Summary
Para garantir uma análise funcional ciliar bem-sucedida e de alta qualidade para o diagnóstico da DCP, um método preciso e cuidadoso para amostragem e processamento do epitélio respiratório é essencial. Para continuar prestando serviço de diagnóstico de PCD durante a pandemia de COVID-19, o protocolo de videomicroscopia ciliar foi atualizado para incluir medidas adequadas de controle de infecção.
Abstract
A discinesia ciliar primária (DCP) é uma ciliopatia móvel genética, levando a doença otosinopulmonar significativa. O diagnóstico de DCP é frequentemente perdido ou atrasado devido a desafios com diferentes modalidades diagnósticas. A videomicroscopia ciliar, utilizando a Videomicroscopia Digital de Alta Velocidade (DHSV), uma das ferramentas diagnósticas para a DCP, é considerada o método ideal para a realização da análise funcional ciliar (AFC), compreendendo a análise da frequência dos batimentos ciliares (FSC) e do padrão dos batimentos (CBP). No entanto, o DHSV carece de procedimento operacional padronizado e publicado para processamento e análise de amostras. Ele também usa epitélio respiratório vivo, um problema significativo de controle de infecção durante a pandemia COVID-19. Para continuar prestando um serviço de diagnóstico durante esta crise sanitária, o protocolo de videomicroscopia ciliar foi adaptado para incluir medidas adequadas de controle de infecção.
Aqui, descrevemos um protocolo revisado para amostragem e processamento laboratorial de amostras respiratórias ciliadas, destacando as adaptações feitas para cumprir as medidas de controle de infecção por COVID-19. Resultados representativos da AFC de amostras de escovação nasal obtidas de 16 indivíduos saudáveis, processados e analisados de acordo com este protocolo, são descritos. Também ilustramos a importância da obtenção e processamento de tiras epiteliais ciliadas de ótima qualidade, uma vez que amostras que não atendem aos critérios de seleção de qualidade permitem agora a AFC, potencialmente diminuindo a confiabilidade diagnóstica e a eficiência dessa técnica.
Introduction
A discinesia ciliar primária (DCP) é uma ciliopatia móvel heterogênea hereditária, na qual os cílios respiratórios são estacionários, lentos ou discinéticos, levando ao comprometimento do clearance mucociliar e doença oto-sino-pulmonar crônica1,2,3,4. As manifestações clínicas da DCP são tosse úmida crônica e congestão nasal crônica com início na primeira infância, infecções recorrentes ou crônicas do trato respiratório superior e inferior levando a bronquiectasias, otite média e sinusite recorrentes oucrônicas5,6,7. Aproximadamente metade dos pacientes com DCP apresenta defeitos de lateralidade de órgãos, como situs inversus ou situs ambiguus. Alguns pacientes também apresentam problemas de infertilidade devido à imobilidade de espermatozoides em homens e cílios imóveis nas tubas uterinas em mulheres 1,2,8. A DCP é rara, mas a prevalência é difícil de definir, variando de 1:10.000 a 1:20.000 9,10. No entanto, acredita-se que a prevalência real de DCP seja maior devido às dificuldades no diagnóstico e à falta de suspeita clínica. Os sintomas da DCP mimetizam manifestações respiratórias comuns de outras condições respiratórias agudas ou crônicas, e os desafios diagnósticos da confirmação diagnóstica são bem conhecidos, levando a tratamento e seguimento inadequados 2,5,9,11.
A videomicroscopia ciliar, utilizando Videomicroscopia Digital de Alta Velocidade (DHSV), é uma das ferramentas diagnósticas para a DCP4,8,12,13. O DHSV é considerado o método ideal para a realização da análise funcional ciliar (AFC), compreendendo a análise da frequência dos batimentos ciliares (FSC) e do padrão dos batimentos (CBP)2,14,15,16. O DHSV utiliza epitélio respiratório vivo, geralmente obtido a partir de escovaçãonasal13.
Em vista do surto COVID-19 atual, a confirmação de um diagnóstico de PCD é agora ainda mais importante, pois as evidências sugerem que a doença respiratória subjacente pode levar a piores resultados após a infecção por COVID-1917,18. Um serviço de diagnóstico de PCD seguro e eficiente durante a pandemia atual também permitirá que pacientes confirmados com PCD se beneficiem de medidas de proteção adicionais, em comparação com a população em geral19.
A transmissão da COVID-19 ocorre principalmente através da disseminação de gotículas20. O alto potencial de transmissão a partir de pacientes assintomáticos (ou minimamente sintomáticos) é sugerido pela alta carga viral em amostranasal20. Além disso, se as partículas virais se tornarem aerossolizadas, elas permanecerão no ar por pelo menos 3 horas21. Portanto, os profissionais de saúde respiratória são expostos a um alto reservatório de carga viral durante a realização de cuidados clínicos e coleta de amostras para técnicasdiagnósticas22. Além disso, a manipulação de amostras respiratórias vivas expõe o técnico à contaminação por COVID-19. Enquanto as recomendações de melhores práticas para médicos respiratórios e cirurgiões otorrinolaringologistas que cuidam de pacientes COVID-19 estão sendo implementadas23, há uma falta de recomendações para a realização de DHSV durante a pandemia COVID-19.
Para continuar prestando um serviço de diagnóstico PCD, garantindo a segurança do profissional de saúde (realizando a coleta de amostras) e do técnico (realizando o processamento de amostras), o protocolo de videomicroscopia ciliar teve que ser adaptado durante a pandemia da COVID-19. A técnica de videomicroscopia ciliar atualmente é limitada a serviços de pesquisa e centros de diagnóstico especializados, uma vez que a AFC requer amplo treinamento e experiência. Além disso, atualmente, há uma falta de padronização e procedimento operacional preciso para o processamento e análise de amostras utilizando DHSV 4,13.
O objetivo deste trabalho é descrever os procedimentos operacionais padrão para DHSV, com particular referência às medidas de controle de infecção e segurança na amostragem e processamento do epitélio nasal vivo. Isso permitirá que o diagnóstico e o cuidado de PCD de alta qualidade continuem, apesar do atual surto de COVID-19.
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Protocol
A aprovação foi obtida do comitê de ética do hospital-faculdade de Liège e do Departamento de Higiene e Proteção à Saúde no Trabalho da Universidade.
1. Amostragem do epitélio respiratório ciliado
- Certifique-se de que os indivíduos estejam livres de infecção por pelo menos 4-6 semanas, e livres de medicação nasal e inalatória, antes da amostragem.
- Preparar preparação M199 suplementada: Suplemento Meio de Cultura Celular 199 (M199) (500 mL) com solução antibiótica (5 mL de estreptomicina/penicilina (50 μg/mL)) e solução antifúngica (5 mL de anfotericina B (2,5μg/mL)).
- Preparar 2 (um para cada narina) tubos cônicos de 15 mL com tampas e preencher cada um deles com 3 mL de M199 suplementado.
- Preparar uma escova de broncocitologia (espessura: 2 mm e comprimento: 11 mm). Corte a extremidade do fio para garantir que a escova tenha cerca de 15 cm de comprimento (Figura 1A,B). Para segurar a escova ao realizar a escovação nasal, utilize uma pinça nasal de Weil-Blakesley (Figura 1B).
