Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Поведенческая задача «Выбор трех камер» с использованием рыбок данио в качестве модельной системы

Published: April 14, 2021 doi: 10.3791/61934
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 2,4, 1,2
1Department of Biology, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University, 3Department of Chemistry, American University, 4Department of Neuroscience, American University

Summary

Мы представляем поведенческую камеру, предназначенную для оценки когнитивных функций. Мы предоставляем данные, показывающие, что однажды приобретенные, рыбки данио запоминают задачу через 8 недель. Мы также показываем, что гипергликемические рыбки данио изменили когнитивные функции, что указывает на то, что эта парадигма применима к исследованиям, оценивающим познание и память.

Abstract

Нейродегенеративные заболевания зависят от возраста, изнурительны и неизлечимы. Недавние отчеты также коррелируют гипергликемию с изменениями в памяти и / или когнитивными нарушениями. Мы модифицировали и разработали трехкамерную когнитивную задачу выбора, аналогичную той, которая используется с грызунами для использования с гипергликемическими рыбками данио. Испытательная камера состоит из центрально расположенной пусковой камеры и двух отсеков выбора с обеих сторон, с косяком конспецифичностью, используемой в качестве награды. Мы предоставляем данные, показывающие, что однажды приобретенные рыбки данио запоминают задание по крайней мере через 8 недель. Наши данные показывают, что рыбки данио надежно реагируют на это вознаграждение, и мы выявили когнитивный дефицит у гипергликемических рыб после 4 недель лечения. Этот поведенческий анализ может быть также применим к другим исследованиям, связанным с познанием и памятью.

Introduction

Нейродегенеративные заболевания зависят от возраста, изнурительны и неизлечимы. Распространенность этих заболеваний растет, что приводит к настоятельной необходимости в совершенствовании и разработке новых терапевтических стратегий. Начало и представление каждого заболевания уникально, так как некоторые влияют на языковые, двигательные и вегетативные области мозга, в то время как другие вызывают дефицит обучения и потерю памяти1. В частности, когнитивный дефицит и / или нарушения являются наиболее распространенными осложнениями при всех нейродегенеративных заболеваниях2. В надежде пролить свет на основные механизмы, связанные с этими нейродегенеративными заболеваниями, было использовано множество различных модельных систем (включая одноклеточные организмы от дрозофилы до позвоночных более высокого порядка, таких как грызуны и люди); однако большинство нейродегенеративных заболеваний остаются неизлечимыми.

Обучение и память являются высокосохраняемными процессами среди организмов, поскольку постоянные изменения окружающей среды требуют адаптации3. Нарушение как познания, так и синаптической пластичности было продемонстрировано в нескольких моделях грызунов. В частности, хорошо заведомо заведомые поведенческие анализы используют ассоциативное обучение для оценки когнитивных изменений после различных заболеваний и расстройств, вызванныхнарушениями4. Кроме того, изменение контрастной дискриминации оценивает когнитивный дефицит, поскольку оно включает в себя функции обучения и памяти более высокого порядка, а изменение зависит от ингибирования ранее изученной ассоциации. Широко используемое трехкамерное задание на выбор разъясняет возможные дефициты путей обучения и памяти центральной нервной системы5,6. В последнее время эта область расширилась, включив в себя модели, не являющиеся млекопитающими, такие как рыбкиданио (Danio rerio),поскольку было разработано несколько парадигм для диапазона возрастов от личинок до взрослыхособей 7,8лет.

Рыбки данио обеспечивают баланс сложности и простоты, что выгодно для оценки когнитивных нарушений с помощью поведенческих методов. Во-первых, рыбки данио поддаются высокопроизводительной поведенческой проверке, учитывая их небольшой размер и плодовитую репродуктивную природу. Во-вторых, рыбки данио обладают структурой, боковым паллием, который аналогичен гиппокампу млекопитающих, поскольку он имеет аналогичные нейронные маркеры и типы клеток7. Рыбки данио также способны приобретать и запоминать пространственную информацию9 и, как и люди, являются суточными10. Поэтому неудивительно, что рыбки данио все чаще используются в качестве модели нейродегенеративных заболеваний. Однако отсутствие соответствующих поведенческих анализов затруднило применение модели рыбок данио для когнитивных оценок. Опубликованная работа с использованием поведенческих анализов, специфичных для рыбок данио, включает ассоциативные учебные задания11,тревожное поведение 12, память13, распознавание объектов14и обусловленное предпочтение места15,16,17,18,19. Хотя было много разработок в отношении поведенческих анализов рыбок данио, аналоги для некоторых тестов когнитивных функций у грызунов еще не разработаны для использования с рыбками данио18.

