Summary
Apresentamos uma câmara comportamental projetada para avaliar o desempenho cognitivo. Fornecemos dados mostrando que uma vez adquiridos, zebrafish se lembram da tarefa 8 semanas depois. Também mostramos que os zebrafish hiperglicêmicos alteraram o desempenho cognitivo, indicando que esse paradigma é aplicável a estudos que avaliam a cognição e a memória.
Abstract
As doenças neurodegenerativas são dependentes da idade, debilitantes e incuráveis. Relatórios recentes também correlacionaram a hiperglicemia com alterações na memória e/ou comprometimento cognitivo. Modificamos e desenvolvemos uma tarefa cognitiva de três câmaras semelhante à usada com roedores para uso com zebrafish hiperglicímico. A câmara de teste consiste em uma câmara de partida localizada centralmente e dois compartimentos de escolha de cada lado, com um cardume de conespecíficos usado como recompensa. Fornecemos dados mostrando que uma vez adquiridos, os zebrafish se lembram da tarefa pelo menos 8 semanas depois. Nossos dados indicam que os zebrafish respondem robustamente a esta recompensa, e identificamos déficits cognitivos em peixes hiperglicômicos após 4 semanas de tratamento. Este ensaio comportamental também pode ser aplicável a outros estudos relacionados à cognição e memória.
Introduction
As doenças neurodegenerativas são dependentes da idade, debilitantes e incuráveis. Essas doenças estão aumentando na prevalência, resultando em uma necessidade urgente de melhorar e desenvolver novas estratégias terapêuticas. O início e apresentação de cada doença é único, pois alguns afetam as regiões do cérebro, motor e autônomo, enquanto outras causam déficits de aprendizagem e perda de memória1. Mais notavelmente, déficits cognitivos e/ou prejuízos são as complicações mais prevalentes em todas as doenças neurodegenerativas2. Na esperança de lançar luz sobre os mecanismos subjacentes envolvidos nessas doenças neurodegenerativas, o uso de muitos sistemas de modelos diferentes (incluindo organismos unicelulares para Drosophila para vertebrados de maior ordem, como roedores e humanos) foram empregados; no entanto, a maioria das doenças neurodegenerativas permanece incurável.
A aprendizagem e a memória são processos altamente conservados entre os organismos, pois mudanças constantes no ambiente requerem adaptação3. O comprometimento tanto na cognição quanto na plasticidade sináptica tem sido demonstrado em vários modelos de roedores. Especificamente, ensaios comportamentais bem estabelecidos utilizam aprendizado associativo para avaliar alterações cognitivas após várias doenças e distúrbios induzidos por comprometimento4. Além disso, a reversão da discriminação por contraste avalia déficits cognitivos porque envolve funções de aprendizagem e memória de maior ordem, e a reversão depende da inibição de uma associação previamente aprendida. A tarefa de escolha de três câmaras amplamente utilizada elucida possíveis déficits nas vias de aprendizagem e memória do sistema nervoso central5,6. Recentemente, este campo expandiu-se para incluir modelos não-mamíferos, como o zebrafish (Danio rerio), já que vários paradigmas foram desenvolvidos para uma faixa etária, desde larvas até adultos7,8.
O zebrafish proporciona um equilíbrio de complexidade e simplicidade que é vantajoso para a avaliação de prejuízos cognitivos com técnicas comportamentais. Primeiro, os zebrafish são favoráveis à triagem comportamental de alto rendimento, dado seu pequeno tamanho e natureza reprodutiva prolífica. Em segundo lugar, os zebrafish possuem uma estrutura, o pálio lateral, que é análogo ao hipocampo mamífero, pois possui marcadores neuronais semelhantes e tiposcelulares 7. Os zebrafish também são capazes de adquirir e lembrar informações espaciais9 e, como os humanos, são diurnos10. Portanto, não é de surpreender que os zebrafish estejam sendo usados como modelo para doenças neurodegenerativas com frequência crescente. No entanto, a ausência de ensaios comportamentais adequados tem dificultado a aplicação do modelo de zebrafish para avaliações cognitivas. Os trabalhos publicados utilizando ensaios comportamentais específicos de zebrafish incluem tarefas de aprendizagem associativa11,comportamento de ansiedade12,memória13,reconhecimento deobjetos 14e preferência de local condicionado15,16,17,18,19. Embora tenha havido muitos desenvolvimentos em relação aos ensaios comportamentais dos zebrafish, as contrapartidas para alguns testes de funções cognitivas em roedores ainda não foram desenvolvidas para uso com zebrafish18.
