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Immunology and Infection

डिजिटल हाई स्पीड सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नाक ब्रशिंग नमूनाकरण और प्रसंस्करण - कोविड-19 महामारी के लिए अनुकूलन

Published: November 7, 2020 doi: 10.3791/61949
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 4, 5, 1,6, 2, 1,7
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

Summary

पीसीडी निदान के लिए एक सफल और उच्च गुणवत्ता वाले सिलिअरी कार्यात्मक विश्लेषण की गारंटी देने के लिए, श्वसन उपकला नमूनाकरण और प्रसंस्करण के लिए एक सटीक और सावधानीपूर्वक विधि आवश्यक है। कोविड-19 महामारी के दौरान पीसीडी डायग्नोस्टिक सेवा प्रदान करना जारी रखने के लिए, उचित संक्रमण नियंत्रण उपायों को शामिल करने के लिए सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल को अपडेट किया गया है।

Abstract

प्राथमिक सिलियरी डिस्केनेसिया (पीसीडी) एक आनुवंशिक मोटाइल सिलियोपैथी है, जिससे महत्वपूर्ण ओटोसिनोपुलमोनरी रोग होता है। विभिन्न नैदानिक तौर-तरीकों के साथ चुनौतियों के कारण पीसीडी निदान अक्सर छूट जाता है या विलंबित होता है। डिजिटल हाई-स्पीड वीडियोमाइक्रोस्कोपी (डीएचएसवी) का उपयोग करके सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी, पीसीडी के लिए नैदानिक उपकरणों में से एक, सिलियरी फंक्शनल विश्लेषण (सीएफए) करने के लिए इष्टतम विधि माना जाता है, जिसमें सिलियरी बीट फ्रीक्वेंसी (सीबीएफ) और बीट पैटर्न (सीबीपी) विश्लेषण शामिल हैं। हालांकि, डीएचएसवी में नमूनों के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए मानकीकृत, प्रकाशित ऑपरेटिंग प्रक्रिया का अभाव है। इसमें जीवित श्वसन उपकला का भी उपयोग किया जाता है, जो कोविड-19 महामारी के दौरान एक महत्वपूर्ण संक्रमण नियंत्रण मुद्दा है। इस स्वास्थ्य संकट के दौरान नैदानिक सेवा प्रदान करना जारी रखने के लिए, सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल को पर्याप्त संक्रमण नियंत्रण उपायों को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया है।

यहां, हम सिलिएटेड श्वसन नमूनों के नमूने और प्रयोगशाला प्रसंस्करण के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो कोविड-19 संक्रमण नियंत्रण उपायों का पालन करने के लिए किए गए अनुकूलन पर प्रकाश डालता है। इस प्रोटोकॉल के अनुसार संसाधित और विश्लेषण किए गए 16 स्वस्थ विषयों से प्राप्त नाक ब्रशिंग नमूनों से सीएफए के प्रतिनिधि परिणाम वर्णित हैं। हम इष्टतम गुणवत्ता वाले उपकला सिलिएटेड स्ट्रिप्स प्राप्त करने और संसाधित करने के महत्व को भी स्पष्ट करते हैं, क्योंकि गुणवत्ता चयन मानदंडों को पूरा नहीं करने वाले नमूने अब सीएफए के लिए अनुमति देते हैं, संभावित रूप से नैदानिक विश्वसनीयता और इस तकनीक की दक्षता को कम करते हैं।

Introduction

प्राथमिक सिलियरी डिस्केनेसिया (पीसीडी) एक विरासत में मिली विषम मोटाइल सिलियोपैथी है, जिसमें श्वसन सिलिया स्थिर, धीमी या डिस्काइनेटिक होती है, जिससे बिगड़ा हुआ म्यूकोसिलरी क्लीयरेंस और क्रोनिक ओटो-साइनो-पल्मोनरी रोग 1,2,3,4 होता है। पीसीडी की नैदानिक अभिव्यक्तियाँ पुरानी गीली खांसी और पुरानी नाक की भीड़ हैं जो प्रारंभिक शैशवावस्था में शुरू होती हैं, आवर्तक या पुरानी ऊपरी और निचले श्वसन पथ के संक्रमण से ब्रोन्किइक्टेसिस होता है, और आवर्तक या पुरानी ओटिटिस मीडिया और साइनसाइटिस 5,6,7 होता है। पीसीडी रोगियों में से लगभग आधे अंग पार्श्विक दोषों के साथ मौजूद होते हैं जैसे कि साइटस इनवर्सस या सीटूस एम्बिगस। कुछ रोगियों में पुरुषों में इम्मोटिल शुक्राणु और महिलाओं में फैलोपियन ट्यूब में इम्मोटिल सिलिया के कारण बांझपन के मुद्दों के साथ भी मौजूद हैं। पीसीडी दुर्लभ है, लेकिन प्रसार को परिभाषित करना मुश्किल है, और 1: 10,000 से 1: 20,000 9,10 तक है। हालांकि, निदान में कठिनाइयों और नैदानिक संदेह की कमी के कारण पीसीडी का वास्तविक प्रसार अधिक माना जाता है। पीसीडी के लक्षण अन्य तीव्र या पुरानी श्वसन स्थितियों के सामान्य श्वसन अभिव्यक्तियों की नकल करते हैं, और निदान की पुष्टि करने की नैदानिक चुनौतियां अच्छी तरह से ज्ञात हैं, जिससे अपर्याप्त उपचार और अनुवर्ती 2,5,9,11 होते हैं।

डिजिटल हाई-स्पीड वीडियोमाइक्रोस्कोपी (डीएचएसवी) का उपयोग करके सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी, पीसीडी 4,8,12,13 के लिए नैदानिक उपकरणों में से एक है। डीएचएसवी को सिलियरी फंक्शनल एनालिसिस (सीएफए) करने के लिए इष्टतम विधि माना जाता है, जिसमें सिलियरी बीट फ्रीक्वेंसी (सीबीएफ) और बीट पैटर्न (सीबीपी) विश्लेषण 2,14,15,16 शामिल हैं। डीएचएसवी जीवित श्वसन उपकला का उपयोग करता है, जो आमतौर पर नाक ब्रशिंग13 से प्राप्त होता है।

वर्तमान कोविड-19 प्रकोप को देखते हुए, पीसीडी निदान की पुष्टि अब और भी महत्वपूर्ण है क्योंकि सबूत बताते हैं कि अंतर्निहित श्वसन रोग कोविड-19 संक्रमणके बाद बदतर परिणाम पैदा कर सकता है। वर्तमान महामारी के दौरान एक सुरक्षित और कुशल पीसीडी नैदानिक सेवा भी सामान्य आबादी19 की तुलना में पुष्टि किए गए पीसीडी रोगियों को अतिरिक्त सुरक्षात्मक उपायों से लाभ उठाने की अनुमति देगी।

कोविड-19 का संचरण मुख्य रूप से ड्रॉपलेट स्प्रेड20 के माध्यम से होता है। नाक के नमूने20 में उच्च वायरल लोड द्वारा स्पर्शोन्मुख (या न्यूनतम रोगसूचक) रोगियों से संचरण की उच्च क्षमता का सुझाव दिया जाता है। इसके अतिरिक्त, यदि वायरल कण एरोसोलाइज्ड हो जाते हैं, तो वे कम से कम 3 घंटे 21 तक हवा मेंरहते हैं। इसलिए, श्वसन स्वास्थ्य कर्मियों को नैदानिक देखभाल और नैदानिक तकनीकों के लिए नमूना संग्रह करते समय वायरल लोड के उच्च भंडार के संपर्क मेंलाया जाता है। इसके अलावा, जीवित श्वसन नमूनों में हेरफेर तकनीशियन को सीओवीआईडी -19 संदूषण के लिए उजागर करता है। कोविड-19 रोगियों की देखभाल करने वाले श्वसन चिकित्सकों और ईएनटी सर्जनों के लिए सर्वोत्तम अभ्यास की सिफारिशोंको लागू किया जा रहा है, लेकिन कोविड-19 महामारी के दौरान डीएचएसवी करने के लिए सिफारिशों की कमी है।

पीसीडी डायग्नोस्टिक सेवा प्रदान करना जारी रखने के लिए, स्वास्थ्य कार्यकर्ता (नमूना संग्रह करने वाले) और तकनीशियन (नमूना प्रसंस्करण करने वाले) की सुरक्षा सुनिश्चित करते हुए, कोविड-19 महामारी के दौरान सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना पड़ा। सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी की तकनीक वर्तमान में अनुसंधान सेवा और विशेष नैदानिक केंद्रों तक सीमित है, क्योंकि सीएफए को व्यापक प्रशिक्षण और अनुभव की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, वर्तमान में, डीएचएसवी 4,13 का उपयोग करके नमूनों के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए मानकीकरण और सटीक संचालन प्रक्रिया की कमी है।

इस पेपर का उद्देश्य डीएचएसवी के लिए मानक संचालन प्रक्रियाओं का वर्णन करना है, विशेष रूप से जीवित नाक उपकला का नमूना लेने और प्रसंस्करण करते समय संक्रमण नियंत्रण उपायों और सुरक्षा के संदर्भ में। यह वर्तमान कोविड-19 प्रकोप के बावजूद उच्च गुणवत्ता वाले पीसीडी निदान और देखभाल को जारी रखने की अनुमति देगा।

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Protocol

लीज अस्पताल-संकाय नैतिकता समिति और काम पर स्वच्छता और स्वास्थ्य संरक्षण के लिए विश्वविद्यालय विभाग से अनुमोदन प्राप्त किया गया था।

1. श्वसन सिलिएटेड एपिथेलियम का नमूना

  1. सुनिश्चित करें कि नमूने लेने से पहले कम से कम 4-6 सप्ताह के लिए लोग संक्रमण से मुक्त हैं, और नाक और साँस की दवा से मुक्त हैं।
  2. पूरक एम 199 तैयारी तैयार करें: पूरक सेल कल्चर मीडियम 199 (एम 199) (500 एमएल) एंटीबायोटिक समाधान के साथ (5 एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन / पेनिसिलिन (50 μg / mL)) और एंटिफंगल समाधान (5 एमएल एम्फोटेरिसिन बी (2.5μg / mL))।
  3. ढक्कन के साथ 2 (प्रत्येक नासिका के लिए एक) 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें, और उनमें से प्रत्येक को पूरक एम 199 के 3 एमएल से भरें।
  4. ब्रोन्कियल साइटोलॉजी ब्रश तैयार करें (मोटाई: 2 मिमी और लंबाई: 11 मिमी)। यह सुनिश्चित करने के लिए तार के अंत को काटें कि ब्रश लगभग 15 सेमी लंबा है (चित्रा 1ए, बी)। नाक ब्रश करते समय ब्रश को पकड़ने के लिए, वील-ब्लेक्सले नाक बल (चित्रा 1 बी) का उपयोग करें।
  5. कोविड-19 अनुकूलन: कोविड-19 के लिए अज्ञात स्थिति के जीवित नाक उपकला नमूने को संसाधित करने से बचें, सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी के लिए नाक ब्रश करने से 48 से 72 घंटे पहले रोगी का कोविड-19 परीक्षण करें। इस कोविड-19 परीक्षण में24,25 नासोफैरेनजील स्वैब नमूने से पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन शामिल है। चूंकि इस बिंदु पर कोविड-19 के लिए रोगी की स्थिति अज्ञात है, इसलिए चिकित्सक और स्टाफ के सदस्यों को पर्याप्त रूप से संरक्षितकिया जाना चाहिए, जिसमें एफएफपी 2 मास्क, दस्ताने, फेस शील्ड या चश्मे और लंबी आस्तीन का पानी प्रतिरोधी गाउन शामिल है। अनुपलब्ध, असंभव या संदिग्ध पीसीआर परीक्षण के मामले में, नाक ब्रशिंग के सभी प्रसंस्करण को एल 2 जैव-सुरक्षा प्रयोगशाला में किया गया। कोविड-19 पॉजिटिव स्थिति के मामले में, पीसीडी निदान परीक्षण को स्थगित करें और रोगी को प्रबंधित करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोणों पर विचार करें।
    सावधानी: कोविड-19 परीक्षण के लिए यह नासोफरीन्जियल स्वैब नमूना नाक श्वसन सिलियरी एपिथेलियम27,28 को नुकसान पहुंचाकर द्वितीयक सिलियरी डिस्केनेसिया को प्रेरित कर सकता है। इससे बचने के लिए, कठोर एंडोस्कोपिक नियंत्रण के तहत नाक गुहा में एक पतली कपास का फाहा पेश करें, टर्बिनेट्स या सेप्टम को चोट पहुंचाने से बचें। फिर नमूना नासोफैरिनक्स से लिया जाता है और कठोर एंडोस्कोप के नियंत्रण में कपास के फाहे को हटा दिया जाता है। पर्याप्त उपकरणों के साथ, आघात के बिना वयस्कों और बच्चों में आसानी से 0 ° कठोर एंडोस्कोपी की जाती है।

2. श्वसन सिलिएटेड एपिथेलियम नमूने प्राप्त करना

कोविड-19 अनुकूलन: भले ही रोगी की कोविड-19 स्थिति नकारात्मक हो, झूठी-नकारात्मक दर के कारण, रोगी को प्रक्रिया के दौरान अपने मुंह पर सर्जिकल मास्क रखने के लिए कहा जाता है, और दस्ताने, एफएफपी 2 मास्क और फेस शील्ड चिकित्सक द्वारा पहना जाता है।

  1. नाक ब्रश करने की तैयारी
    1. रोगी को अपनी नाक उड़ाने के लिए कहें।
    2. नाक एंडोस्कोपी के तहत नाक ब्रश करना या अंधा करना। यदि नाक एंडोस्कोपी का उपयोग कर रहे हैं, तो नाक ब्रश करने से पहले 2 नाक की जांच करें (सीओवीआईडी -19 नाक स्वैब के लिए पहले 48-72 बार किए जाने पर दोहराएं)। परीक्षा से म्यूकोसा की स्थिति को सत्यापित करना संभव हो जाता है (नाक ब्रश करने पर सूजन की एक उच्च डिग्री रक्तस्राव का कारण बन सकती है, ...), अवर टर्बिनेट की स्थिति (उदाहरण के लिए टेलेंजीक्टेसिया की उपस्थिति को बाहर करने के लिए), और यदि सेप्टम नाक सीधी है (चित्रा 1 सी)।
    3. रोगी को लेटने के लिए कहें, या आराम से बैठने के लिए कहें, सिर कुर्सी पर पीछे की ओर आराम कर रहा है (क्योंकि नाक ब्रश करने से सिर को पीछे ले जाने के लिए रिफ्लेक्स होता है)। एक दूसरा देखभालकर्ता नाक ब्रश िंग के दौरान सिर को पकड़ता है, खासकर बच्चों में।
    4. नाक ब्रश करने से पहले पूरक एम 199 में ब्रश को हिलाएं (ब्रश को नम करने से ब्रश करने से जलन कम हो जाती है)।
      नोट: पूरक एम 199 के भीतर ब्रश को नम किया जा सकता है; यदि रोगी को एंटीबायोटिक दवाओं से एलर्जी है (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन पूरक सेल कल्चर माध्यम में मौजूद हैं), तो ब्रश को खारा में नम करें।
  2. नाक ब्रश करना
    1. स्थानीय या सामान्य संज्ञाहरण13 के बिना धीरे से नाक ब्रशिंग डालें। यदि नाक एंडोस्कोपी का उपयोग कर रहे हैं, तो एंडोस्कोप को नाक के प्रवेश द्वार पर अवर नाक टर्बिनेट की कल्पना करने के लिए रखें, फिर नाक में कोशिका विज्ञान ब्रश डालें। यदि "अंधा" नाक ब्रशिंग कर रहे हैं, तो नाक के फर्श (चित्रा 1 डी) के बाद ब्रश को नाक में डालें।
      नोट: कुछ नैदानिक केंद्र नाक ब्रश करने के लिए नेफाज़ोलिन के टैम्पोन के साथ स्थानीय संज्ञाहरण का उपयोग करते हैं।
    2. ब्रश को निचले नाक के टर्बिनेट के पिछले हिस्से पर कई बार पीछे और पूर्ववर्ती रूप से स्थानांतरित करें और फिर वापस ले लें। ऑपरेटर को यह महसूस करना चाहिए कि ब्रश एपिथेलियम को रगड़ता है, और रोगी ब्रशिंग के किनारे एकतरफा पानी की आंख महसूस कर सकता है।
      नोट: यदि नाक ब्रशिंग बहुत पहले की जाती है, तो कोई सिलिएटेड कोशिकाएं प्राप्त नहीं होंगी, क्योंकि पूर्ववर्ती नाक गुहा को संक्रमणकालीन गैर-सिलिएटेड एपिथेलियम के साथ पंक्तिबद्ध किया जाता है।
    3. नमूना लेने के बाद, तुरंत संस्कृति माध्यम के भीतर नाक ब्रशिंग नमूने रखें। प्राप्त श्वसन उपकला स्ट्रिप्स को पूरक एम 199 युक्त ट्यूब में ब्रश को उत्तेजित करके हटा दिया जाता है, फिर ट्यूब को बंद कर दिया जाता है (चित्रा 1 ई)।
    4. कोविड-19 अनुकूलन: नमूना लेने के तुरंत बाद पूरक एम 199 में ब्रश को उत्तेजित करके उपकला स्ट्रिप्स को हटा न दें। ब्रश को ट्यूब में रखें, तार को काटें ताकि यह ट्यूब के अंदर पूरी तरह से फिट हो सके, और ट्यूब को तुरंत बंद कर दें। नमूने को एक एयरटाइट डबल बैग में रखें।

Figure 1
चित्र 1: नाक ब्रशिंग तकनीक। (ए) संपूर्ण ब्रोन्कियल साइटोलॉजी ब्रश (बी) रेडी-टू-ब्रश: तार का ब्रशिंग छोर काटा जाता है (लगभग 15 सेमी लंबा) और वील-ब्लेक्सले नाक बल (सी) नाक गुहा का एंडोस्कोपिक दृश्य: सेप्टम (1) अवर टर्बिनेट (2) और मध्य टर्बिनेट (3) (डी) हीन टर्बिनेट के पीछे के हिस्से पर नाक ब्रशिंग की जाती है (2). नाक सेप्टम (1) मध्य टर्बिनेट (3). (ई) पूरक एम 199 सेल कल्चर माध्यम में ब्रश को हिलाकर श्वसन उपकला स्ट्रिप्स को हटा दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. श्वसन सिलिएटेड एपिथेलियम प्रसंस्करण

  1. नमूना लेने के बाद 9 घंटे के भीतर माइक्रोस्कोप के तहत नाक ब्रशिंग नमूनों का विश्लेषण करें, क्योंकि सीबीएफ और सीबीपी दोनों इस समय सीमा (अप्रकाशित डेटा) के भीतर स्थिर हैं।
  2. एक्स 100 तेल-विसर्जन चरण-कंट्रास्ट या एक हस्तक्षेप कंट्रास्ट लेंस के साथ एक सीधा या उलटा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। आदर्श रूप से, माइक्रोस्कोप को एक विरोधी कंपन तालिका पर रखें क्योंकि सिलियरी बीटिंग बाहरी कंपन (जैसे प्रयोगशाला बेंच से) के कारण कलाकृतियों के अधीन हो सकती है।

कोविड-19 अनुकूलन: ऑपरेटर नाक प्रसंस्करण करने के लिए व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करता है, जिसमें एफएफपी 2 मास्क, दस्ताने और लंबी आस्तीन वाले पानी प्रतिरोधी गाउन शामिल हैं।

  1. विज़ुअलाइज़ेशन कक्ष तैयार करें।
    1. एक प्रयोगशाला निर्मित खुले विज़ुअलाइज़ेशन कक्ष में सिलिएटेड एपिथेलियल स्ट्रिप्स को निलंबित करें, जिससे माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण किए जाने के दौरान सिलिया को स्वतंत्र रूप से पीटने की अनुमति मिलती है। यह कक्ष एक कवर स्लिप (22 मिमी x 40 मिमी) और दो आसन्न वर्ग कवर स्लिप (20 मिमी x 20 मिमी) द्वारा एक ग्लास स्लाइड को अलग करके बनाया गया है, जिसे 15 मिमी की दूरी से अलग किया गया है, और ग्लास स्लाइड12 (चित्रा 2, चित्रा 4 ए) पर चिपकाया गया है।

कोविड-19 अनुकूलन: ऊपर वर्णित प्रयोगशाला-निर्मित कक्ष खुला है, और नमूने और पर्यावरण के बीच गैस और आर्द्रता विनिमय की अनुमतिदेता है। कोविड-19 महामारी के संदर्भ में, 0.25 मिमी गहराई वाले दो तरफा फंसे स्पेसर का उपयोग करके एक बंद विज़ुअलाइज़ेशन चैंबर का उपयोग करना संभव है (चित्रा 3, चित्रा 4 बी)। स्पेसर ग्लास स्लाइड पर फंस गया है, और फिर स्पेसर के शीर्ष पर एक कवर स्लिप (22 मिमी x 40 मिमी) फंस गई है।

Figure 2
चित्रा 2: प्रयोगशाला निर्मित खुले कक्ष का माउंटिंग। (ए) ग्लास स्लाइड पर 2 वर्ग कवरलिप्स (20 मिमी x 20 मिमी) रखे गए हैं। (बी) वर्ग कवर स्लिप को लगभग 15 मिमी की दूरी से अलग किया जाता है, और ग्लास स्लाइड पर चिपकाया जाता है। (C) कक्ष को पूरक M199 में सिलिएटेड एपिथेलियम के एक छोटे नमूने (लगभग 60 μL) के साथ दो आसन्न वर्ग कवर पर्चियों के बीच भरा जाता है। (डी) एक लंबा आयताकार कवरस्लिप (22 मिमी x 40 मिमी) दो आसन्न वर्ग कवर स्लिप पर रखा जाता है, और कक्ष को कवर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एक दो तरफा फंसे हुए स्पेसर का उपयोग करके बंद कक्ष का माउंटिंग। (ए) ग्लास स्लाइड और डबल-साइड अटक स्पेसर। (बी) सुरक्षा को स्पेसर के एक तरफ हटा दिया जाता है, और स्पेसर को फिर ग्लास स्लाइड पर चिपका दिया जाता है। (सी) सुरक्षा को डबल-साइडेड फंसे स्पेसर के दूसरी तरफ से हटा दिया जाता है, और फिर स्पेसर को पूरक एम 199 में सिलिएटेड एपिथेलियम के एक छोटे से नमूने (लगभग 60 μL) से भर दिया जाता है। (डी) एक लंबा आयताकार कवरस्लिप (22 मिमी x 40 मिमी) स्पेसर पर फंस जाता है, और कक्ष को बंद कर देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: योजनाबद्ध आरेख डिजिटल हाई-स्पीड वीडियोमाइक्रोस्कोपी (डीएचएसवी) का उपयोग करके सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मुख्य विज़ुअलाइज़ेशन कक्षों को दर्शाता है। (ए) ओपन हैंगिंग ड्रॉप तकनीक: सिलिएटेड नमूना को एक खुले कक्ष में सेल कल्चर माध्यम की एक बूंद में निलंबित किया जाता है जो एक कवरस्लिप और एक ग्लास स्लाइड को दो आसन्न कवरलिप द्वारा अलग किया जाता है। (बी) बंद हैंगिंग ड्रॉप तकनीक: सिलिएटेड नमूना को एक बंद कक्ष में सेल कल्चर माध्यम की एक बूंद में निलंबित किया जाता है जो एक ग्लास साइड और एक कवर स्लिप के बीच सैंडविच स्पेसर द्वारा बनाया जाता है। स्पेसर ग्लास स्लाइड और कवर स्लिप दोनों पर मजबूती से चिपक जाता है। केम्पेनेर्स एट अल.13 से पुन: प्रस्तुत और संशोधित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. तापमान का नियंत्रण
    1. बुलबुला लपेट के साथ माइक्रोस्कोप को घेरें (चित्रा 5ए, बी)।
    2. वेल्क्रो स्ट्रैप (चित्रा 5 सी) का उपयोग करके उद्देश्य के चारों ओर लेंस हीटर संलग्न करें
    3. नियंत्रण तापमान जांच करने से 1 घंटे पहले लेंस हीटर नियंत्रक चालू करें।
    4. माइक्रोस्कोप चालू करें और जांचें कि माइक्रोस्कोप सेट अप किया गया है, क्योंकि नमूने के माध्यम से प्रकाश की मात्रा स्लाइड पर तापमान को बदल सकती है।
    5. गर्म बॉक्स नियंत्रक चालू करें (चित्रा 5 डी)।
    6. जांचें कि संदर्भ जांच शुरू करने से पहले ठीक से काम करती है। उंगलियों के बीच संदर्भ जांच टिप पकड़ो; यह शरीर के तापमान को मापना चाहिए।
    7. स्लाइड के बीच में फ्री मीडिया डालें, उस पर चिपके हुए दो आसन्न वर्ग कवर स्लिप (20 मिमी x 20 मिमी) के बीच।
    8. पूरक एम 199 में संदर्भ जांच टिप रखें। एक आयताकार कवरस्लिप (22 मिमी x 40 मिमी) के साथ कवर करें। सुनिश्चित करें कि जांच पूरी तरह से मीडिया से घिरी हुई है (अन्यथा तापमान गिर सकता है)।
    9. कोविड-19 अनुकूलन: स्पेसर का उपयोग करके बंद कक्ष में तापमान नियंत्रण करने के लिए, स्पेसर के एक तरफ काटें (यह छेद संदर्भ जांच के समान आकार का होना चाहिए)। स्पेसर को ग्लास स्लाइड पर चिपकाएं, स्पेसर के बीच में फ्री मीडिया रखें। स्पेसर के छेद के माध्यम से समाधान में संदर्भ जांच की नोक रखें, फिर स्पेसर पर एक आयताकार कवरस्लिप (22 मिमी x 40 मिमी) चिपकाएं।
    10. स्लाइड को गर्म बॉक्स की प्लेट में रखें। ढक्कन के साथ गर्म बॉक्स बंद करें।
    11. तेल-विसर्जन उद्देश्य पर तेल जोड़ें।
    12. माइक्रोस्कोप स्टेज पर गर्म बॉक्स रखें।
    13. माध्यम के भीतर संदर्भ जांच के साथ 37 डिग्री सेल्सियस को मापने के लिए प्लेट और ढक्कन के तापमान को समायोजित करें (संक्षेपण से बचने के लिए ढक्कन का तापमान प्लेट के तापमान से 2 डिग्री सेल्सियस अधिक होना चाहिए)।
    14. 5 मिनट प्रतीक्षा करें (नमूने के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाने के लिए आवश्यक समय)।
    15. उद्देश्य को समायोजित करें, लेंस की नोक से कवरस्लिप को छूने तक इसे स्लाइड के करीब ले जाएं।
    16. माइक्रोस्कोप में जांच के मध्य को देखने के लिए उद्देश्य को स्थानांतरित करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि जांच कंप्यूटर स्क्रीन पर देखी गई है (यह जांचने के लिए कि सिलिएटेड नमूने को देखने से पहले कैमरा सिस्टम काम करता है)। प्रोब के बीच में देखते समय, स्क्रीन पूरी तरह से काली होती है।
    17. लेंस हीटर के तापमान को समायोजित करें (तापमान के नुकसान की भरपाई करने के लिए जब तेल-विसर्जन लेंस कवरस्लिप के संपर्क में होता है)। जब उद्देश्य कवर स्लिप को छूता है तो माध्यम के भीतर संदर्भ जांच के साथ 37 डिग्री सेल्सियस को मापना सुनिश्चित करें।
      नोट: आदर्श रूप से, एक नियंत्रित तापमान के साथ एक कमरे में काम करें, ताकि ये तापमान स्थापित न हों। यदि कमरे का तापमान नियंत्रित नहीं है, तो आपको सिलिअरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी करने से पहले हर दिन इस तापमान नियंत्रण जांच को करना चाहिए।
    18. तापमान की जांच करने के बाद, गर्म बॉक्स से स्लाइड हटा दें।
    19. स्लाइड और संदर्भ जांच की नोक को शराब के साथ साफ करें और दूर रखें।
    20. आइसोप्रोपेनॉल और लेंस सफाई ऊतकों के साथ लेंस को गोलाकार गति के साथ साफ करें।

Figure 5
चित्रा 5: डीएचएसवी प्रयोगशाला में उपयोग किए जाने वाले उपकरण। (ए) 100x तेल-विसर्जन चरण-कंट्रास्ट लेंस से लैस माइक्रोस्कोप को एक एंटी-वाइब्रेशन टेबल पर रखा जाता है ताकि बाहरी कंपन सिलियरी कार्यात्मक विश्लेषण के लिए कलाकृतियों का कारण बन सकें (बी) माइक्रोस्कोप परिवेशी हवा से गर्मी के नुकसान को रोकने के लिए बुलबुला लपेट से घिरा हुआ है। (सी) तेल विसर्जन उद्देश्य गर्मी की हानि पैदा करता है। इसे लेंस हीटर (तीर) का उपयोग करके रोका जा सकता है। (डी) नमूना हीटिंग बॉक्स का उपयोग करके गर्म किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. श्वसन सिलिएटेड उपकला नमूने की तैयारी

  1. सिलिया को पूरे ट्यूब में फैलने की अनुमति देने के लिए ट्यूब को धीरे से हिलाएं (सिलिया को अन्य सिलिएटेड स्ट्रिप्स, बलगम या मलबे पर फंसने से बचने के लिए, जो उन्हें स्वतंत्र रूप से पीटने से रोकते हैं)।
    नोट: यह कदम सिलिएटेड एपिथेलियम (चित्रा 12) के "इष्टतम किनारों" को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।
  2. पिपेट के साथ ट्यूब के बीच में पूरक एम 199 में लगभग 50 μL सिलिएटेड एपिथेलियम निकालें।
  3. नमूना प्रयोगशाला-निर्मित कक्ष पर रखें (दो आसन्न वर्ग कवर स्लिप (20 मिमी x 20 मिमी) के बीच) और एक आयताकार कवरस्लिप (22 मिमी x 40 मिमी) के साथ कवर करें। बुलबुले न जोड़ने के लिए सावधान रहें।
  4. कोविड-19 अनुकूलन: माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट में चरण 4.1-4.3 करें। माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट में प्रक्रिया।
    1. नमूना तैयार करने से 10 मिनट पहले माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट पर स्विच करें (यह सुनिश्चित करने के लिए कि पर्यावरण बाँझ है)।
    2. किसी भी हैंडलिंग से पहले, 70% इथेनॉल के साथ पूरे सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा कैबिनेट को कीटाणुरहित करें।
    3. माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट में रखने से पहले 70% इथेनॉल के साथ सभी आवश्यक सामग्री को कीटाणुरहित करें।
    4. माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट के तहत केवल एक बार नमूने वाले 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों को खोलें, फिर पूरक एम 199 में ब्रश (वील-ब्लेक्सले नाक बल का उपयोग करके) को उत्तेजित करके उपकला स्ट्रिप्स को हटा दें।
    5. ग्लास स्लाइड पर स्पेसर को चिपकाएं और डबल-साइडेड फंसे स्पेसर से सुरक्षा को हटा दें।
    6. सिलिया को पूरे ट्यूब में फैलने की अनुमति देने के लिए ट्यूब को धीरे से हिलाएं।
    7. ट्यूब के बीच से पूरक एम 199 में सिलिएटेड एपिथेलियम का एक छोटा सा नमूना पिपेट (लगभग 60 μL) के साथ निकालें और स्पेसर भरें।
    8. कक्ष को बंद करने के लिए स्पेसर पर आयताकार कवरस्लिप (22 मिमी x 40 मिमी) चिपकाएं।
    9. माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट से बाहर निकलने से पहले स्लाइड को कीटाणुरहित करें।
    10. माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट से स्लाइड निकालें।
    11. माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा कैबिनेट से बाहर निकलते समय दस्ताने बदलें।
    12. उपयोग के बाद सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा कैबिनेट को बंद करने से पहले 10 मिनट प्रतीक्षा करें (यह सुनिश्चित करने के लिए कि दरवाजा बंद करने से पहले सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा कैबिनेट का वातावरण बाँझ है)।
  5. स्लाइड को गर्म बॉक्स की प्लेट में रखें। ढक्कन के साथ गर्म बॉक्स बंद करें।
  6. तेल-विसर्जन उद्देश्य पर तेल जोड़ें।
  7. गर्म बॉक्स को माइक्रोस्कोप के मंच पर रखें।
  8. गर्म बॉक्स और लेंस हीटर चालू करें।
    नोट: लेंस हीटर को उपयोग से 1 घंटे पहले चालू किया जाना चाहिए।
  9. चरण 3.4 पर प्राप्त मानों के अनुसार गर्म बॉक्स और लेंस हीटर नियंत्रकों की तापमान सेटिंग्स समायोजित करें।
  10. 5 मिनट प्रतीक्षा करें (गर्म बॉक्स और उद्देश्य हीटर दोनों के लिए पूर्व निर्धारित सेटिंग्स का उपयोग करते समय नमूने के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाने के लिए आवश्यक समय)।
  11. लेंस की नोक से कवरस्लिप को छूने तक स्लाइड के उद्देश्य से संपर्क करें।

5. श्वसन सिलिएटेड किनारों की कल्पना करना

  1. माइक्रोस्कोप पर उच्च गति वाले वीडियो कैमरे को ठीक करें, कैमरे को कंप्यूटर से कनेक्ट करें, और कैमरे को चालू करें।
  2. कंप्यूटर चालू करें.
  3. सॉफ्टवेयर के माध्यम से डिजिटल हाई स्पीड वीडियोमाइक्रोस्कोपी कैमरे को कंप्यूटर से कनेक्ट करें (ताकि ओकुलर लेंस के माध्यम से देखी गई छवि मॉनिटर पर प्रक्षेपित की जाए)।
    1. सॉफ़्टवेयर खोलें, और उसके बाद मुख्य मेनू स्वचालित रूप से खुलता है (चित्रा 6 ए)।
      नोट: सॉफ्टवेयर छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में उपयोग किया जाने वाला कार्यक्रम है। सिस्टम वीडियो अनुक्रमों को रिकॉर्ड करने और कम फ्रेम दर या फ्रेम दर फ्रेम पर वापस चलाने की अनुमति देता है। इसे मुफ्त में डाउनलोड किया जा सकता है।
    2. खुला कैमरा (चित्रा 6 ए)।
    3. जब कैमरा गणना फ़िल्टर दिखाई देता है, तो ओके चुनें (चित्रा 6 बी)।
    4. ताज़ा सूची का चयन करें; कैमरे के नाम का चयन करें; इंटरफ़ेस चुनें: विशेषज्ञ, फिर खोलें (चित्रा 6 सी) का चयन करें।
    5. डॉक किए गए संवाद मेनू के शीर्ष पर कैमरा नियंत्रण-लाइन पर, लाइव (चित्रा 6 डी) का चयन करें।
    6. छवि देखने के लिए प्ले चुनें और देखने के लिए रोकें (चित्रा 6 डी)।

Figure 6
चित्रा 6: सॉफ्टवेयर के उपयोग का विवरण: मॉनिटर पर श्वसन सिलिएटेड किनारों का विज़ुअलाइज़ेशन। (ए) सॉफ्टवेयर खोलते समय मुख्य मेनू सीधे दिखाई देता है। (बी) कैमरा गणना फ़िल्टर बंद करें। (सी) कैमरा चुनें और इंटरफ़ेस का चयन करें : विशेषज्ञ। (डी) लाइव मोड माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखी गई छवि को मॉनिटर पर कल्पना करने की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. कैमरा अधिग्रहण सेटिंग (ऊपरी दाएं कोने में) समायोजित करें (चित्रा 7)।
    1. अधिग्रहण सेटिंग्स पर कैमरा चुनें, फिर फ्रेम दर समायोजित करें: दर (हर्ट्ज): 500 (नीचे देखें) (चित्रा 7 ए)।
    2. अधिग्रहण सेटिंग्स पर कैमरा चुनें, फिर रुचि के क्षेत्र (ROI) (चित्रा 7A) को समायोजित करें।
      नोट: आरओआई की गणना एक्स 100 तेल-विसर्जन उद्देश्य के साथ देखे गए स्नातक पैमाने का उपयोग करके की जाती है और मॉनिटर पर प्रक्षेपित की जाती है, ताकि 50 μm के अनुरूप पिक्सेल की संख्या को परिभाषित किया जा सके (जैसा कि आप लगभग 50 μm मापने वाले सिलिएटेड किनारों को रिकॉर्ड करना चाहते हैं (नीचे देखें))।
    3. अधिग्रहण सेटिंग्स पर रिकॉर्ड चुनें, फिर वीडियो की अवधि और रिकॉर्ड किए गए फ्रेम की कुल संख्या को समायोजित करें (2 सेकंड की अवधि, 1000 फ्रेम से मेल खाती है यदि चुना गया फ्रेम दर 5ओओ हर्ट्ज है) (चित्रा 7 बी)।
      नोट: हमारे अनुभव में, सीबीएफ और सीबीपी दोनों के पूर्ण विश्लेषण की अनुमति देने के लिए न्यूनतम 2 सेकंड की वीडियो लंबाई आवश्यक है।
    4. फ़ाइल चुनें फिर नई अधिग्रहण सेटिंग को सहेजने के लिए कैमरा Cfg सहेजें (एक नाम दर्ज करें और यदि आवश्यक हो तो इस नए कॉन्फ़िगरेशन के लिए एक टिप्पणी) (चित्रा 7सी, डी)।
    5. इस नए कैमरा कॉन्फ़िगरेशन को खोलने के लिए, फ़ाइल और लोड कैमरा Cfg (चित्रा 7C) खोलें।

Figure 7
चित्रा 7: सॉफ्टवेयर के उपयोग का विवरण: बीटिंग सिलिएटेड किनारों की वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए कैमरा अधिग्रहण सेटिंग्स का समायोजन। (ए) अधिग्रहण सेटिंग कैमरा पर, वीडियो रिकॉर्डिंग (दर) के लिए रुचि के क्षेत्र (आरओआई) और फ्रेम दर को समायोजित करें। (बी) अधिग्रहण सेटिंग रिकॉर्ड पर, वीडियो रिकॉर्डिंग की अवधि को समायोजित करें (पहले चुनी गई फ्रेम दर के अनुसार चुनी गई रिकॉर्डिंग अवधि के लिए आवश्यक फ्रेम की संख्या)। (सी) इस नई कैमरा कॉन्फ़िगरेशन सेटिंग्स को सेव कैमरा सीएफजी फ़ंक्शन का उपयोग करके सहेजा जा सकता है। लोड कैमरा सीएफजी आगे उपयोग के लिए सहेजी गई कॉन्फ़िगरेशन सेटिंग्स को फिर से खोलने की अनुमति देता है। (डी) नई कैमरा कॉन्फ़िगरेशन सेटिंग्स का नाम दिया जा सकता है, और यदि आवश्यक हो तो एक टिप्पणी जोड़ी जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. ओकुलर लेंस के माध्यम से देखें और नमूने के भीतर कोशिकाओं या मलबे की खोज करें, फिर ध्यान केंद्रित करें।
  2. जांचें कि छवि मॉनिटर पर दिखाई दे रही है, और कंडेनसर को समायोजित करके छवि की गुणवत्ता में सुधार करें, (और हस्तक्षेप कंट्रास्ट लेंस का उपयोग करके डीआईसी प्रिज्म), और यदि आवश्यक हो तो फोकस समायोजित करें।
  3. सिलिएटेड एपिथेलियम की स्ट्रिप्स की खोज करें।

6. श्वसन सिलिएटेड किनारों का चयन

नोट: प्रयोगात्मक प्रणाली सिलिया को तीन अलग-अलग विमानों में देखने की अनुमति देती है: एक साइडवेज प्रोफाइल, सीधे पर्यवेक्षक की ओर और सीधे ऊपर से (चित्रा 8)।

Figure 8
चित्रा 8: डीएचएसवी तकनीक सिलिया को तीन अलग-अलग विमानों में देखने की अनुमति देती है। (ए) साइडवेज प्रोफाइल में। (बी) पर्यवेक्षक की ओर सीधे और (सी) सीधे ऊपर से। केम्पेनेर्स एट अल.16 से पुन: प्रस्तुत किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. रिकॉर्ड केवल अखंड सिलिएटेड एपिथेलियल किनारों को रिकॉर्ड करें जो लंबाई में कम से कम 50 μm मापते हैं।
  2. साइडवेज प्रोफाइल पर किए गए रिकॉर्ड के लिए, थॉमस एट अल.29 स्कोरिंग सिस्टम (चित्रा 9) के अनुसार किनारे की गुणवत्ता निर्धारित करें। सिलिअरी कार्यात्मक विश्लेषण के लिए केवल सामान्य किनारों (चित्रा 9 ए) या मामूली अनुमानों (चित्रा 9 बी) वाले किनारों का उपयोग करें। पृथक कोशिकाओं को बाहर रखें (चित्रा 9 ई)।

Figure 9
चित्रा 9: सिलिएटेड एपिथेलियल किनारों की विभिन्न गुणवत्ता के लिए थॉमस एट अल29 द्वारा स्कोरिंग सिस्टम की प्रतिनिधि छवि। (ए) सामान्य किनारे: एक बरकरार समान सिलिएटेड एपिथेलिया स्ट्रिप के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसकी लंबाई 50 μm > (B) मामूली अनुमानों के साथ सिलिएटेड किनारे के रूप में परिभाषित किया गया है: लंबाई में >50 μm के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसमें कोशिकाएं उपकला किनारे रेखा से बाहर निकलती हैं, लेकिन आसन्न कोशिकाओं (C) पर सिलिया की युक्तियों के ऊपर एपिकल सेल झिल्ली का कोई बिंदु नहीं होता है।) प्रमुख अनुमानों के साथ सिलिएटेड किनारे: लंबाई में एक किनारे >50 μm के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसमें कोशिकाएं उपकला किनारे रेखा से बाहर निकलती हैं, जिसमें आसन्न कोशिकाओं पर सिलिया की युक्तियों के ऊपर एपिकल सेल झिल्ली का कम से कम एक बिंदु होता है (डी) पृथक सिलिएटेड सेल: उपकला किनारे पर एकमात्र सिलिएटेड सेल के रूप में परिभाषित किया गया है > लंबाई में 50 μm (E)) एकल कोशिकाएं: सिलिएटेड कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है जिनका स्वयं या किसी अन्य सेल प्रकार के बीच कोई संपर्क नहीं है। स्केल बार: 5.5 μm. थॉमस एट अल.29 से पुन: प्रस्तुत कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. बलगम और मलबे से मुक्त केवल सिलिया का उपयोग करके सीएफए करें, और रिकॉर्ड किए गए किनारे के लिए चुनी गई प्रोफ़ाइल में पिटाई करें। केवल सिलिएटेड किनारों का चयन करें जो किनारे के साथ न्यूनतम 2 सीबीएफ और सीबीपी मूल्यांकन (नीचे देखें) की अनुमति देते हैं।
  2. सीएफए के लिए केवल उन नमूनों का उपयोग करें जो साइडवेज प्रोफाइल में कम से कम 6 किनारों को हराते हैं और उपरोक्त मानदंडों को पूरा करते हैं; साइडवेज प्रोफाइल में अधिकतम 20 किनारों का विश्लेषण करें।
  3. सीबीपी को चिह्नित करने के लिए पर्यवेक्षक प्रोफ़ाइल के ऊपर से सिलिया बीटिंग के न्यूनतम 1 अतिरिक्त किनारे का उपयोग करें।

7. सिलिअटेड किनारे को रिकॉर्ड करना

  1. 500 फ्रेम प्रति सेकंड की कैमरा फ्रेम दर का उपयोग करके बीटिंग सिलिया एज रिकॉर्ड करें, और एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन मॉनिटर पर प्रोजेक्ट करें। सीबीएफ और सीबीपी13 दोनों के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए 400 हर्ट्ज की न्यूनतम फ्रेम दर की आवश्यकता होती है। पार्टिकुलेट क्लीयरेंस की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए 30 फ्रेम प्रति सेकंड की फ्रेम दर पर एक किनारे रिकॉर्ड करें।
  2. डॉक किए गए संवाद मेनू (चित्रा 6 डी) के शीर्ष पर कैमरा नियंत्रण-लाइन पर लाइव का चयन करें
  3. छवि देखने के लिए प्ले चुनें और देखने के लिए रोकें (चित्रा 6 डी)
  4. बढ़त रिकॉर्ड करने के लिए, रिकॉर्ड दबाएँ (चित्रा 6D). सहेजने से पहले रिकॉर्डिंग देखने के लिए, डॉक किए गए संवाद मेनू के शीर्ष पर कैमरा नियंत्रण-लाइन पर जाएं और प्लेबैक चुनें। रिकॉर्ड किए गए वीडियो को देखने के लिए प्ले चुनें और देखना बंद करें (चित्रा 10 ए)।
    नोट: सहेजने से पहले रिकॉर्ड किए गए किनारे को देखना बंद करें।

Figure 10
चित्रा 10: सॉफ्टवेयर के उपयोग का विवरण। (ए) प्लेबैक मोड। बीट सिलिएटेड एज के रिकॉर्ड किए गए वीडियो अनुक्रम की समीक्षा करने के लिए, प्लेबैक मोड चुनें। छवि देखने के लिए प्ले चुनें और देखना समाप्त करने के लिए रोकें । सिलियरी फ़ंक्शन के विश्लेषण में सुधार करने के लिए प्रसिद्धि दर को समायोजित किया जा सकता है (बी, सी) बीटिंग सिलिएटेड किनारों की वीडियो रिकॉर्डिंग को सहेजना (बी) वीडियो को बचाने के लिए, फ़ाइल चुनें फिर अधिग्रहण सहेजें। (सी) रिकॉर्ड किए गए वीडियो का नाम दर्ज करें और उस स्थान का चयन करें जहां वीडियो रिकॉर्ड किया गया है। सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग एक के रूप में सहेजी गई है। रॉ फ़ाइल (डी) बीटिंग सिलिएटेड किनारों की रिकॉर्डिंग का विकल्प विश्लेषण किया जाना है: वीडियो रिकॉर्डिंग खोलने के लिए, फ़ाइल चुनें, फिर खोलें, फिर छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. डेटाबेस में वीडियो सहेजें (चित्रा 10बी, सी)।
    1. शीर्ष बाएं कोने में फ़ाइल खोलें, फिर अधिग्रहण सहेजें (चित्रा 10 बी)।
    2. अधिग्रहण सहेजें में, रिकॉर्ड किए गए वीडियो का नाम दर्ज करें और सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग को RAW फ़ाइल प्रकार प्रारूप (चित्रा 10C) के रूप में सहेजा गया है।
  2. जब वीडियो सहेजा जाता है, तो लाइव मोड पर लौटें (डॉक किए गए संवाद मेनू के शीर्ष पर कैमरा नियंत्रण-लाइन पर वापस जाएं और लाइव चुनें) (चित्रा 6 डी)।
  3. सीएफए के लिए आवश्यक चयन मानदंडों को पूरा करने वाले किनारों की संख्या रिकॉर्ड करने के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
    नोट: स्लाइड की तैयारी के बाद अधिकतम 20 मिनट के भीतर (निर्जलीकरण से बचने के लिए) एक स्लाइड से चयन मानदंडों को पूरा करने वाले कई बीटिंग सिलिएटेड किनारों को रिकॉर्ड करना संभव है। 20 मिनट के बाद, यदि चयन मानदंडों को पूरा करने वाले पर्याप्त किनारे प्राप्त करना संभव नहीं है, तो एक नई स्लाइड तैयार करें।
  4. गर्म बॉक्स से स्लाइड निकालें।
  5. आयताकार कवरस्लिप को हटा दें और इसे विशिष्ट खतरनाक चिकित्सा अपशिष्ट कंटेनर में फेंक दें।
  6. स्लाइड को साफ करें (उस पर चिपके हुए दो वर्ग कवर स्लिप के साथ) 70% इथेनॉल और शोषक कागज के साथ। एक बार स्लाइड साफ हो जाने के बाद, इसे फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. कोविड-19 अनुकूलन: एक एयरटाइट बैग में कवरस्लिप और स्पेसर के साथ स्लाइड रखें, दस्ताने और मास्क हटा दें और उन्हें एयरटाइट बैग में रखें। एयरटाइट बैग को विशिष्ट खतरनाक चिकित्सा अपशिष्ट कंटेनर में रखें।

8. सिलियरी कार्यात्मक विश्लेषण

  1. मैनुअल सीबीएफ और सीबीपी मूल्यांकन करने के लिए प्रारंभिक तैयारी
    1. सॉफ़्टवेयर खोलें.
    2. शीर्ष बाएँ कोने में फ़ाइल खोलें, फिर खोलें और फिर छवियाँ (चित्र 10D).
    3. विश्लेषण करने के लिए वीडियो चुनें।
    4. डॉक किए गए संवाद मेनू के शीर्ष पर कैमरा नियंत्रण-लाइन पर जाएं और प्लेबैक (चित्रा 10 ए) का चयन करें। रिकॉर्ड किए गए वीडियो को देखने के लिए प्ले चुनें और देखना समाप्त करने के लिए रोकें ।
  2. मैनुअल सिलियरी बीट आवृत्ति (सीबीएफ) विश्लेषण
    1. सीबीएफ का मूल्यांकन केवल साइडवेज किनारों का उपयोग करके करें।
    2. सिलिएटेड किनारों को लगभग 5 आसन्न क्षेत्रों में विभाजित करें, प्रत्येक को लगभग 10 μm मापा जाता है (चित्र 11)।
    3. कम फ्रेम दर पर सिलिया या सिलिया के समूहों की पहचान और कल्पना करें, और प्रत्येक क्षेत्र में अधिकतम 2 सीबीएफ माप किए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक किनारे के साथ अधिकतम 10 सीबीएफ माप होते हैं (चित्रा 11)।
    4. सिलिया के एक समूह के लिए 5 बीट चक्र ों को पूरा करने के लिए आवश्यक फ्रेम की संख्या रिकॉर्ड करें।
    5. एक साधारण गणना द्वारा सीबीएफ में परिवर्तित करें: (सीबीएफ = रिकॉर्डिंग फ्रेम दर (हर्ट्ज)/(5 बीट के लिए फ्रेम की संख्या) x 5)13,16,30। इम्मोटाइल सिलिया को 0 हर्ट्ज 13 के सीबीएफ के रूप में रिपोर्ट कियागया है।
      नोट: रिकॉर्ड किए गए वीडियो (चित्रा 10 ए) को वापस चलाते समय फ्रेम दर समायोजित करें। यह विशेष रूप से उपयोगी है जब सिलिया ने बहुत धीरे-धीरे बीट का विश्लेषण किया। फ्रेम दर बढ़ाने से यह परिभाषित करने में मदद मिलती है कि सिलिया बहुत धीरे-धीरे धड़कता है या इम्मोटाइल है।
    6. प्रत्येक नमूने के लिए, स्थिर सिलिया सहित साइडवेज प्रोफाइल में दर्ज सभी सीबीएफ के औसत (एसडी) या (95% सीआई) के रूप में औसत सीबीएफ की गणना करें।

Figure 11
चित्रा 11: एक इष्टतम गुणवत्ता किनारे की प्रतिनिधि छवि, और सीएफए विश्लेषण की अनुमति देने के लिए 5 क्षेत्रों में विभाजन। एक इष्टतम गुणवत्ता वाले सिलिएटेड एपिथेलियल किनारे को 5 आसन्न क्षेत्रों में विभाजित किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक 10 μm मापता है। प्रत्येक क्षेत्र में अधिकतम 2 सीबीएफ माप (और 2 सीबीपी मूल्यांकन) किए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक किनारे पर अधिकतम 10 सीबीएफ माप (और सीबीपी मूल्यांकन) होते हैं। स्केल बार = 20 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. मैनुअल सिलियरी बीट पैटर्न (सीबीपी) विश्लेषण
    1. डिस्केनेसिया के मार्करों का मूल्यांकन करने के लिए, केवल साइडवे प्रोफाइल का उपयोग करें; सीबीपी13 के प्रकार को चिह्नित करने के लिए पर्यवेक्षक की ओर और ऊपर से विमानों का उपयोग करें। सीबीपी मूल्यांकन के लिए विभिन्न तरीके और स्कोर मौजूद हैं। नीचे डिस्केनेसिया के मार्करों की परिभाषा के साथ प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली विधि का वर्णन किया गया है।
    2. नमूने के भीतर प्रत्येक अलग सीबीपी का प्रतिशत
      1. सीबीएफ माप (चित्रा 11) के लिए पहचाने गए और उपयोग किए जाने वाले सिलिया के प्रत्येक सिलिया या समूह के लिए, कम फ्रेम दर पर एक सीबीपी विश्लेषण करें: डीएचएसवी विश्लेषण12,30 पर देखे गए सामान्य सीबीपी के साथ पूर्ण बीट चक्र के दौरान सिलिया द्वारा लिए गए सटीक पथ की तुलना करें।
      2. विश्लेषण किए गए प्रत्येक सिलिया या समूह के लिए एक अलग सीबीपी (सामान्य, इम्मोटिल, कठोर, गोलाकार, अतुल्यकालिक (असमन्वित सिलिअरी बीटिंग) या डिस्काइनेटिक13) का श्रेय दें।
      3. प्रत्येक नमूने के लिए, नमूने के भीतर प्रत्येक अलग सीबीपी के प्रतिशत की गणना करें; नमूने के लिए जिम्मेदार सीबीपी प्रमुख सीबीपी है।
    3. डिस्केनेसिया के 3 मार्करों की गणना करें।
      1. इम्मोटिलिटी इंडेक्स (आईएमआई) की गणना करें: नमूने के भीतर इम्मोटिल सिलिया का प्रतिशत (नमूना एक्स 100 में सीबीएफ की संख्या = 0/ सीबीएफ रीडिंग की कुल संख्या)। IMI को माध्य (SD) या (95% CI) 1,16,31 के रूप में व्यक्त करें।
      2. डिस्केनेसिया स्कोर (डीकेएस) की गणना करें। प्रत्येक सिलिएटेड किनारे को क्वाड्रंट में विभाजित करें, और डिस्काइनेटिक (या असामान्य रूप से धड़कने वाली) सिलिया वाले क्वाड्रंट की संख्या निर्धारित की जाती है। यह 0 और 4 के बीच डीकेएस की गणना करने की अनुमति देता है (0: किनारे पर सामान्य सीबीपी; 1: सिलिया के ≤ 25% में असामान्य सीबीपी; 2: सिलिया के ≤ 50% में असामान्य सीबीपी; 3: सिलिया के 75% ≤ में असामान्य बीट पैटर्न; और 4: सभी सिलिया में असामान्य सीबीपी)। नमूना16,29 के लिए औसत डीकेएस (इंटरक्वार्टाइल रेंज) की गणना की जाती है।
      3. सामान्य धड़कन के प्रतिशत की गणना करें: नमूने के भीतर एक सामान्य सीबीपी के साथ सिलिया के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किया गया है (नमूना एक्स 100 के लिए सामान्य सीबीपी रीडिंग की संख्या / सीबीपी रीडिंग की कुल संख्या)।

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Representative Results

तकनीक की दक्षता को स्पष्ट करने के लिए, हम 16 स्वस्थ वयस्क स्वयंसेवकों (5 पुरुष, आयु सीमा 22-54 वर्ष) की एक श्रृंखला में सीएफए के परिणामों को प्रस्तुत करते हैं।

कुल 16 स्वयंसेवकों में से 14 (4 पुरुष, आयु सीमा 24-54 वर्ष) से नाक ब्रशिंग नमूनों ने पर्याप्त उपयुक्त उपकला किनारों को प्रदान किया जो सीएफए करने के लिए आवश्यक चयन मानदंडों को पूरा करते थे। इन 14 नाक ब्रशिंग नमूनों से, कुल 242 सिलिएटेड किनारों को दर्ज किया गया था, और 212 किनारों ने परिभाषित समावेश मानदंडों को पूरा किया और उनका विश्लेषण किया गया। इन सभी किनारों को साइडवेज प्रोफाइल में दर्ज किया गया था (पर्यवेक्षक के ऊपर से सिलिया बीटिंग को दर्ज किया गया था और प्रत्येक स्वयंसेवक के लिए विश्लेषण किया गया था ताकि यह आकलन किया जा सके कि क्या एक गोलाकार सीबीपी13 देखा गया था, लेकिन इन किनारों को सीएफए के लिए शामिल नहीं किया गया था)। कुल 807 सीबीएफ माप और सीबीपी मूल्यांकन सिलिया या विश्लेषण किए गए सिलिया के समूहों से प्राप्त किए गए थे (तालिका 1)। प्रत्येक स्वस्थ विषय के लिए सीएफए के विस्तृत परिणाम तालिका 1 में प्रस्तुत किए गए हैं।

14 विषयों के लिए औसत सीबीएफ (± मानक विचलन) जिनके नमूने समावेश मानदंडों को पूरा करते थे, 14.79 (± 2.17) हर्ट्ज था। यह 37 डिग्री सेल्सियस16,29,30 के नियंत्रित तापमान पर डीएचएसवी करने वाली प्रयोगशालाओं में पिछले प्रकाशित संदर्भ डेटा से सहमत है, जबकि कमरे के तापमान पर डीएचएसवी करने वाली प्रयोगशालाओं में सीबीएफ मापकम 15,32,33 हैं। स्वस्थ विषयों के लिए सामान्य सीबीपी का औसत (± मानक विचलन) प्रतिशत 78.82 (± 14.73) % था, और इनमें से प्रत्येक स्वस्थ विषयों के लिए, प्रमुख बीट पैटर्न सामान्य था। स्वस्थ विषयों में एक गोलाकार बीट पैटर्न में कोई सिलिया नहीं पाया गया, जैसा कि पहले16,34 बताया गया था।

औसत आईएमआई (± मानक विचलन) 2.27 (± 2.3) % था और औसत डीएसके (इंटरक्वार्टाइल रेंज) 0 (0-1) था। ये मान स्वस्थ स्वैच्छिक16,29 से संबंधित पिछले प्रकाशन के समान थे। यह ध्यान रखना दिलचस्प है कि डीएसके और सीबीएफ मामूली प्रक्षेपण (चित्रा 9) के साथ केवल सामान्य किनारों या किनारों का चयन करते समय प्राप्त विश्लेषण से थॉमस एट अल द्वारा रिपोर्ट किए गए मूल्यों के समान थे, जो केवल उन किनारों का विश्लेषण करने के महत्व को दर्शाते हैं जो समावेश मानदंड29 को पूरा करते हैं। यदि कम गुणवत्ता वाले किनारों का उपयोग किया जाता है, तो उन्होंने कम सीबीएफ और उच्च डीकेएस29 की सूचना दी। इससे पता चलता है कि उपकला किनारों का उपयोग करना जो चयन मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं, गलत तरीके से पीसीडी निदान का कारण बन सकते हैं।

इसलिए, पीसीडी नैदानिक उपकरण के रूप में उपयोग किए जाने के लिए, नाक ब्रशिंग नमूनों से सीएफए को इष्टतम गुणवत्ता वाले उपकला स्ट्रिप्स (चित्रा 12 ए) का उपयोग करके किया जाना चाहिए, जो नाक ब्रशिंग नमूनों के इष्टतम प्रसंस्करण और एक इष्टतम किनारे चयन द्वारा प्राप्त किया जाना चाहिए। जैसा कि प्रोटोकॉल में बताया गया है, केवल कम से कम 50 μm लंबाई में बरकरार अबाधित सिलिएटेड उपकला किनारों का उपयोग किया जाना चाहिए, और सीएफए को बलगम और मलबे से मुक्त केवल सिलिया का उपयोग करके किया जाना चाहिए। साइडवेज प्रोफाइल में, सीबीएफ और सीबीपी के 2 से कम मूल्यांकन की अनुमति देने वाले बीटिंग किनारों को बाहर रखा जाना चाहिए।

इसके अलावा, लाल रक्त कोशिका और बलगम मुक्त सिलिया पिटाई को अवरुद्ध कर सकते हैं, या पर्यवेक्षक से सिलिया को छिपा सकते हैं (चित्रा 12 बी)। बलगम की मात्रा को रोगी को नाक ब्रश करने से पहले अपनी नाक उड़ाने के लिए कहकर सीमित किया जा सकता है, और तीव्र नाक की सूजन के दौरान नाक ब्रश करने से बचने के लिए (सूजन बलगम की मात्रा बढ़ जाती है, और नाक ब्रश करते समय रक्तस्राव का खतरा बढ़ जाता है)। इसके अलावा, मामूली रक्तस्राव को सीमित करने के लिए नाक ब्रशिंग कोमल होनी चाहिए और इस प्रकार लाल रक्त कोशिकाओं की मात्रा। लेकिन, दूसरी ओर, यदि ब्रश हीन नाक टर्बिनेट के खिलाफ मजबूती से नहीं दबाता है, तो नाक ब्रशिंग नमूने में पर्याप्त उच्च गुणवत्ता वाले सिलिएटेड एपिथेलियल स्ट्रिप्स नहीं हो सकते हैं (चित्रा 12सी, डी)।

अंत में, यदि नाक ब्रशिंग नाक गुहा के पूर्ववर्ती भाग पर की जाती है, तो कोई सिलिएटेड कोशिकाएं प्राप्त नहीं होंगी, क्योंकि नाक के इस हिस्से को संक्रमणकालीन गैर-सिलिएटेड एपिथेलियम (चित्रा 12 ई) के साथ पंक्तिबद्ध किया जाता है। इसलिए, नाक ब्रशिंग नमूने की गुणवत्ता साइडवेज प्रोफाइल में सिलिया बीटिंग के न्यूनतम 6 किनारों (और ऊपर से सिलिया बीटिंग के 1 किनारे) को शामिल करने के मानदंडों को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है।

16 स्वस्थ स्वयंसेवकों में से, 2 नाक ब्रशिंग नमूने सीएफए के लिए बाहर रखे गए थे। एक विषय को बाहर रखा गया था क्योंकि नमूना समावेश मानदंडों को पूरा करने वाले सिलिएटेड किनारों की आवश्यक संख्या प्रदान नहीं कर सका, जिसमें मुख्य रूप से नमूने के भीतर पृथक कोशिकाएं पाई गईं (चित्रा 12 डी)। दूसरे विषय को बाहर रखा गया था क्योंकि दर्ज किए गए सभी उपकला किनारों (एन = 7) गैर-सिलिएटेड थे (चित्रा 12 ई), यह सुझाव देते हुए कि नाक ब्रशिंग बहुत पूर्ववर्ती थी, और अवर टर्बिनेट पर ठीक से प्रदर्शन नहीं किया गया था। यह निष्कर्ष निकाला गया था क्योंकि विषय एक स्वस्थ स्वयंसेवक था। बार-बार नाक ब्रश करने वाले नमूने जो पीसीडी के संदेह के साथ एक रोगी में केवल गैर-सिलिएटेड उपकला किनारों का उत्पादन करते हैं, जिससे मल्टीपल मोटिल सिलिया (आरजीएमसी) की कम पीढ़ी का निदान हो सकता है, जो सिलियोजेनेसिस3,35,36 में विफलता के कारण एक म्यूकोसिलरी क्लीयरेंस डिसऑर्डर है।

कोविड-19 महामारी के कारण, लीज विश्वविद्यालय के डायग्नोस्टिक सेंटर को सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल को अपनाना पड़ा। महामारी से पहले, हमने एक खुले विज़ुअलाइज़ेशन चैंबर का उपयोग किया था जो नमूने और पर्यावरण के बीच गैस और आर्द्रता विनिमय की अनुमति देता था। चूंकि यह संभावित रूप से ऑपरेटर और / या पर्यावरण के संदूषण का कारण बन सकता है, इसलिए हमने एक बंद विज़ुअलाइज़ेशन कक्ष पर स्विच किया, और गैस और तरल के लिए इस कक्ष की जड़ी-बूटियों का परीक्षण किया गया। चित्रा 13 एक दो तरफा अटके हुए स्पेसर का उपयोग करके बंद विज़ुअलाइज़ेशन कक्ष के सील परीक्षण को दर्शाता है। कक्ष को ट्रिपैन नीले और हवा के 60 μL से भरकर, फिर 4 घंटे के दौरान कक्ष को पानी में डुबोकर हर्मेटिकिटी का परीक्षण किया गया था। जैसा कि हमने 4 घंटे के दौरान पानी के भीतर ट्रिपैन ब्लू रिसाव या हवा के बुलबुले नहीं देखे, हमने निष्कर्ष निकाला कि चैंबर तरल और गैस दोनों के लिए हर्मेटिक रूप से सील किया गया था। महामारी के दौरान सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी करने के लिए इस बंद विज़ुअलाइज़ेशन चैंबर के उपयोग को लीज विश्वविद्यालय के कार्य में स्वच्छता और स्वास्थ्य संरक्षण विभाग द्वारा अनुमोदित किया गया है।

स्वस्थ स्वयंसेवक नहीं। दर्ज किए गए एज नहीं। किनारों का विश्लेषण सीबीएफ माप की संख्या CBF (Hz)
(एसडी ± औसत)		 सामान्य सीबीपी (%)
(एसडी ± औसत)		 IMI (%)
(एसडी ± औसत)		 DSK Median
(इंटरक्वार्टाइल रेंज)
1 21 16 52 16.59 ± 3.83 82.7 0 0 (0-2)
2 11 7 34 18.4 ± 5.32 97.1 0 0 (0-1)
3 12 11 48 12.12 ± 1.87 91.7 0 0 (0-2)
4 20 20 60 15.18 ± 3.29 86.7 1.67 0 (0-1)
5 18 14 54 11.82 ± 3.97 87 3.7 0 (0-1)
6 15 11 51 16.23 ± 5.5 76.5 5.9 1 (1-2)
7 21 18 60 14.37 ± 4.12 68.3 3.3 1 (0-2)
8 19 18 51 14.12 ± 4.79 74.5 5.9 1 (0-2)
9 17 17 37 16.77 ± 4.74 89.2 0 0 (0-2)
10 15 15 69 16.49 ± 4.44 75.4 2.9 1 (1-2)
11 15 14 77 14.53 ± 2.42 81.8 0 0 (0-2)
12 16 11 48 15.27 ± 2.38 81.3 0 0 (0-2)
13 24 22 72 14.8 ± 4.07 86.1 4.17 0 (0-2)
14 18 18 94 10.4 ± 3.43 79.8 4.26 1 (0-1)
कुल: 242 212 807 14.79 ± 2.17 82.72 ± 7.62 2.27 ± 2.3 0 (0-1)

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, दर्ज और विश्लेषण किए गए किनारों की संख्या, प्राप्त सीबीएफ मापों की संख्या, और सीबीएफ के मूल्य, 14 स्वस्थ विषयों में सामान्य सीबीपी, आईएमआई, डीएसके का प्रतिशत। सीबीएफ = सिलियरी बीट आवृत्ति, सीबीपी = सिलियरी बीट पैटर्न, आईएमआई = इम्मोटैलिटी इंडेक्स और डीएसके = डिस्केनेसिया स्कोर।

Figure 12
चित्रा 12: नाक ब्रशिंग की जटिलता को दर्शाता चित्र। (ए) "इष्टतम गुणवत्ता उपकला पट्टी": बरकरार एक समान सिलिएटेड एपिथेलिया स्ट्रिप लंबाई में 50 μm >, जिससे सीबीएफ और सीबीपी मूल्यांकन के लिए 2 से अधिक सिलिया या सिलिया के समूह का उपयोग किया जा सकता है (यानी, सिलिया बलगम या मलबे में फंसे बिना, साइडवेज प्रोफाइल में स्वतंत्र रूप से धड़क रहा है)। (बी) एक सिलिएटेड एपिथेलियल स्ट्रिप के ऊपर बड़ी मात्रा में कोशिकाओं और बलगम का प्रतिनिधित्व करने वाली छवि, सिलिया को स्वतंत्र रूप से पीटने से रोकती है, और पर्यवेक्षक से सिलिया को छिपाती है। (सी) दर्ज किए गए किनारे की गुणवत्ता अपर्याप्त है, क्योंकि यह प्रमुख प्रक्षेपण29 के साथ बढ़त है। (डी) एकल सिलिएटेड सेल, जिसका उपयोग सिलियरी कार्यात्मक विश्लेषण के लिए नहीं किया जा सकता है। (ई) नाक ब्रशिंग नाक गुहा के पूर्ववर्ती भाग पर की गई है, जिसे संक्रमणकालीन गैर-सिलिएटेड एपिथेलियम के साथ पंक्तिबद्ध किया गया है। इसलिए, कोई सिलिएटेड कोशिकाएं प्राप्त नहीं की गईं। स्केल बार = 20 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 13
चित्रा 13: गैस और ट्रिपैन ब्लू समाधान के साथ स्पेसर का सील परीक्षण। ट्राइपैन ब्लू और एयर के 60 μL के साथ कक्ष को भरकर, फिर कक्ष को 4 घंटे के लिए पानी में डुबोकर स्पेसर की जड़ी-बूटियों का परीक्षण किया गया था। जैसा कि हमने 4 घंटों के दौरान पानी के भीतर ट्रिपैन ब्लू रिसाव या हवा के बुलबुले नहीं देखे, हमने निष्कर्ष निकाला कि चैंबर गैस और तरल दोनों के लिए हर्मेटिक था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पेपर का उद्देश्य कोविड-19 महामारी के दौरान उचित संक्रमण नियंत्रण विचारों के लिए किए गए समायोजन के साथ नाक ब्रशिंग नमूनों का उपयोग करके सीएफए के लिए एक मानक संचालन प्रक्रिया प्रदान करना है। पीसीडी निदान चुनौतीपूर्ण है, और वर्तमान में अंतरराष्ट्रीय सिफारिश के अनुसार विभिन्न नैदानिक परीक्षणों के एक पैनल की आवश्यकता होती है, जिसमें नाक नाइट्रिक ऑक्साइड माप, डीएचएसवी का उपयोग करके सीएफए, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके सिलियरी अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण, इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके सिलियरी प्रोटीन का लेबलिंग, और पीसीडी के कारण जीन 4,37 के लिए आनुवंशिक परीक्षण शामिल हैं। वर्तमान में, कोई भी परीक्षण पीसीडी 4,37 के साथ प्रत्येक रोगी का निदान नहीं करेगा। यूरोपीय श्वसन सोसायटी के दिशानिर्देशों के अनुसार, केवल टीईएम द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चरल दोष और पीसीडी के कारण जीन में द्वि-एलील उत्परिवर्तन पीसीडी निदान की पुष्टि कर सकते हैं। दुर्भाग्य से, इन परीक्षणों में झूठे नकारात्मक परिणामों की 15-30% दर 4,37,38,39 है। डीएचएसवी में पीसीडी निदान (0.95-1.00 और 0.91-0.96, क्रमशः) 31,38,40,41 के लिए उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता होने का लाभ है, लेकिन हाल की अंतरराष्ट्रीय सिफारिशों में कहा गया है कि वर्तमान में, डीएचएसवी पीसीडी निदान 4,37 की पुष्टि करने के लिए पर्याप्त रूप से मानकीकृत नहीं है. दरअसल, सिलियेटेड नमूना तैयार करने और प्रसंस्करण के लिए सटीक संचालन प्रक्रिया की कमी है, सिलियरी फ़ंक्शन 4,8,13,16,34,38,40 की व्याख्या के लिए मानकीकृत सीएफए विधि और मानक कार्यात्मक विश्लेषण डेटा की कमी है। यह पेपर श्वसन सिलिएटेड एपिथेलियल नमूने प्राप्त करने और संसाधित करने के लिए केंद्र में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करता है, और सिलिअरी कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए। चूंकि वर्तमान में डीएचएसवी प्रोटोकॉल के लिए कोई अंतरराष्ट्रीय सहमति नहीं है, इसलिए प्रक्रिया के कुछ चरण केंद्रों के बीच भिन्न हो सकते हैं। सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी के दौरान तापमान, माध्यम का उपयोग, और विश्लेषण किए गए उपकला किनारों की गुणवत्ता जैसे कारकों में भिन्नता सभी सिलिअरी फ़ंक्शन13 को प्रभावित कर सकती है।