Основываясь на предыдущих исследованиях из нашей лаборатории, мы смоделировали / разработали когнитивную задачу у рыбок данио, основанную на трехкамерной задаче выбора, используемой с грызунами, использующими социальное взаимодействие в качестве вознаграждения. Кроме того, мы расширили аспект ассоциативного обучения поведенческой задачи и включили изменение контрастной дискриминации в надежде на дальнейшее развитие этой поведенческой задачи для оценки когнитивных нарушений. Это позволило нам изучить как первоначальное приобретение дискриминационного обучения, так и последующее торможение этого обучения на обратном этапе. В текущем исследовании мы демонстрируем, что эта процедура обеспечила надежный метод оценки когнитивного функционирования у рыбок данио после погружения в глюкозу в течение 4 или 8 недель.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Американском университете (протокол No 1606, 19-02).

1. Животные

  1. Выращивание и содержание животных
    1. Приобретите взрослых рыбок данио дикого типа(Danio rerio)в возрасте 4-11 месяцев в качестве эмбрионов и выращивайте их самостоятельно.
    2. Поддерживайте рыбу в водной системе стоек при 28–29 °C при 14-ч при 14-ч светлом: 10-ч темном фотопериоде.
    3. Кормите рыбу два раза в день коммерческими хлопьями и добавяйте живую артемию.
    4. Выбирайте рыбу случайным образом из этих резервуаров для поведенческих экспериментов.
  2. По завершении эксперимента обезболивают животных погружением в 0,02% трикаина в течение 2 мин или до тех пор, пока не появится недостаток двигательной координации и снижение частоты дыхания для последующего молекулярного и/или нейрохимического анализа.

2. Трехкамерная выборная испытательная камера

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта поведенческая техника была модифицирована из Ruhl et al.20.

  1. Конструкция камеры
    1. Модифицируйте поведенческую камеру26— аквариум объемом 40 л (50 х 30 х 30см3)— чтобы иметь центральную или пусковую камеру (10 х 30 х 30 см3),отделенную от двух камер бокового выбора (каждая 20 х 30 х 30см3, рисунок 1А).
    2. Сконструируйте три отсека, используя алюминиевый «U-образный» канал, прикрепленный к внутренним стеклянным стенам с помощью герметика аквариума, чтобы разделить резервуар на три камеры.
    3. Сконструйте непрозрачные перегородки высотой 10 см из серого листа ПВХ, которые вписываются в алюминиевые каналы с обеих сторон. Сделайте каждый разделитель из 2 частей, каждая из которых равна по размеру: неподвижная нижняя часть, постоянно установленная внутри резервуара, и подвижная верхняя часть, которая движется вверх и вниз по алюминиевым дорожкам.
    4. Приклейте очень большие зажимы для связующего к верхней части серых листов ПВХ, чтобы они выступали в качестве ручек.
    5. Используя постоянный маркер, прорисуйте небольшие горизонтальные линии на 10 см выше приклееной серой трубы ПВХ на внешней стороне резервуара.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта отметка является точкой, к которой верхний серый лист ПВХ будет открыт, чтобы обеспечить доступ с любой стороны.
    6. Добавьте контрольную (системную) воду в резервуар до уровня 25 см от дна до верха резервуара, или ~ 30 л. Поместите стеклянные аквариумные нагреватели в каждую секцию камеры за 24 ч до начала испытаний, чтобы довести температуру до 28,5 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите нагреватели в начале сеанса поведения и выполните полный обмен воды после двух дней использования.
  2. Установка дискриминации
    1. Для каждой задачи дискриминации индивидуально размещайте цветные войлочные изделия (бежевый, черный или белый) на внешней задней, боковой и нижней сторонах камер выбора, используя Velcro(рисунок 1B–D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центральная камера не должна иметь цвета фона, связанного с ней.
  3. В качестве награды создайте группу конспецифичных (мелководье), поместив 4 взрослых рыбок данио, которые иначе не будут использоваться в исследовании, в небольшой, прозрачный резервуар в дальнем заднем углу каждой камеры выбора(рисунок 1B-D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте мелководную рыбу случайным образом из резервуаров для скота каждый день, по крайней мере, с одним самцом и одной самкой того же возраста и размера, что и экспериментальная рыба в каждом мелководье.