Com base em estudos anteriores do nosso laboratório, modelamos/desenvolvemos uma tarefa cognitiva em zebrafish baseada na tarefa de escolha de três câmaras usada com roedores usando a interação social como recompensa. Além disso, expandimos o aspecto de aprendizagem associativa da tarefa comportamental e incorporamos a reversão da discriminação de contraste na esperança de desenvolver ainda mais essa tarefa comportamental para avaliar o comprometimento cognitivo. Isso nos permitiu examinar tanto a aquisição inicial da aprendizagem por discriminação quanto a subsequente inibição desse aprendizado na fase de reversão. No presente estudo, demonstramos que este procedimento forneceu um método confiável para avaliar o funcionamento cognitivo em zebrafish após a imersão da glicose por 4 ou 8 semanas.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Americana (protocolo nº 1606, 19-02).
1. Animais
- Criação e manutenção de animais
- Obter zebrafish adultos do tipo selvagem (Danio rerio) com idades entre 4 e 11 meses como embriões e criá-los internamente.
- Mantenha o peixe em um sistema de rack aquático a 28-29 °C em um fotoperíodo escuro de 14 horas:10 h.
- Alimente o peixe duas vezes por dia com flocos comerciais e suplemento com Artemiaviva .
- Escolha peixes aleatoriamente destes tanques de estoque para experimentos comportamentais.
- Após a conclusão do experimento, anestesia os animais por imersão em 0,02% de tricaine por 2 min ou até que haja falta de coordenação motora e taxa de respiração reduzida para análises moleculares e/ou neuroquímicas posteriores.
2. Câmara de teste de escolha de três câmaras
NOTA: Esta técnica comportamental foi modificada a partir de Ruhl et al.20.
- Construção de câmara
- Modifique a câmara comportamental26— um aquário de 40 L (50 x 30 x 30 cm3)— para ter uma câmara central ou inicial (10 x 30 x 30 cm3), separada de duas câmaras de escolha lateral (cada uma 20 x 30 x 30 cm3, Figura 1A).
- Construa os três compartimentos usando um canal de alumínio "em forma de U" afixado nas paredes de vidro interior com selante de aquário, para separar o tanque em três câmaras.
- Construa divisores opacos, 10 cm de altura, de folha de PVC cinza encaixe nos canais de alumínio de ambos os lados. Faça cada divisor de 2 peças, cada uma igual em tamanho: uma peça inferior estacionária permanentemente montada dentro do tanque e uma peça superior móvel que se move para cima e para baixo nas faixas de alumínio.
- Cole clipes de aglutinante extra-grandes na parte superior das folhas de PVC cinza para agir como alças.
- Usando um marcador permanente, desenhe pequenas linhas horizontais 10 cm acima do tubo de PVC cinza aderido na parte externa do tanque.
NOTA: Esta marca é o ponto para o qual a folha de PVC cinza superior será aberta para permitir o acesso a ambos os lados. - Adicione o controle (sistema) água ao tanque a um nível de 25 cm de baixo para cima do tanque, ou ~ 30 L. Coloque aquecedores de aquário de vidro em cada seção da câmara por 24 horas antes do teste para levar a temperatura a 28,5 °C.
NOTA: Remova os aquecedores no início da sessão de comportamento e realize uma troca completa de água após dois dias de uso.
- Configuração de discriminação
- Para cada tarefa de discriminação, coloque individualmente peças de feltro coloridas (bege, preto ou branco) nas costas, laterais e inferiores das câmaras de escolha usando Velcro(Figura 1B-D).
NOTA: A câmara central não deve ter cor de fundo associada a ela.
- Para cada tarefa de discriminação, coloque individualmente peças de feltro coloridas (bege, preto ou branco) nas costas, laterais e inferiores das câmaras de escolha usando Velcro(Figura 1B-D).
- Como recompensa, crie um grupo de conespecíficos (cardumes) colocando 4 zebrafish adultos, que não serão usados de outra forma no estudo, em um pequeno tanque claro no canto traseiro de cada câmara de escolha(Figura 1B-D).
NOTA: Escolha peixes cardume aleatoriamente de tanques de estoque todos os dias, com pelo menos um macho e uma fêmea da mesma idade e tamanho que os peixes experimentais em cada tanque de cardum.
3. Tarefas comportamentais
- Aclimatação
NOTA: A aclimatação à câmara de comportamento consiste em três dias de treinamento; dois dias de aclimatação em grupo seguido de um dia de treinamento individual. - Aclimatação em grupo
- Anexar o fundo bege (neutro) ao exterior de ambos os compartimentos de escolha, e submergir um tanque de cardilho vivo em cada um dos compartimentos de escolha(Figura 1B).
- Adicione cinco-seis zebrafish à câmara de partida central com ambas as portas deslizantes abertas, e deixe o peixe vagar livremente por 30 minutos.
NOTA: O zebrafish experimental deve ser capaz de interagir e socializar com esses peixes de cardume através do tanque como recompensa depois de cruzar em ambos os compartimentos de escolha durante a aclimatação. Acredita-se que um peixe tenha entrado em uma das câmaras laterais quando seu corpo inteiro entra na câmara. - Repita este procedimento com o mesmo peixe experimental por um segundo dia (2 dias de aclimatação em grupo).
NOTA: Não mantenha os mesmos grupos de peixes.
- Aclimatação individual
- Configuração da câmara: Anexar o fundo bege (neutro) à parte externa de ambos os compartimentos de escolha, e submergir um tanque de cardião vivo em ambos os compartimentos de escolha, como na aclimatação em grupo(Figura 1B,E).
- Coloque um zebrafish individual na câmara de partida central por 2 minutos com as portas deslizantes fechadas, e após o período de 2 minutos, abra ambas as portas simultaneamente.
- Certifique-se de que cada peixe nada da câmara central através de uma porta por um total de 10 vezes, independentemente de qual lado. Recompense o peixe cada vez que ele entra em uma das câmaras laterais (1 dia de aclimatação individual).
NOTA: Se um peixe não conseguir completar essa tarefa 10 vezes dentro de um período de 30 minutos ou se recusar a deixar a câmara inicial, exclua-a do estudo.
- Aquisição de dados: Registo o número de vezes que o peixe nada para ambos os lados e o tempo total necessário para concluir a tarefa.
- Configuração da câmara: Anexar o fundo bege (neutro) à parte externa de ambos os compartimentos de escolha, e submergir um tanque de cardião vivo em ambos os compartimentos de escolha, como na aclimatação em grupo(Figura 1B,E).
- Aquisição
NOTA: Após a aclimatação, o zebrafish iniciou uma tarefa de aquisição de 3 dias.- Configuração da câmara: Anexar uma peça de feltro branco ao lado de fora de um compartimento de escolha e uma peça de feltro preto para fora do compartimento de outra escolha(Figura 1C,F).
NOTA: Alterne a cor de fundo de cada lado diariamente usando um cronograma de pseudorandom37.- Durante a duração desta fase de treinamento, coloque um cardume-recompensa apenas colocado em um dos compartimentos de escolha; este se torna o lado recompensado.
- Para começar a aquisição, coloque um único peixe experimental na câmara inicial por um período de 2 minutos com os compartimentos de escolha fechados.
- Após a aclimatação de 2 minutos, abra simultaneamente ambas as portas, dando acesso aos dois compartimentos de escolha, e inicie o cronômetro para avaliar a latência da escolha.
- Usando um design tendencioso, atribua aleatoriamente ao peixe uma preferência em preto ou branco (ou seja, W+/B- ou B+/W-), o que significa que o cardume é colocado no compartimento de escolha preto (B+) ou branco (W+).
- Denotando a resposta de escolha
- Uma vez que o peixe faça uma escolha entrando em um dos compartimentos laterais, pare o temporizador.
- Se o peixe escolher corretamente o lado preferido, feche imediatamente a porta entre a câmara central e aquele lado para restringir o peixe ao lado preferido por 1 min, e permitir que ele seja recompensado interagindo com o tanque de cardum(Figura 1C,F). Marque este teste como "C" para "Correto" (recompensado).
- Se o peixe nadar pela porta incorreta, transfira-o de volta para a câmara central, feche as duas portas e marque o teste como "eu" para "incorreto" (não recompensado).