- Adaptação COVID-19: Evite processar uma amostra viva de epitélio nasal de status desconhecido para COVID-19, teste o paciente para COVID-19 48 a 72 horas antes da escovação nasal para videomicroscopia ciliar. Este teste COVID-19 consiste na reação em cadeia da polimerase de uma amostra de swab nasofaríngeo24,25. Como o status do paciente para COVID-19 é desconhecido neste momento, o médico e os membros da equipe devem ser adequadamente protegidos23,26, incluindo máscara FFP2, luvas, protetor facial ou óculos e avental resistente à água de manga comprida. Em caso de indisponibilidade, impossibilidade ou dúvida do teste de PCR, efetua-se todo o processamento da escovação nasal em laboratório de biossegurança L2. Em caso de status positivo de COVID-19, adie o teste de diagnóstico de PCD e considere abordagens alternativas para gerenciar o paciente.
CUIDADO: Esta amostra do swab nasofaríngeo para o teste de COVID-19 pode induzir discinesia ciliar secundária por danificar o epitélio ciliar respiratório nasal27,28. Para evitar isso, introduzir um fino cotonete na cavidade nasal até a nasofaringe sob rígido controle endoscópico, evitando lesar os cornetos ou o septo. A amostra é então retirada da nasofaringe e retirada do cotonete sob o controle do endoscópio rígido. Com equipamento adequado, a endoscopia rígida de 0° é facilmente realizada em adultos e crianças sem trauma.
2. Obtenção de espécimes de epitélio ciliado respiratório
Adaptação COVID-19: Mesmo que o estado COVID-19 do paciente seja negativo, devido à taxa de falso-negativos, o paciente é solicitado a manter uma máscara cirúrgica em sua boca durante o procedimento, e luvas, máscara FFP2 e face shield são usados pelo médico.
- Preparo para escovação nasal
- Peça ao paciente para assoar o nariz.
- Realizar escovação nasal sob endoscopia nasal ou cega. Se estiver usando uma endoscopia nasal, examine as 2 narinas antes da escovação nasal (não repita se feito 48-72 anteriormente para COVID-19 swab nasal). O exame permite verificar a condição da mucosa (um alto grau de inflamação pode causar sangramento quando a escovação nasal é realizada, ...), a condição de cornetos inferiores (para excluir a presença de telangiectasias, por exemplo) e se o septo nasal é reto (Figura 1C).
- Peça ao paciente para se deitar, ou para sentar confortavelmente, a cabeça apoiada para trás na cadeira (porque a escovação nasal faz com que um reflexo mova a cabeça para trás). Um segundo cuidador segura a cabeça durante a escovação nasal, particularmente em crianças.
- Agite a escova no M199 suplementado antes da escovação nasal (umedecer a escova reduz a irritação da escovação).
NOTA: A escova pode estar umedecida dentro do M199 suplementado; Se o paciente for alérgico a antibióticos (penicilina e estreptomicina estão presentes no meio de cultura celular suplementado), umedeça a escova em soro fisiológico.
- Escovação nasal
- Inserir suavemente a escovação nasal, sem anestesia local ou geral13. Se estiver usando endoscopia nasal, coloque o endoscópio na entrada do nariz para visualizar o corneto nasal inferior e, em seguida, insira a escova de citologia no nariz. Se estiver realizando uma escovação nasal "cega", inserir a escova no nariz, seguindo o assoalho nasal (Figura 1D).
OBS: Alguns centros diagnósticos utilizam anestesia local com tampão de nafazolina para realizar a escovação nasal. - Mover a escova posterior e anteriormente várias vezes sobre a parte posterior do corneto nasal inferior e, em seguida, retirar. O operador deve sentir que a escova esfrega o epitélio, e o paciente pode sentir olho lacrimejante unilateral no lado da escovação.
OBS: Se a escovação nasal for realizada muito anteriormente, não serão obtidas células ciliadas, pois a cavidade nasal anterior é revestida por um epitélio transicional não ciliado. - Após a amostragem, colocar imediatamente os espécimes de escovação nasal dentro do meio de cultura. As tiras epiteliais respiratórias obtidas são deslocadas agitando-se a escova no tubo contendo o M199 suplementado e, em seguida, fecha-se o tubo (Figura 1E).
- Adaptação COVID-19: Não deslocar as tiras epiteliais agitando a escova no M199 suplementado imediatamente após a amostragem. Coloque a escova no tubo, corte o fio para que ele possa caber completamente dentro do tubo e feche o tubo imediatamente. Coloque a amostra num saco duplo hermético.
- Inserir suavemente a escovação nasal, sem anestesia local ou geral13. Se estiver usando endoscopia nasal, coloque o endoscópio na entrada do nariz para visualizar o corneto nasal inferior e, em seguida, insira a escova de citologia no nariz. Se estiver realizando uma escovação nasal "cega", inserir a escova no nariz, seguindo o assoalho nasal (Figura 1D).
Figura 1: Técnica de escovação nasal. (A) Escova de broncocitologia completa (B) Pronta para escovar: a extremidade de escovação do fio é cortada (cerca de 15 cm de comprimento) e mantida por uma pinça nasal de Weil-Blakesley (C) Visão endoscópica da cavidade nasal: septo (1) corneto inferior (2) e corneto médio (3) (D) A escovação nasal é realizada na parte posterior do corneto inferior (2). Septo nasal (1) Concha média (3). (E) As tiras epiteliais respiratórias são deslocadas agitando-se a escova no meio de cultura celular M199 suplementado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Processamento do epitélio ciliado respiratório
- Analisar amostras de escovação nasal ao microscópio dentro de 9 horas após a amostragem, pois tanto o FSC quanto a CEC estão estáveis dentro deste período de tempo (dados não publicados).
- Use um microscópio de luz vertical ou invertido, com um contraste de fase de imersão em óleo x100 ou uma lente de contraste de interferência. O ideal é colocar o microscópio em uma mesa antivibratória, pois o batimento ciliar pode estar sujeito a artefatos devido a vibrações externas (por exemplo, da bancada do laboratório)13.
Adaptação COVID-19: O operador usa equipamentos de proteção individual para realizar o processamento nasal, incluindo máscara FFP2, luvas e avental resistente à água de mangas compridas.
- Prepare a câmara de visualização.
- Suspender as tiras epiteliais ciliadas em uma câmara de visualização aberta construída em laboratório, permitindo que os cílios batam livremente enquanto são analisados ao microscópio. Esta câmara é criada pela separação de uma lamínula de cobertura (22 mm x 40 mm) e uma lâmina de vidro por duas lamínulas quadradas adjacentes (20 mm x 20 mm), separadas por uma distância de 15 mm, e coladas na lâmina de vidro12 (Figura 2, Figura 4A).
Adaptação COVID-19: A câmara construída em laboratório descrita acima é aberta e permite a troca de gases e umidade entre a amostra e o ambiente13. No contexto da pandemia de COVID-19, é possível utilizar uma câmara de visualização fechada utilizando um espaçador de dupla face presa, com 0,25 mm de profundidade (Figura 3, Figura 4B). O espaçador é preso na lâmina de vidro e, em seguida, uma tampa (22 mm x 40 mm) é presa em cima do espaçador.