3. Поведенческие задачи

  1. Акклиматизация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Акклиматация в поведенческую камеру состоит из трех дней обучения; два дня групповой акклиматизации с последующим днем индивидуального обучения.
  2. Групповая акклиматация
    1. Прикрепите бежевый (нейтральный) войлочный фон к внешней стороне обоих отсеков выбора и погрузь живой отсек в каждый из выбранных отсеков(рисунок 1B).
    2. Добавьте пять-шесть рыбок данио в центральную стартовую камеру с открытыми раздвижными дверями и дайте рыбе свободно бродить в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная рыбка данио должна иметь возможность взаимодействовать и общаться с этими мелководными рыбами через аквариум в качестве награды после пересечения в любом отсеке выбора во время акклиматизации. Считается, что рыба вошла в одну из боковых камер, когда все ее тело входит в камеру.
    3. Повторите эту процедуру с той же подопытной рыбой в течение второго дня (2 дня групповой акклиматизации).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите одни и те же группы рыб.
  3. Индивидуальная акклиматация
    1. Настройка камеры: Прикрепите бежевый (нейтральный) войлочный фон к внешней стороне обоих отсеков выбора и погрузь живой отсек в оба отсека выбора, как в групповой акклиматизации(рисунок 1B, E).
      1. Поместите отдельную рыбку данио в центральную стартовую камеру на 2 мин с закрытыми раздвижными дверями, а после 2-минутного периода откройте обе двери одновременно.
      2. Убедитесь, что каждая рыба плавает из центральной камеры через дверь в общей сложности 10 раз, независимо от того, с какой стороны. Вознаграждайте рыбу каждый раз, когда она входит в одну из боковых камер (1 день индивидуальной акклиматизации).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если рыба не может выполнить эту задачу 10 раз в течение 30-минутного периода или вообще отказывается покидать стартовую камеру, исключите ее из исследования.
    2. Сбор данных: запишите количество раз, когда рыба плавает в обе стороны, и общее время, необходимое для выполнения задачи.
  4. Приобретение
    ПРИМЕЧАНИЕ: После акклиматизации рыбки данио приступили к 3-дневному приобретению.
    1. Установка камеры: Прикрепите белый войлок к внешней стороне одного отсека выбора и черный войлок к внешней стороне другого отсека выбора(рисунок 1C, F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чередуйте цвет фона каждой стороны ежедневно, используя псевдослучайный график37.
      1. На время этого этапа обучения размещайте мелкое вознаграждение, размещенное только в одном из выбранных отсеков; это становится вознаграждаемой стороной.
      2. Чтобы начать приобретение, поместите одну подопытную рыбу в стартовую камеру на 2-минутный период с закрытыми отсеками выбора.
      3. После 2-минутной акклиматизации одновременно откройте обе двери, предоставив доступ к обоим отсекам выбора, и запустите секундомер для оценки задержки выбора.
      4. Используя предвзятый дизайн, случайным образом назначьте рыбе либо черное, либо белое предпочтение (т. Е. Либо W +/ B-, либо B+/W-), что означает, что отмель помещается либо в черный (B+), либо в белый (W+) отсек выбора.
    2. Обозначение ответа на выбор
      1. Как только рыба сделает выбор, войдя в один из боковых отсеков, остановите таймер.
      2. Если рыба правильно выбрала предпочтительную сторону, немедленно закройте дверь между центральной камерой и этой стороной, чтобы ограничить рыбу предпочтительной стороной в течение 1 мин, и позвольте ей быть вознагражденной взаимодействием с мелководьем(рисунок 1C, F). Оцените это испытание как «C» за «Правильно» (вознаграждается).
      3. Если рыба проплывает через неправильную дверь, перенесите ее обратно в центральную камеру, закройте обе двери и отличьте испытание как «I» за «неправильное» (не вознагражденное).
      4. Если рыба не принимает решения в течение 2 минут после открытия дверей, переместите рыбу в правильную сторону в течение 1 минуты и засчилите испытание как «М» за «отмеченный» (с награждаемым силой).
      5. При перемещении / перемещении рыбы обратно в стартовую камеру осторожно направляйте рыбу в центральную камеру, используя рыбную сеть в качестве пастушьего инструмента.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не вычерпывать рыбу из воды и не заменяйте ее в стартовой камере, так как это может повлиять на поведенческий анализ.
      6. Как только рыба вернется в центральную камеру, подождите 1 минуту, прежде чем снова выполнить задание. Убедитесь, что каждая рыба выполняет задание 8 раз.
    3. Сбор данных
      1. Для каждой экспериментальной рыбы запишите время до первого решения (или задержку выбора) и индивидуальные оценки (C, I или M) для каждого из 8 испытаний приобретения (раздел 3.4.2) в порядке.
      2. Отчет о результатах этих экспериментов был представлен в виде средних групп для каждого испытания в каждый день приобретения.
      3. После того, как рыба завершила испытание, классифицируйте ее как «высокоэффективную» рыбу или «низкопроизводительную» рыбу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба считалась «высокопроизводительной», если ей удалось выбрать правильную сторону аквариума по крайней мере в 6 из 8 общих испытаний за день. Любая рыба, которая не соответствует этому критерию, является «низкоукачествемной».
      4. После идентификации, разместите высокопроизводительных и низкопроизводительных рыб отдельно.
      5. Классифицируйте рыбу как «высоких» или «низких» исполнителей в каждый из трех дней приобретения, после того, как рыба завершила испытания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В конце третьего дня приобретения рыба остается либо «высокой», либо «низкой» в течение всего периода исследования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые рыбы, которые изначально были в группе «низкой производительность», изучают задачу в день приобретения 2 или 3. Когда это происходит, первоначальная «низкопроизводительная» рыба может быть перемещена в группу «высокопроизводительных». Не перемещайте рыбу между группами таким образом после 3 дня (окончания приобретения).

