Summary
Este protocolo invasivamente induz hiperglicemia em zebrafish por até 8 semanas. Usando este protocolo, um estudo aprofundado dos efeitos adversos da hiperglicemia pode ser feito.
Abstract
O zebrafish (Danio rerio) é um excelente modelo para investigar os efeitos da hiperglicemia crônica, uma marca registrada do Diabetes Mellitus tipo II (T2DM). Este protocolo de imersão alternativo é um método não invasivo e passo-a-passo de induzir hiperglicemia por até oito semanas. Os zebrafish adultos são alternadamente expostos ao açúcar (glicose) e água por 24 horas cada. Os zebrafish começam o tratamento em uma solução de glicose de 1% por 2 semanas, depois uma solução de 2% por 2 semanas, e finalmente uma solução de 3% para as 4 semanas restantes. Em comparação com os controles tratados com água (estresse) e tratados com manitol (osmóticos), os zebrafish tratados com glicose têm níveis significativamente mais elevados de açúcar no sangue. Os zebrafish tratados com glicose apresentam níveis de açúcar no sangue de 3 vezes mais do que os controles, sugerindo que após quatro e oito semanas a hiperglicemia pode ser alcançada. A hiperglicemia sustentada esteve associada ao aumento da Proteína Ácida Fibrilar (GFAP) e ao aumento dos níveis de kappa B (NF-kB) na retina e diminuição das respostas fisiológicas, bem como déficits cognitivos sugerindo que este protocolo pode ser usado para modelar complicações da doença.
Introduction
Os zebrafish (Danio rerio) estão rapidamente se tornando um modelo animal amplamente utilizado para estudar tanto a doença quanto a cognição1. A facilidade da manipulação genética e da transparência embrionária através dos estágios iniciais do desenvolvimento, fazem deles um dos principais candidatos a estudar doenças humanas com uma base genética conhecida. Por exemplo, os zebrafish têm sido usados para estudar síndrome de Holt-Oram, cardiomiopatias, doença renal glomerulocástica, distrofia muscular e diabetes mellitus (DM) entre outras doenças1. Além disso, o modelo de zebrafish é ideal por causa do pequeno tamanho da espécie, facilidade de manutenção e alta fecundidade2,3.
O pâncreas de zebrafish é anatomicamente e funcionalmente semelhante ao pâncreasmamífero 4. Assim, as características únicas de tamanho, alta fecundidade e estruturas endócrinas semelhantes fazem do zebrafish um candidato adequado para estudar complicações relacionadas ao DM. No zebrafish, existem dois métodos experimentais usados para induzir a hiperglicemia prolongada que é característica do DM: um influxo de glicose (modelagem Tipo 2) e cessação da secreção de insulina (modelagem Tipo 1)5,6. Experimentalmente, para parar a secreção de insulina, as células β pancreáticas podem ser quimicamente destruídas usando injeções de Estreptozotocina (STZ) ou Alloxan. A STZ tem sido utilizada com sucesso em roedores e zebrafish, resultando em complicações associadas à retinopatia7,8,9, prejuízos cognitivos10e regeneração de membros11. No entanto, em zebrafish, β células se regeneram após o tratamento, fazendo com que "injeções de reforço" de STZ sejam necessárias para manter as condições diabéticas12. Alternativamente, o pâncreas do zebrafish pode ser removido6. Estes são procedimentos altamente invasivos, devido às múltiplas injeções, e tempo de recuperação extensiva.
Por outro lado, a hiperglicemia pode ser induzida não invasivamente através da exposição à glicose exógena. Neste protocolo, os peixes ficam submersos em uma solução de glicose altamente concentrada por 24 horas5,13 ou continuamente durante 2 semanas14,15,16. A glicose exógena é tomada transdermicamente, por ingestão, e/ou através das brânquias, resultando em níveis elevados de açúcar no sangue. Uma vez que esta técnica não invasiva não manipula diretamente os níveis de insulina, não pode alegar induzir DM tipo 2. No entanto, pode ser usado para examinar complicações induzidas pela hiperglicemia, que é um dos principais sintomas do DM tipo 2.
Recentemente, o mutante de zebrafish pdx1-/- foi desenvolvido manipulando o gene homeobox 1 pancreático e duodenal, um gene ligado à causa genética do DM tipo 2 em humanos. Usando este mutante, os pesquisadores conseguiram replicar a interrupção do desenvolvimento pancreático, o alto açúcar no sangue e estudar a retinopatia diabética induzida pela hiperglicemia17,18.
Neste artigo, descrevemos um método de indução de hiperglicemia não invasiva que usa um protocolo de imersão alternada. Este protocolo mantém condições hiperglicêmicas por até 8 semanas com complicações subsequentes observadas. Em suma, os zebrafish adultos são colocados em uma solução de açúcar por 24 horas e, em seguida, uma solução de água por 24 horas. Ao contrário da imersão contínua em soluções externas de glicose, alternar dias entre açúcar e água imita o aumento e a queda do açúcar no sangue no diabetes. Um protocolo de glicose alternado também permite que a hiperglicemia seja induzida por períodos mais longos de tempo, já que os zebrafish não são tão capazes de compensar as altas condições de glicose externa. Como prova de princípio, fornecemos dados mostrando que a hiperglicemia induzida por este protocolo altera a química da retina e a fisiologia.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Americana.
1. Preparando os tanques de solução
- Obtenha seis tanques, dois para cada grupo experimental (glicose, manitol e água). Rotule um dos dois tanques de "tanque de carcaça" (ele abrigará o peixe) e rotule o outro 'tanque de solução' (ele vai segurar a solução).
NOTA: O grupo de tratamento de manitol é o controle osmótico, e o grupo de tratamento de água é um controle de manuseio/estresse. É importante manter os tanques, companhias aéreas/pedras aéreas, tampas e materiais de limpeza separados para cada grupo de tratamento - Use um tanque 2 L se o número total de peixes utilizados for inferior a 20. Use um tanque 4 L se o número total de peixes utilizados for superior a 20.
NOTA: Use um N de 5-10 por grupo de tratamento por ponto de tempo amostral. - Mantenha os tanques em banho-maria a 28-29 °C para manter a temperatura da água.
- No dia 1, coloque os peixes em suas respectivas soluções de tratamento (glicose, manitol, água) por 24 horas ('Água para Tratamento'). No dia 2, transfira os peixes de suas soluções de tratamento para a água por 24 horas ('Tratamento à Água'). No dia 3, transfira os peixes da água para soluções de tratamento ('Água para Tratamento'). Esta exposição alternada continua para o restante do experimento (Figura 1). Transfira os peixes de controle tratados com água diariamente para a água.
- Certifique-se de que os peixes são alimentados e transferidos dentro da mesma janela de 2 horas todos os dias durante toda a duração do experimento.
2. Preparando o peixe
- Use zebrafish adulto (4 meses – 1 ano)5.
- Alimente os peixes moídos tetramin flocos diariamente na chegada ao laboratório.
- Regissua o pH e a temperatura de todos os tanques e regise a condição geral dos peixes.
3. Transferência de peixe
- Transfira peixes em cada grupo de tratamento do tanque de habitação para o tanque de solução correspondente usando uma rede de peixe padrão.
- Coloque o tanque contendo o peixe de volta no banho de água, substitua a pedra de ar e a tampa do tanque. Este tanque é agora o "tanque de habitação" e o tanque que anteriormente segurava o peixe é agora o "tanque de solução".
- Descarte a solução antiga e limpe o tanque, juntamente com as tampas do tanque, companhias aéreas, pedras aéreas e redes para evitar o acúmulo de glicose e manitol.
NOTA: Não lave os itens com sabão. Use água e uma escova/esponja dedicada para cada condição de tratamento para limpar adequadamente os tanques. - Seque os recém-limpos "tanques de solução" com uma toalha de papel. Prepare as soluções para o dia seguinte usando este tanque. Certifique-se de que os outros itens são secos e separados por grupos de tratamento apropriados.
NOTA: Mantenha um registro de quais soluções os peixes estão sendo transferidos para fora e para cada dia, bem como as soluções que estão preparadas para o dia seguinte. Por exemplo: Peixe transferido de glicose para H2O, nova solução de glicose de 1% preparada para amanhã.
4. Preparação da solução pós-transferência
- Preparando soluções de açúcar
- Encha cada tanque de solução com 2 L (ou 4 L) de água do sistema (a água do sistema é definida como água que foi tratada com a razão correta da solução de sal e está na mesma temperatura que os tanques de estoque e tratamento).