Figura 2: Montagem da câmara aberta construída em laboratório. (A) As 2 lamínulas quadradas (20 mm x 20 mm) são colocadas sobre a lâmina de vidro. (B) As lamínulas de cobertura quadrada são separadas por uma distância de cerca de 15 mm, e coladas na lâmina de vidro. (C) A câmara é preenchida entre as duas lamínulas de cobertura quadrada adjacentes com uma pequena amostra (aproximadamente 60 μL) de epitélio ciliado em M199 suplementado. (D) Uma longa lamínula retangular (22 mm x 40 mm) é colocada nas duas lamínulas quadradas adjacentes e cobre a câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Montagem da câmara fechada com espaçador de dupla face. (A) A corrediça de vidro e o espaçador de dupla face presa. (B) A proteção é removida em um dos lados do espaçador, e o espaçador é então preso na lâmina de vidro. (C) A proteção é removida do outro lado do espaçador preso de dupla face e, em seguida, o espaçador é preenchido com uma pequena amostra (aproximadamente 60 μL) de epitélio ciliado em M199 suplementado. (D) Uma longa lamínula retangular (22 mm x 40 mm) é presa no espaçador e fecha a câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diagrama esquemático mostrando as principais câmaras de visualização utilizadas para a realização da videomicroscopia ciliar por videomicroscopia digital de alta velocidade (DHSV). (A) A técnica de gota suspensa aberta: a amostra ciliada é suspensa em uma gota de meio de cultura celular em uma câmara aberta criada pela separação de uma lamínula e uma lâmina de vidro por duas lamínulas adjacentes. (B) Técnica da gota suspensa fechada: a amostra ciliada é suspensa em uma gota de meio de cultura celular em uma câmara fechada criada por um espaçador prensado entre um lado de vidro e uma lamínula. O espaçador adere firmemente na lâmina de vidro e no deslizamento da tampa. Reproduzido e modificado de Kempeneers et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Controle de temperatura
- Envolver o microscópio com plástico bolha (Figura 5A,B).
- Conecte o aquecedor da lente ao redor da objetiva usando uma correia Velcro (Figura 5C)
- Ligue o controlador do aquecedor da lente 1 hora antes de realizar a verificação de temperatura do controle.
- Ligue o microscópio e verifique se a configuração do microscópio está feita, pois a quantidade de luz através da amostra pode alterar a temperatura na lâmina.
- Ligue o controlador da caixa aquecida (Figura 5D).
- Verifique se o teste de referência funciona corretamente antes de iniciar. Segure a ponta da sonda de referência entre os dedos; Deve medir a temperatura corporal.
- Coloque mídia livre no meio do slide, entre as duas lamínulas quadradas adjacentes (20 mm x 20 mm) coladas nele.
- Coloque a ponta da sonda de referência no M199 suplementado. Tampa com lamínula retangular (22 mm x 40 mm). Certifique-se de que a sonda esteja completamente rodeada por meios (caso contrário, a temperatura pode cair).
- Adaptação COVID-19: Para realizar o controle de temperatura na câmara fechada utilizando um espaçador, corte um dos lados do espaçador (este orifício deve ter o mesmo tamanho da sonda de referência). Coloque o espaçador na lâmina de vidro, coloque a mídia livre no meio do espaçador. Coloque a ponta da sonda de referência na solução, através do orifício do espaçador, e depois cole uma tampa retangular (22 mm x 40 mm) no espaçador.
- Coloque a lâmina na placa da caixa aquecida. Feche a caixa aquecida com a tampa.
- Adicione óleo na objetiva de imersão em óleo.
- Coloque a caixa aquecida no palco do microscópio.
- Ajustar a temperatura da placa e da tampa (a temperatura da tampa deve ser 2 °C superior à temperatura da placa para evitar condensação) para medir 37 °C com a sonda de referência dentro do meio.
- Aguarde 5 minutos (tempo necessário para elevar a temperatura da amostra para 37 °C).
- Ajuste a objetiva, aproximando-a da lâmina até tocar a tampa com a ponta da lente.
- Mova a objetiva para ver o meio da sonda no microscópio.
NOTA: Certifique-se de que a sonda é vista na tela do computador (para verificar se o sistema de câmera funciona antes de olhar para a amostra ciliada). Ao visualizar o meio da sonda, a tela fica completamente preta. - Ajuste a temperatura do aquecedor da lente (para compensar a perda de temperatura quando a lente de imersão em óleo está em contato com a tampa). Certifique-se de medir 37 °C com a sonda de referência dentro do meio quando a objetiva tocar a tampa.
OBS: O ideal é trabalhar em uma sala com temperatura controlada, para que essas temperaturas configuradas não mudem. Se a temperatura da sala não for controlada, você deve realizar essa verificação de controle de temperatura todos os dias antes de realizar a videomicroscopia ciliar. - Depois de verificar a temperatura, retire a lâmina da caixa aquecida.
- Limpe a lâmina e a ponta da sonda de referência com álcool e guarde.
- Limpe a lente com isopropanol e limpe os tecidos com movimentos circulares.
Figura 5: Equipamento utilizado no laboratório DHSV. (A) O microscópio equipado com uma lente de contraste de fase de imersão em óleo de 100x é colocado em uma mesa antivibratória para evitar que vibrações externas causem artefatos para análise funcional ciliar (B) O microscópio é cercado por plástico bolha para evitar a perda de calor do ar ambiente. (C) A objetiva de imersão em óleo gera perda de calor. Isso pode ser evitado usando um aquecedor de lente (setas). (D) A amostra é aquecida usando uma caixa de aquecimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Preparo das amostras epiteliais ciliadas respiratórias
- Agite o tubo suavemente para permitir que os cílios se espalhem por todo o tubo (para evitar que os cílios fiquem presos em outras tiras ciliadas, muco ou detritos, que impedem que batam livremente).
OBS: Esta etapa é essencial para a obtenção das "bordas ótimas" do epitélio ciliado (Figura 12). - Retirar aproximadamente 50 μL de epitélio ciliado em M199 suplementado no meio do tubo com uma pipeta.
- Coloque a amostra na câmara construída em laboratório (entre as duas lamínulas quadradas adjacentes (20 mm x 20 mm)) e cubra com uma lamínula retangular (22 mm x 40 mm). Tenha cuidado para não adicionar bolhas.
- Adaptação COVID-19: Executar as etapas 4.1-4.3 em um gabinete de segurança microbiológica. Procedimento no gabinete de segurança microbiológica.
- Ligue o armário de segurança microbiológica 10 minutos antes de preparar a amostra (para se certificar de que o ambiente é estéril).
- Antes de qualquer manuseio, desinfete todo o gabinete de segurança microbiológica com etanol 70%.
- Desinfetar todo o material necessário com etanol 70% antes de colocar no armário de segurança microbiológica.
- Abrir os tubos cônicos de 15 mL contendo as amostras apenas uma vez sob o gabinete de segurança microbiológica e, em seguida, deslocar as tiras epiteliais agitando a escova (usando pinça nasal de Weil-Blakesley) em M199 suplementado.
- Coloque o espaçador na lâmina de vidro e remova a proteção do espaçador de dupla face preso.
- Agite o tubo suavemente para permitir que os cílios se espalhem por todo o tubo.
- Retirar uma pequena amostra de epitélio ciliado em M199 suplementado do meio do tubo com uma pipeta (aproximadamente 60 μL) e preencher o espaçador.
- Cole a tampa retangular (22 mm x 40 mm) no espaçador para fechar a câmara.
- Desinfete a lâmina antes de sair do armário de segurança microbiológica.
- Retire a lâmina do armário de segurança microbiológica.
- Troque as luvas ao sair do armário de segurança microbiológica.
- Aguarde 10 minutos antes de desligar o armário de segurança microbiológica após o uso (para certificar-se de que o ambiente do armário de segurança microbiológica está estéril antes de fechar a porta).
- Coloque a lâmina na placa da caixa aquecida. Feche a caixa aquecida com a tampa.
- Adicione óleo na objetiva de imersão em óleo.
- Coloque a caixa aquecida no palco do microscópio.
- Ligue a caixa aquecida e o aquecedor da lente.
NOTA: O aquecedor de lentes deve ser ligado 1 hora antes do uso. - Ajustar as definições de temperatura da caixa aquecida e dos controladores do aquecedor de lentes de acordo com os valores obtidos no passo 3.4.
- Aguarde 5 minutos (tempo necessário para elevar a temperatura da amostra até 37 °C ao utilizar regulações predeterminadas tanto para a caixa aquecida como para o aquecedor objetivo).
- Aproxime a objetiva da lâmina até tocar a tampa com a ponta da lente.
5. Visualização das bordas ciliadas respiratórias
- Fixe a câmera de vídeo de alta velocidade no microscópio, conecte a câmera ao computador e ligue a câmera.
- Ligue o computador.
- Conecte a câmera de videomicroscopia digital de alta velocidade ao computador (para que a imagem visualizada através das lentes oculares seja projetada no monitor) através do software.
- Abra o software e, em seguida, o menu principal será aberto automaticamente (Figura 6A).
OBS: O software é o programa utilizado no laboratório para aquisição e processamento das imagens. O sistema permite que as sequências de vídeo sejam gravadas e reproduzidas a uma taxa de quadros reduzida ou quadro a quadro. Ele pode ser baixado gratuitamente. - Abra a câmera (Figura 6A).
- Quando Camera enumeration filter (Filtro de enumeração da câmera ) for exibido, escolha OK (Figura 6B).
- Selecione Atualizar lista; selecione o nome da câmera; escolha Interface: Expert e selecione Open (Figura 6C).
- Na linha de controle da câmera na parte superior do menu de diálogo encaixado, selecione Ao vivo (Figura 6D).
- Escolha Reproduzir para exibir a imagem e Parar para concluir a visualização (Figura 6D).
- Abra o software e, em seguida, o menu principal será aberto automaticamente (Figura 6A).
Figura 6: Descrição do uso do software: visualização das bordas ciliadas respiratórias no monitor. (A) O menu principal aparece diretamente ao abrir o software. (b) Feche o filtro de enumeração da câmera. (C) Escolha a câmera e selecione Interface: Expert. (D) O modo ao vivo permite visualizar no monitor a imagem vista através do microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Ajuste a configuração de aquisição da câmera (no canto superior direito) (Figura 7).
- Em Configurações de aquisição , escolha Câmera e ajuste a taxa de quadros: Taxa (Hz): 500 (veja abaixo) (Figura 7A).
- Em Configurações de aquisição , escolha Câmera e ajuste a região de interesse (ROI) (Figura 7A).
NOTA: O ROI é calculado usando uma escala graduada visualizada com a objetiva de imersão em óleo x100 e projetada no monitor, para definir o número de pixels correspondente a 50 μm (como você deseja registrar bordas ciliadas medindo aproximadamente 50 μm (veja abaixo)). - Em Configurações de aquisição , escolha Gravar e ajuste a duração do vídeo e o número total de quadros gravados (uma duração de 2 segundos, corresponde a 1000 quadros se a taxa de quadros escolhida for 5OO Hz) (Figura 7B).
NOTA: Em nossa experiência, um mínimo de 2 segundos de duração do vídeo é necessário para permitir uma análise completa tanto da CBF quanto da CBP. - Escolha Arquivo e Salvar Cfg da câmera para salvar a nova configuração de aquisição (insira um nome e, se necessário, um comentário para essa nova configuração) (Figura 7C,D).
- Para abrir essa nova configuração de câmera, abra File and Load Camera Cfg (Figura 7C).
Figura 7: Descrição do uso do software: ajuste das configurações de aquisição da câmera para gravação em vídeo das bordas ciliadas batedoras. (A) Na configuração de aquisição Câmera, ajuste a região de interesse (ROI) e a taxa de quadros para gravação de vídeo (Taxa). (B) Na configuração de aquisição Record, ajuste a duração da gravação de vídeo (número de quadros necessários para a duração de gravação escolhida, de acordo com a taxa de quadros escolhida anteriormente). (C) Esta nova configuração da câmera pode ser salva usando a função Salvar câmera Cfg . Load Camera Cfg permite reabrir as definições de configuração salvas para uso posterior. (D) As novas definições de configuração da câmera podem ser nomeadas e um comentário pode ser adicionado, se necessário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Veja através de lentes oculares e procure células ou detritos dentro da amostra, em seguida, concentre-se.
- Verifique se a imagem está visível no monitor e melhore a qualidade da imagem ajustando o condensador (e o prisma DIC se estiver usando uma lente de contraste de interferência) e ajuste o foco, se necessário.
- Pesquisa de tiras de epitélio ciliado.
6. Seleção das bordas ciliadas respiratórias
OBS: O sistema experimental permite visualizar os cílios batidos em três planos distintos: perfil lateral, batendo diretamente em direção ao observador, e diretamente acima (Figura 8).
Figura 8: A técnica DHSV permite que os cílios batidos sejam visualizados em três planos distintos. (A) no perfil lateral. (B) bater diretamente em direção ao observador e. (C) diretamente de cima. Reproduzido de Kempeneers et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Registre apenas bordas epiteliais ciliadas intactas e ininterruptas que meçam pelo menos 50 μm de comprimento.
- Para registros feitos no perfil lateral, determinar a qualidade da borda de acordo com o sistema de pontuação Thomas et al.29 (Figura 9). Utilizar apenas bordas normais (Figura 9A) ou bordas com pequenas projeções (Figura 9B) para análise funcional ciliar. Excluir células isoladas (Figura 9E).
Figura 9: Imagem representativa do sistema de pontuação de Thomas et al29 para as diferentes qualidades das bordas epiteliais ciliadas. (A) Rebordo normal: definido como uma faixa de epitélio ciliada uniforme intacta > 50 μm de comprimento (B) Rebordo ciliado com pequenas projeções: definido como uma borda >50 μm de comprimento, com células se projetando para fora da linha da borda epitelial, mas sem ponto da membrana celular apical projetando-se acima das pontas dos cílios nas células adjacentes (C) Rebordo ciliado com projeções maiores: definida como uma borda >50 μm de comprimento, com células projetando-se para fora da linha da borda epitelial, com pelo menos um ponto da membrana celular apical projetando-se acima das pontas dos cílios nas células adjacentes (D) Célula ciliada isolada: definida como a única célula ciliada em uma borda epitelial >50 μm de comprimento (E) Células únicas: definidas como células ciliadas que não têm contato entre si ou com qualquer outro tipo celular. Barra de escala: 5,5 μm. Reproduzido de Thomas et al.29Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.
- Realizar AFC utilizando apenas cílios livres de muco e detritos, e batendo no perfil escolhido para a borda registrada. Selecione apenas bordas ciliadas que permitam um mínimo de 2 avaliações de FSC e PBC (veja abaixo) ao longo da borda.
- Utilizar para CFA apenas amostras que produzam um mínimo de 6 arestas batendo no perfil lateral e atendendo aos critérios acima; Analise no máximo 20 arestas no perfil lateral.
- Use um mínimo de 1 borda adicional de cílios batendo acima do perfil do observador para caracterizar a CEC.
7. Registro da borda ciliada
- Grave a borda dos cílios batendo usando uma taxa de quadros da câmera de 500 quadros por segundo e projete em um monitor de alta resolução. Uma taxa de quadros mínima de 400 Hz é necessária para permitir a análise tanto da CBF quanto da CBP13. Registre uma aresta a uma taxa de quadros de 30 quadros por segundo para avaliar a eficiência da folga de partículas.
- Selecione Live, na linha de controle da câmera na parte superior do menu de diálogo encaixado (Figura 6D)
- Escolha Reproduzir para exibir a imagem e Parar para concluir a visualização (Figura 6D)
- Para gravar uma borda, pressione Record (Figura 6D). Para visualizar a gravação antes de salvar, vá na linha de controle da câmera na parte superior do menu de diálogo encaixado e selecione Reprodução. Escolha Reproduzir para visualizar o vídeo gravado e Parar para concluir a visualização (Figura 10A).
Observação : pare de exibir a borda gravada antes de salvar.
Figura 10: Descrição do uso do software. (A) modo de reprodução. Para rever uma sequência de vídeo gravada de batida ciliada de borda, escolha o Modo de Reprodução. Escolha Reproduzir para exibir a imagem e Parar para concluir a visualização. A taxa de fama pode ser ajustada para melhorar a análise da função ciliar (B, C) Salvando as gravações de vídeo das bordas ciliadas batidas (B) Para salvar o vídeo, escolha Arquivo e Salvar aquisições. (C) Digite o nome do vídeo gravado e escolha o local onde o vídeo é gravado. Certifique-se de que a gravação é salva como um arquivo . Arquivo RAW (D) escolha de uma gravação de bordas ciliadas a serem analisadas: Para abrir uma gravação de vídeo, escolha Arquivo, depois Abrir e, em seguida, Imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Salve o vídeo no banco de dados (Figura 10B,C).
- Abra Arquivo no canto superior esquerdo e salve as aquisições (Figura 10B).
- Em Salvar aquisições, insira o nome do vídeo gravado e verifique se a gravação foi salva como um formato de tipo de arquivo RAW (Figura 10C).
- Quando o vídeo for salvo, retorne ao modo ao vivo (volte para a linha de controle da câmera na parte superior do menu de diálogo encaixado e selecione ao vivo) (Figura 6D).
- Repita o procedimento para registrar o número de arestas que atendem aos critérios de seleção exigidos para CFA.
OBS: É possível registrar várias bordas ciliadas batendo atendendo aos critérios de seleção a partir de uma lâmina, no prazo máximo de 20 minutos após o preparo da lâmina (para evitar a dessecação). Após 20 minutos, se não for possível obter arestas suficientes que atendam aos critérios de seleção, prepare um novo slide. - Retire a lâmina da caixa aquecida.
- Remova a tampa retangular e jogue-a no recipiente específico de resíduos médicos perigosos.
- Limpe a lâmina (com as duas tampas quadradas coladas nela) com etanol 70% e papel absorvente. Uma vez que o slide está limpo, ele pode ser usado novamente.
- Adaptação COVID-19: Coloque o escorregador com a tampa e o espaçador em um saco hermético, retire luvas e máscara e coloque-as no saco hermético. Coloque o saco hermético no recipiente específico para resíduos médicos perigosos.
8. Análise funcional ciliar
- Preparação preliminar para realização do manual de avaliação CBF e CBP
- Abra o software.
- Abra Arquivo no canto superior esquerdo, Abrir e Imagens (Figura 10D).
- Escolha o vídeo a ser analisado.
- Vá na linha de controle da câmera na parte superior do menu de diálogo encaixado e selecione Reprodução (Figura 10A). Escolha Reproduzir para visualizar o vídeo gravado e Parar para concluir a visualização.
- Análise manual da frequência de batimento ciliar (FSC)
- Realizar a avaliação da FBC utilizando apenas as bordas laterais.
- Divida as bordas ciliadas em aproximadamente 5 áreas adjacentes, cada uma medindo aproximadamente 10 μm (Figura 11).
- Identificar e visualizar cílios ou grupos de cílios em uma taxa de quadros reduzida, e um máximo de 2 medições de FSC são feitas em cada área, resultando em um máximo de 10 medidas de FSC ao longo de cada borda (Figura 11).
- Registre o número de quadros necessários para que um grupo de cílios complete 5 ciclos de batida.
- Converter para CBF por um cálculo simples: (CBF= taxa de quadros de gravação (Hz)/(número de quadros para 5 batimentos) x 5)13,16,30. Cílios imóveis são relatados como tendo FSC de 0 Hz13.
NOTA: ajuste a taxa de quadros ao reproduzir os vídeos gravados (Figura 10A). Isso é especialmente útil quando os cílios analisados batem muito lentamente. Aumentar a taxa de quadros ajuda a definir se os cílios batem muito lentamente ou são imóveis. - Para cada amostra, calcular a média do FSC como a média (DP) ou (IC 95%) de todos os FSC registrados no perfil lateral, incluindo os cílios estáticos.
Figura 11: Imagem representativa de uma borda de ótima qualidade e a divisão em 5 áreas para permitir a análise da AFC. Uma borda epitelial ciliada de ótima qualidade é fragmentada em 5 áreas adjacentes, cada uma medindo 10 μm. Um máximo de 2 medidas de FSC (e 2 avaliações de CEC) são feitas em cada área, resultando em um máximo de 10 medidas de FSC (e avaliações de CEC) ao longo de cada borda. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Análise do padrão de batimento ciliar manual (CBP)
- Para avaliar os marcadores de discinesia, utilizar apenas o perfil lateral; utilizar os planos em direção ao observador e de cima para caracterizar o tipo de CEC13. Existem diferentes métodos e escores para avaliação da DLC. A seguir é descrito o método utilizado em laboratório com a definição dos marcadores de discinesia.
- A porcentagem de cada PBC distinta dentro da amostra
- Para cada cílio ou grupo de cílios identificado e utilizado para a mensuração do FSC (Figura 11), realizar uma análise da CEC a uma taxa de quadros reduzida: comparar o trajeto preciso percorrido pelos cílios durante um ciclo de batimento completo com a CEC normal observada na análise do DHSV12,30.
- Atribuir uma CEC distinta (normal, imóvel, rígida, circular, assíncrona (batimento ciliar incoordenado) oudiscinética13) a cada cílio ou grupo de cílios analisado.
- Para cada amostra, calcular a porcentagem de cada CEC distinta dentro da amostra; a DLC atribuída à amostra é a predominante observada na CEC.
- Calcular os 3 marcadores de discinesia.
- Calcular o índice de imotilidade (IMI): a porcentagem de cílios imóveis dentro da amostra (número de CBF=0/número total de leituras de FSC na amostra X 100). Expresse o IMI como média (DP) ou (IC 95%)1,16,31.
- Calcular o escore de discinesia (DKS). Divida cada borda ciliada em quadrantes, e o número de quadrantes com cílios discinéticos (ou anormalmente batendo) é determinado. Isso permite calcular uma DKS entre 0 e 4 (0: CEC normal em toda a borda; 1: CEC anormal em ≤ 25% dos cílios; 2: CEC anormal em ≤ 50% dos cílios; 3: padrão de batimento anormal em ≤ 75% dos cílios; e 4: CEC anormal em todos os cílios). A mediana da DKS (intervalo interquartil) é calculada para a amostra16,29.
- Calcular a porcentagem de batimento normal: definida como a porcentagem de cílios com CEC normal dentro da amostra (número de leituras normais de CEC/número total de leituras de CEC para a amostra x100).
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Representative Results
Para ilustrar a eficiência da técnica, apresentamos os resultados da AFC em uma série de 16 voluntários adultos saudáveis (5 homens, faixa etária de 22-54 anos).
Amostras de escovação nasal de 14 (4 homens, faixa etária de 24-54 anos) do total de 16 voluntários forneceram bordas epiteliais adequadas suficientes que satisfizeram os critérios de seleção necessários para a realização da AFC. Destas 14 amostras de escovação nasal, um total de 242 bordas ciliadas foram registradas, e 212 bordas preencheram os critérios de inclusão definidos e foram analisadas. Todas essas bordas foram registradas no perfil lateral (cílios batendo acima do observador foram registrados e analisados para cada voluntário para avaliar se uma CEC circular foi observada13, mas essas bordas não foram incluídas para a AFC). Um total de 807 medidas de FSC e avaliação da CEC foram obtidas dos cílios ou grupos de cílios analisados (Tabela 1). Os resultados detalhados da AFC para cada indivíduo saudável são apresentados na Tabela 1.
A média do FSC (± desvio padrão) para os 14 sujeitos cujas amostras preencheram os critérios de inclusão foi de 14,79 (± 2,17) Hz. Isso concorda com dados de referência publicados anteriormente em laboratórios que realizam DHSV a uma temperatura controlada de 37 °C 16,29,30, enquanto as medidas de FSC em laboratórios que realizam DHSV em temperatura ambiente são menores 15,32,33. A porcentagem média (± desvio padrão) de CEC normal para os indivíduos saudáveis foi de 78,82 (± 14,73) %, e para cada um desses indivíduos saudáveis, o padrão de batimento predominante foi normal. Nenhum cílio bateu em um padrão circular de batimento nos indivíduos saudáveis, como relatado anteriormente16,34.
A média do IMI (desvio padrão ±) foi de 2,27 (± 2,3%) % e a mediana do DSK (intervalo interquartil) foi de 0 (0-1). Esses valores foram semelhantes a publicações anteriores sobre volutomistas saudáveis 16,29. É interessante notar que o DSK e o FSC foram semelhantes aos valores relatados por Thomas et al a partir da análise obtida ao selecionar apenas bordas normais ou com menor projeção (Figura 9), refletindo a importância de analisar apenas bordas que atendam aos critérios de inclusão29. Se utilizarem bordas de baixa qualidade, relataram menor FSC e maior DKS29. Isso ilustra que o uso de bordas epiteliais que não preenchem os critérios de seleção pode levar incorretamente a um diagnóstico de DCP.
Portanto, para ser usado como uma ferramenta diagnóstica de PCD, a AFC de amostras de escovação nasal deve ser realizada usando tiras epiteliais de ótima qualidade (Figura 12A), obtidas por um processamento ótimo de amostras de escovação nasal e uma seleção de borda ótima. Conforme relatado no protocolo, apenas bordas epiteliais ciliadas intactas e ininterruptas com pelo menos 50 μm de comprimento devem ser usadas, e a AFC deve ser realizada apenas com cílios livres de muco e debris. No perfil lateral, devem ser excluídas bordas de batimento que permitam avaliação inferior a 2 de FSC e CEC.
Além disso, as hemácias e o muco podem bloquear o batimento dos cílios livres ou esconder os cílios do observador (Figura 12B). A quantidade de muco pode ser limitada pedindo ao paciente para assoar o nariz antes da escovação nasal, e evitar realizar a escovação nasal durante a inflamação nasal aguda (a inflamação aumenta a quantidade de muco e o risco de sangramento durante a escovação nasal). Além disso, a escovação nasal deve ser suave para limitar o sangramento leve e, portanto, a quantidade de glóbulos vermelhos. Mas, por outro lado, se a escova não pressionar firmemente contra o corneto nasal inferior, a amostra de escovação nasal pode não conter tiras epiteliais ciliadas de alta qualidade suficientes (Figura 12C,D).
Finalmente, se a escovação nasal for realizada na parte anterior da cavidade nasal, não serão obtidas células ciliadas, pois esta parte do nariz é revestida por um epitélio transicional não ciliado (Figura 12E). Portanto, a qualidade da amostra de escovação nasal é importante para produzir um mínimo de 6 bordas de cílios batendo no perfil lateral (e 1 borda de cílios batendo por cima) atendendo aos critérios de inclusão.
Dos 16 voluntários saudáveis, 2 amostras de escovação nasal foram excluídas para AFC. Um sujeito foi excluído porque a amostra não continha o número necessário de bordas ciliadas que atendessem aos critérios de inclusão, encontrando-se principalmente células isoladas dentro da amostra (Figura 12D). O segundo sujeito foi excluído porque todas as bordas epiteliais registradas (n=7) eram não ciliadas (Figura 12E), sugerindo que a escovação nasal era muito anterior e não realizada adequadamente no corneto inferior. Essa conclusão foi tirada porque o sujeito era um voluntário saudável. Repetidas amostras de escovação nasal que produzem apenas bordas epiteliais não ciliadas em um paciente com suspeita de DCP podem levar ao diagnóstico de uma geração reduzida de múltiplos cílios móveis (CMR), um distúrbio do clearance mucociliar causado por falha na ciliogênese 3,35,36.
Devido à pandemia de COVID-19, o centro de diagnóstico da Universidade de Liège teve que adaptar o protocolo de videomicroscopia ciliar. Antes da pandemia, usávamos uma câmara de visualização aberta que permitia a troca de gases e umidade entre a amostra e o ambiente. Como isso poderia potencialmente levar à contaminação do operador e/ou do ambiente, mudamos para uma câmara de visualização fechada, e a hermeticidade dessa câmara para gás e líquido foi testada. A Figura 13 mostra o teste de vedação da câmara de visualização fechada utilizando espaçador preso dupla face. A hermeticidade foi testada enchendo-se a câmara com 60 μL de azul de Trypan e ar, imergindo-a em água durante 4 horas. Como não observamos vazamento de azul de Trypan ou bolhas de ar dentro da água durante 4 horas, concluímos que a câmara estava hermeticamente fechada para líquido e gás. O uso desta câmara de visualização fechada para realizar videomicroscopia ciliar durante a pandemia foi aprovado pelo Departamento de Higiene e Proteção à Saúde no Trabalho da Universidade de Liège.
| Voluntário saudável | Não. de borda gravada | Não. Das Arestas Analisadas | Nº de Medições da FBC | CBF (Hz) (Média ± DP) |
CEC normal (%) (Média ± DP) |
IMI (%) (Média ± DP) |
Mediana DSK (Intervalo Interquartil) |
| 1 | 21 | 16 | 52 | 16,59 ± 3,83 | 82.7 | 0 | 0 (0-2) |
| 2 | 11 | 7 | 34 | 18.4 ± 5.32 | 97.1 | 0 | 0 (0-1) |
| 3 | 12 | 11 | 48 | 12.12 ± 1.87 | 91.7 | 0 | 0 (0-2) |
| 4 | 20 | 20 | 60 | 15.18 ± 3.29 | 86.7 | 1.67 | 0 (0-1) |
| 5 | 18 | 14 | 54 | 11,82 ± 3,97 | 87 | 3.7 | 0 (0-1) |
| 6 | 15 | 11 | 51 | 16.23 ± 5.5 | 76.5 | 5.9 | 1 (1-2) |
| 7 | 21 | 18 | 60 | 14.37 ± 4.12 | 68.3 | 3.3 | 1 (0-2) |
| 8 | 19 | 18 | 51 | 14.12 ± 4.79 | 74.5 | 5.9 | 1 (0-2) |
| 9 | 17 | 17 | 37 | 16,77 ± 4,74 | 89.2 | 0 | 0 (0-2) |
| 10 | 15 | 15 | 69 | 16.49 ± 4.44 | 75.4 | 2.9 | 1 (1-2) |
| 11 | 15 | 14 | 77 | 14,53 ± 2,42 | 81.8 | 0 | 0 (0-2) |
| 12 | 16 | 11 | 48 | 15,27 ± 2,38 | 81.3 | 0 | 0 (0-2) |
| 13 | 24 | 22 | 72 | 14.8 ± 4.07 | 86.1 | 4.17 | 0 (0-2) |
| 14 | 18 | 18 | 94 | 10.4 ± 3.43 | 79.8 | 4.26 | 1 (0-1) |
| Total: | 242 | 212 | 807 | 14,79 ± 2,17 | 82,72 ± 7,62 | 2.27 ± 2.3 | 0 (0-1) |
Tabela 1: Resultados representativos do número de bordas registradas e analisadas, do número de medidas de FSC obtidas e dos valores de FSC, porcentagem de CBP NORMAL, IMI, DSK em 14 indivíduos saudáveis, seguindo este protocolo. FSC = frequência dos batimentos ciliares, PBC = padrão dos batimentos ciliares, IMI = índice de imotilidade e DSK = escore de discinesia.
Figura 12: Figura ilustrativa da complexidade da escovação nasal. (A) "Faixa epitelial de ótima qualidade": tira de epitélio ciliada uniforme intacta > 50 μm de comprimento, permitindo que mais de 2 cílios ou grupo de cílios sejam usados para avaliação de FSC e CBP (ou seja, cílios batendo livremente no perfil lateral, sem ficarem presos em muco ou detritos). (B) Imagem representando uma grande quantidade de células e muco presos acima de uma faixa epitelial ciliada, impedindo que os cílios batam livremente e escondendo os cílios do observador. (C) A qualidade da borda registrada é insuficiente, por se tratar de uma aresta com grande projeção29. (D) Célula ciliada única, que não pode ser utilizada para análise funcional ciliar. (E) A escovação nasal foi realizada na parte anterior da cavidade nasal, revestida por epitélio transicional não ciliado. Portanto, não foram obtidas células ciliadas. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13: Teste de vedação do espaçador com gás e solução de Azul de Trypan. A hermeticidade do espaçador foi testada preenchendo a câmara com 60 μL de azul de tripano e ar, imergindo a câmara em água por 4 horas. Como não observamos vazamento de azul de tripano ou bolhas de ar dentro da água durante as 4 horas, concluímos que a câmara era hermética tanto para gás quanto para líquido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo visa fornecer um procedimento operacional padrão para CFA usando amostras de escovação nasal, com ajustes feitos para considerações apropriadas de controle de infecção durante a pandemia COVID-19. O diagnóstico da DCP é desafiador e, atualmente, requer um painel de diferentes testes diagnósticos, de acordo com a recomendação internacional, incluindo dosagem nasal de óxido nítrico, CFA por DHSV, análise ultraestrutural ciliar por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), marcação de proteínas ciliares por imunofluorescência e teste genético para genes causadores de DCP 4,37. Atualmente, nenhum exame único diagnosticará todos os pacientes com DCP 4,37. De acordo com as diretrizes da Sociedade Respiratória Europeia, apenas defeitos ultraestruturais característicos por TEM e mutações bialélicas em genes causadores de PCD podem confirmar um diagnóstico de PCD. Infelizmente, esses testes apresentam uma taxa de 15-30% de resultados falso-negativos 4,37,38,39. O DHSV tem a vantagem de ter maior sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de DCP (0,95-1,00 e 0,91-0,96, respectivamente)31,38,40,41, mas recomendações internacionais recentes afirmam que, atualmente, o DHSV não é suficientemente padronizado para confirmar um diagnóstico deDCP4,37. De fato, há uma falta de procedimento operacional preciso para o preparo e processamento de amostras ciliadas, uma falta de método padronizado de CFA e dados de análise funcional normativa para a interpretação da função ciliar 4,8,13,16,34,38,40. Este trabalho propõe um protocolo utilizado no centro para obtenção e processamento de amostras epiteliais ciliadas respiratórias e para avaliação funcional ciliar. Como atualmente não há consenso internacional para um protocolo de DHSV, algumas etapas do processo podem variar entre os centros. A variação de fatores como temperatura durante a videomicroscopia ciliar, meio utilizado e qualidade das bordas epiteliais analisadas podem influenciar a função ciliar13.
Existe variação na temperatura estabelecida durante a análise do DHSV entre os centros, com alguns defendendo que o DHSV seja realizado à temperatura ambiente13. Defendemos que a análise das amostras seja feita a 37 °C. Isso aumenta a complexidade da configuração, mas um diagnóstico de DCP pode ser perdido se a análise de CEC for realizada abaixo de 37 °C. relataram uma variante da DCP sensível à temperatura, apresentando um padrão de batimento coordenado normal quando os cílios foram observados à temperatura ambiente, mas um padrão hiperfreqüente e discinético anormal a 37 °C42. Além disso, tem sido bem descrito que o FSC varia com a temperatura, com uma relação sigmoidal43,44, de modo que os dados de referência do FSC diferem de acordo com a temperatura utilizada para a realização do VSDH.
Além disso, atualmente há falta de padronização no método manual e/ou computadorizado para avaliação do FSC e da CEC13. Neste trabalho, propomos a técnica manual de avaliação da FBC e da CEC utilizada em nosso laboratório.
Como o processamento manual de dados de DHSV envolve alguma subjetividade e é demorado, uma variedade de softwares tem sido desenvolvida para avaliação de FSC e CBP, utilizando diferentes programas semi-automatizados (envolvendo a seleção de regiões de interesse (ROIs) específicas para examinar) ou totalmente automatizados 34,45,46 (analisando toda a imagem capturada). Todos os programas utilizam a variação da intensidade luminosa nos pixels das imagens de vídeo gravadas ao longo do tempo para calcular a FBC. No entanto, a maioria dos programas envolve a exclusão manual ou automatizada de dados específicos para reduzir o ruído: áreas de estase, áreas onde a amplitude do FSC ou do batimento ciliar (CBA) se enquadram nos valores limiares particulares. A comparação entre a avaliação manual e automatizada do FSC foi publicada apenas para um programa45, e não mostrou diferença significativa (teste t pareado, p=0,64). Resultados recentes em 75 pacientes com DCP não mostraram diferença significativa entre a avaliação do FSC obtida pela transformação rápida de Fourier (FFT) e aquimografia47. Diferentes softwares assistidos por computador para análise de CEC foram desenvolvidos 48,49,50, principalmente envolvendo a avaliação da CEC em ROIs limitadas, mas atualmente nenhum está disponível comercialmente 48.
Até onde sabemos, este é o primeiro procedimento operacional padrão publicado para CFA usando DHSV. A AFC que utiliza amostras de escovação nasal fresca tem algumas limitações; a maioria das quais pode ser superada com a realização de uma reanálise da função ciliar após a cultura de células ciliadas respiratórias. Primeiro, infecção, inflamação ou dano durante a amostragem pode levar a anormalidades funcionais ciliares secundárias. A cultura de células ciliadas respiratórias pode melhorar a acurácia do DHSV, particularmente para descartar resultados falso-positivos27. Em segundo lugar, como os pacientes com DCP apresentam inflamação e infecção respiratória crônica, a cultura do epitélio ciliado pode ser necessária, pois encontrar um intervalo de 4-6 semanas livre de infecção para realizar um procedimento de escovação nasal pode ser difícil. Em terceiro lugar, a qualidade da amostra de escovação nasal pode não ser suficiente para fornecer o número necessário de bordas de alta qualidade, particularmente em crianças pequenas. Cultivar as amostras pode ajudar a superar esse problema. Finalmente, a AFC pode ser difícil se a amostra contiver numerosos detritos celulares ou uma alta carga de muco; isso também pode ser resolvido se a CFA for realizada após a cultura celular. Além disso, o treinamento extensivo da equipe em centros experientes é fundamental, uma vez que a detecção de anormalidades da DLC permanece fortemente dependente da experiência do investigador 4,13. O desenvolvimento e a validação de um software automatizado de avaliação da CBP irão potencialmente melhorar essa variabilidade dependente do usuário e ampliar o uso do DHSV para fins de diagnóstico de PCD.
Os resultados também demonstram a importância da técnica de escovação nasal para permitir a efetiva AFC. A cuidadosa técnica de escovação nasal aumenta a capacidade de se obter tiras epiteliais ciliadas de ótima qualidade. Em particular, soprar o nariz antes do procedimento limita o muco, realizar uma escovação suave reduz as hemácias e a colocação correta da escova aumenta a taxa de sucesso da obtenção do epitélio ciliado, pois escovar a parte anterior da cavidade nasal traz de volta o epitélio não ciliado.
Devido à crise sanitária da pandemia de COVID-19, as considerações de controle de infecção nos levaram a adaptar muitos aspectos dos protocolos de videomicroscopia ciliar. Antes da pandemia, usávamos uma câmara construída em laboratório aberto. As vantagens desta câmara incluem a sua facilidade e rapidez de preparação e utilização, custo e a capacidade de reutilização após a limpeza. Há algumas ressalvas importantes, no entanto. A quantidade de meio é importante: as tiras ciliadas precisam estar bem hidratadas para bater corretamente, mas muito meio vai sair da câmara aberta e se misturar com o óleo, impedindo uma boa imagem. Além disso, os espécimes precisam ser observados em no máximo 20 minutos, para evitar a dessecação. Isso pode ser potencialmente superado se um meio M199 adicional for adicionado usando uma seringa diretamente sob a tampa. No contexto da pandemia de COVID-19, o grande problema da câmara aberta é que ela permite a troca de gases e umidade entre o preparo e o ambiente13. Há um risco potencial de contaminação laboratorial e do operador se a amostra estiver infectada pela COVID-19. Identificamos uma câmara de visualização fechada usando um espaçador e demonstramos sua eficácia. Alteramos o protocolo, desde a escovação nasal até a preparação e análise das lâminas, para dar conta de medidas rigorosas de controle de infecção destinadas a prevenir a transmissão da COVID-19. Essas adaptações nos permitiram continuar prestando um serviço de diagnóstico de DCP, sem a utilização de um laboratório de nível 2 de biossegurança. Dada a duração incerta desta atual crise sanitária e a importância de continuar a fornecer serviços essenciais de diagnóstico de PCD, como o DHSV, as adaptações propostas neste artigo tornam possível a realização de CFA sem a utilização de recursos laboratoriais de biossegurança L2, obrigatórios para outras atividades essenciais durante esta crise sanitária.
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Disclosures
Esses autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier e a todos os membros da equipe do centro de diagnóstico PCD de Paris-Est por sua disponibilidade e calorosa recepção durante a visita ao seu centro de diagnóstico PCD, e os inúmeros intercâmbios. Também agradecemos a Robert Hirst e a todos os membros da equipe do centro PCD de Leicester por sua recepção e tempo, conselhos e experiência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | FisherScientific | 352096 | 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid |
| Amphotericin B | LONZA | 17-836E | Antifungal solution |
| Blakesley-weil nasal forceps | NOVO SURGICAL | E7739-12 | Used to hold the brush to perform the nasal brushing |
| Bronchial cytology brush | CONMED | 129 | Used for nasal brushing |
| Cotton swab | NUOVA APTACA | 2150/SG | Used for COVID-19 testing |
| Digitial high-speed videomicroscopy camera | IDTeu Innovation in motion | CrashCam Mini 1510 | |
| Glass slide | ThermoScientific | 12372098 | Microscope slides used to create the visualization chamber |
| Heated Box | IBIDI cells in focus | 10918 | Used to heat the sample |
| Inverted Light microscope | Zeiss | AXIO Vert.A1 | |
| Lens Heater | TOKAI HIT | TPiE-LH | Used to heat the oil immersion lens |
| Medium 199 (M199), HEPES | TermoFisher Scientific | 12340030 | Cell Culture Medium |
| Motion Studio X64 | IDT Motion | version 2.14.01 | Software |
| Oil | FischerScientific, Carl Zeiss | 11825153 | |
| Rectangular cover slip | VWR | 631-0145 | Used to cover the visualization chamber |
| Spacer (Ispacer) 0.25 mm | Sunjinlab | IS203 | Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber |
| Square cover slip | VWR | 631-0122 | Used for the creation of lab-built open visualization chamber |
| Streptomycin/Penicillin | FisherScientific, Gibco | 11548876 | Antiobiotics solution |
References
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