Summary
Ce protocole induit non envahissantement l’hyperglycémie chez le poisson zèbre pendant jusqu’à 8 semaines. À l’aide de ce protocole, une étude approfondie des effets indésirables de l’hyperglycémie peut être réalisée.
Abstract
Le poisson zèbre (Danio rerio) est un excellent modèle pour étudier les effets de l’hyperglycémie chronique, une caractéristique du diabète sucré de type II (DT2). Ce protocole alternatif d’immersion est une méthode non envahissante et pas à pas d’induire l’hyperglycémie pendant jusqu’à huit semaines. Les poissons zèbres adultes sont alternativement exposés au sucre (glucose) et à l’eau pendant 24 heures chacun. Le poisson zèbre commence le traitement dans une solution de glucose à 1% pendant 2 semaines, puis une solution à 2% pendant 2 semaines et enfin une solution à 3% pendant les 4 semaines restantes. Comparé aux contrôles traités à l’eau (stress) et traités au mannitol (osmotique), les poissons zèbres traités au glucose ont des niveaux de sucre dans le sang significativement plus élevés. Le poisson zèbre glucose-traité montre des niveaux de sucre dans le sang de 3 fois celui des contrôles, suggérant qu’après quatre et huit semaines hyperglycémie puisse être réalisée. L’hyperglycémie soutenue a été associée à la protéine acide fibrillaire glial accrue (GFAP) et aux niveaux nucléaires accrus du facteur Kappa B (N-F-kB) dans la rétine et aux réponses physiologiques diminuées, ainsi qu’aux déficits cognitifs suggérant que ce protocole puisse être employé pour modéliser des complications de la maladie.
Introduction
Le poisson zèbre (Danio rerio) devient rapidement un modèle animal largement utilisé pour étudier à la fois la maladie et la cognition1. La facilité de la manipulation génétique et la transparence embryonnaire à travers les premiers stades de développement, en font un candidat de choix pour étudier les maladies humaines avec une base génétique connue. Par exemple, le poisson zèbre a été utilisé pour étudier le syndrome de Holt-Oram, les cardiomyopathies, les maladies rénales glomérulokystiques, la dystrophie musculaire et le diabète sucré (DM) parmi d’autres maladies1. De plus, le modèle du poisson zèbre est idéal en raison de la petite taille de l’espèce, de sa facilité d’entretien et de sa fécondité élevée2,3.
Le pancréas du poisson zèbre est à la fois anatomiquement et fonctionnellement similaire au pancréas des mammifères4. Ainsi, les caractéristiques uniques de taille, de fécondité élevée et de structures endocriniennes similaires font du poisson zèbre un candidat approprié pour étudier les complications liées au DM. Chez le poisson zèbre, il existe deux méthodes expérimentales utilisées pour induire l’hyperglycémie prolongée qui est caractéristique du DM : un afflux de glucose (modélisation de type 2) et l’arrêt de la sécrétion d’insuline (modélisation de type 1)5,6. Expérimentalement, pour arrêter la sécrétion d’insuline, les cellules β pancréatiques peuvent être détruites chimiquement à l’aide d’injections de streptozotocine (STZ) ou d’alloxane. STZ a été utilisé avec succès chez les rongeurs et les poissons zèbres, entraînant des complications associées à la rétinopathie7,8,9,troubles cognitifs10et à la régénération des membres11. Cependant, chez le poisson zèbre, les cellules β se régénèrent après le traitement, ce qui rend nécessaires des « injections de rappel » de STZ pour maintenir des conditions diabétiques12. Alternativement, le pancréas du poisson zèbre peut être enlevé6. Ce sont deux procédures très invasives, en raison des injections multiples, et le temps de récupération étendu.
Réciproquement, l’hyperglycémie peut être induite non envahissante par l’exposition au glucose exogène. Dans ce protocole, les poissons sont immergés dans une solution de glucose hautement concentrée pendant 24 heures5,13 ou continuellement pendant 2 semaines14,15,16. Le glucose exogène est pris par voie transdermique, par ingestion et/ou à travers les branchies, ce qui entraîne une glycémie élevée. Puisque cette technique non envahissante ne manipule pas directement des niveaux d’insuline, elle ne peut pas prétendre induire le DM de type 2. Cependant, il peut être utilisé pour examiner les complications induites par l’hyperglycémie, qui est l’un des principaux symptômes du DM de type 2.
Récemment, le mutant du poisson zèbre pdx1-/- a été développé en manipulant le gène de l’homéobox 1 pancréatique et duodénal, un gène lié à la cause génétique du DM de type 2 chez l’homme. En utilisant ce mutant, les chercheurs ont pu reproduire la perturbation du développement pancréatique, l’hyperglycémie et étudier la rétinopathie diabétique induite par l’hyperglycémie17,18.
En ce document, nous décrivons une méthode non envahissante d’induction d’hyperglycémie qui emploie un protocole alternatif d’immersion. Ce protocole maintient des conditions hyperglycemic pendant jusqu’à 8 semaines avec des complications suivantes observées. En bref, les poissons zèbres adultes sont placés dans une solution de sucre pendant 24 heures, puis dans une solution aqueuse pendant 24 heures. Contrairement à l’immersion continue dans des solutions de glucose externes, l’alternance de jours entre le sucre et l’eau imite la montée et la chute de la glycémie dans le diabète. Un protocole de glucose alternatif permet en outre à l’hyperglycémie d’être induite pendant de plus longues périodes de temps, car les poissons zèbres ne sont pas aussi capables de compenser les conditions de glucose externe élevées. Comme preuve de principe, nous fournissons des données 444 40000 10000.As proof of principle, we provide data showing that hyperglycemia induced using this protocol alters retinal chemistry and physiology.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’American University.
1. Préparation des réservoirs de solution
- Obtenir six réservoirs, deux pour chaque groupe expérimental (glucose, mannitol et eau). Étiquetez l’un des deux réservoirs « réservoir de logement » (il abritera le poisson) et étiquetez l’autre « réservoir de solution » (il contiendra la solution).
REMARQUE: Le groupe de traitement mannitol est le contrôle osmotique, et le groupe de traitement de l’eau est un groupe de manipulation / stress. Il est important de garder les réservoirs, les compagnies aériennes / pierres à air, les couvercles et les fournitures de nettoyage séparés pour chaque groupe de traitement - Utilisez un réservoir de 2 L si le nombre total de poissons utilisés est inférieur à 20. Utilisez un réservoir de 4 L si le nombre total de poissons utilisés est supérieur à 20.
NOTA : Utilisez un N de 5 à 10 par groupe de traitement et par point de temps d’échantillonnage. - Gardez les réservoirs dans un bain-marie à 28-29 °C pour maintenir la température de l’eau.
- Le jour 1, placez les poissons dans leurs solutions de traitement respectives (glucose, mannitol, eau) pendant 24 heures (« Water to Treatment »). Le jour 2, transférer les poissons de leurs solutions de traitement à l’eau pendant 24 heures (« Traitement à l’eau »). Le jour 3, transférer le poisson de l’eau vers des solutions de traitement (« Eau à traitement »). Cette exposition alternée se poursuit pour le reste de l’expérience (Figure 1). Transférer quotidiennement des poissons témoins traités à l’eau de l’eau à l’eau.
- Assurez-vous que les poissons sont nourris et transférés dans la même fenêtre de 2 heures chaque jour pendant toute la durée de l’expérience.
2. Préparation du poisson
- Utilisez le poisson zèbre adulte (4 mois – 1 an)5.
- Nourrissez les flocons de Tetramin au sol tous les jours à votre arrivée au laboratoire.
- Notez le pH et la température de tous les réservoirs et notez l’état général du poisson.
3. Transfert de poisson
- Transférer les poissons de chaque groupe de traitement du réservoir de logement au réservoir de solution correspondant à l’aide d’un filet à poisson standard.
- Replacez le réservoir contenant le poisson dans le bain-marie, remplacez la pierre à air et le couvercle du réservoir. Ce réservoir est maintenant le « réservoir de logement » et le réservoir qui contenait auparavant le poisson est maintenant le « réservoir de solution ».
- Jetez l’ancienne solution et nettoyez le réservoir, ainsi que les couvercles du réservoir, les compagnies aériennes, les pierres à air et les filets pour éviter l’accumulation de glucose et de mannitol.
REMARQUE: Ne pas laver les articles avec du savon. Utilisez de l’eau et une brosse/éponge de gommage dédiée pour chaque condition de traitement afin de nettoyer correctement les réservoirs. - Séchez les « réservoirs de solution » nouvellement nettoyés avec une serviette en papier. Préparez les solutions pour le lendemain en utilisant ce réservoir. Assurez-vous que les autres articles sont séchés et séparés par des groupes de traitement appropriés.
REMARQUE : Tenez un registre des solutions que les poissons sont transférés chaque jour, ainsi que des solutions préparées pour le lendemain. Par exemple : Poisson transféré du glucose àH2O,nouvelle solution de glucose à 1% préparée pour demain.
4. Préparation de la solution post-transfert
- Préparation de solutions de sucre
- Remplissez chaque réservoir de solution avec 2 L (ou 4 L) d’eau du système (l’eau du système est définie comme de l’eau qui a été traitée avec le bon rapport de solution saline et qui est à la même température que les réservoirs de stock et de traitement).
- Mesurez la quantité correcte de glucose et de mannitol (voir l’étape 5 ci-dessous) à l’aide d’une balance de chargement supérieure et de bateaux de pesage séparés pour chaque produit chimique.
- Ajouter la partie aliquote de glucose ou de mannitol pesée au réservoir de solution nettoyé approprié, qui ne contient que de l’eau du système.
- Agiter les solutions de glucose et de mannitol avec des tiges de verre séparées jusqu’à ce que les sucres soient complètement dissous.
- Retournez les réservoirs de solution au bain-marie et couvrez-les de leurs couvercles correspondants.
- Préparation de solutions d’eau
- Remplissez les réservoirs expérimentaux (2 L ou 4 L) avec de l’eau système.
- Retournez ces « réservoirs de solution » au bain-marie et recouvrez-les de leurs couvercles correspondants.
5. Évolution des pourcentages
- Maintenir le poisson dans une solution à 1% pendant les 2 premières semaines de traitement: 40 g de glucose ou de mannitol dans un réservoir de 4 L.
- Maintenir le poisson dans une solution à 2% pendant les semaines 3 et 4 du traitement: 80 g de glucose ou de mannitol dans un réservoir de 4 L.
- Maintenir le poisson dans une solution à 3% pendant les 4 dernières semaines de traitement: 120 g de glucose ou de mannitol dans un réservoir de 4 L.
6. Mesurer la glycémie et recueillir les tissus
- Anesthésier le poisson 2 à la fois dans une solution de tricaine à 0,02%.
- Décapiter le poisson directement derrière les branchies à l’aide d’une lame de rasoir.
- Mesurer la valeur de la glycémie.
REMARQUE: Nous utilisons un lecteur de glycémie (par exemple, Freestyle Lite) pour mesurer la glycémie et placer la bandelette de test directement sur le cœur exposé (échantillon de sang cardiaque). - Disséquer le tissu recherché du poisson (cerveau, muscle, etc.).
- Entreposer les tissus recueillis en les congelant instantanément sur de la glace carbonique et en les stockant dans un congélateur à -80 °C, en les fixant dans du paraformaldéhyde à 4 % ou en les plaçant dans une solution tampon pour une utilisation immédiate.
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Representative Results
En utilisant ce protocole(figure 1),les valeurs de sucre dans le sang sont significativement élevées après 4 semaines et 8 semaines de traitement(figure 2A),l’hyperglycémie étant définie comme 3 fois les moyennes de contrôle des groupes traités à l’eau et traités au mannitol. Les témoins traités à l’eau sont transférés quotidiennement dans et hors de l’eau, ce qui fournit un contrôle du stress et de la manipulation. Le mannitol sert de contrôle osmotique dans les études de glucose in vitro19,20,car il s’agit d’un sucre à 6 carbones comme le glucose mais n’est pas repris par les cellules. Pour être cohérents avec ces études, et d’autres études chez le poissonzèbre 21,nous avons administré du mannitol aux mêmes concentrations que le glucose pour déterminer si les effets observés étaient dus à l’osmolarité élevée résultant de l’exposition au glucose ou d’un effet spécifique au glucose.
La glycémie est mesurée en anesthésiant le poisson à l’aide de 0,02% de tricaine jusqu’à ce que les mouvements des branchies aient ralenti, puis en décapitant. Les niveaux de glucose sanguin, mesurés à l’aide d’un lecteur de glycémie(figure 2B),sont déterminés en plaçant la bandelette de test du glucomètre directement sur le cœur perforé (c.-à-d. le sang cardiaque).
Le tissu rétinien prélevé après 4 semaines d’hyperglycémie affiche une augmentation des niveaux de protéines acides fibrillaires gliales (GFAP) (Figure 3A). L’expression de GFAP est observée dans les cellules gliales de Muller dans la rétine, qui sont altérées dans la rétinopathie diabétique22,23. On observe également une augmentation de la teneur en GFAP et/ou des profils d’immunoréactivité chez les rats diabétiques induits par STZ24,25, 26,27, 28, pdx1-/- poissons mutants17,et chez les rétines des humains diabétiques29. Cette augmentation du GFAP est associée à une augmentation des niveaux de Kappa B (NF-kB) du facteur nucléaire (Figure 3B)30, ce qui suggère que l’hyperglycémie induite chez le poisson zèbre à l’aide du protocole d’immersion alternatif déclenche une réponse inflammatoire et une gliose réactive. Les enregistrements d’ERG après 4 semaines de traitement ont identifié une diminution de la réponse dans les rétines traitées au glucose par rapport aux témoins traités au mannitol (figure 4A). Les amplitudes des composants de l’onde a (photorécepteur) et de l’onde b (cellules bipolaires) sont diminuées chez les poissons hyperglycémiques(figure 4B). Ces réponses altérées d’ERG sont corrélées aux changements spécifiques des cônes rouges et/ou verts30,21,qui semblent particulièrement sensibles à l’insulte hyperglycémique. Des réponses altérées d’ERG sont également observées dans des modèles animaux de diabète31,32,33,34,35 et les humains diabétiques. Les poissons zèbres traités au glucose montrent également une diminution des performances cognitives (voir Rowe et al., 2020, dans ce numéro), ce qui suggère qu’une hyperglycémie prolongée entraîne également des déficits de la fonction cognitive, ce qui est également signalé chez les patients diabétiques plus âgés.
Figure 1 : Schéma du protocole d’immersion alternatif. Il s’agit d’une représentation visuelle du processus de transfert. Les poissons sont maintenus en solution à 1% pendant 2 semaines, en solution à 2% pendant 2 semaines, puis en solution à 3% pendant les 4 semaines restantes. Chaque jour, les poissons sont transférés dans une solution de sucre ou d’eau. Les traitements témoins transfèrent les poissons dans et hors de l’eau (0% de glucose - contrôle de manipulation) toutes les 24 heures ou dans et hors du mannitol (contrôle osmotique), avec des concentrations de mannitol parallèles à celles utilisées pour le glucose. Nous avons mesuré des niveaux de glucose sanguin, réalisé des expériences, et recueilli le tissu après 4 et 8 semaines de traitement (encadré). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : La glycémie est élevée après 4 et 8 semaines de traitement. (A) Les poissons traités au glucose ont plus de 3 fois la quantité de sucre dans le sang par rapport aux poissons témoins traités à l’eau et au mannitol, une augmentation significative (p = 0,029 à 4 semaines; p < 0,001 à 8 semaines). Cela signifie qu’après 4 et 8 semaines, le poisson zèbre traité avec du glucose était hyperglycémique. Des données ont été rassemblées de n = 5 poissons traités par mannitol, n = 8 poissons glucose-traités, et n = 3 poissons de contrôle de l’eau à 4 semaines ; n = 5 poissons traités au mannitol, n = 10 poissons traités au glucose et n = 7 poissons traités à l’eau à 8 semaines. (B) Une représentation visuelle d’un poisson zèbre et du lecteur de glycémie Freestyle Lite que nous utilisons pour mesurer la glycémie. Les niveaux de sucre dans le sang sont mesurés à partir d’un échantillon de sang cardiaque après que les poissons ont été anesthésiés dans une solution de tricaine à 0,02% et décapités. Les valeurs sont moyennes ± SE. Les astérisques indiquent des différences significatives où * = p < 0,05; = p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Les taux de GFAP sont augmentés chez les poissons zèbres traités au glucose. Les poissons zèbres traités au glucose ont des niveaux accrus de (A) protéine acide fibrillaire gliale (GFAP; 1:1000) et (B) Rel-A (NfK-B; 1:1000) tels que déterminés à partir de l’analyse densitométrie des taches western. β-actine (1:1000) a servi de contrôle de chargement. L’augmentation des niveaux de Rel-A était significative (p < 0,003, astérisques). W = témoin traité à l’eau, G = traité au glucose, M = traité au mannitol. W2, G2, M2 sont des répliques pour W, G et M. Ceci suggère qu’il y ait insulte à la rétine dans le poisson zèbre hyperglycemic qui cause le gliosis réactif. (Modifié à partir de la figure 7,Tanvir et al., 201830, publié à l’origine sous les termes d’une licence CC-BY). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : La réponse à l’ERG est réduite chez les poissons traités au glucose. (A) Des traces représentatives d’ERG à partir de rétines de poisson zèbre traitées au glucose (rouge), traitées au mannitol (vert) et traitées à l’eau (noir) évoquées avec un stimulus de 570 nm sur un fond rouge adaptant. Le bloqueur des récepteurs du glutamate CNQX (50μM) était présent dans la solution de bain pour isoler les réponses des cellules bipolaires photoréceptrices et ON. Unités : axe des y = μV, axe des x = temps. L’impulsion d’onde carrée reflète la durée de l’impulsion lumineuse. (B) Quantification des variations des amplitudes de réponse. Amplitudes de réponse normalisées moyennes pour les ondes a photorécepteurs (amplitude a1, à droite), mesurées comme la déviation vers le bas du pic au début de l’impulsion lumineuse carrée, et les ondes bipolar de cellule bipolar (amplitude b2, à gauche), mesurées de creux à pic pendant l’impulsion lumineuse. Les deux valeurs ont été sensiblement réduites dans les tissus glucose- contre les tissus mannitol-traités (p < 0,001 pour a1 ; p < 0,0001 pour b2 ; n = 14 yeux par traitement). Des valeurs ont été normalisées au contrôle eau-traité. Ceci est compatible avec d’autres modèles animaux diabétiques (tels que les rongeurs) et chez les humains atteints de diabète. (Tiré de la figure 4, Tanvir et al. 201830, publié à l’origine sous les termes d’une licence CC-BY). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le diabète est un problème national. Des études montrent que d’ici 2030, on estime que 400 millions de personnes auront une forme ou une autre de diabète. Dans les modèles de rongeurs, le DM de type 2 est étudié à l’aide de manipulations génétiques. Chez les rats, les rats gras diabétiques zucker (ZDF), et les rats gras Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), fournissent plus d’informations sur les effets du type 2 DM10. En outre, des régimes riches en graisses ont été utilisés chez les rongeurs pour induire une hyperglycémie. Ceci reflète le procédé non envahissant proposé dans ce document. Utilisant notre protocole non envahissant, nous pouvons induire l’hyperglycémie pendant jusqu’à 8 semaines, simulant ainsi l’hyperglycémie prolongée dans le poisson zèbre autrement sain.