4. Экспериментальное лечение

  1. После периода приобретения, когда рыбки продемонстрируют способность решать простую задачу различения черного и белого фона, начинайте схему лечения подопытной рыбки данио.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы показать применимость этого метода, это исследование показывает два экспериментальных проекта:
    1. Продольное исследование
      1. Верните подопытных рыб в их резервуары на 8 недель. Поддерживайте рыб в стандартных аквариумах с ежедневной подпиткой воды, и кормите их два раза в день.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не проводите никаких поведенческих тренировок в течение этих 8 недель в резервуарах для хранения.
      2. Выполните обратную оценку после этого периода, чтобы оценить, может ли рыбка данио решить задачу разворота после 8 недель без обучения.
    2. Гипергликемия: подвергайте экспериментальные группы воздействию воды (контроль стресса), маннитола (1%-3%, осмотический контроль) или глюкозы (1%-3%) в течение 4 или 8 недель22,23.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не проводите никаких поведенческих тренировок в течение этих 4 или 8 недель.

5. Разворот

ПРИМЕЧАНИЕ: После экспериментальных манипуляций (как в разделе 4.2) рыбы тестируются в заключительной части парадигмы 3-камерного выбора — развороте. Для этого вознаграждаемая сторона переворачивается (по сравнению с приобретением) таким образом, что рыба, ранее вознагражденная косяном на белой стороне, теперь вознаграждается косякой на черной стороне и наоборот. Таким образом, разворот оценивает, узнала ли рыба, где находится награда (мелководье), независимо от цвета фона.

  1. Установка камеры
    1. Прикрепите черный войлок к внешней стороне одной из выбранных камер и белый войлок к внешней стороне другой, убедившись, что черно-белые стороны являются теми же сторонами, что и в испытаниях по приобретению (раздел 3.4).
    2. Погрузьте отмельной бак в дальний задний угол стороны, который является противоположностью ранее вознагражденной камеры выбора(рисунок 1D, G).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другими словами, рыба, ранее награжденная на белой стороне, теперь вознаграждается на черной стороне и наоборот.
    3. Испытать рыбу по отдельности, как по описанию в разделе 3.5. Начните с помещения одной экспериментальной рыбы в стартовую камеру на 2-минутный период и закройте доступ к выбранным отсекам.
    4. Одновременно открывают обе стороны камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Завершайте в общей сложности 8 испытаний каждый день в течение трех последовательных дней лечения.
  2. Обозначение ответа на выбор
    1. Если рыба правильно выбрала предпочтительный цвет, немедленно закройте дверь в центральную камеру на 1 мин, позволив рыбе взаимодействовать с мелкой наградой. Оцените это испытание как «C» за «Правильно» (вознаграждается).
    2. Если рыба проплывает через неправильную дверь, перенесите ее обратно в центральную камеру, закройте обе двери и отличьте это испытание как «Я» за «неправильное» (не вознагражденное).
    3. Если рыба не принимает решения в течение 2 минут после открытия дверей, переместите рыбу в правильную сторону и поставьте испытание как «М» за «отмеченный» (награждаемый силой).
  3. Сбор данных
    1. Для каждой экспериментальной рыбки данио запишите задержку выбора и индивидуальные оценки (C, I, M), в порядке, для каждого испытания.
    2. Сообщите о результатах этих экспериментов в виде средних значений группы для каждого блока с двумя испытаниями в каждый из 3 дней разворота.
    3. Храните данные для высоко- и низкопроизводительных рыб отдельно, чтобы определить, показывают ли они тот же уровень производительности во время разворота, что и во время захвата.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Акклиматация в поведенческую камеру включает в себя три дня обучения: 2 дня групповой акклиматизации, за которыми следует 1 день индивидуальной акклиматизации. Однако, поскольку мы не могли отличить отдельных рыбок данио друг от друга, мы смогли собрать данные только во время индивидуальной акклиматизации. В это время экспериментальным животным (n = 30), обусловленным использованием мелкого вознаграждения, потребовалось в среднем 125,11 с, чтобы достичь своего первого решения(рисунок 2A)и в среднем 725,34 с (12 мин), чтобы выполнить всю индивидуальную задачу акклиматизации(рисунок 2B). Не было никаких существенных побочных предпочтений во время акклиматизации(рисунок 2C). Количество исключенных рыб было минимальным по сравнению с другими видами вознаграждения (пища), которые мы ранее оценивали в нашей лаборатории(рисунок 2C).

