
  36. Giusti, G., et al. The influence of nerve conduits diameter in motor nerve recovery after segmental nerve repair. Microsurgery. 34 (8), 646-652 (2014).
  37. Hundepool, C. A., et al. Comparable functional motor outcomes after repair of peripheral nerve injury with an elastase-processed allograft in a rat sciatic nerve model. Microsurgery. 38 (7), 772-779 (2018).
  38. Lee, J. Y., et al. The effect of collagen nerve conduits filled with collagen-glycosaminoglycan matrix on peripheral motor nerve regeneration in a rat model. Journal of Bone and Joint Surgery. 94 (22), 2084-2091 (2012).
  39. Shin, R. H., Friedrich, P. F., Crum, B. A., Bishop, A. T., Shin, A. Y. Treatment of a segmental nerve defect in the rat with use of bioabsorbable synthetic nerve conduits: a comparison of commercially available conduits. Journal of Bone and Joint Surgery. 91 (9), 2194-2204 (2009).
  40. Coombes, J. S., et al. Effects of vitamin E deficiency on fatigue and muscle contractile properties. Eur J Appl Physiol. 87 (3), 272-277 (2002).
  41. Kauvar, D. S., Baer, D. G., Dubick, M. A., Walters, T. J. Effect of fluid resuscitation on acute skeletal muscle ischemia-reperfusion injury after hemorrhagic shock in rats. Journal of the American College of Surgeons. 202 (6), 888-896 (2006).
  42. Murlasits, Z., et al. Resistance training increases heat shock protein levels in skeletal muscle of young and old rats. Experimental Gerontology. 41 (4), 398-406 (2006).
  43. Zhou, Z., Cornelius, C. P., Eichner, M., Bornemann, A. Reinnervation-induced alterations in rat skeletal muscle. Neurobiology of Disease. 23 (3), 595-602 (2006).
  44. Schmoll, M., et al. In-situ measurements of tensile forces in the tibialis anterior tendon of the rat in concentric, isometric, and resisted co-contractions. Physiological Reports. 5 (8), (2017).
  45. Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. 10 (4), 01580 (2020).
  46. Kingery, W. S., Vallin, J. A. The development of chronic mechanical hyperalgesia, autotomy and collateral sprouting following sciatic nerve section in rat. Pain. 38 (3), 321-332 (1989).
  47. Weber, R. A., Proctor, W. H., Warner, M. R., Verheyden, C. N. Autotomy and the sciatic functional index. Microsurgery. 14 (5), 323-327 (1993).
  48. Kunst, G., Graf, B. M., Schreiner, R., Martin, E., Fink, R. H. Differential effects of sevoflurane, isoflurane, and halothane on Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Anesthesiology. 91 (1), 179-186 (1999).
  49. Schmoll, M., et al. A novel miniature in-line load-cell to measure in-situ tensile forces in the tibialis anterior tendon of rats. PLoS One. 12 (9), 0185209 (2017).
  50. Paul, R. J. Cell Physiology Source Book (Fourth Edition). Sperelakis, N. , Academic Press. 801-821 (2012).

Tags

신경 과학 문제 172 신경 부상 신경 재생 상주 신경 기능 적 회복 운동 기능 파상 근육 힘 쥐 모델
쥐의 티비아리스 전방 근육의 최대 동면 성 파타닉 힘 측정
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedar, M., Saffari, T. M.,… More

Bedar, M., Saffari, T. M., Friedrich, P. F., Giusti, G., Bishop, A. T., Shin, A. Y. Maximum Isometric Tetanic Force Measurement of the Tibialis Anterior Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61926, doi:10.3791/61926 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter