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Neuroscience

Maximale isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei ratten

Published: June 26, 2021 doi: 10.3791/61926
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Orthopedic Surgery, Mayo Clinic, 2Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Health Sciences, Department of Plastic Surgery, Nijmegen, The Netherlands

Summary

Die Bewertung der motorischen Erholung bleibt das Benchmark-Ergebnismaß in experimentellen peripheren Nervenstudien. Die isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei der Ratte ist ein unschätzbares Werkzeug, um funktionelle Ergebnisse nach der Rekonstruktion von Ischiasnervendefekten zu beurteilen. Die Methoden und Nuancen werden in diesem Artikel ausführlich beschrieben.

Abstract

Traumatische Nervenverletzungen führen zu einem erheblichen Funktionsverlust und segmentale Nervendefekte erfordern oft die Verwendung von autologen Interpositionsnerventransplantaten. Aufgrund ihrer begrenzten Verfügbarkeit und der damit verbundenen komorischen Morbidität auf der Spenderseite konzentrieren sich viele Studien im Bereich der Nervenregeneration auf alternative Techniken, um eine segmentale Nervenlücke zu überbrücken. Um die Ergebnisse chirurgischer oder pharmakologischer experimenteller Behandlungsmöglichkeiten zu untersuchen, wird das Ischiasnervenmodell der Ratte häufig als Bioassay verwendet. Es gibt eine Vielzahl von Ergebnismessungen, die in Rattenmodellen verwendet werden, um das Ausmaß der Nervenregeneration zu bestimmen. Die maximale Ausstoßkraft des Zielmuskels bleibt das relevanteste Ergebnis für die klinische Translation experimenteller Therapien. Die isometrische Kraftmessung der tetanischen Muskelkontraktion wurde zuvor als reproduzierbare und gültige Technik zur Bewertung der motorischen Erholung nach Nervenverletzungen oder -reparaturen in Ratten- und Kaninchenmodellen beschrieben. In diesem Video geben wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zu diesem unschätzbaren Verfahren zur Beurteilung der funktionellen Erholung des Tibialis-Vordermuskels in einem Ischiasnervendefektmodell der Ratte unter Verwendung optimierter Parameter. Wir werden die notwendigen präoperativen Vorbereitungen zusätzlich zum chirurgischen Ansatz und der Dissektion des gemeinsamen Peronealnervs und der Tibialis anteriorEnmuskelsehne beschreiben. Die isometrische tetanische Kraftmesstechnik wird detailliert beschrieben. Die Bestimmung der optimalen Muskellänge und Reizpulsfrequenz wird erläutert und die Messung der maximalen tetanischen Muskelkontraktion demonstriert.

Introduction

Der Verlust der motorischen Funktion nach einer traumatischen peripheren Nervenverletzung hat einen signifikanten Einfluss auf die Lebensqualität und den sozioökonomischen Status der Patienten1,2,3. Die Prognose dieser Patientenpopulation bleibt aufgrund minimaler Verbesserungen der Operationstechniken im Laufe der Jahre schlecht4. Die direkte, spannungsfreie Epineuralreparatur bildet die chirurgische Rekonstruktion nach Goldstandard. In Fällen mit ausgedehnten Nervenlücken hat sich jedoch die Interposition eines autologen Nerventransplantats als überlegen erwiesen5,6. Die damit verbundene Morbidität an der Spenderstelle und die begrenzte Verfügbarkeit von autologen Nerventransplantaten haben die Notwendigkeit alternativer Techniken erforderlich erklärt7,8.

Experimentelle Tiermodelle wurden verwendet, um den Mechanismus der peripheren Nervenregeneration aufzuklären und die Ergebnisse einer Vielzahl von rekonstruktiven und pharmakologischen Behandlungsmöglichkeiten zu bewerten8,9. Das Ischiasnervenmodell der Ratte ist das am häufigsten verwendete Tiermodell10. Ihre geringe Größe macht sie einfach zu handhaben und zu beherbergen. Aufgrund ihres superlativen neuroregenerativen Potenzials kann die verminderte Zeit zwischen Intervention und Bewertung der Ergebnisse zu relativ niedrigeren Kosten führen11,12. Weitere Vorteile seiner Verwendung sind morphologische Ähnlichkeiten mit menschlichen Nervenfasern und die hohe Anzahl vergleichender/historischer Studien13. Letzteres sollte zwar vorsichtig angegangen werden, da eine Vielzahl unterschiedlicher Ergebnismessungen zwischen den Studien den Vergleich der Ergebnisse erschwert14,15,16,17,18.

Die Ergebnismessungen zur Beurteilung der Nervenregeneration reichen von der Elektrophysiologie bis zur Histomorphometrie, aber diese Methoden implizieren eine Korrelation, messen aber nicht unbedingt direkt die Rückkehr der motorischen Funktion14,15. Regenerierende Nervenfasern stellen möglicherweise keine geeigneten Verbindungen her, was zu einer Überschätzung der Anzahl der funktionellen Verbindungen führen kann14,15,19,20. Die beste und klinisch relevanteste Messung zum Nachweis der korrekten Reinnervation von Endorganen bleibt die Beurteilung der Muskelfunktion21,22,23. Die Erstellung von Werkzeugen zur Bewertung der motorischen Funktion für Tiermodelle ist jedoch eine Herausforderung. Medinaceli et al. beschrieben erstmals die Walking-Track-Analyse, die seitdem die am häufigsten verwendete Methode zur Bewertung der funktionellen Erholung in experimentellenperipherenNervenstudienist 21,24,25,26,27,28. Die Walking-Track-Analyse quantifiziert den Ischiasfunktionsindex (SFI) basierend auf Messungen von Pfotenabdrücken von gehenden Ratten21,29. Wesentliche Einschränkungen der Laufweganalyse, wie Zehenkontrakturen, Autoverstümmelung, Verschmieren des Drucks und schlechte Korrelation mit anderen Messungen der Reinnervation, haben die Verwendung anderer Parameter zur Quantifizierung der funktionellen Erholungerforderlich 30,31.

In früheren Studien an Lewis-Ratten32 und neuseeländischen Kaninchen33haben wir die isometrische Tetanic Force (ITF)-Messung für den Tibialis anterior (TA) Muskel validiert und ihre Wirksamkeit bei der Bewertung der Muskelregeneration nach verschiedenen Arten der Nervenreparatur34,35,36,37,38,39nachgewiesen . Der TA-Muskel ist wegen seiner relativ großen Größe, Innervation durch den peronealen Ast des Ischiasnervs und gut aufgeklärten biochemischen Eigenschaften gut geeignet40,41,42,43. Wenn die Muskellänge (Vorspannkraft) und die elektrischen Parameter optimiert werden, bietet die ITF eine Side-to-Side-Variabilität von 4,4% bzw. 7,5% bei Ratten32 bzw. Kaninchen33.

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll der ITF-Messung im Ischiasnervmodell der Ratte, einschließlich einer gründlichen Beschreibung der notwendigen präoperativen Planung, des chirurgischen Ansatzes und der Dissektion des gemeinsamen Peronealnervs und der distalen TA-Muskelsehne. Anhand vorgegebener Werte für die Reizintensität und -dauer wird die optimale Muskellänge und Reizpulsfrequenz definiert. Mit diesen vier Parametern kann die ITF anschließend konsistent und genau gemessen werden.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A334818) durchgeführt.

1. Kalibrierung des Kraftaufnehmers

  1. Stellen Sie sicher, dass der Computer ordnungsgemäß an das multifunktionale E/A-Datenerfassungsgerät USB-6009 angeschlossen ist, das wiederum an den Kraftaufnehmer angeschlossen werden sollte.
    HINWEIS: Andere Rattenstämme und -spezies benötigen möglicherweise einen anderen Wägezellen-Kraftaufnehmer, da höhere Kräfte zu erwarten sind 44.
  2. Befestigen Sie eine benutzerdefinierte Klemme aus einem modifizierten chirurgischen Hämostaten am Kraftaufnehmer, der an einem verstellbaren Hebelarm mit Vakuumbasis montiert ist.
    HINWEIS: Die sondergefertigte Klemme besteht aus einem chirurgischen Hämostat, der mit einer Anzugsschraube modifiziert wurde, die eine Einstellung der Spannung ermöglicht (Abbildung 1).
  3. Positionieren Sie die maßgefertigte Acrylglas-Testplattform, die zwei Holzblöcke zur Fixierung der Rattenrückengliedmaße enthält, auf dem Tisch.
    HINWEIS: Andere Materialien wie Urethan können auch anstelle von Holz verwendet werden, solange die K-Drähte eindringen und fixieren können.
  4. Befestigen Sie die Klemme, den Kraftaufnehmer und die verstellbare Hebelarmkombination vertikal an der Prüfplattform über die Vakuumbasis.
  5. Befestigen Sie einen Klettverschluss an der Klemme für die Kalibriergewichte.
  6. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Software (z. B. LabVIEW).
  7. Sobald die Software geöffnet ist, starten Sie das maßgeschneiderte virtuelle Instrument (VI) für die ITF-Messung (Abbildung 2).
    HINWEIS: Abbildung 2 enthält den LabVIEW-Code in einem VI-Snippet. Dieser VI-Ausschnitt kann in LabVIEW auf das Blockdiagramm gezogen werden. Es wird automatisch in einen grafischen Code umgewandelt. Für dieses Experiment wurde die Abtastrate auf 2000 Hz eingestellt, wobei 25 Samples für jede Iteration gelesen werden mussten.
  8. Führen Sie das VI aus, indem Sie den weißen Pfeil in der linken oberen Ecke drücken und Neue Kalibrierung auswählen. Es öffnet sich ein neues Fenster.
  9. Starten Sie den Kalibrierungsprozess ohne Gewicht (nur die Klemme mit einem angebrachten Klettverschluss) und drücken Sie OK.
  10. Fügen Sie nacheinander 10, 20, 30 und 50 Gramm Gewicht hinzu und drücken Sie OK zwischen jeder Gewichtsmessung.
  11. Sobald alle fünf Messungen gesammelt sind, klicken Sie auf Verarbeiten.
  12. Akzeptieren Sie die Werte nur, wenn das Diagramm auf dem VI eine positive lineare Kurve anzeigt (Abbildung 3).
  13. Positionieren Sie die Kombination aus Klemme, Kraftaufnehmer und verstellbarem Hebelarm horizontal auf der Prüfplattform. Dies wird die Position sein, die für die Messung der ITF verwendet wird.
  14. Klicken Sie auf Null und das Fenster wird automatisch geschlossen.

2. Tierische Probanden

  1. Verwenden Sie männliche Lewis-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300-500 g.
    HINWEIS: Für den Vergleich der Nervenregeneration ist es unerlässlich, sowohl in der Kontroll- als auch in der Versuchsgruppe denselben Rattenstamm zu verwenden, da Gewicht und Inzidenz der Autotomie belastungsabhängig sind und die Ergebnisse der ITF10,32,45,46,47enorm beeinflussen können .

3. Chirurgische Vorbereitung

  1. Bereiten Sie alle erforderlichen chirurgischen Instrumente vor der Operation vor (Materialtabelle).
  2. Wiegen Sie die Tiere, um die erforderliche Menge an Anästhesie zu bestimmen.
  3. Induzieren Sie die Anästhesie, indem Sie die Ratte in eine Kammer legen, die mit 3% Isofluran in Sauerstoff vergast ist.
  4. Betäuben Sie die Ratte tief mit einem Cocktail aus zehnteiligem Ketamin (100 mg / ml) und einem Teil Xylazin (100 mg / ml) in einer Dosierung von 1 ml / kg Körpergewicht über eine intraperitoneale Injektion. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie basierend auf der Reaktion auf eine Zehenquetschung und durch Beobachtung der Atemfrequenz.
  5. Etwa 30 Minuten nach der Anfangsdosis des Ketamin/Xylazin-Cocktails verabreichen Sie intraperitoneal eine zusätzliche Dosis von 0,3-0,6 ml/kg Körpergewicht von nur Ketamin (100 mg/ml), um eine angemessene Anästhesie während des gesamten Verfahrens aufrechtzuerhalten, die als niedrige Atemfrequenz und fehlendes Ansprechen auf eine Zehenklemme definiert ist.
    ACHTUNG: Es ist wichtig, die erforderliche Anästhesie akribisch zu verabreichen, da einer Überdosierung nicht entgegengewirkt werden kann.
  6. Rasieren Sie vorsichtig die Hinterbeine der Ratte mit elektrischen Klippern.
  7. Legen Sie die Ratte in Bauchlage auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur bei 37 °C zu halten. Optional kann die Körpertemperatur mit einem Rektalthermometer überwacht werden.
  8. Injizieren Sie 5 ml 0,9% Natriumchlorid (NaCl) subkutan in die lose Haut über dem Hals der Ratte, um einen ausreichenden Feuchtigkeitsstatus während des gesamten Eingriffs zu erhalten.
  9. Aufgrund der Nichtüberlebensnatur dieses Verfahrens müssen das Operationsfeld und die Instrumente nicht steril sein. Der Chirurg sollte persönliche Schutzausrüstung (PSA) verwenden und chirurgische Lupen werden empfohlen, um die anatomischen Strukturen richtig zu visualisieren.

4. Chirurgischer Ansatz für den gemeinsamen Nervus peronealis

  1. Platzieren Sie die Ratte entweder in der rechten oder linken seitlichen Liegeposition, je nachdem, welche Seite zuerst gemessen wird.
  2. Erzeugen Sie einen 2-3 cm großen Schnitt in der Haut des posterolateralen Oberschenkels parallel zum Femur, beginnend am größeren Trochanter mit einer chirurgischen Klinge Nr. 15.
  3. Identifizieren Sie die Ebene zwischen dem Musculus biceps femoris und den Muskeln Gluteus maximus und vastus lateralis und führen Sie eine stumpfe Dissektion mit einer Tenotomieschere durch, um diese Muskeln zu trennen und den darunter liegenden Ischiasnerv freizulegen.
  4. Lokalisieren Sie die Trifurkation des Ischiasnervs und platzieren Sie einen Retraktor, um einen besseren Zugang zu erhalten. Zu den drei Zweigen des Ischiasnervs gehören der gemeinsame Nervus peronealis, der Nervus tibialis und der Nervus suralis.
  5. Isolieren Sie den gemeinsamen peronealen Nervenast (normalerweise den ventralsten Ast) des Ischiasnervs mit einer gekrümmten mikrochirurgischen Zette.
    HINWEIS: Bei Unsicherheit den isolierten Nerv sanft mit einem chirurgischen Nervenstimulator stimulieren und die motorische Reaktion beobachten. Die Stimulation des gemeinsamen Peronealnervs führt zu einer Dorsiflexion der Pfote.

5. Dissektion der distalen Tibialis vorderen Muskelsehne

  1. Um den TA-Muskel und seine Einführung freizulegen, schneiden Sie die Haut am anterolateralen Aspekt des Unterschenkels, beginnend am Kniegelenk und absteigend zur mittelmäßigen Seite der Hinterpfote.
  2. Sezieren Sie die distale TA-Muskelsehne mit einem Skalpell mit einer chirurgischen Klinge Nr. 15 vom umgebenden Gewebe.
  3. Sezieren Sie mit einer Mückenzette unverblümt die TA-Muskelsehne in Richtung Desinführung und schneiden Sie die Sehne so distal wie möglich ab. Lassen Sie den proximalen TA-Muskel ungestört und erhalten Sie den neurovaskulären Pedikel.
    HINWEIS: Befeuchten Sie den TA-Muskel regelmäßig (ca. alle 5 Minuten) mit erhitztem 0,9% NaCl (37 °C), um Abkühlung und Austrocknung zu verhindern.

6. Isometrische tetanische Kraftmessung

  1. Verbinden Sie die bipolaren Elektrodenkabel und das Erdungskabel entsprechend ihrer Farbe mit einem bipolaren Stimulatorgerät.
  2. Befestigen Sie das andere Ende der bipolaren Elektrodenkabel an einer Subminiaturelektrode.
    HINWEIS: Die Referenzelektrode (rot, Anode) sollte distal und die aktive Elektrode (schwarz, Kathode) proximal platziert werden.
  3. Übertragen Sie das Tier zusammen mit dem Heizkissen auf die Testplattform.
  4. Fixieren Sie die Hintergliedmaße der Ratte mit zwei 1 mm Kirschnerdrähten durch den Knöchel und die seitliche Kondyle des distalen Femurs am Holzblock, um den hinteren Aspekt des Knies zu vermeiden.
    VORSICHT: Vermeiden Sie Gefäßschäden an der Arteria poplitea und der Vene, die sich dorsal zum Femurkondylen befinden.
  5. Befestigen Sie einen Halter mit einer benutzerdefinierten Klemme an der Prüfplattform mit seiner Vakuumbasis.
  6. Befestige die distale TA-Muskelsehne an der Klemme, die am Kraftaufnehmer befestigt ist.
    HINWEIS: Die Klemme und der Kraftaufnehmer sollten parallel zum Verlauf des TA-Muskels positioniert werden.
  7. Platzieren Sie den Retraktor am posterolateralen Oberschenkel der Ratte, um auf den gemeinsamen Peronealnerv zuzugreifen.
    HINWEIS: Der Ischiasnerv und seine Äste sollten mit erhitzten 0,9% NaCl (37 °C) feucht gehalten werden, um Abkühlung und Austrocknung zu verhindern.
  8. Führen Sie das Erdungskabel in die umgebenden Muskeln (z. B. den Muskel Vastus lateralis) ein.
    HINWEIS: Der Grass SD9 Stimulator benötigt ein Erdungskabel, um elektrische Artefakte zu reduzieren. Neuere Stimulatoren benötigen möglicherweise kein zusätzliches Erdungskabel.
  9. Haken Sie den gemeinsamen Peronealnerv an die Subminiaturelektrode und fixieren Sie seine Position mit dem Halter auf der Plattform (Abbildung 4).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass nur der gemeinsame Peronealnerv an die Subminiaturelektrode angeschlossen ist.
  10. Optimierung der Muskellänge
    1. Schalten Sie das bipolare Stimulatorgerät ein und stellen Sie die Einstellungen wie folgt ein: quadratischer monophasischer Puls, Verzögerung 2 ms, Stimuluspulsdauer 0,4 ms, Stimulusintensität 2 V.
      HINWEIS: Die Verzögerung bestimmt die Zeit zwischen dem Sync-Out-Impuls und der Abgabe der Vorderkante des Pulses.
    2. Wählen Sie Parametertest aus, und aktivieren Sie die Triggerauflistung im VI.
    3. Erhöhen Sie die Muskellänge (Vorspannung), indem Sie den am Kraftaufnehmer befestigten Hebelarm einstellen.
    4. Beginnen Sie bei 10 g Vorspannung und verwenden Sie Inkremente von 10 g, bis die maximale aktive Muskelkraft bestimmt ist.
    5. Tragen Sie für jede Vorspannung zwei einzelne Zuckungen direkt hintereinander über die Taste am bipolaren Stimulatorgerät auf. Die Ausgabe wird auf dem Bildschirm sichtbar sein und die Ratte sollte dorsiflexion der Pfote zeigen.
      HINWEIS: Bevor Sie den Nerv stimulieren, entfernen Sie immer überschüssige 0,9% NaCl, die den Nerv umgeben, mit Applikatoren mit Baumwollspitze, um sicherzustellen, dass das Signal nicht an das umgebende Gewebe geleitet wird.
    6. Um die Messung zu stoppen, klicken Sie im VI erneut auf Trigger-Sammlung.
    7. Wenn das Programm die beiden Spitzenausgangskräfte automatisch erkennt, klicken Sie auf Akzeptieren. Falls das Programm diese Ausgangskräfte nicht automatisch auswählt, drücken Sie Ablehnen und wählen Sie die Spitzen manuell aus. Die beiden Spitzenausgangskräfte werden auf eine mittlere Spitzenausgangskraft gemittelt(Abbildung 5).
    8. Berechnen Sie die aktive Muskelkraft, indem Sie die Vorspannung von der mittleren Spitzenausgangskraft subtrahieren.
    9. Notieren Sie die aktive Kraft für jede Vorspannung, um den Trend zu visualisieren und die maximale aktive Kraft zu erkennen (Abbildung 6). Eine Tabelle kann auch verwendet werden.
  11. Messung der isometrischen Tetanikumskraft
    1. Nachdem Sie die ideale Muskellänge bestimmt haben, lassen Sie den Muskel 5 Minuten lang bei Null Vorspannung ruhen, bevor Sie mit den Tetanmuskelkontraktionen beginnen.
    2. Wechseln Sie in der Zwischenzeit vom Parametertest zum Frequenztest am VI und stellen Sie die Reizintensität auf 10 V am bipolaren Stimulatorgerät ein.
    3. Halten Sie die Verzögerung und die Stimuluspulsdauer bei 2 ms bzw. 0,4 ms.
    4. Messen Sie die isometrische tetanische Muskelkraft mit steigenden Reizfrequenzen ab 30 Hz in Schritten von 30 Hz, bis das maximale Kraftplateau eingehalten wird.
    5. Klicken Sie auf Trigger collection und stellen Sie die vorgegebene optimale Muskellänge ein.
    6. Drücken Sie die Repeat-Taste am bipolaren Stimulatorgerät, um eine tetanische Stimulation für maximal 5 Sekunden zu induzieren oder bis ein Kraftgipfel deutlich beobachtet wird.
      HINWEIS: Bevor Sie den Nerv stimulieren, entfernen Sie immer überschüssige 0,9% NaCl, die den Nerv umgeben, mit Applikatoren mit Baumwollspitze, um sicherzustellen, dass das Signal nicht an das umgebende Gewebe geleitet wird.
    7. Um die Daten zu sammeln, drücken Sie erneut Trigger-Sammlung und dokumentieren Sie die maximale Ausgabekraft. Falls das Programm die maximale Spitzenausgangskraft nicht automatisch erkennt, drücken Sie Ablehnen und wählen Sie die Spitze manuell aus.
    8. Lassen Sie den Muskel 5 Minuten lang bei null Vorbelastung ruhen, bevor Sie mit den nächsten tetanischen Muskelkontraktionen beginnen.
      HINWEIS: Befeuchten Sie den TA-Muskel regelmäßig (ca. alle 5 Minuten) mit erhitzten 0,9% NaCl (37 °C), um Abkühlung und Austrocknung zu verhindern.
    9. Erhöhen Sie die Reizfrequenz weiter, bis das maximale Kraftplateau erreicht ist. Das Kraftplateau wird als die maximale isometrische tetanische Kraft definiert.
      HINWEIS: Entfernen Sie nach diesem Schritt die K-Drähte, heften oder nähen Sie die Haut und wiederholen Sie den gesamten Vorgang bis zur kontralateralen Hintergliedmaße, beginnend mit Schritt 4.

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Representative Results

Fünf Parameter werden verwendet, um die ITF-Messung zu messen. Dazu gehören Muskelspannung (Vorspannkraft), Reizintensität (Spannung), Reizimpulsfrequenz, Reizdauer von 0,4 ms und eine Verzögerung von 2 ms. Vor der Messung der ITF muss die optimale Muskelspannung durch zwei einzelne zuckende Muskelkontraktionen mit einer Intensität von 2 V während des Parametertests ermittelt werden. Diese Reize verursachen eine Dorsiflexion der Pfote und erzeugen ein Ausgangssignal auf der Grafik im VI (Abbildung 5). Diese einzelnen Zuckungskurven haben idealerweise einen schnellen vertikalen Aufschwung, der die Kontraktionsperiode direkt darstellt, gefolgt von einer langsameren vertikalen Abnahmeperiode, die die Entspannungsperiode demonstriert. Das Programm mittelt diese beiden Spitzenausgangskräfte, aber die aktive Kraft muss manuell berechnet werden, indem die Vorspannkraft von der mittleren Ausgangskraft subtrahiert wird. Im Beispiel in Abbildung 5ergibt eine Vorspannung von 10 g zwei Spitzenausgangskräfte von 411,09 g (4,03 N) und 379,78 g (3,73 N), was auf eine mittlere Spitzenausgangskraft von 395,43 g (3,88 N) gemittelt wird. Wenn die aktiven Kräfte jeder Vorspannung in einem Diagramm dargestellt werden, kann die maximale aktive Kraft identifiziert werden. Diese aktiven Kräfte erzeugen normalerweise eine glockenförmige Kurve und die maximale aktive Kraft für Lewis-Ratten mit einem Gewicht von 300-500 g sollte etwa 30-40 g (0,29-0,39 N) betragen (Abbildung 6).

Für die tetanischen Stimulationen während des Frequenztests wird die Reizintensität auf eine supramaximale Spannung (10 V) erhöht, um eine maximale Aktivierung aller TA-Muskelmotoreinheiten mit steigenden Frequenzen zu gewährleisten. Die optimale tetanische Kurve nimmt stark zu und nimmt stark ab und hat eine langsam abnehmende Plateauphase mit minimalen Schwingungen. Abbildung 7 zeigt ein Beispiel einer tetanischen Kurve bei einer Reizfrequenz von 30 Hz mit einer isometrischen tetanischen Kraft von 803,25 g (7,88 N). Das Plateau mit der höchsten Kraft ist definiert als das maximale ITF-Plateau.

Figure 1
Abbildung 1: Bild der kundenspezifischen Klemme, die aus einem chirurgischen Hämostaten besteht und mit einer Anzugsschraube modifiziert wurde, die eine Einstellung der Spannung ermöglicht.

Figure 2
Abbildung 2: Grafischer Code für virtuelles Instrument zur isometrischen tetanischen Kraftmessung in LabVIEW. Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Kalibrierung des Kraftaufnehmers. Eine erfolgreiche Kalibrierung des Kraftaufnehmers mit fünf Gewichten (0, 10, 20, 30 und 50 g) sollte zu einer positiven linearen Kurve führen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Schematische Übersicht des Versuchsaufbaus zur isometrischen tetanischen Kraftmessung. (Urheberrechtlich geschützt und mit Genehmigung der Mayo Foundation for Medical Education and Research verwendet; alle Rechte vorbehalten. Nachdruck aus: Shin, R. H. et al. Isometrische tetanische Kraftmessmethode des Tibialis anterior in der Ratte. Mikrochirurgie. 28 (6), 452-457 (2008)). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Einzelzuckenkurven zur Optimierung der Muskellänge. Für jede Vorspannungsmessung werden zwei einzelne Zuckungen angewendet. Diese einzelnen Zuckungskurven haben einen schnellen vertikalen Aufschwung (Kontraktionsperiode), gefolgt von einer vertikalen Abnahme (Entspannungsperiode). Die beiden Spitzenausgangskräfte werden auf eine mittlere Spitzenausgangskraft gemittelt. In diesem Beispiel mit einer Lewis-Ratte ergibt eine Vorspannung von 10 g zwei Spitzenausgangskräfte von 411,09 g (4,03 N) und 379,78 g (3,73 N), was auf eine mittlere Spitzenausgangskraft von 395,43 g (3,88 N) gemittelt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Optimale Muskellänge (Vorspannung). Die aktive Muskelkraft kann berechnet werden, indem die Vorspannung von der mittleren Spitzenausgangskraft subtrahiert wird. Die aktive Muskelkraft für jede Vorbelastung sollte dokumentiert werden, bis ein Abfall der aktiven Muskelkraft sichtbar ist. Die Vorspannung, die die höchste aktive Muskelkraft ergibt, wird verwendet, um die isometrische tetanische Kraft zu messen. Die optimale Vorspannung für Lewis-Ratten mit einem Gewicht von 300-500 g sollte bei etwa 30-40 g (0,29-0,39 N) (N=10) liegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Repräsentative isometrische tetanische Kraftkurve. Die optimale tetanische Kurve nimmt stark zu und hat dann eine langsam abnehmende Plateauphase, gefolgt von einer starken Abnahme. Das Plateau mit der höchsten Kraft ist definiert als das maximale ITF-Plateau. Dieses Beispiel zeigt die Tetanic-Kurve bei einer Reizfrequenz von 30 Hz mit einer isometrischen tetanischen Kraft von 803,25 g (7,88 N). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine zuvor validierte Methode zur Erfassung genauer maximaler ITF-Messungen des TA-Muskels im Rattenmodell32. Die Wiederherstellung der Maximalen Kraft nach experimentellen Nervenrekonstruktionsbehandlungen ist im klinischen Umfeld von primärem Interesse, da sie beweist, dass sich der Nerv nicht nur regenerierte, sondern auch Arbeitsverbindungen mit dem Zielmuskel einstellte. Die ITF kann in einem kleinen Nervenlückenmodell wie dem Ischiasnervmodell32der Ratte und mit einigen Modifikationen des Protokolls auch in einem größeren Nervenlückenkaninchenmodell33verwendet werden.