После акклиматизации рыбки данио приступили к этапу приобретения. Поскольку рыба тестировалась индивидуально, мы собирали данные о каждой рыбе в каждый из трех дней приобретения. Рыба была классифицирована как «высоко- или низкопроизводительная», причем «высокоэффективные» реагировали быстрее и точнее, несмотря на то, что все рыбы имели одинаковое предыдущее воздействие на испытательную камеру. Только рыба, которая выбрала отсек для вознагражденного выбора, по крайней мере, в 6 из 8 испытаний, была классифицирована как «высокоэффективная». Рыбы, которые не соответствовали этому критерию, были «низкоукачествеваемыми». Высоко- и низкопроизводительные рыбы были размещены отдельно, чтобы различать их производительность во всех последующих испытаниях. Интересно, что мы заметили, что некоторые рыбы меняли категорию (т.е. изначально были «низкопроизводительными», но стали «высокоэффективными») в ходе приобретения. Фактически, количество высокопроизводительных животных увеличивалось каждый день, причем более высокопроизводительная рыба в день приобретения 3 по сравнению с днем 1(рисунок 3A). К 3-му дню >50% рыбы стали «высокоэффективными». Кроме того, первоначальная задержка выбора для всех рыб в течение трех дней сбора (A1-A3) уменьшилась, что указывает на улучшение производительности с каждым днем приобретения(рисунок 3B). Та же тенденция наблюдалась и тогда, когда рассматривалась только высокопроизводительная группа рыб: к 3-му дню время принятия первого решения улучшилось (стало быстрее)(рисунок 3C).

Коэффициент дискриминации (вознаграждаемые испытания/ (вознаграждение + невыдворенные испытания) был рассчитан для каждого блока испытаний приобретения (в среднем двух испытаний на рыбу) в течение трех дней приобретения (A1-A3) для всех экспериментальных животных (n = 30), чтобы определить, насколько точно рыба решала (приобретала) задачу дискриминации (т. Е. Переход на вознаграждаемую сторону аквариума). Это соотношение показало, что процент рыбы, перемещающейся на вознаграждаемую сторону во время каждого испытания, увеличивался ежедневно (т.е. через пробные блоки в каждый отдельный день) и в целом (т.е. в течение трех дней приобретения), в результате чего все рыбы к концу приобретения показали вышеуказанные результаты (пунктирная линия, представленная на графике; (Рисунок 4А)и указывает, что рыба научилась различать задачу.

После приобретения обучения дискриминации мы проверили, как долго рыбки данио будут помнить задачу. Для этого проверенные рыбки данио оставались в резервуарах для хранения в течение 8 недель. По истечении этого времени рыбы были протестированы на разворотном задании, которое длилось 3 дня (R1–R3). Мы обнаружили, что рыбы продемонстрировали сильное поведение разворота и повышенную дискриминацию в течение трех дней разворота(рисунок 4B),что указывает на то, что они смогли (1) запомнить связь между цветом аквариума и вознаграждением и (2) ингибировать то, что они ранее узнали во время приобретения, и изучить обратную / противоположную парадигму. Как показано на рисунке 4B,рыбки данио первоначально отправились на не вознагражденную сторону аквариума, о чем свидетельствует коэффициент дискриминации, который был ниже шанса во время начальных следов в день разворота 1. Однако к концу R1 производительность увеличилась до большего, чем случайность, результат, который был сохранен на R2 и R3, причем самые высокие показатели коэффициента дискриминации наблюдались на R3. Взятые вместе, эти данные показывают, что наивные экспериментальные животные способны решить задачу дискриминации, даже если первоначальное поведение было приобретено на 8 недель раньше, без какой-либо дополнительной подготовки в перерывах между поведенческими сессиями.

Парадигма 3-камерного выбора также может быть применена для изучения осложнений заболевания. В нашем исследовании с гипергликемическими рыбками данио акклиматация и приобретение были такими, как описано, и реверс был протестирован после 4 или 8 недель гипергликемии. Гипергликемия была индуцирована альтернативным протоколом погружения (McCarthy et al., 2020 - этот вопрос), так что обучение происходило через день, в дни после того, как рыбки данио находились в тестовых растворах в течение 24 ч. Во время приобретения основное влияние учебного дня на коэффициент дискриминации (F (2, 239) = 4,457, p = 0,012; Рисунок 5А),при этом соотношение на А1 значительно ниже, чем на А3 (p = 0,010), что указывает на то, что рыбы со временем улучшили точность своего выбора. Во время реверса наблюдался значительный основной эффект лечения (F (2, 326) = 3,057, p = 0,048), но не было других значимых основных эффектов или взаимодействий (учебный день: (F (2, 326) = 1,602, p = 0,203); учебный день x лечение: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,620); Рисунок 5А). Реакция животных, получавших глюкозу, была значительно снижена по сравнению с животными, обработанными водой (p = 0,037), но не было других существенных различий (контроль v. mannitol: p = 0,387; маннит v. глюкоза: p = 0,524), предполагающих специфический для глюкозы эффект. После 8 недель гипергликемии не было отмечено статистических различий в коэффициентах дискриминации в рамках обучения приобретению (F (2 263) = 2,909, p = 0,056; Рисунок 5B). Тем не менее, наблюдались значительные основные эффекты как учебного дня (F (2, 189) = 4,721, p = 0,010), так и лечения (F (2, 189) = 7,940, p = 0,000) на разворот, но не было значимого взаимодействия (тренировочный день * лечение = F (4, 189) = 0,869, p = 0,484). Последующие наименее значимые различия (ЛСД) попарно сравнивали выявленные значительные различия между R1 и R3 (p = 0,022) и между R2 и R3 (p = 0,003). Парные сравнения ЛСД также выявили значительные различия между группой очистки воды и группами обработки глюкозой и маннитом (вода v. маннит: p = 0,008; вода против глюкозы: 0,000); однако группы глюкозы и маннитола существенно не отличались друг от друга (p = 0,265), что позволяет предположить, что эти различия в соотношении дискриминации могут быть обусловлены осмотическими эффектами.

Figure 1
Рисунок 1: Трехкамерная камера выбора и настройка поведения. (A) Схема 3-камеры. Экспериментальные животные были ограничены центральной стартовой камерой в течение 2 минут, а затем им был предоставлен доступ к любой стороне резервуара в начале испытания. Для этого верхняя половина каждой из двух перегородок была поднята, чтобы создать пространство размером 10 см, чтобы рыбы могли пересечь любой отсек. (В,Э) Акклиматация проводилась с использованием бежевого фона и косяка конспецифичных в качестве награды. (С,Ф) Комплектование осуществлялось с использованием черно-белых фонов на выбранных камерах; награда располагалась только с одной стороны камеры. G) разворот осуществлялся с использованием черно-белого фона на отсеках выбора; вознаграждение было доступно только на противоположной стороне камеры (против приобретения). (H) Близкое изображение мелкого резервуара, погруженного в один из выбранных отсеков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Задержка и количество отмеченных испытаний во время индивидуальной акклиматизации. (A) Задержка выбора первого решения. (B) Общее количество времени для завершения индивидуальной акклиматизации. (C) Число позиций слева и справа не различаются, что указывает на отсутствие присущих им боковых предпочтений до начала приобретения. Мы также сообщаем об общем количестве испытаний меток во время индивидуальной акклиматизации. Значения указаны как средние ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Процент высокопроизводительной рыбы и задержка первоначального выбора среди всех рыб и высокопроизводительных рыб в течение трех дней приобретения. (A) Высокоэффективная рыба перемещалась из центральной камеры на вознаграждаемую сторону камеры по крайней мере в 6 из 8 испытаний каждый день приобретения (A1-A3). (B) В течение трех дней обучения приобретению (A1–A3) общая задержка первоначального выбора уменьшилась; тенденция также проявляется в высокопроизводительной рыбе (C). Значения указаны как средние ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Показатели дискриминации во время испытаний по приобретению и отмене. (A) Коэффициент дискриминации (вознаграждаемые испытания / (вознаграждение + невыдворенные испытания) рыбы в течение дней приобретения (A1-A3) и (B) во время обратного обучения через 8 недель. Разворот также оценивался в течение 3 дней (R1–R3). Для обеих задач каждая рыба должна была пройти 8 испытаний, а результаты представлены в двух блоках испытаний (2, 4, 6, 8). Правильные ответы как во время приобретения, так и при разворота увеличивались со временем, причем более быстрая реакция наблюдалась во время разворота, что указывает на то, что рыба выучила и запомнила задачу. Значения сообщаются как среднее ± SEM. Пунктирная линия представляет случайность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Приобретение и обращение гипергликемических рыбок данио с использованием 3-камерной поведенческой задачи выбора. (A) До лечения наивные рыбки данио приобрели поведенческую задачу выбора 3 камеры в течение трех дней поведенческой тренировки (приобретение, A1-A3). Между коэффициентами дискриминации по А1 и А3 существовала значительная разница, указывающая на то, что обучение имело место (p = 0,012). После 4 недель лечения (цветные символы) наблюдался значительный эффект лечения (p = 0,048), при этом животные, обработанные глюкозой, демонстрировали значительно сниженные коэффициенты дискриминации по сравнению с животными, обработанными водой (p = 0,037). (B) В отдельном эксперименте оценивали поведение до и после 8 недель гипергликемии. Несмотря на устойчивый рост производительности в течение каждого дня приобретения, не было существенных различий в соотношении дискриминации по A1-A3. Однако после 8 недель лечения (цветные символы) наблюдался основной эффект лечения (р < 0,001) и индивидуальный основной эффект тренировочного дня (р=0,010). Пост-специальные анализы выявили значительную разницу между группой, обработанной водой, и группами, обработанными маннитом и глюкозой, что свидетельствует об осмотическом эффекте (вода против маннитола: p = 0,008; вода против глюкозы: p < 0,001). * обозначает значительный основной эффект. Точки данных представляют собой групповое среднее ± SEM, а точки данных с разными буквами значительно отличаются друг от друга. Пунктирная линия представляет случайность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя за последние 15 лет24года наблюдался огромный рост количества и разнообразия нейробиологических исследований, выполненных с использованием рыбок данио, поведенческие анализы отсутствуют у этого вида по сравнению с модельными системами млекопитающих11,25,26. Здесь мы показываем, что трехкамерная задача выбора, разработанная для использования с грызунами, может быть адаптирована для оценки приобретения и обращения вспять визуальной дискриминации обучения у рыбок данио. Используя живую косяк в качестве награды, эта задача обеспечила надежный анализ, который может быть применен к различным исследованиям, изучающим поведенчески связанные заболевания, такие как гипергликемические осложнения диабета, болезни Альцгеймера и деменции.

Ранее было установлено, что рыбки данио способны к обучению и хранению информации, так как это требуется для принятия экологически значимых решений и необходимо для выживания в дикой природе3. Наши данные о сборе и обращении в течение 8-недельного продольного исследования подтверждают предыдущие доказательства того, что рыбки данио, хотя и маленькие, способны изучать и запоминать простую задачу дискриминации, и что рыбки данио также могут ингибировать ранее приобретенные ответы. В продольном 8-недельном исследовании количество принудительных вознаграждений уменьшилось, а коэффициент дискриминации увеличился, что указывает на то, что рыбы лучше выбирают правильную, вознагражденную сторону и выучили задачу. Хотя эти изменения были несущественными, мы наблюдали общую тенденцию к снижению числа судебных процессов с применением силы во время приобретения и увеличение коэффициента дискриминации. Кроме того, результаты трехкамерной поведенческой задачи выбора с гипергликемическими рыбами показали применимость теста к исследованиям, изучающим гипергликемические состояния, и указывают на то, что эта парадигма может быть использована в сочетании с другими экспериментальными манипуляциями, такими как воздействие лекарств или мутантные линии, для оценки потенциального воздействия на познание.

Важным ограничением этого исследования является то, что мы не можем идентифицировать отдельных рыб с течением времени и поэтому должны полагаться на средние значения группы для оценки данных. Разработка способа индивидуального отслеживания рыб в различных группах лечения, как у грызунов, могла бы решить эти проблемы. В попытке устранить эти различия мы отсортировали рыбу на этапе приобретения на основе их производительности, что оказалось неожиданным преимуществом нашей методологии. «Высокопроизводительная рыба» набрала ≥ 6/8 в каждый день тренировки, тогда как рыба с более низкими баллами была «низкоэффективной рыбой». При подсчете каждый день количество «высокоэффективных» увеличивалось в группе, вознагражденной мелководьем, так что к 3-му дню в этой категории было значительно больше рыбы по сравнению с лечением, вознагражденным рыбой. Тенденции задержки выбора, наблюдаемые у всех («высокие + низкие показатели») рыб, аналогичны тем, которые наблюдаются только в группе «высоких результатов», предполагая, что сильные ответы этой группы были движущей силой общих ответов.

Таким образом, эти результаты показывают, что обучение дискриминации на основе мелководья у рыбок данио обеспечивает осуществимую экономически эффективную модель для изучения нормального и нарушенного когнитивного функционирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Сабрину Джонс за ее помощь в адаптации парадигмы трехкамерного выбора грызунов к модели рыбок данио, а также Джереми Поповица и Эллисон Мёрк за их помощь в дни сбора поведения, помощь в проведении испытаний, уход за животными и настройку аквариума. Отдельное спасибо также Джеймсу М. Форбсу (инженеру-механику) за помощь в проектировании и строительстве 3-камерного резервуара.

