Summary
Um eine erfolgreiche und qualitativ hochwertige ziliäre Funktionsanalyse für die PCD-Diagnostik zu gewährleisten, ist eine präzise und sorgfältige Methode zur Probenahme und Verarbeitung des respiratorischen Epithels unerlässlich. Um während der COVID-19-Pandemie weiterhin PCD-diagnostische Dienstleistungen anbieten zu können, wurde das ziliäre Videomikroskopieprotokoll aktualisiert, um geeignete Maßnahmen zur Infektionskontrolle aufzunehmen.
Abstract
Die primäre ziliäre Dyskinesie (PCD) ist eine genetisch bedingte Motilziliopathie, die zu einer signifikanten otosinopulmonalen Erkrankung führt. Die PCD-Diagnose wird aufgrund von Herausforderungen mit unterschiedlichen diagnostischen Modalitäten oft übersehen oder verzögert. Die Ziliar-Videomikroskopie mit digitaler Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie (DHSV), einem der diagnostischen Instrumente für PCD, gilt als die optimale Methode zur Durchführung einer ziliären Funktionsanalyse (CFA), die aus der Analyse der Ziliarschlagfrequenz (CBF) und des Schlagmusters (CBP) besteht. Dem DHSV fehlt jedoch ein standardisiertes, veröffentlichtes Arbeitsverfahren für die Verarbeitung und Analyse von Proben. Es verwendet auch lebendes respiratorisches Epithel, ein wichtiges Problem der Infektionskontrolle während der COVID-19-Pandemie. Um während dieser Gesundheitskrise weiterhin diagnostische Dienstleistungen anbieten zu können, wurde das ziliäre Videomikroskopieprotokoll angepasst, um angemessene Maßnahmen zur Infektionskontrolle zu enthalten.
Hier beschreiben wir ein überarbeitetes Protokoll für die Probenahme und Laborverarbeitung von Flimmeratmungsproben und heben die Anpassungen hervor, die zur Einhaltung der COVID-19-Infektionskontrollmaßnahmen vorgenommen wurden. Repräsentative Ergebnisse von CFA aus Nasenputzproben von 16 gesunden Probanden, die nach diesem Protokoll verarbeitet und analysiert wurden, werden beschrieben. Wir veranschaulichen auch, wie wichtig es ist, epitheliale Flimmerstreifen in optimaler Qualität zu erhalten und zu verarbeiten, da Proben, die nicht den Qualitätsauswahlkriterien entsprechen, nun eine CFA zulassen, was möglicherweise die diagnostische Zuverlässigkeit und die Effizienz dieser Technik verringert.
Introduction
Die primäre Ziliärdyskinesie (PCD) ist eine vererbte heterogene motile Ziliopathie, bei der die respiratorischen Zilien stationär, langsam oder dyskinetisch sind, was zu einer gestörten mukoziliären Clearance und einer chronischen oto-sino-pulmonalen Erkrankung führt 1,2,3,4. Die klinischen Manifestationen der PCD sind chronischer feuchter Husten und chronische verstopfte Nase ab dem frühen Säuglingsalter, rezidivierende oder chronische Infektionen der oberen und unteren Atemwege, die zu Bronchiektasen führen, sowie rezidivierende oder chronische Mittelohrentzündung und Sinusitis 5,6,7. Etwa die Hälfte der PCD-Patienten weist Organlateralitätsdefekte wie Situs inversus oder Situs ambiguus auf. Einige Patientinnen weisen auch Unfruchtbarkeitsprobleme auf, die auf unbewegliche Spermien bei Männern und unbewegliche Flimmerhärchen in den Eileitern bei Frauen zurückzuführensind 1,2,8. PCD ist selten, aber die Prävalenz ist schwer zu definieren und reicht von 1:10.000 bis 1:20.000 9,10. Es wird jedoch angenommen, dass die tatsächliche Prävalenz der PCD aufgrund von Schwierigkeiten bei der Diagnose und fehlendem klinischem Verdacht höher ist. Die Symptome der PCD ahmen häufige respiratorische Manifestationen anderer akuter oder chronischer Atemwegserkrankungen nach, und die diagnostischen Herausforderungen bei der Bestätigung der Diagnose sind bekannt, was zu einer unzureichenden Behandlung und Nachsorge führt 2,5,9,11.
Die Ziliär-Videomikroskopie mit digitaler Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie (DHSV) ist eines der diagnostischen Instrumente für PCD 4,8,12,13. DHSV gilt als die optimale Methode zur Durchführung einer ziliären Funktionsanalyse (CFA), die aus der Analyse der Ziliarschlagfrequenz (CBF) und des Schlagmusters (CBP) besteht 2,14,15,16. DHSV verwendet lebendes respiratorisches Epithel, das in der Regel durch Nasenbürsten gewonnen wird13.
Angesichts des aktuellen COVID-19-Ausbruchs ist die Bestätigung einer PCD-Diagnose nun noch wichtiger, da es Hinweise darauf gibt, dass eine zugrunde liegende Atemwegserkrankung zu schlechteren Ergebnissen nach einer COVID-19-Infektion führen kann17,18. Eine sichere und effiziente PCD-Diagnostik während der aktuellen Pandemie wird es auch dazu bringen, dass bestätigte PCD-Patienten im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung von zusätzlichen Schutzmaßnahmen profitierenkönnen 19.
Die Übertragung von COVID-19 erfolgt hauptsächlich durch Tröpfchenausbreitung20. Ein hohes Übertragungspotenzial von asymptomatischen (oder minimal symptomatischen) Patienten wird durch die hohe Viruslast in der Nasenprobe20 nahegelegt. Wenn Viruspartikel aerosolisiert werden, bleiben sie außerdem mindestens 3 Stunden in der Luft21. Daher sind Beschäftigte in der Atemwegsmedizin einem hohen Reservoir an Viruslast ausgesetzt, während sie die klinische Versorgung und die Probenentnahme für diagnostische Techniken durchführen22. Darüber hinaus setzt die Manipulation lebender Atemwegsproben den Techniker einer COVID-19-Kontamination aus. Während Best-Practice-Empfehlungen für Pneumologen und HNO-Chirurgen, die COVID-19-Patienten betreuen, umgesetzt werden23, fehlt es an Empfehlungen für die Durchführung von DHSV während der COVID-19-Pandemie.
Um weiterhin eine PCD-Diagnostik anbieten zu können und gleichzeitig die Sicherheit des medizinischen Personals (Durchführung der Probenentnahme) und des Technikers (Durchführung der Probenverarbeitung) zu gewährleisten, musste das ziliäre Videomikroskopieprotokoll während der COVID-19-Pandemie angepasst werden. Die Technik der Ziliar-Videomikroskopie ist derzeit auf Forschungsdienste und spezialisierte diagnostische Zentren beschränkt, da CFA eine umfangreiche Ausbildung und Erfahrung erfordert. Darüber hinaus fehlt es derzeit an einer Standardisierung und einem präzisen Arbeitsablauf für die Verarbeitung und Analyse von Proben mit DHSV 4,13.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, Standardarbeitsanweisungen für DHSV zu beschreiben, mit besonderem Bezug auf Infektionskontrollmaßnahmen und Sicherheit bei der Probenahme und Verarbeitung von lebendem Nasenepithel. Dies wird es ermöglichen, trotz des aktuellen COVID-19-Ausbruchs eine qualitativ hochwertige PCD-Diagnose und -Versorgung fortzusetzen.
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Protocol
Die Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Krankenhauses Lüttich und der Universitätsabteilung für Hygiene und Gesundheitsschutz am Arbeitsplatz eingeholt.
1. Probenahme von respiratorischem Flimmerepithel
- Stellen Sie vor der Probenahme sicher, dass die Probanden mindestens 4-6 Wochen lang frei von Infektionen und frei von nasalen und inhalativen Medikamenten sind.
- Bereiten Sie das ergänzte M199-Präparat vor: Ergänzen Sie das Zellkulturmedium 199 (M199) (500 ml) mit antibiotischer Lösung (5 ml Streptomycin/Penicillin (50 μg/ml)) und antimykotischer Lösung (5 ml Amphotericin B (2,5 μg/ml)).
- Bereiten Sie 2 (eines für jedes Nasenloch) konische 15-ml-Röhrchen mit Deckel vor und füllen Sie jedes von ihnen mit 3 ml ergänztem M199.
- Bereiten Sie eine Bronchialzytologiebürste vor (Dicke: 2 mm und Länge: 11 mm). Schneiden Sie das Ende des Drahtes ab, um sicherzustellen, dass die Bürste ca. 15 cm lang ist (Abbildung 1A,B). Um die Bürste beim Nasenputzen zu halten, verwenden Sie eine Weil-Blakesley-Nasenzange (Abbildung 1B).
- Anpassung an COVID-19: Vermeiden Sie die Verarbeitung einer lebenden Nasenepithelprobe mit unbekanntem Status für COVID-19, testen Sie den Patienten 48 bis 72 Stunden vor dem Nasenputzen für die Ziliarvideomikroskopie auf COVID-19. Dieser COVID-19-Test besteht aus einer Polymerase-Kettenreaktion aus einer Nasen-Rachen-Abstrichprobe24,25. Da der Status des Patienten für COVID-19 zu diesem Zeitpunkt unbekannt ist, müssen Arzt und Personal angemessen geschützt sein23,26, einschließlich FFP2-Maske, Handschuhe, Gesichtsschutz oder Schutzbrille und langärmeliger wasserabweisender Kittel. Im Falle eines nicht verfügbaren, unmöglichen oder zweifelhaften PCR-Tests wird die gesamte Verarbeitung des Nasenbürstens im L2-Biosicherheitslabor durchgeführt. Im Falle eines positiven COVID-19-Status sollten Sie die PCD-Diagnosetests verschieben und alternative Ansätze zur Behandlung des Patienten in Betracht ziehen.
VORSICHT: Diese Nasen-Rachen-Abstrichentnahme für COVID-19-Tests könnte eine sekundäre Ziliärdyskinesie induzieren, indem sie das nasale respiratorische Ziliarepithel schädigt27,28. Um dies zu vermeiden, führen Sie ein dünnes Wattestäbchen unter strenger endoskopischer Kontrolle in die Nasenhöhle bis zum Nasen-Rachen-Raum ein, um Verletzungen der Nasenmuscheln oder der Nasenscheidewand zu vermeiden. Die Probe wird dann aus dem Nasen-Rachen-Raum entnommen und das Wattestäbchen unter Kontrolle des starren Endoskops entnommen. Mit entsprechender Ausstattung kann eine 0° starre Endoskopie bei Erwachsenen und Kindern problemlos ohne Trauma durchgeführt werden.
2. Gewinnung von Proben aus respiratorischem Flimmerepithel
COVID-19-Anpassung: Auch wenn der COVID-19-Status des Patienten aufgrund der Falsch-Negativ-Rate negativ ist, wird der Patient gebeten, während des Eingriffs eine chirurgische Maske auf dem Mund zu tragen, und der Arzt trägt Handschuhe, FFP2-Maske und Gesichtsschutz.
- Vorbereitung auf das Nasenputzen
- Bitten Sie den Patienten, sich die Nase zu putzen.
- Führen Sie das Nasenputzen unter Nasenendoskopie oder verblindet durch. Wenn Sie eine Nasenendoskopie durchführen, untersuchen Sie die 2 Nasenlöcher vor dem Nasenputzen (nicht wiederholen, wenn dies zuvor 48-72 für COVID-19-Nasenabstriche durchgeführt wurde). Die Untersuchung ermöglicht es, den Zustand der Schleimhaut (ein hoher Grad der Entzündung kann beim Nasenputzen Blutungen verursachen, ...), den Zustand der unteren Nasenmuschel (z. B. zum Ausschluss einer Teleangiektasie) und ob die Nasenscheidewand gerade ist (Abbildung 1C) zu überprüfen.