- Se o peixe não tomar uma decisão dentro de 2 minutos após as portas serem abertas, mova o peixe para o lado correto por 1 min, e marque o teste como "M" para "marcado" (recompensado à força).
- Ao transferir/mover peixes de volta para a câmara de partida, guie suavemente o peixe para a câmara central usando uma rede de peixe como ferramenta de pastoreio.
NOTA: Não retire o peixe da água e substitua-o na câmara inicial, pois isso pode afetar o ensaio comportamental. - Assim que o peixe voltar para a câmara central, espere 1 min antes de realizar a tarefa novamente. Certifique-se de que cada peixe executa a tarefa 8 vezes.
- Aquisição de dados
- Para cada peixe experimental, regisque o tempo para primeira decisão (ou latência de escolha) e as pontuações individuais (C, I ou M) para cada um dos 8 ensaios de aquisição (seção 3.4.2) em ordem.
- Os resultados desses experimentos foram relatados como médias de grupo para cada ensaio em cada dia de aquisição.
- Uma vez que um peixe tenha concluído um teste, categorize-o como um peixe de "alto desempenho" ou um peixe de "baixo desempenho".
NOTA: Um peixe foi considerado de "alto desempenho" se tivesse sucesso na escolha do lado correto do tanque em pelo menos 6 dos 8 ensaios totais do dia. Qualquer peixe que não atenda a esse critério é um "baixo desempenho". - Uma vez identificados, abrigam peixes de alto desempenho e de baixo desempenho separadamente.
- Categorize o peixe como "alto" ou "baixo" em cada um dos três dias de aquisição, após um peixe ter concluído os ensaios.
NOTA: Ao final do terceiro dia de aquisição, os peixes permanecem como artistas "altos" ou "baixos" durante a duração do estudo.
NOTA: Alguns peixes que estavam inicialmente no grupo de "baixo desempenho" aprendem a tarefa no dia 2 ou 3 de aquisição. Quando isso acontece, o peixe inicial de "baixo desempenho" pode ser movido para o grupo de "alto desempenho". Não mova o peixe entre os grupos desta forma após o dia 3 (o fim da aquisição).
- Configuração da câmara: Anexar uma peça de feltro branco ao lado de fora de um compartimento de escolha e uma peça de feltro preto para fora do compartimento de outra escolha(Figura 1C,F).
4. Tratamento experimental
- Após o período de aquisição, quando os peixes demonstram a capacidade de resolver uma simples tarefa de discriminação entre o fundo preto e branco, iniciam o regime de tratamento para o zebrafish experimental.
NOTA: Para mostrar a aplicabilidade deste método, este estudo mostra dois projetos experimentais:- Estudo longitudinal
- Devolva os peixes experimentais aos tanques de espera por 8 semanas. Mantenha os peixes em tanques padrão com mudanças diárias de água, e alimente-os duas vezes ao dia.
NOTA: Não realize nenhum treinamento comportamental durante estas 8 semanas nos tanques de retenção. - Realize a avaliação de reversão após esse período para avaliar se o zebrafish pode resolver a tarefa de reversão após 8 semanas sem treinamento.
- Devolva os peixes experimentais aos tanques de espera por 8 semanas. Mantenha os peixes em tanques padrão com mudanças diárias de água, e alimente-os duas vezes ao dia.
- Hiperglicemia: Exponha os grupos experimentais à água (controle de estresse), manitol (1%-3%, controle osmótico) ou glicose (1%-3%) para 4 ou 8 semanas22,23.
NOTA: Não realize nenhum treinamento comportamental durante estas 4 ou 8 semanas.
- Estudo longitudinal
5. Reversão
NOTA: Após a manipulação experimental (como na seção 4.2), os peixes são testados na parte final do paradigma de escolha de 3 câmaras — reversão. Para isso, o lado recompensado é invertido (comparado à aquisição) de tal forma que os peixes anteriormente recompensados com um cardume no lado branco são agora recompensados com um cardume no lado preto e vice-versa. Dessa forma, a reversão avalia se os peixes aprenderam onde está a recompensa (cardume) está localizada, independentemente da cor do fundo.
- Configuração da câmara
- Anexar o feltro preto ao lado de uma das câmaras de escolha e o branco sentido para o lado de fora do outro, certificando-se de que os lados preto e branco são os mesmos lados dos ensaios de aquisição (seção 3.4).
- Submergir o tanque de cardião no canto traseiro do lado que é o oposto da câmara de escolha previamente recompensada(Figura 1D,G).
NOTA: Em outras palavras, os peixes anteriormente recompensados no lado branco são agora recompensados no lado preto e vice-versa. - Teste o peixe individualmente como na seção 3.5. Comece colocando um único peixe experimental na câmara inicial por um período de 2 minutos, e feche o acesso aos compartimentos de escolha.
- Ao mesmo tempo abra os dois lados da câmara.
NOTA: Complete um total de 8 ensaios por dia durante três dias consecutivos de tratamento.
- Denotando a resposta de escolha
- Se o peixe escolher corretamente a cor preferida, feche imediatamente a porta da câmara central por 1 minuto, permitindo que o peixe interaja com a recompensa do cardume. Marque este teste como "C" para "Correto" (recompensado).
- Se o peixe nadar pela porta incorreta, transfira-o de volta para a câmara central, feche as duas portas e marque este teste como "eu" para "incorreto" (não recompensado).
- Se o peixe não tomar uma decisão dentro de 2 minutos após as portas serem abertas, mova o peixe para o lado correto, e marque o teste como "M" para "marcado" (recompensado à força).
- Aquisição de dados
- Para cada zebrafish experimental, regisse a latência da escolha e as pontuações individuais (C, I, M), em ordem, para cada ensaio.
- Informe os resultados desses experimentos como médias de grupo para cada bloco de dois ensaios em cada um dos 3 dias de reversão.
- Mantenha os dados para peixes de alto e baixo desempenho separados para determinar se eles exibem o mesmo nível de desempenho durante a reversão como durante a aquisição.
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Representative Results
A aclimatação à câmara de comportamento envolve três dias de treinamento: 2 dias de aclimatação em grupo seguido de 1 dia de aclimatação individual. No entanto, como não conseguimos distinguir os zebrafish individuais uns dos outros, só conseguimos coletar dados durante a aclimatação individual. Neste momento, os animais experimentais (n = 30), condicionados a uma recompensa baseada em cardum, levaram uma média de 125,11 s para chegar à primeira decisão(Figura 2A) e uma média de 725,34 s (12 min) para completar toda a tarefa de aclimatação individual(Figura 2B). Não houve preferência lateral significativa durante a aclimatação (Figura 2C). O número de peixes excluídos foi mínimo em comparação com outros tipos de recompensa (alimentos) que tínhamos avaliado anteriormente em nosso laboratório (Figura 2C).
Após a aclimatação, o zebrafish iniciou a fase de aquisição. Como os peixes foram testados individualmente, coletamos dados de cada peixe em cada um dos três dias de aquisição. Os peixes foram classificados como "altos ou baixos desempenhos", com "altos desempenhos" respondendo mais rápido e com mais precisão, apesar de todos os peixes terem a mesma exposição prévia à câmara de testes. Apenas os peixes que selecionaram o compartimento de escolha recompensado em pelo menos 6 dos 8 ensaios foram classificados como "de alto desempenho". Os peixes que não atenderam a esse critério foram "baixos desempenhos". Peixes de alto e baixo desempenho foram alojados separadamente para distinguir seu desempenho em todos os ensaios subsequentes. Curiosamente, observamos que alguns peixes mudaram de categoria (ou seja, eram inicialmente 'baixos desempenhos', mas se tornaram "artistas de alto desempenho") durante o curso da aquisição. De fato, o número de animais de alto desempenho aumentou a cada dia, com peixes de maior desempenho no dia 3 de aquisição em comparação com o dia1 (Figura 3A). No terceiro dia, >50% dos peixes tinham se tornado "artistas de alto desempenho". Além disso, a latência inicial de escolha para todos os peixes ao longo dos três dias de aquisição (A1-A3) diminuiu, indicando um melhor desempenho a cada dia de aquisição(Figura 3B). A mesma tendência também foi observada quando apenas o grupo de peixes de alto desempenho foi considerado: no dia 3, o tempo para a primeira decisão melhorou (tornou-se mais rápido) (Figura 3C).
Uma razão de discriminação (ensaios recompensados/(recompensa + ensaios não recompensados) foi calculada para cada bloco de teste de aquisição (média de dois ensaios/peixe) ao longo dos três dias de aquisição (A1-A3) para todos os animais experimentais (n = 30) para determinar com precisão a forma como o peixe estava resolvendo (adquirir) a tarefa de discriminação (ou seja, indo para o lado recompensado do tanque). Essa razão revelou que a porcentagem de peixes que se deslocam para o lado recompensado durante cada ensaio aumentou diariamente (ou seja, através de blocos de ensaio em cada dia individual) e geral (ou seja, ao longo dos três dias de aquisição) resultando em todos os peixes com desempenho acima do acaso até o final da aquisição (linha pontilhada representada no gráfico; (Figura 4A) e indicando que os peixes tinham aprendido a tarefa de discriminação.
Após a aquisição do aprendizado da discriminação, testamos quanto tempo os zebrafish se lembrariam da tarefa. Para isso, os zebrafish testados permaneceram em tanques de retenção por 8 semanas. Após esse período, os peixes foram testados em uma tarefa de reversão que durou 3 dias (R1-R3). Verificou-se que os peixes demonstraram forte comportamento de reversão e aumento da discriminação ao longo dos três dias de reversão(Figura 4B),indicando que foram capazes de (1) lembrar a relação entre a cor do tanque e a recompensa e (2) inibir o que haviam aprendido anteriormente durante a aquisição e aprender o paradigma reverso/oposto. Como mostrado na Figura 4B,o zebrafish inicialmente foi para o lado não recompensado do tanque, como indicado pela razão de discriminação estar abaixo do acaso durante as trilhas iniciais no dia 1 de reversão. No entanto, ao final do R1, o desempenho aumentou para maior do que o acaso, resultado que foi mantido em R2 e R3, com os maiores escores de índice de discriminação observados no R3. Juntos, esses dados mostram que animais experimentais ingênuos são capazes de resolver a tarefa de discriminação, embora o comportamento inicial tenha sido adquirido 8 semanas antes, sem qualquer treinamento adicional entre as sessões comportamentais.
O paradigma de escolha de 3 câmaras também pode ser aplicado ao exame de complicações da doença. Em nosso estudo com zebrafish hiperglicêmico, a aclimatação e aquisição foram descritos, e a reversão foi testada após 4 ou 8 semanas de hiperglicemia. A hiperglicemia foi induzida com um protocolo de imersão alternativo (McCarthy et al., 2020 - esta questão), de modo que o treinamento ocorreu a cada dois dias, dias após o zebrafish estar em soluções de teste por 24 horas. Durante a aquisição, houve um efeito principal do dia de treinamento sobre a razão de discriminação (F (2.239) = 4,457, p = 0,012; Figura 5A), com a razão em A1 sendo significativamente menor do que em A3 (p = 0,010), indicando que o peixe melhorou sua precisão de escolha ao longo do tempo. Durante a reversão, houve um efeito principal significativo do tratamento (F (2, 326) = 3,057, p = 0,048), mas nenhum outro efeito ou interações principais significativos (dia de treinamento: (F (2.326) = 1,602, p = 0,203); dia de treinamento x tratamento: (F (4, 326) = 0,661, p = 0,620); Figura 5A). A resposta dos animais tratados com glicose foi significativamente reduzida em relação aos animais tratados com água (p = 0,037), mas não houve outras diferenças significativas (controle v. mannitol: p = 0,387; mannitol v. glicose: p = 0,524), sugerindo um efeito específico da glicose. Após 8 semanas de hiperglicemia, não foram observadas diferenças estatísticas nas razões de discriminação entre os treinamentos de aquisição (F (2.263) = 2,909, p = 0,056; Figura 5B). No entanto, houve efeitos principais significativos tanto do dia de treinamento (F (2, 189) = 4,721, p = 0,010) e tratamento (F (2.189) = 7,940, p = 0,000) na reversão, mas sem interação significativa (dia de treinamento * tratamento = F (4,189) = 0,869, p = 0,484). As comparações de duplas de diferença menos significativa (LSD) posteriores identificaram diferenças significativas entre R1 e R3 (p = 0,022) e entre R2 e R3 (p = 0,003). As comparações em pares do LSD também revelaram diferenças significativas entre o grupo de tratamento de água e os grupos de tratamento de glicose e manitol (água v. mannitol: p = 0,008; água v. glicose: 0,000); no entanto, os grupos de glicose e manitol não foram significativamente diferentes um do outro (p = 0,265), sugerindo que essas diferenças na razão de discriminação podem ser devido a efeitos osmóticos.
Figura 1: Câmara de teste de três câmaras e configuração de comportamento. (A) esquema de 3 câmaras. Os animais experimentais ficaram restritos à câmara de partida central por 2 minutos e, em seguida, permitiram o acesso a ambos os lados do tanque no início de um ensaio. Para isso, a metade superior de cada uma das duas divisórias foi levantada para criar um espaço de 10 cm para os peixes atravessarem para qualquer compartimento de escolha. (B,E) A aclimatação foi realizada usando um fundo bege e cardum de conespecíficos como recompensa. (C,F) A aquisição foi realizada utilizando-se fundos preto e branco nas câmaras de escolha; recompensa foi localizado apenas em um lado da câmara. (G) A reversão foi realizada utilizando-se fundos preto e branco nos compartimentos de escolha; recompensa só estava disponível no lado oposto da câmara (vs. aquisição). (H) Imagem de perto do tanque de cardião submerso em um dos compartimentos de escolha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Latência e número de ensaios marcados durante a aclimatação individual. (A) Escolha latência da primeira decisão. (B) O tempo total para completar a aclimatação individual. (C) O número de entradas para o lado esquerdo e direito não são diferentes, indicando nenhuma preferência lateral inerente antes do início da aquisição. Também relatamos o número total de ensaios de marca durante a aclimatação individual. Os valores são reportados como Média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O percentual de peixes de alto desempenho e a latência de escolha inicial entre todos os peixes e peixes de alto desempenho ao longo dos três dias de aquisição. (A) Peixe de alto desempenho movido da câmara central para o lado recompensado da câmara em pelo menos 6 de 8 ensaios a cada dia de aquisição (A1-A3). (B) Ao longo de três dias de treinamento de aquisição (A1-A3), a latência geral da escolha inicial diminuiu; uma tendência também evidente em peixes de alto desempenho (C). Os valores são reportados como Média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Desempenho discriminação durante os ensaios de aquisição e reversão. (A) Razão de discriminação (ensaios recompensados/(recompensa + ensaios não recompensados) de peixes nos dias de aquisição (A1-A3) e (B) durante o aprendizado de reversão 8 semanas depois. A reversão também foi avaliada por 3 dias (R1-R3). Para ambas as tarefas, cada peixe teve que completar 8 ensaios, e os resultados são apresentados em blocos de dois ensaios (2, 4, 6, 8). As respostas corretas durante a aquisição e a reversão aumentaram com o tempo, com uma resposta mais rápida observada durante a reversão, indicando que o peixe aprendeu e lembrou da tarefa. Os valores são reportados como Média ± SEM. A linha pontilhada representa o acaso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Aquisição e Reversão de zebrafish hiperglicêmicos usando a tarefa comportamental de escolha de 3 câmaras. (A) Antes do tratamento, o zebrafish ingênuo adquiriu a tarefa comportamental de escolha de três câmaras ao longo de três dias de treinamento comportamental (aquisição, A1-A3). Houve diferença significativa entre as razões de discriminação em A1 e A3 indicando que o aprendizado ocorreu (p = 0,012). Após 4 semanas de tratamento (símbolos coloridos) houve um efeito significativo do tratamento (p = 0,048), com animais tratados com glicose apresentando razões de discriminação significativamente reduzidas em comparação com animais tratados com água (p = 0,037). (B) Em um experimento separado, foi avaliado o comportamento antes e depois de 8 semanas de hiperglicemia. Apesar do aumento constante do desempenho em cada dia de aquisição, não houve diferenças significativas na relação discriminação em relação ao A1-A3. No entanto, após 8 semanas de tratamento (símbolos coloridos), houve um efeito principal do tratamento (p < 0,001) e um efeito principal individual do dia de treinamento (p = 0,010). As análises pós-hoc revelaram uma diferença significativa entre o grupo tratado com água e ambos os grupos tratados com manitol e glicose, sugerindo um efeito osmótico (água v. mannitol: p = 0,008; água v. glicose: p < 0,001). * denota um efeito principal significativo. Os pontos de dados representam ± sem-forma, e os pontos de dados com letras diferentes são significativamente diferentes entre si. A linha pontilhada representa o acaso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora tenha havido um enorme crescimento na quantidade e variedade de pesquisas de neurociência realizadas usando zebrafish nos últimos 15 anos24, faltam ensaios comportamentais nesta espécie em comparação com os sistemas de modelos mamíferos11,25,26. Aqui, mostramos que uma tarefa de escolha de três câmaras desenvolvida para uso com roedores pode ser adaptada para avaliar a aquisição e reversão de um aprendizado de discriminação visual em zebrafish. Usando um cardume vivo como recompensa, essa tarefa forneceu um ensaio robusto que pode ser aplicado a uma variedade de estudos que examinam doenças ligadas comportamentalmente, como complicações hiperglicêmicas de diabetes, Alzheimer e demência.
Foi previamente estabelecido que os zebrafish são capazes de aprender e armazenar informações, pois é necessário tomar decisões ecologicamente relevantes e necessárias para a sobrevivência na natureza3. Nossos dados de aquisição e reversão em um estudo longitudinal de 8 semanas apoiam evidências prévias de que os zebrafish, embora pequenos, são capazes de aprender e lembrar de uma simples tarefa de discriminação, e que o zebrafish também pode inibir respostas adquiridas anteriormente. No estudo longitudinal de 8 semanas, o número de recompensas forçadas diminuiu, e a razão de discriminação aumentou, indicando que os peixes melhoram na escolha do lado correto e recompensado e aprenderam a tarefa. Embora essas mudanças não tenham sido significativas, vimos uma tendência global de queda no número de ensaios recompensados pela força durante a aquisição e um aumento na taxa de discriminação. Além disso, os resultados da tarefa comportamental de escolha de três câmaras com peixes hiperglicêmicos revelaram a aplicabilidade do teste a estudos que examinam condições hiperglicêmicas e indicam que esse paradigma poderia ser usado em combinação com outras manipulações experimentais, como exposições de drogas ou linhas mutantes, para avaliar potenciais efeitos na cognição.
Uma limitação importante deste estudo é que não podemos identificar peixes individuais ao longo do tempo e, portanto, devemos contar com as médias dos grupos para avaliar os dados. Desenvolver uma maneira de rastrear individualmente os peixes nos diferentes grupos de tratamento, como nos roedores, poderia abordar essas questões. Na tentativa de resolver essas diferenças, classificamos o peixe durante a fase de aquisição com base em seu desempenho, o que acabou sendo um benefício inesperado de nossa metodologia. 'Peixe de alto desempenho' marcou ≥ 6/8 em cada dia de treinamento, enquanto os peixes com pontuações mais baixas foram "peixes de baixo desempenho". Quando contados a cada dia, o número de "artistas de alto desempenho" aumentou no grupo recompensado pelo cardume para que, no dia 3, houvesse significativamente mais peixes nesta categoria em comparação com o tratamento recompensado pelos peixes. As tendências de latência observadas em todos os peixes ('alto + baixos desempenhos') são semelhantes às observadas apenas no grupo "de alto desempenho", sugerindo que as fortes respostas desse grupo estavam impulsionando as respostas globais.
Em resumo, esses achados indicam que o aprendizado de discriminação baseado em cardião em zebrafish fornece um modelo econômico e viável para o estudo do funcionamento cognitivo normal e prejudicado.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Sabrina Jones por sua ajuda na adaptação de um paradigma de escolha de três câmaras para o modelo de zebrafish e Jeremy Popowitz e Allison Murk por sua ajuda em dias de coleta de comportamento, assistência com testes de execução, cuidados com animais e configuração de tanques. Agradecimentos especiais também a James M. Forbes (Engenheiro Mecânico) por sua ajuda com o projeto e construção do tanque de escolha de 3 câmaras.
Financiamento: VPC e TLD receberam uma bolsa conjunta de Apoio à Pesquisa da Faculdade (FRSG) da American University College of Arts and Sciences. A CJR recebeu apoio da American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support.
Materials
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| Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU= |
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| Tetra 10 Gallon Fish tank | Petsmart | Item #5271256 | |
| Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in) | Petsmart | Item #5175115 |
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