- Meça a quantidade correta de glicose e manitol (ver passo 5 abaixo) usando uma balança de carregamento superior e barcos de pesagem separados para cada produto químico.
- Adicione a glicose pesada ou aliquot mannitol ao tanque de solução limpo apropriado, que contém apenas água do sistema.
- Misture as soluções de glicose e manitol com hastes de vidro separadas até que os açúcares sejam completamente dissolvidos.
- Devolva os tanques de solução para o banho de água e cubra com as tampas correspondentes.
- Preparando soluções de água
- Encha tanques experimentais (2 L ou 4 L) com água do sistema.
- Devolva esses "tanques de solução" ao banho de água e cubra com as tampas correspondentes.
5. Alterar percentuais
- Mantenha o peixe em uma solução de 1% durante as primeiras 2 semanas de tratamento: 40 g de glicose ou manitol em um tanque de 4 L.
- Mantenha o peixe em uma solução de 2% durante as semanas 3 e 4 de tratamento: 80 g de glicose ou manitol em um tanque de 4 L.
- Mantenha o peixe em uma solução de 3% para as últimas 4 semanas de tratamento: 120 g de glicose ou manitol em um tanque de 4 L.
6. Medir os níveis de glicose no sangue e coletar tecido
- Anesthetize peixe 2 de cada vez em uma solução tricaine 0,02%.
- Decapitar o peixe diretamente atrás das brânquias usando um razorblade.
- Meça o valor do açúcar no sangue.
NOTA: Usamos um medidor de glicemia (por exemplo, Freestyle Lite) para medir a glicemia e colocar a tira de teste diretamente no coração exposto (amostra de sangue cardíaco). - Dissecar o tecido desejado do peixe (cérebro, músculo, etc.).
- Armazene o tecido coletado por flash congelando em gelo seco e armazenando em um congelador de -80 °C, fixando em 4% de paraformaldeído ou colocando em uma solução tampão para uso imediato.
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Representative Results
Utilizando este protocolo (Figura 1), os valores de açúcar no sangue são significativamente elevados após 4 semanas e 8 semanas de tratamento(Figura 2A),com hiperglicemia definida como 3x as médias de controle tanto de grupos tratados com água quanto tratados com manitol. Os controles tratados com água são transferidos diariamente para dentro e para fora da água, proporcionando um controle de estresse/manuseio. O mannitol serve como um controle osmótico em estudos de glicose in vitro19,20, pois é um açúcar de 6 carbonos como a glicose, mas não é tomado pelas células. Para ser consistente com esses estudos, e outros estudos em zebrafish21,administramos manitol nas mesmas concentrações que a glicose para determinar se os efeitos observados eram devido à alta osmolaridade resultante da exposição à glicose ou de um efeito específico da glicose.
O açúcar no sangue é medido por anestesiar o peixe usando 0,02% tricaine até que os movimentos da brânquia tenham diminuído e, em seguida, decapitado. Os níveis de glicose no sangue, medidos com um medidor de glicemia(Figura 2B),são determinados a partir da colocação da tira de teste do glucometer diretamente no coração perfurado (ou seja, sangue cardíaco).
O tecido retiniano coletado após 4 semanas de hiperglicemia apresenta um aumento nos níveis de Proteína Ácida Fibrilar (GFAP) glial(Figura 3A). A expressão GFAP é observada em células gliais de Muller na retina, que são alteradas na retinopatia diabética22,23. O aumento do teor de GFAP e/ou padrões de imunoreatividade também são observados em ratos diabéticos induzidos por STZ24,25,26,27,28, pdx1-/- peixe mutante17, e em retinas de humanos diabéticos29. Esse aumento no GFAP está associado a um aumento nos níveis de fator nuclear Kappa B (NF-kB)(Figura 3B)30, sugerindo que a hiperglicemia induzida em zebrafish usando o protocolo de imersão alternativa desencadeia uma resposta inflamatória e gliose reativa. As gravações de ERG após 4 semanas de tratamento identificaram uma diminuição da resposta nas retinas tratadas com glicose em comparação com os controles tratados com manitol(Figura 4A). Amplitudes tanto dos componentes a-wave (fotoreceptor) quanto b-wave (células bipolares) são diminuídas em peixes hiperglicêmicos(Figura 4B). Estas respostas ERG alteradas estão correlacionadas a alterações específicas nos cones vermelhos e/ou verdes30,21, que parecem particularmente sensíveis ao insulto hiperglicêmico. As respostas alteradas do ERG também são observadas em modelos animais de diabetes31,32,33,34,35 e humanos diabéticos. Os zebrafish tratados com glicose também apresentam diminuição do desempenho cognitivo (ver Rowe et al., 2020, nesta edição), sugerindo que a hiperglicemia prolongada também leva a déficits de função cognitiva que também é relatado em pacientes diabéticos mais velhos.
Figura 1: Esquema do protocolo de imersão alternativa. Esta é uma representação visual do processo de transferência. Os peixes são mantidos em solução de 1% por 2 semanas, 2% solução por 2 semanas e, em seguida, 3% solução para as 4 semanas restantes. Todos os dias, os peixes são transferidos para solução de açúcar ou água. Os tratamentos de controle transferem peixes para dentro e para fora da água (0% de glicose - controle de manuseio) a cada 24 horas ou dentro e fora do manitol (controle osmótico), com concentrações de manitol paralelas às usadas para glicose. Medimos os níveis de glicemia, realizamos experimentos e coletamos tecido após 4 e 8 semanas de tratamento (encaixotado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os níveis de glicemia são elevados após 4 e 8 semanas de tratamento. (A) Os peixes tratados com glicose têm mais de 3x a quantidade de açúcar no sangue em comparação com os peixes de controle tratados com água e mannil, um aumento significativo (p = 0,029 em 4 semanas; p < 0,001 em 8 semanas). Isso significa que, após 4 e 8 semanas, os zebrafish tratados com glicose eram hiperglicêmicos. Os dados foram coletados de n = 5 peixes tratados com mannil, n = 8 peixes tratados com glicose e n = 3 peixes de controle de água em 4 semanas; n = 5 peixes tratados com mannil, n = 10 peixes tratados com glicose e n = 7 peixes tratados com água em 8 semanas. (B) Uma representação visual de um zebrafish e do Medidor de Glicemia Freestyle Lite que usamos para medir os níveis de glicose no sangue. Os níveis de açúcar no sangue são medidos a partir de uma amostra de sangue cardíaco depois que os peixes são anestesiados em uma solução tricaina de 0,02% e decapitados. Os valores são médios ± SE. Asteriscos denotam diferenças significativas onde * = p < 0,05; = p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os níveis de GFAP são aumentados em zebrafish tratados com glicose. Os zebrafish tratados com glicose têm níveis aumentados de (A) proteína ácida fibrilar gliana (GFAP; 1:1000) e (B) Rel-A (NfK-B; 1:1000) conforme determinado a partir da análise de densitometria das manchas ocidentais. β-actin (1:1000) serviu como controle de carregamento. O aumento dos níveis de Rel-A foi significativo (p < 0,003, asteriscos). W = controle tratado com água, G = tratamento de glicose, M = mannitol tratado. W2, G2, M2 são réplicas para W, G e M. Isso sugere que há insulto à retina em zebrafish hiperglicímico que causa gliose reativa. (Modificado da Figura 7, Tanvir et al., 201830, publicado originalmente sob os termos de uma licença CC-BY). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A resposta do ERG é reduzida em peixes tratados com glicose. (A) Traços representativos do ERG de retinas de zebrafish tratadas com glicose (vermelha), tratadas com manitol (verde) e tratadas com água (preta) evocadas com um estímulo de 570nm em um fundo de adaptação vermelha. O bloqueador de receptores de glutamato CNQX (50μM) esteve presente na solução de banho para isolar as respostas de células fotorreceptoras e ON bipolar. Unidades: eixo y = μV, x-eixo = tempo. O pulso de onda quadrada reflete a duração do pulso de luz. (B) Quantificar as alterações nas amplitudes de resposta. Amplitudes de resposta normalizadas médias para ondas fotorreceptoras (amplitude a1, direita), medida como o pico de deflexão para baixo no início do pulso de luz quadrada, e ondas b de célula bipolar (amplitude b2, esquerda), medida de cocho ao pico durante o pulso de luz. Ambos os valores foram significativamente reduzidos em tecidos tratados com glicose vs. mannitol (p < 0,001 para a1; p < 0,0001 para b2; n = 14 olhos por tratamento). Os valores foram normalizados para o controle tratado com água. Isso é consistente com outros modelos animais diabéticos (como roedores) e em humanos com diabetes. (Retirado da Figura 4, Tanvir et al. 201830, publicado originalmente sob os termos de uma licença CC-BY). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Diabetes é um problema nacional. Estudos mostram que até 2030, estima-se que 400 milhões de pessoas terão algum tipo de diabetes. Em modelos de roedores, o DM tipo 2 é estudado usando manipulação genética. Em ratos, os ratos gordurosos zucker diabéticos (ZDF), e os ratos gordurosos Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), estão fornecendo mais informações sobre os efeitos do Tipo 2 DM10. Além disso, dietas de alto teor de gordura têm sido usadas em roedores para induzir hiperglicemia. Isso espelha o procedimento não invasivo proposto neste artigo. Usando nosso protocolo não invasivo, podemos induzir hiperglicemia por até 8 semanas, simulando assim hiperglicemia prolongada em zebrafish saudável.
Após a medida do açúcar no sangue, o tecido (retina e cérebro) pode ser coletado para análise subsequente. Diferenças fisiológicas, como gravações de eletroretinograma (ERG), podem ser medidas diretamente a partir de copos oculares de retina21,30. As respostas comportamentais (ou seja, respostas optomotores ou diferenças cognitivas (Rowe et al., 2020) podem ser avaliadas antes da medição do açúcar no sangue. Para a determinação da Mancha Ocidental dos níveis de proteína, o tecido é colocado no tampão RIPA ou flash congelado e armazenado a -80 °C. Devido a diferenças no tamanho/teor de proteínas, várias retinas podem ter que ser agrupadas antes da análise. Para a imunocitoquímica, o tecido é fixado em uma solução de paraformaldeído de 4% por 24 horas e, em seguida, equilibrado em uma solução de 30% de sacarose antes até a secção congelada (20 μm).
Para otimizar os resultados, pesar cuidadosamente tanto o mannitol quanto a glicose, e certificar-se de que as soluções estão completamente misturadas. Também é muito importante manter um cronograma ativo dos dias de transferência, para garantir que o açúcar e a água estejam alternando diariamente e na mesma hora do dia. Além disso, certifique-se de medir cuidadosamente a água como muito pouco ou muito pode mudar a concentração da solução. Por fim, monitore cuidadosamente o pH e a temperatura das soluções, pois a transferência de peixes para soluções extremas pode chocar o peixe e causar mortalidade. Não há evidências de que a exposição prolongada à glicose ou altas concentrações de glicose, quando expostas gradualmente, tenha efeitos tóxicos sobre o zebrafish. Se o protocolo for seguido corretamente, não se deve esperar mortes ímvas do zebrafish.
Embora este seja um método comprovado de induzir hiperglicemia, uma limitação deste protocolo é que não se pode verificar que os peixes são hiperglicêmicos até depois de sacrificados. Outra limitação é que não avaliamos os níveis de pâncreas ou insulina e, portanto, não podemos alegar induzir diabetes tipo 2, apenas que induzimos hiperglicemia. No entanto, isso também é o que torna este procedimento melhor do que os métodos concorrentes: não é invasivo. Observamos complicações de hiperglicemia prolongada induzidas por este protocolo que são relatadas em modelos de roedores e indivíduos diabéticos. No futuro, é possível que possamos usar esse procedimento para olhar técnicas terapêuticas que ajudem a aliviar sintomas de DM, como a retinopatia.
Em resumo, este protocolo de imersão alternada não invasiva é uma maneira eficaz de induzir hiperglicemia por até 8 semanas. Este método é uma ferramenta poderosa que permite que as complicações da hiperglicemia crônica sejam examinadas e posterior determinação dos tratamentos terapêuticos. Também oferece a oportunidade de comparar os achados de pesquisa biomédica entre organismos modelos.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Gostaríamos de reconhecer vpc, CJR e PCM para o desenvolvimento deste protocolo. A EMM recebeu apoio financeiro do American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support para realizar esta pesquisa. Este trabalho também foi apoiado por um American University Faculty Mellon Award e financiamento através do American University College of Arts and Sciences (ambos para VPC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
References
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