Финансирование: VPC и TLD получили совместный грант поддержки исследований факультета (FRSG) от Американского университетского колледжа искусств и наук. CJR получил поддержку от Американского университетского колледжа искусств и наук.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack Amazon N/A https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17
Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion
Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black Amazon N/A https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU=
Marineland® Silicone Aquarium Sealant Petsmart Item #2431002
PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length Amazon N/A https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2
Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel Lowes Item #55979Model #11377 https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181
Tetra 10 Gallon Fish tank Petsmart Item #5271256
Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in) Petsmart Item #5175115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gitler, A. D., Dhillon, P., Shorter, J. Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope. Disease Models & Mechanisms. 10, 499-502 (2017).
  2. Perry, R. J., Watson, P., Hodges, J. R. The nature and staging of attention dysfunction in early (minimal and mild) Alzheimer's disease: relationship to episodic and semantic memory impairment. Neuropsychologia. 38, 252-271 (2000).
  3. Gerlai, R. Learning and memory in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 134, Elsevier Ltd. (2016).
  4. Davidson, T. L., et al. The effects of a high-energy diet on hippocampal-dependent discrimination performance and blood-brain barrier integrity differ for diet-induced obese and diet-resistant rats. Physiology and Behavior. 107, 26-33 (2012).
  5. Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Current Protocols in Neuroscience. 56 (1), (2011).
  6. Remmelink, E., Smit, A. B., Verhage, M., Loos, M. Measuring discrimination- and reversal learning in mouse models within 4 days and without prior food deprivation. Learning and Memory. 23, 660-667 (2016).
  7. Salas, C., et al. Neuropsychology of learning and memory in teleost fish. Zebrafish. 3, 157-171 (2006).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
  9. Luchiaria, A. C., Salajanb, D. C., Gerlai, R. Acute and chronic alcohol administration: Effects on performance of zebrafish in a latent learning task. Behavior Brain Research. 282, 76-83 (2015).
  10. Fadool, J., Dowling, J. Zebrafish: A model system for the study of eye genetics. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 89-110 (2008).
  11. Fernandes, Y. M., Rampersad, M., Luchiari, A. C., Gerlai, R. Associative learning in the multichamber tank: A new learning paradigm for zebrafish. Behavioural Brain Research. 312, 279-284 (2016).
  12. Reider, M., Connaughton, V. P. Developmental exposure to methimazole increases anxiety behavior in zebrafish. Behavioral Neuroscience. , (2015).
  13. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
  14. May, Z., et al. Object recognition memory in zebrafish. Behavioural Brain Research. 296, 199-210 (2016).
  15. Mathur, P., Lau, B., Guo, S. Conditioned place preference behavior in zebrafish. Nature Protocols. 6, 338-345 (2011).
  16. Guo, S. Linking genes to brain, behavior and neurological diseases: What can we learn from zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 3, 63-74 (2004).
  17. Kily, L. J. M., et al. Gene expression changes in a zebrafish model of drug dependency suggest conservation of neuro-adaptation pathways. Journal of Experimental Biology. 211, 1623-1634 (2008).
  18. Webb, K. J., et al. Zebrafish reward mutants reveal novel transcripts mediating the behavioral effects of amphetamine. Genome Biology. 10, (2009).
  19. Clayman, C. L., Malloy, E. J., Kearns, D. N., Connaughton, V. P. Differential behavioral effects of ethanol pre-exposure in male and female zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 335, 174-184 (2017).
  20. Ruhl, T., et al. Acute administration of THC impairs spatial but not associative memory function in zebrafish. Psychopharmacology. 231, 3829-3842 (2014).
  21. Gellermann, L. W. Chance orders of alternating stimuli in visual discrimination experiments. The Pedagogical Seminary and Journal of Genetic Psychology. 42, 206-208 (1933).
  22. Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44, 157-163 (2007).
  23. Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13, 87-94 (2016).
  24. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: Zebrafish as a model system of human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 817341 (2012).
  25. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R., Court, P. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35, 63-75 (2014).
  26. Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in cell biology. 101, 249-270 (2011).

Tags

Поведение Выпуск 170 Дискриминация разворот обучение память Данио рерио подкрепление гипергликемия
Поведенческая задача «Выбор трех камер» с использованием рыбок данио в качестве модельной системы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rowe, C. J., Crowley-Perry, M.,… More

Rowe, C. J., Crowley-Perry, M., McCarthy, E., Davidson, T. L., Connaughton, V. P. The Three-Chamber Choice Behavioral Task using Zebrafish as a Model System. J. Vis. Exp. (170), e61934, doi:10.3791/61934 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter