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Neuroscience

जेब्राफिश में लंबे समय तक हाइपरग्लिमिया का उत्पादन करने के लिए ग्लूकोज में वैकल्पिक विसर्जन

Published: May 5, 2021 doi: 10.3791/61935
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1
1Department of Biology, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University, 3Department of Chemistry, American University

Summary

यह प्रोटोकॉल गैर-8 सप्ताह तक जेब्राफिश में हाइपरग्लाइसेमिया को प्रेरित करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हाइपरग्लाइसीमिया के प्रतिकूल प्रभावों का गहन अध्ययन किया जा सकता है।

Abstract

ज़ेब्राफिश(डैनियो रेरियो)क्रोनिक हाइपरग्लिशेमिया के प्रभावों की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है, जो टाइप II डायबिटीज मेलिटस (टी2डीएम) की एक बानगी है। यह वैकल्पिक विसर्जन प्रोटोकॉल आठ सप्ताह तक हाइपरग्लाइसेमिया को प्रेरित करने का एक गैर-भेदभावपूर्ण, स्टेप-वार विधि है। वयस्क जेब्राफिश बारी-बारी से चीनी (ग्लूकोज) और पानी के लिए 24 घंटे प्रत्येक के लिए उजागर कर रहे हैं । ज़ेब्राफ़िश 2 सप्ताह के लिए 1% ग्लूकोज समाधान में उपचार शुरू करता है, फिर 2 सप्ताह के लिए 2% समाधान, और अंत में शेष 4 सप्ताह के लिए 3% समाधान। पानी का इलाज (तनाव) और मैनिटोल-उपचारित (ओस्मोटिक) नियंत्रण की तुलना में, ग्लूकोज-उपचारित जेब्राफिश में रक्त शर्करा का स्तर काफी अधिक होता है। ग्लूकोज का इलाज करने वाली जेब्राफिश नियंत्रण के 3 गुना के रक्त शर्करा के स्तर को दिखाती है, जिससे यह सुझाव दिया जाता है कि चार और आठ सप्ताह के हाइपरग्लाइसीमिया दोनों के बाद हासिल किया जा सकता है । निरंतर हाइपरग्लिमिया बढ़ी हुई ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) और रेटिना में परमाणु कारक कापा बी (एनएफ-केबी) के स्तर में वृद्धि और शारीरिक प्रतिक्रियाओं में कमी के साथ जुड़ा हुआ था, साथ ही इस प्रोटोकॉल का सुझाव देने वाले संज्ञानात्मक घाटे का उपयोग रोग जटिलताओं को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

जेब्राफिश (डैनियो रेरियो) रोग और अनुभूति दोनों का अध्ययन करने के लिए जल्दी से एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला पशु मॉडल बन रहा है1। प्रारंभिक विकासात्मक चरणों के माध्यम से आनुवंशिक हेरफेर और भ्रूणीय पारदर्शिता की आसानी, उन्हें एक ज्ञात आनुवंशिक आधार के साथ मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख उम्मीदवार बनाती है। उदाहरण के लिए, जेब्राफिश का उपयोग अन्य बीमारियों के बीच होल्ट-ओरम सिंड्रोम, कार्डियोमायोपैथी, ग्लोमेरुलोसिस्टिक किडनी रोग, मस्कुलर डिस्ट्रॉफी और मधुमेह मेलिटस (डीएम) का अध्ययन करने के लिए किया गया है1। इसके अलावा, जेब्राफिश मॉडल प्रजातियों के छोटे आकार, रखरखाव में आसानी और उच्च फेकुंदिटी2,3के कारण आदर्श है।

जेब्राफिश अग्न्याशय दोनों शारीरिक रूप से और कार्यात्मक रूप से स्तनधारी अग्न्याशय4के समान है । इस प्रकार, आकार, उच्च fecundity, और इसी तरह के अंतःस्रावी संरचनाओं की अनूठी विशेषताएं जेब्राफिश को डीएम से संबंधित जटिलताओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त उम्मीदवार बनाती हैं। जेब्राफिश में, लंबे समय तक हाइपरग्लाइसेमिया को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दो प्रयोगात्मक तरीके हैं जो डीएम की विशेषता है: ग्लूकोज (मॉडलिंग टाइप 2) की आमद और इंसुलिन स्राव (मॉडलिंग टाइप 1)5,6की समाप्ति। प्रायोगिक रूप से, इंसुलिन स्राव को रोकने के लिए, अग्नाशय β-कोशिकाओं को रासायनिक रूप से या तो स्ट्रेप्टोज़ोसिन (एसटीजेड) या एलोक्सन इंजेक्शन का उपयोग करके नष्ट किया जा सकता है। एसटीजेड का उपयोग कृंतक और जेब्राफिश में सफलतापूर्वक किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप रेटिनोपैथी7,8,9,संज्ञानात्मक हानि 10 और अंग उत्थान11से जुड़ी जटिलताएं हैं। हालांकि, ज़ेब्राफ़िश में, β-कोशिकाएं उपचार के बाद पुनर्जीवित होती हैं, जिससे एसटीजेड के "बूस्टर इंजेक्शन" मधुमेह की स्थिति को बनाए रखने के लिए आवश्यक हो जाते हैं12। वैकल्पिक रूप से, जेब्राफिश के अग्न्याशय को6हटाया जा सकता है। ये दोनों अत्यधिक आक्रामक प्रक्रियाएं हैं, कई इंजेक्शन के कारण, और व्यापक वसूली समय।

इसके विपरीत, हाइपरग्लाइसीमिया को बहिर्जात ग्लूकोज के संपर्क में आने के माध्यम से गैर-भेदभावपूर्ण रूप से प्रेरित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, मछली 24 घंटे 5, 13 या लगातार 2सप्ताह14,15,16 के लिए एक अत्यधिक केंद्रित ग्लूकोज समाधान में डूबेहुएहैं। बहिर्जात ग्लूकोज को ट्रांसडर्मल रूप से, घूस द्वारा, और/या गहरे नाले के पार ले जाया जाता है जिसके परिणामस्वरूप रक्त शर्करा का स्तर ऊंचा हो जाता है । चूंकि यह गैर-आक्रामक तकनीक सीधे इंसुलिन के स्तर में हेरफेर नहीं करती है, इसलिए यह टाइप 2 डीएम को प्रेरित करने का दावा नहीं कर सकती है। हालांकि, इसका उपयोग हाइपरग्लाइसेमिया द्वारा प्रेरित जटिलताओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो टाइप 2 डीएम के मुख्य लक्षणों में से एक है।

हाल ही में, ज़ेब्राफिश उत्परिवर्ती pdx1-/-अग्नाशय और duodenal होमोबॉक्स 1 जीन, मनुष्यों में टाइप 2 डीएम के आनुवंशिक कारण से जुड़े एक जीन में हेरफेर करके विकसित किया गया था । इस उत्परिवर्ती का उपयोग करते हुए, शोधकर्ता अग्नाशय के विकास व्यवधान, उच्च रक्त शर्करा को दोहराने और हाइपरग्लाइसेमिया-प्रेरित मधुमेह रेटिनोपैथी17, 18का अध्ययन करने में सक्षम रहे हैं।

इस पेपर में, हम एक नॉनइनवेसिव हाइपरग्लिसेमिया प्रेरण विधि का वर्णन करते हैं जो एक वैकल्पिक विसर्जन प्रोटोकॉल का उपयोग करता है। यह प्रोटोकॉल बाद की जटिलताओं के साथ 8 सप्ताह तक हाइपरग्लीसेमिक स्थितियों को बनाए रखता है। संक्षेप में, वयस्क जेब्राफिश को 24 घंटे के लिए चीनी समाधान में रखा जाता है और फिर 24 घंटे के लिए पानी का समाधान किया जाता है। बाहरी ग्लूकोज समाधानों में निरंतर विसर्जन के विपरीत, चीनी और पानी के बीच बारी-बारी से मधुमेह में रक्त शर्करा के उदय और गिरावट की नकल करता है। एक वैकल्पिक ग्लूकोज प्रोटोकॉल अतिरिक्त रूप से हाइपरग्लिसेमिया को लंबे समय तक प्रेरित करने की अनुमति देता है, क्योंकि जेब्राफिश उच्च बाहरी ग्लूकोज की स्थिति की भरपाई करने में सक्षम नहीं है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हम यह दिखाते हुए डेटा प्रदान करते हैं कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रेरित हाइपरग्लाइसीमिया रेटिना रसायन और शरीर विज्ञान को बदल देता है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को अमेरिकी विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. समाधान टैंक तैयार करना

  1. छह टैंक प्राप्त करें, प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह (ग्लूकोज, मैनिटोल और पानी) के लिए दो। दो टैंकों में से एक को लेबल करें 'हाउसिंग टैंक' (यह मछली को घर देगा) और अन्य 'समाधान टैंक' लेबल (यह समाधान रखेगा)।
    नोट: मैनिटॉल उपचार समूह ऑस्मोटिक नियंत्रण है, और जल उपचार समूह एक हैंडलिंग/तनाव नियंत्रण है । यह टैंक, एयरलाइनों/एयरस्टोन, lids, और सफाई की आपूर्ति प्रत्येक उपचार समूह के लिए अलग रखने के लिए महत्वपूर्ण है
  2. यदि उपयोग की जाने वाली मछलियों की कुल संख्या 20 से कम है तो 2 एल टैंक का उपयोग करें। यदि उपयोग की जाने वाली मछलियों की कुल संख्या 20 से अधिक है तो 4 एल टैंक का उपयोग करें।
    नोट: नमूना समय बिंदु प्रति उपचार समूह प्रति 5-10 के एक एन का उपयोग करें ।
  3. पानी का तापमान बनाए रखने के लिए टंकियों को 28-29 डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान में रखें।
  4. 1 दिन पर, मछली को 24 घंटे ('उपचार के लिए पानी' के लिए अपने संबंधित उपचार समाधान (ग्लूकोज, मैनिटोल, पानी) में रखें। 2 दिन पर, मछली को उनके उपचार समाधानों से पानी में 24 घंटे ('उपचार से पानी' के लिए स्थानांतरित करें। 3 दिन पर, मछली को पानी से उपचार समाधान ('उपचार के लिए पानी' में स्थानांतरित करें। यह बारी - बारी जोखिम प्रयोग के शेष के लिए जारी है(चित्रा 1. पानी से शोधित नियंत्रण मछली को रोजाना पानी से पानी में स्थानांतरित करें।
  5. सुनिश्चित करें कि मछली खिलाया और प्रयोग की अवधि के दौरान प्रत्येक दिन एक ही 2 घंटे की खिड़की के भीतर स्थानांतरित कर रहे हैं ।

2. मछली तैयार करना

  1. वयस्क जेब्राफिश (4 महीने - 1 वर्ष)5का उपयोग करें ।
  2. प्रयोगशाला में पहुंचने पर मछली की जमीन टेट्रामिन गुच्छे को प्रतिदिन खिलाएं।
  3. पीएच और सभी टैंकों के तापमान को रिकॉर्ड करें और मछली की सामान्य स्थिति को रिकॉर्ड करें।

3. मछली स्थानांतरित करना

  1. एक मानक मछली नेट का उपयोग कर इसी समाधान टैंक के लिए आवास टैंक से प्रत्येक उपचार समूह में मछली हस्तांतरण।
  2. मछली युक्त टैंक को पानी के स्नान में वापस रखें, एयरस्टोन और टैंक ढक्कन को बदलें। यह टैंक अब 'आवास टैंक' है और टैंक जो पहले मछली को आयोजित करता था, अब 'समाधान टैंक' है।
  3. पुराने समाधान को त्यागें और टैंक के ढक्कन, एयरलाइंस, एयरस्टोन और जाल के साथ टैंक को साफ करें ताकि ग्लूकोज और मैनिटॉल के बिल्डअप को रोका जा सके।
    नोट: साबुन से आइटम न धोएं। टैंकों को ठीक से साफ करने के लिए प्रत्येक उपचार स्थिति के लिए पानी और एक समर्पित स्क्रब ब्रश/स्पंज का उपयोग करें।
  4. एक कागज तौलिया के साथ नए साफ 'समाधान टैंक' सूखी। इस टैंक का उपयोग करके अगले दिन के लिए समाधान तैयार करें। सुनिश्चित करें कि अन्य वस्तुओं को उचित उपचार समूहों द्वारा सुखा और अलग किया गया है।
    नोट: मछली के बाहर और प्रत्येक दिन में किन समाधानों को स्थानांतरित किया जा रहा है, साथ ही अगले दिन के लिए तैयार किए गए समाधानों का एक लॉग रखें। उदाहरण के लिए: मछली ग्लूकोज से एच2ओ, नई 1% ग्लूकोज समाधान कल के लिए तैयार करने के लिए स्थानांतरित कर दिया ।

4. स्थानांतरण के बाद समाधान की तैयारी

  1. चीनी समाधान तैयार करना
    1. सिस्टम वॉटर के 2 एल (या 4 एल) के साथ प्रत्येक समाधान टैंक को भरें (सिस्टम पानी को पानी के रूप में परिभाषित किया गया है जिसे नमक समाधान के सही अनुपात के साथ माना गया है और स्टॉक और उपचार टैंक के समान तापमान पर है)।
    2. ग्लूकोज और मैनिटॉल की सही मात्रा को मापें (नीचे चरण 5 देखें) एक शीर्ष लोडिंग स्केल और प्रत्येक रसायन के लिए अलग वजन नौकाओं का उपयोग करके।
    3. तौला ग्लूकोज या mannitol aliquot उचित, साफ समाधान टैंक है, जो केवल प्रणाली पानी शामिल करने के लिए जोड़ें ।
    4. ग्लूकोज और मैनिटॉल समाधान को अलग-अलग ग्लास हलचल छड़ के साथ हिलाएं जब तक कि शर्करा पूरी तरह से भंग न हो जाए।
    5. पानी स्नान करने के लिए समाधान टैंक वापसी और उनके इसी lids के साथ कवर।
  2. पानी के समाधान की तैयारी
    1. सिस्टम वॉटर के साथ प्रायोगिक टैंक (2 एल या 4 एल) भरें।
    2. इन 'समाधान टैंक' को पानी स्नान में वापस करें और उनके संबंधित ढक्कन के साथ कवर करें।

5. बदलते प्रतिशत

  1. उपचार के पहले 2-सप्ताह के दौरान मछली को 1% समाधान में बनाए रखें: 4 एल टैंक में 40 ग्राम ग्लूकोज या मैनिटॉल।
  2. उपचार के 3 और 4 सप्ताह के दौरान 2% समाधान में मछली को बनाए रखें: 4 एल टैंक में 80 ग्राम ग्लूकोज या मैनिटॉल।
  3. उपचार के अंतिम 4 सप्ताह के लिए 3% समाधान में मछली को बनाए रखें: 4 एल टैंक में 120 ग्राम ग्लूकोज या मैनिटॉल।

6. रक्त शर्करा के स्तर को मापने और ऊतक का संग्रह

  1. एक समय में 0.02% ट्राइकेन समाधान में मछली 2 एनेस्थेटाइज करें।
  2. एक रेज़रब्लेड का उपयोग करके मछली को सीधे गिलों के पीछे हटा दें।
  3. रक्त शर्करा मूल्य को मापें।
    नोट: हम रक्त ग्लूकोज को मापने के लिए रक्त ग्लूकोज मीटर (जैसे, फ्रीस्टाइल लाइट) का उपयोग करते हैं और परीक्षण पट्टी को सीधे उजागर दिल (हृदय रक्त नमूना) पर रखें।
  4. मछली (मस्तिष्क, मांसपेशी, आदि) से वांछित ऊतक विच्छेदन।
  5. सूखी बर्फ पर फ्लैश फ्रीजिंग और एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में भंडारण, 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड में फिक्सिंग, या तत्काल उपयोग के लिए एक बफर समाधान में रखने के द्वारा एकत्र ऊतकों की दुकान ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल(चित्रा 1)का उपयोग करना, रक्त शर्करा मूल्यों को 4 सप्ताह और 8-सप्ताह के उपचार(चित्रा 2 ए)के बाद काफी ऊंचा किया जाता है, जिसमें हाइपरग्लाइसीमिया को 3x के रूप में परिभाषित किया जाता है, जो पानी के इलाज और मैनिटोल-उपचारित समूहों दोनों से नियंत्रण औसत है। पानी से शोधित नियंत्रणों को प्रतिदिन पानी के और बाहर स्थानांतरित किया जाता है, जो तनाव/हैंडलिंग नियंत्रण प्रदान करता है । मैनिटॉल इन विट्रो ग्लूकोज अध्ययन19,20में एक ऑस्मोटिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, क्योंकि यह ग्लूकोज की तरह 6 कार्बन वाली चीनी है लेकिन कोशिकाओं द्वारा नहीं लिया जाता है। उन अध्ययनों के अनुरूप होने के लिए, और जेब्राफिश21में अन्य अध्ययनों, हमने यह निर्धारित करने के लिए ग्लूकोज के समान सांद्रता में मैनिटॉल को प्रशासित किया कि क्या देखा गया प्रभाव ग्लूकोज जोखिम या ग्लूकोज-विशिष्ट प्रभाव के परिणामस्वरूप उच्च ऑसोलार्किटी के कारण था।

रक्त शर्करा को 0.02% ट्राइकेन का उपयोग करके मछली को एनेस्थेटाइज करके मापा जाता है जब तक कि गिल आंदोलन धीमा न हो जाए, और फिर decapitating न हो। रक्त शर्करा का स्तर, एक रक्त ग्लूकोज मीटर(चित्रा 2B)के साथ मापा जाता है, ग्लूकोमीटर परीक्षण पट्टी सीधे पंचर दिल (यानी, हृदय रक्त) पर रखने से निर्धारित कर रहे हैं ।

हाइपरग्लाइसेमिया के 4-सप्ताह के बाद एकत्र किए गए रेटिना ऊतक ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) के स्तर(चित्र 3 ए)में वृद्धि प्रदर्शित करता है। रेटिना में मुलर ग्लियल कोशिकाओं में जीएफएपी अभिव्यक्ति देखी जाती है, जो मधुमेह रेटिनोपैथी22, 23में बदल जाती है। एसटीजेड-प्रेरित मधुमेह चूहों24, 25, 26, 27,28, पीडीएक्स1-/-उत्परिवर्ती मछली17और मधुमेह मनुष्यों से रेटिनास में29से बढ़ी हुई जीएफएपी सामग्री और/या इम्यूनोरेएक्टिविटी पैटर्न भी देखे जाते हैं । जीएफएपी में यह वृद्धि परमाणु कारक कापा बी (एनएफ-केबी) स्तर(चित्रा 3 बी)30में वृद्धि से जुड़ी है, जो वैकल्पिक विसर्जन प्रोटोकॉल का उपयोग करके जेब्राफिश में प्रेरित हाइपरग्लीसेमिया का सुझाव देता है, एक भड़काऊ प्रतिक्रिया और प्रतिक्रियाशील ग्लियोसिस को ट्रिगर करता है। उपचार के 4 सप्ताह के बाद ईआरजी रिकॉर्डिंग ने मैनिटोल-उपचारित नियंत्रण(चित्रा 4A)की तुलना में ग्लूकोज-इलाज रेटिना में कम प्रतिक्रिया की पहचान की। हाइपरग्लिसेमिक मछली(चित्रा 4 बी)में ए-वेव (फोटोरिसेप्टर) और बी-वेव (बाइपोलर सेल) दोनों के आयामों में कमी आई है। ये परिवर्तित ईआरजी प्रतिक्रियाएं लाल और/या हरे शंकु30,21में विशिष्ट परिवर्तनों से सहसंबद्ध हैं, जो विशेष रूप से हाइपरग्लाइसेमिक अपमान के प्रति संवेदनशील दिखाई देते हैं । मधुमेह31, 32, 33,34, 35और मधुमेह के मानव के पशुमॉडलोंमें परिवर्तित ईआरजी प्रतिक्रियाएं भी देखी जाती हैं। ग्लूकोज-इलाज जेब्राफिश भी संज्ञानात्मक प्रदर्शन में कमी दिखा (रोवे एट अल देखें, २०२०, इस मुद्दे में), लंबे समय तक हाइपरग्लाइसीमिया का सुझाव भी संज्ञानात्मक समारोह घाटे जो भी पुराने मधुमेह रोगियों में रिपोर्ट की ओर जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: वैकल्पिक विसर्जन प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध। यह स्थानांतरण प्रक्रिया का एक दृश्य प्रतिनिधित्व है। मछली को 2-सप्ताह के लिए 1% समाधान में बनाए रखा जाता है, 2 सप्ताह के लिए 2% समाधान, और फिर शेष 4 हफ्तों के लिए 3% समाधान। प्रत्येक दिन, मछली या तो चीनी या पानी के समाधान में स्थानांतरित कर रहे हैं । नियंत्रण उपचार में और पानी के बाहर मछली हस्तांतरण (0% ग्लूकोज-हैंडलिंग नियंत्रण) हर 24 घंटे में या में और mannitol (ओस्मोटिक नियंत्रण) के बाहर, mannitol सांद्रता ग्लूकोज के लिए इस्तेमाल किया उन समानांतर के साथ । हम रक्त शर्करा के स्तर को मापा है, प्रयोगों प्रदर्शन किया है, और उपचार के 4 और 8 सप्ताह के बाद ऊतक एकत्र (बॉक्स्ड) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: उपचार के 4 और 8 सप्ताह के बाद रक्त शर्करा का स्तर ऊंचा होता है। (क)ग्लूकोज से उपचारित मछली में पानी की तुलना में रक्त शर्करा की मात्रा 3x से अधिक होती है-और मैनिटोल-उपचारित नियंत्रण मछली, एक महत्वपूर्ण वृद्धि (पी = 0.029 4 सप्ताह में; पी < 0.001 8 सप्ताह में)। इसका मतलब यह है कि दोनों 4 और 8 सप्ताह के बाद ग्लूकोज के साथ इलाज जेब्राफिश हाइपरग्लीसेमिक थे । डेटा n = 5 mannitol इलाज मछली, एन = 8 ग्लूकोज का इलाज मछली, और n = 3 पानी नियंत्रण मछली से 4 सप्ताह में एकत्र किए गए थे; n = 5 मैनिटोल-उपचारित मछली, एन = 10 ग्लूकोज-उपचारित मछली, और एन = 7 पानी का इलाज मछली 8 सप्ताह में। (ख)एक जेब्राफिश और फ्रीस्टाइल लाइट ब्लड ग्लूकोज मीटर का एक दृश्य प्रतिनिधित्व जिसका उपयोग हम रक्त शर्करा के स्तर को मापने के लिए करते हैं । रक्त शर्करा के स्तर को कार्डियक रक्त के नमूने से मापा जाता है क्योंकि मछली को 0.02% ट्राइकेन समाधान में एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और काटना होता है। मानों का मतलब है ± एसई. एस्टेरिस महत्वपूर्ण मतभेदों को दर्शाता है जहां * = पी < ०.०५; = पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: ग्लूकोज-इलाज जेब्राफिश में जीएफएपी का स्तर बढ़ जाता है। ग्लूकोज-उपचारित जेब्राफिश में पश्चिमी ब्लॉट्स के घनत्व विश्लेषण से निर्धारित(ए)ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी; 1:1000) और(बी)एनएफके-बी; 1:1:000) के स्तर में वृद्धि हुई है । β-ऐक्टिन (1:1000) लोडिंग कंट्रोल के रूप में कार्य करता था। रिलायंस एनर्जी-ए के स्तर में वृद्धि महत्वपूर्ण थी (पी < ०.००३, तारक) । W = पानी का इलाज नियंत्रण, जी = ग्लूकोज-उपचारित, एम = मैनिटोल-उपचारित। W2, G2, M2 डब्ल्यू, जी और एम के लिए प्रतिकृति हैं। इससे पता चलता है कि हाइपरग्लाइसेमिक जेब्राफिश में रेटिना का अपमान होता है जो प्रतिक्रियाशील ग्लियोसिस का कारण बनता है। (चित्रा 7से संशोधित, तनवीर एट अल., 201830,मूल रूप से सीसी-बाय लाइसेंस की शर्तों के तहत प्रकाशित) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ईआरजी प्रतिक्रिया ग्लूकोज-इलाज मछली में कम हो जाती है। (A)ग्लूकोज-उपचारित (लाल), मैनिटोल-उपचारित (हरा), और पानी का इलाज (काला) जेब्राफिश रेटिना से प्रतिनिधि ईआरजी निशान एक लाल अनुकूल पृष्ठभूमि पर 570nm उत्तेजना के साथ पैदा किया । ग्लूटामेट रिसेप्टर अवरोधक सीएनक्यूएक्स (50μM) फोटोरिसेप्टर और बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाओं को अलग करने के लिए स्नान समाधान में मौजूद था। इकाइयां: वाई-एक्सिस = μV, एक्स-एक्सिस = समय। वर्ग तरंग नाड़ी प्रकाश नाड़ी की अवधि को दर्शाती है। (ख)प्रतिक्रिया आयामों में परिवर्तन की मात्रा । फोटोरिसेप्टर ए-वेव्स (a1 आयाम, दाएं) के लिए सामान्यीकृत प्रतिक्रिया आयाम का मतलब, वर्ग प्रकाश नाड़ी की शुरुआत में चोटी के नीचे विक्षेप के रूप में मापा जाता है, और द्विध्रुवी कोशिका बी-तरंगें (बी 2 आयाम, बाएं), प्रकाश नाड़ी के दौरान गर्त से चोटी तक मापा जाता है। दोनों मूल्यों को ग्लूकोज बनाम मैनिटोल-उपचारित ऊतकों (पी < 0.001 a1 के लिए; पी < 0.0001 b2 के लिए; n = 14 आंखें प्रति उपचार) में काफी कमी आई थी। मानों को पानी से शोधित नियंत्रण में सामान्य किया गया था । यह अन्य मधुमेह पशु मॉडल (जैसे कृंतक) और मधुमेह वाले मनुष्यों में के अनुरूप है। (चित्रा 4 से लिया गया, तनवीर एट अल 201830,मूल रूप से सीसी-बाय लाइसेंस की शर्तों के तहत प्रकाशित) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

मधुमेह एक राष्ट्रव्यापी समस्या है। अध्ययनों से पता चलता है कि २०३० तक, एक अनुमान के अनुसार ४००,०,० लोगों को मधुमेह के कुछ फार्म का होगा । कृंतक मॉडल में, टाइप 2 डीएम आनुवंशिक हेरफेर का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है। चूहों में जुकर डायबिटिक फैटी चूहे (जेडडीएफ), और ओत्सुका लांग-इवांस टोकुशिमा फैटी चूहे (ओलेटफ), टाइप 2 डीएम10के प्रभावों के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर रहे हैं । इसके अलावा, हाइपरग्लाइसेमिया को प्रेरित करने के लिए कृंतक में उच्च वसा वाले आहार का उपयोग किया गया है। यह इस पत्र में प्रस्तावित गैर-आवास प्रक्रिया को प्रतिबिंबित करता है। हमारे गैर-इनवसिव प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम हाइपरग्लाइसेमिया को 8-सप्ताह तक प्रेरित कर सकते हैं, इसलिए अन्यथा स्वस्थ जेब्राफिश में लंबे समय तक हाइपरग्लाइसेमिया का अनुकरण कर सकते हैं।

रक्त शर्करा मापा जाता है के बाद, ऊतक (रेटिना और मस्तिष्क) बाद में विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है। इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (ईआरजी) रिकॉर्डिंग जैसे शारीरिक मतभेदों को सीधे रेटिना नेत्र कप21,30से मापा जा सकता है। उपचार प्रतिक्रियाओं (यानी, ऑप्टोमोटर प्रतिक्रियाओं या संज्ञानात्मक मतभेद (रोवे एट अल, 2020) का मूल्यांकन रक्त शर्करा माप से पहले किया जा सकता है। प्रोटीन के स्तर के पश्चिमी दाग निर्धारण के लिए, ऊतक को रिपा बफर या फ्लैश फ्रोजन में रखा जाता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। आकार/प्रोटीन सामग्री में अंतर के कारण, कई रेटिना विश्लेषण से पहले जमा किया जा सकता है । इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए, ऊतक को 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान में तय किया जाता है और फिर जमे हुए सेक्शनिंग (20 माइक्रोन) तक 30% सुक्रोज समाधान में समतुल्य होता है।

परिणामों को अनुकूलित करने के लिए, ध्यान से मैनिटोल और ग्लूकोज दोनों का वजन करें, और सुनिश्चित करें कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित हैं। यह भी बहुत महत्वपूर्ण है हस्तांतरण दिनों के एक सक्रिय अनुसूची रखने के लिए, सुनिश्चित करें कि चीनी और पानी दैनिक बारी और दिन के एक ही समय में कर रहे हैं । इसके अलावा, ध्यान से पानी को मापने के रूप में बहुत कम या बहुत ज्यादा समाधान की एकाग्रता बदल सकता है सुनिश्चित करें । अंत में, ध्यान से पीएच और समाधान के तापमान की निगरानी, चरम समाधान में मछली स्थानांतरित करने के रूप में मछली सदमे और मृत्यु का कारण बन सकता है । इस बात का कोई सबूत नहीं है कि ग्लूकोज के लंबे समय तक जोखिम या ग्लूकोज की उच्च सांद्रता, जब धीरे-धीरे उजागर होती है, तो जेब्राफिश पर विषाक्त प्रभाव पड़ता है। यदि प्रोटोकॉल का सही ढंग से पालन किया जाता है, तो जेब्राफिश की कोई बाहरी मौतों की उम्मीद नहीं की जानी चाहिए।

हालांकि यह हाइपरग्लाइसेमिया को प्रेरित करने का एक सिद्ध तरीका है, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि कोई यह पता नहीं लगा सकता कि मछली बलिदान करने के बाद तक हाइपरग्लाइसेमिक हैं। एक और सीमा यह है कि हम अग्न्याशय या इंसुलिन के स्तर का आकलन नहीं करते हैं और इसलिए, हम टाइप 2 मधुमेह को प्रेरित करने का दावा नहीं कर सकते हैं, केवल यह कि हम हाइपरग्लाइसीमिया को प्रेरित करते हैं। हालांकि, यह भी है जो इस प्रक्रिया को प्रतिस्पर्धी तरीकों से बेहतर बनाता है: यह गैर आक्रामक है । हमने कृंतक मॉडल और मधुमेह व्यक्तियों में रिपोर्ट किए गए इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रेरित लंबे समय तक हाइपरग्लाइसीमिया की जटिलताओं को देखा है। भविष्य में, यह संभव है कि हम इस प्रक्रिया का उपयोग चिकित्सीय तकनीकों को देखने के लिए कर सकते हैं जो डीएम के लक्षणों को कम करने में मदद करते हैं, जैसे रेटिनोपैथी।

संक्षेप में, यह गैर-निवास बारी विसर्जन प्रोटोकॉल 8 सप्ताह तक हाइपरग्लाइसेमिया को प्रेरित करने का एक प्रभावी तरीका है। यह विधि एक शक्तिशाली उपकरण है जो क्रोनिक हाइपरग्लाइसेमिया की जटिलताओं की जांच करने और चिकित्सीय उपचार के बाद के निर्धारण की अनुमति देता है। यह मॉडल जीवों में जैव चिकित्सा अनुसंधान निष्कर्षों की तुलना करने का अवसर भी प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए वीपीसी, सीजेआर और एमसीपी को स्वीकार करना चाहते हैं। EMM इस शोध को पूरा करने के लिए अमेरिकन यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ आर्ट्स एंड साइंसेज ग्रेजुएट स्टूडेंट सपोर्ट से वित्तीय सहायता प्राप्त की । इस काम को अमेरिकन यूनिवर्सिटी फैकल्टी मेलन अवार्ड और अमेरिकन यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ आर्ट्स एंड साइंसेज (दोनों वीपीसी) के माध्यम से फंडिंग द्वारा भी समर्थन दिया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airline Tubing petsmart 5291863 This can be used in the tank to circulate air
Airpump petsmart 5094984 This can be used in the tank to circulate air
Airstones petsmart 5149683 This can be used in the tank to circulate air
D-glucose Sigma G8270-5KG
D-mannitol Acros Organics AC125340050
Freestyle Lite Meter Amazon B01LMOMLTU
Freestyle Lite Strips Amazon B074ZN3H2Z
Net petsmart 5175115
Tanks Amazon B0002APZO4

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रिऐक्शन अंक 171 डैनियो रेरियो, हाइपरग्लाइसेमिया,ग्लूकोज रेटिनोपैथी वैकल्पिक विसर्जन
जेब्राफिश में लंबे समय तक हाइपरग्लिमिया का उत्पादन करने के लिए ग्लूकोज में वैकल्पिक विसर्जन
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McCarthy, E., Rowe, C. J., Crowley-Perry, M., Connaughton, V. P. Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e61935, doi:10.3791/61935 (2021).

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