Après la mesure de la glycémie, les tissus (rétine et cerveau) peuvent être prélevés pour une analyse ultérieure. Les différences physiologiques, telles que les enregistrements d’électrorétinogramme (ERG), peuvent être mesurées directement à partir de coupes oculaires rétiniennes21,30. Les réponses comportementales (c.-à-d. les réponses optomotrices ou les différences cognitives (Rowe et coll., 2020) peuvent être évaluées avant la mesure de la glycémie. Pour la détermination des niveaux de protéines par transfert Western, les tissus sont placés dans un tampon RIPA ou congelés instantanément et stockés à -80 °C. En raison des différences de taille et de teneur en protéines, plusieurs rétines peuvent devoir être mises en commun avant l’analyse. Pour l’immunocytochimie, les tissus sont fixés dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 heures, puis équilibrés dans une solution de saccharose à 30 % avant d’être congelés (20 μm).
Pour optimiser les résultats, pesez soigneusement le mannitol et le glucose, et assurez-vous que les solutions sont soigneusement mélangées. Il est également très important de garder un calendrier actif des jours de transfert, pour s’assurer que le sucre et l’eau alternent tous les jours et à la même heure de la journée. De plus, assurez-vous de mesurer soigneusement l’eau car trop peu ou trop peut modifier la concentration de la solution. Enfin, surveillez attentivement le pH et la température des solutions, car le transfert de poissons dans des solutions extrêmes peut choquer les poissons et causer la mortalité. Il n’y a eu aucune preuve qu’une exposition prolongée au glucose ou des concentrations élevées de glucose, lorsqu’il est exposé progressivement, a des effets toxiques sur le poisson zèbre. Si le protocole est suivi correctement, aucune mort superflue du poisson zèbre ne devrait être attendue.
Bien qu’il s’agisse d’une méthode éprouvée d’induction d’hyperglycémie, une limitation de ce protocole est que l’on ne peut pas s’assurer que les poissons sont hyperglycémiques jusqu’à ce qu’ils soient sacrifiés. Une autre limitation est que nous n’évaluons pas les niveaux de pancréas ou d’insuline et, par conséquent, nous ne pouvons pas prétendre induire le diabète de type 2, seulement que nous induisons une hyperglycémie. Cependant, c’est aussi ce qui rend cette procédure meilleure que les méthodes concurrentes: elle est non invasive. Nous avons observé des complications de l’hyperglycémie prolongée induite par ce protocole qui sont rapportés dans des modèles de rongeurs et des individus diabétiques. À l’avenir, il est possible que nous puissions utiliser cette procédure pour examiner les techniques thérapeutiques qui aident à soulager les symptômes du DM, tels que la rétinopathie.
En résumé, ce protocole d’immersion alternée non invasif est un moyen efficace d’induire une hyperglycémie jusqu’à 8 semaines. Cette méthode est un outil puissant qui permet d’examiner les complications de l’hyperglycémie chronique et de déterminer ultérieurement les traitements thérapeutiques. Il offre également la possibilité de comparer les résultats de la recherche biomédicale entre des organismes modèles.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier VPC, CJR et MCP pour le développement de ce protocole. EMM a reçu un soutien financier de l’American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support pour mener à bien cette recherche. Ce travail a également été soutenu par un prix Mellon de la faculté de l’Université américaine et un financement par l’American University College of Arts and Sciences (tous deux à VPC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
References
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