डीएचएसवी विश्लेषण के दौरान स्थापित तापमान में भिन्नता केंद्रों के बीच मौजूद है, कुछ लोग कमरे के तापमान13 पर डीएचएसवी करने की वकालत करते हैं। हम 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना विश्लेषण करने की वकालत करते हैं। यह सेट अप की जटिलता को बढ़ाता है, लेकिन यदि सीबीपी विश्लेषण 37 डिग्री सेल्सियस के तहत किया जाता है तो पीसीडी निदान छूट सकता है। जैक्सन एट अल ने पीसीडी के एक तापमान-संवेदनशील संस्करण की सूचना दी, जो कमरे के तापमान पर सिलिया देखे जाने पर एक सामान्य समन्वित बीट पैटर्न के साथ प्रस्तुत होता है, लेकिन 37 डिग्री सेल्सियस42 पर एक असामान्य हाइपरफ्रीक्वेंट और डिस्काइनेटिक पैटर्न। इसके अलावा, यह अच्छी तरह से वर्णित किया गया है कि सीबीएफ तापमान के साथ भिन्न होता है, जिसमें सिग्मोइडल संबंध43,44 होता है, ताकि सीबीएफ संदर्भ डेटा डीएचएसवी करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तापमान के अनुसार भिन्न हो।

इसके अलावा, वर्तमान में सीबीएफ और सीबीपी मूल्यांकन13 के लिए मैनुअल और / या कंप्यूटर सहायता प्राप्त विधि में मानकीकरण की कमी है। इस पेपर में, हम अपनी प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली मैनुअल सीबीएफ और सीबीपी मूल्यांकन तकनीक का प्रस्ताव करते हैं।

चूंकि डीएचएसवी डेटा के मैनुअल प्रसंस्करण में कुछ व्यक्तिपरकता शामिल है और इसमें समय लगता है, इसलिए सीबीएफ और सीबीपी मूल्यांकन के लिए विभिन्न प्रकार के सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन विकसित किए गए हैं, जो विभिन्न अर्ध-स्वचालित (जांच करने के लिए रुचि के विशिष्ट क्षेत्रों (आरओआई) के चयन को शामिल करते हैं) या पूरी तरह से स्वचालित कार्यक्रम34,45,46 (पूरी कैप्चर की गई छवि का विश्लेषण)। सभी प्रोग्राम सीबीएफ की गणना करने के लिए समय के साथ रिकॉर्ड किए गए वीडियो छवियों के पिक्सेल में प्रकाश तीव्रता में भिन्नता का उपयोग करते हैं। हालांकि, अधिकांश कार्यक्रमों में शोर को कम करने के लिए विशिष्ट डेटा का मैनुअल या स्वचालित बहिष्करण शामिल होता है: ठहराव के क्षेत्र, ऐसे क्षेत्र जहां सीबीएफ या सिलियरी बीट आयाम (सीबीए) विशेष सीमा मूल्यों के अंतर्गत आते हैं। मैनुअल और स्वचालित सीबीएफ मूल्यांकन के बीच तुलना केवल एक कार्यक्रम45 के लिए प्रकाशित की गई है, और कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया गया है (युग्मित टी-टेस्ट, पी = 0,64)। 75 पीसीडी रोगियों पर हाल के परिणामों ने फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्मेशन (एफएफटी) और किमोग्राफी 47 द्वारा प्राप्त सीबीएफ मूल्यांकन के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहींदिखाया। सीबीपी विश्लेषण के लिए विभिन्न कंप्यूटर-सहायता प्राप्त सॉफ्टवेयर 48,49,50 विकसित किए गए हैं, जिनमें से ज्यादातर सीमित आरओआई में सीबीपी का मूल्यांकन शामिल है, लेकिन वर्तमान में, कोई भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है।

हमारे ज्ञान के लिए, यह डीएचएसवी का उपयोग करके सीएफए के लिए पहली प्रकाशित मानक संचालन प्रक्रिया है। ताजा नाक ब्रशिंग नमूने का उपयोग करने वाले सीएफए की कुछ सीमाएं हैं; जिनमें से अधिकांश श्वसन सिलिएटेड कोशिकाओं के संवर्धन के बाद सिलियरी फ़ंक्शन का पुन: विश्लेषण करके ओवर-आते हैं। सबसे पहले, नमूनाकरण के दौरान संक्रमण, सूजन या क्षति से द्वितीयक सिलियरी कार्यात्मक असामान्यताएं हो सकती हैं। श्वसन सिलिएटेड कोशिकाओं की संस्कृति डीएचएसवी की सटीकता में सुधार कर सकती है, विशेष रूप से झूठे सकारात्मकपरिणामों को खारिज करने के लिए। दूसरा, चूंकि पीसीडी रोगी पुरानी श्वसन सूजन और संक्रमण के साथ मौजूद हैं, सिलिएटेड एपिथेलियम का संवर्धन आवश्यक हो सकता है, क्योंकि नाक ब्रशिंग प्रक्रिया करने के लिए संक्रमण से मुक्त 4-6 सप्ताह का अंतर ढूंढना मुश्किल हो सकता है। तीसरा, नाक ब्रशिंग नमूने की गुणवत्ता विशेष रूप से छोटे बच्चों में उच्च गुणवत्ता वाले किनारों की आवश्यक संख्या प्रदान करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकती है। नमूनों की खेती इस मुद्दे को दूर करने में मदद कर सकती है। अंत में, सीएफए मुश्किल हो सकता है यदि नमूने में कई सेल मलबे या बलगम का उच्च भार होता है; यह भी हल किया जा सकता है यदि सेल संस्कृति के बाद सीएफए किया जाता है। इसके अलावा, अनुभवी केंद्रों में व्यापक कर्मचारी प्रशिक्षण महत्वपूर्ण है, क्योंकि सीबीपी असामान्यताओं का पता लगाना जांचकर्ता 4,13 के अनुभव पर दृढ़ता से निर्भर है। स्वचालित सीबीपी मूल्यांकन सॉफ्टवेयर का विकास और सत्यापन संभावित रूप से इस उपयोगकर्ता निर्भर परिवर्तनशीलता में सुधार करेगा और पीसीडी नैदानिक उद्देश्यों के लिए डीएचएसवी के उपयोग को चौड़ा करेगा।

परिणाम प्रभावी सीएफए की अनुमति देने के लिए नाक ब्रशिंग तकनीक के महत्व को भी प्रदर्शित करते हैं। सावधानीपूर्वक नाक ब्रशिंग तकनीक इष्टतम गुणवत्ता वाले उपकला सिलिएटेड स्ट्रिप्स प्राप्त करने की क्षमता को बढ़ाती है। विशेष रूप से, प्रक्रिया से पहले नाक उड़ाना बलगम को सीमित करता है, कोमल ब्रशिंग करने से लाल रक्त कोशिकाएं कम हो जाती हैं और ब्रश के सही प्लेसमेंट से सिलिएटेड एपिथेलियम प्राप्त करने की सफलता दर बढ़ जाती है क्योंकि नाक गुहा के पूर्ववर्ती भाग को ब्रश करने से गैर-सिलिएटेड एपिथेलियम वापस आ जाता है।

कोविड-19 महामारी के स्वास्थ्य संकट के कारण, संक्रमण नियंत्रण के विचारों ने हमें सिलियरी वीडियोमाइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल के कई पहलुओं को अनुकूलित करने के लिए प्रेरित किया है। महामारी से पहले, हमने एक खुले प्रयोगशाला-निर्मित कक्ष का उपयोग किया था। इस कक्ष के लाभों में तैयारी और उपयोग करने में इसकी आसानी और त्वरितता, लागत और सफाई के बाद पुन: उपयोग करने की क्षमता शामिल है। हालांकि, कुछ महत्वपूर्ण चेतावनियां हैं। माध्यम की मात्रा महत्वपूर्ण है: सिलिएटेड स्ट्रिप्स को ठीक से पीटने के लिए अच्छी तरह से हाइड्रेटेड होने की आवश्यकता होती है, लेकिन बहुत अधिक मीडिया खुले कक्ष से बाहर निकल जाएगा और तेल के साथ मिश्रण करेगा, जिससे एक अच्छी छवि को रोका जा सकेगा। इसके अलावा, निर्जलीकरण से बचने के लिए नमूनों को अधिकतम 20 मिनट के भीतर देखा जाना चाहिए। यह संभावित रूप से दूर किया जा सकता है यदि कवरस्लिप के नीचे सीधे सिरिंज का उपयोग करके अतिरिक्त एम 199 माध्यम जोड़ा जाता है। कोविड-19 महामारी के संदर्भ में, खुले कक्ष की प्रमुख समस्या यह है कि यह तैयारी और पर्यावरण के बीच गैस और आर्द्रता विनिमय की अनुमतिदेता है। यदि नमूना कोविड-19 से संक्रमित होता है तो प्रयोगशाला और ऑपरेटर संदूषण का संभावित खतरा होता है। हमने एक स्पेसर का उपयोग करके एक बंद विज़ुअलाइज़ेशन कक्ष की पहचान की, और इसकी प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया। हमने कोविड-19 संक्रमण को फैलने से रोकने के उद्देश्य से कड़े संक्रमण नियंत्रण उपायों को ध्यान में रखते हुए नाक ब्रश करने से लेकर स्लाइड तैयारी और विश्लेषण तक प्रोटोकॉल में संशोधन किया है। इन अनुकूलनों ने हमें स्तर 2 जैव-सुरक्षित प्रयोगशाला का उपयोग किए बिना पीसीडी नैदानिक सेवा प्रदान करना जारी रखने की अनुमति दी है। इस वर्तमान स्वास्थ्य संकट की अनिश्चित लंबाई को देखते हुए, और डीएचएसवी जैसी आवश्यक पीसीडी नैदानिक सेवाएं प्रदान करना जारी रखने के महत्व को देखते हुए, इस पेपर में प्रस्तावित अनुकूलन इस स्वास्थ्य संकट के दौरान अन्य आवश्यक गतिविधियों के लिए अनिवार्य एल 2 जैव-सुरक्षा प्रयोगशाला संसाधनों का उपयोग किए बिना सीएफए करना संभव बनाते हैं।

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Disclosures

इन लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम जीन-फ्रैंकोइस पापोन, ब्रूनो लुइस, एस्टेल एस्कुडियर और पेरिस-एस्ट के पीसीडी डायग्नोस्टिक सेंटर के सभी टीम के सदस्यों को उनके पीसीडी डायग्नोस्टिक सेंटर की यात्रा के दौरान उनकी उपलब्धता और हार्दिक स्वागत के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम रॉबर्ट हर्स्ट और लीसेस्टर के पीसीडी केंद्र में सभी टीम के सदस्यों को उनके स्वागत और समय, सलाह और विशेषज्ञता के लिए भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution

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References

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