Es gibt mehrere kritische Schritte, die in Betracht gezogen werden sollten, um konsistente und zuverlässige maximale isometrische Muskelkraftmessungen zu gewährleisten. Die Bedeutung der sorgfältigen Auswahl der Art der Anästhesie, um Nebenwirkungen der Skelettmuskulatur zu verhindern, wurde zuvor beschrieben32,33. Die Verwendung von Isofluran hat eine zeitabhängige Abnahme der Muskelkraft gezeigt, die durch seine Fähigkeit erklärt werden kann, sarkoplasmatische Retikulum stimulierte Freisetzung von Kalzium33,48zu induzieren . Die Wirkung von Ketamin/Xylazin auf die Muskelkraft hat sich aufgrund unserer Erfahrung und früherer Studien als minimal erwiesen32. Auch die sichere Befestigung der distalen TA-Muskelsehne am Kraftaufnehmer ist für genaue Messungen von großer Bedeutung. Ein Verrutschen oder Reißen der Sehne sollte verhindert oder direkt korrigiert werden. Daher wurde aus einem chirurgischen Hämostat eine maßgefertigte Klemme erstellt und mit einer Anzugsschraube modifiziert. Andere Forschungsgruppen haben eine Technik beschrieben, bei der die Sehne für etwa 30 Minuten getrocknet wird, um die Grenzfläche zwischen der Sehne und einer Klemme mechanisch zu stärken49. Um die Ausdauer des Muskels zu erhalten, ist es wichtig, eine Austrocknung des TA-Muskels und der Sehne mit warmen 0,9% NaCl zu vermeiden und zwischen jeder tetanischen Stimulation eine 5-minütige Ruhephase zu implementieren. Die Ruhezeit basiert auf der Aktivität des Phosphagensystems, auch bekannt als unmittelbare Energiequelle, die für explosive Muskelkontraktionen wichtig ist. Es besteht aus Adenosintriphosphat (ATP) und Kreatinphosphataktivität und liefert Energie für weniger als 10 Sekunden maximaler Aktivität. Es dauert ungefähr 3-5 Minuten, um 100% der Phosphagens50aufzufüllen.

Wir erkennen die Grenzen der in diesem Video beschriebenen Methode an. Die Nichtüberlebensnatur des Verfahrens erlaubt keine seriellen Messungen im Laufe der Zeit. Darüber hinaus ist es ein detailliertes und zeitaufwändiges Testprotokoll. Während der 1- bis 2-stündigen Testzeit durchlaufen Nerv und Muskel eine signifikante Anzahl von Stimulationen, die zu Muskelermüdung mit potenzieller Abnahme der ITF führen können. Dies hat sich jedoch im Rattenmodell im Vergleich zum Kaninchen33als weniger ausgeprägt erwiesen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in diesem Video beschriebene ITF-Messung ein unschätzbares Werkzeug in experimentellen peripheren Nervenstudien zur Quantifizierung der motorischen Erholung ist. Bei Verwendung anderer Ergebnismessungen wie Elektrophysiologie und Histomorphometrie kann eine globale Bewertung der Nervenfunktion erfolgen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke der National Institutes of Health unter der Vergabenummer RO1 NS 102360 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA G130203
1 mm Kirshner wires Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ N/A
Adson Tissue Forceps ASSI, Westbury, NY, USA MTK-6801226
Bipolar electrode cables Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Bipolar stimulator device Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Cotton-tip Applicators Cardinal Health, Waukegan, IL, USA C15055-006
Curved Mosquito forceps ASSI, Westbury, NY, USA MTK-1201112
Force Transducer MDB-2.5 Transducer Techniques, Temecula, CA N/A
Gauze Sponges 4x4 Covidien, Mansfield, MA, USA 2733
Ground cable Grass Instrument, Quincy, MA N/A
Isoflurane chamber N/A N/A Custom-made
Ketamine Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ 42023-115-10
LabView Software National Instruments, Austin, TX
Loop N/A N/A Custom-made
Microsurgical curved forceps ASSI, Westbury, NY, USA JFA-5B
Microsurgical scissors ASSI, Westbury, NY, USA SAS-15R-8-18
Microsurgical straight forceps ASSI, Westbury, NY, USA JF-3
Retractor ASSI, Westbury, NY, USA AG-124426
Scalpel Blade No. 15 Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA 371115
Slim Body Skin Stapler Covidien, Mansfield, MA, USA 8886803512
Subminiature electrode Harvard Apparatus, Holliston, MA N/A
Surgical Nerve Stimulator Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA 9094
Terrell Isoflurane Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA H961J19A
Testing platform N/A N/A Custom-made
Tetontomy Scissors ASSI, Westbury, NY, USA ASIM-187
Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S407992
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device National Instruments, Austin, TX 779026-01
Vacuum Base Holder Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal N/A Attached clamp is custom-made
Weight (10 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820010.4
Weight (20 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820020.4
Weight (50 g) Denver Instruments, Denver, CO, USA 820050.4
Xylazine Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada 1XYL002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Maximale isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei ratten
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Bedar, M., Saffari, T. M.,… More

Bedar, M., Saffari, T. M., Friedrich, P. F., Giusti, G., Bishop, A. T., Shin, A. Y. Maximum Isometric Tetanic Force Measurement of the Tibialis Anterior Muscle in the Rat. J. Vis. Exp. (172), e61926, doi:10.3791/61926 (2021).

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