- Bitten Sie den Patienten, sich hinzulegen oder bequem zu sitzen, wobei der Kopf nach hinten auf dem Stuhl ruht (da das Nasenputzen einen Reflex auslöst, um den Kopf nach hinten zu bewegen). Eine zweite Bezugsperson hält den Kopf während des Nasenputzens, insbesondere bei Kindern.
- Schütteln Sie die Bürste vor dem Nasenputzen mit dem beigesetzten M199 (das Befeuchten der Bürste reduziert Reizungen durch das Zähneputzen).
Anmerkungen: Die Bürste kann innerhalb des ergänzten M199 angefeuchtet werden; Wenn der Patient allergisch gegen Antibiotika ist (Penicillin und Streptomycin sind im supplementierten Zellkulturmedium vorhanden), befeuchten Sie die Bürste mit Kochsalzlösung.
- Nasenputzen
- Führen Sie die Nasenbürste sanft ohne Lokalanästhesie oder Vollnarkoseein 13. Wenn Sie eine Nasenendoskopie durchführen, platzieren Sie das Endoskop am Naseneingang, um die untere Nasenmuschel sichtbar zu machen, und führen Sie dann die Zytologiebürste in die Nase ein. Wenn Sie ein "verblindetes" Nasenputzen durchführen, führen Sie die Bürste entlang des Nasenbodens in die Nase ein (Abbildung 1D).
HINWEIS: Einige diagnostische Zentren verwenden eine Lokalanästhesie mit einem Tampon Naphazolin, um das Nasenputzen durchzuführen. - Bewegen Sie die Bürste mehrmals nach hinten und vorne über den hinteren Teil der unteren Nasenmuschel und ziehen Sie sie dann zurück. Der Bediener sollte das Gefühl haben, dass die Bürste das Epithel reibt, und der Patient könnte einseitig tränende Augen an der Seite des Putzens spüren.
HINWEIS: Wenn das Nasenputzen zu anterior durchgeführt wird, werden keine Flimmerzellen erhalten, da die vordere Nasenhöhle mit einem Übergangsepithel ohne Flimmerepithel ausgekleidet ist. - Nach der Probenahme werden die Nasenbürstenproben sofort in das Nährmedium gelegt. Die erhaltenen respiratorischen Epithelstreifen werden durch Rühren der Bürste in dem Röhrchen, das das ergänzte M199 enthält, entfernt und dann das Röhrchen verschlossen (Abbildung 1E).
- Anpassung an COVID-19: Entfernen Sie die Epithelstreifen nicht, indem Sie die Bürste unmittelbar nach der Probenahme in der ergänzten M199 umrühren. Setzen Sie die Bürste in das Rohr ein, schneiden Sie den Draht so ab, dass er vollständig in das Rohr passt, und schließen Sie das Rohr sofort. Legen Sie die Probe in einen luftdichten Doppelbeutel.
- Führen Sie die Nasenbürste sanft ohne Lokalanästhesie oder Vollnarkoseein 13. Wenn Sie eine Nasenendoskopie durchführen, platzieren Sie das Endoskop am Naseneingang, um die untere Nasenmuschel sichtbar zu machen, und führen Sie dann die Zytologiebürste in die Nase ein. Wenn Sie ein "verblindetes" Nasenputzen durchführen, führen Sie die Bürste entlang des Nasenbodens in die Nase ein (Abbildung 1D).
Abbildung 1: Nasenputztechnik. (A) Gesamte Bürste für die Bronchialzytologie (B) Bürstenfertig: Das Bürstenende des Drahtes wird abgeschnitten (ca. 15 cm lang) und von einer Weil-Blakesley-Nasenzange gehalten(C) Endoskopische Ansicht der Nasenhöhle: Nasenscheidewand (1) Nasenscheidewand (2) und Mittelmuschel (3) (D) Das Nasenputzen wird am hinteren Teil der unteren Nasenmuschel (2) durchgeführt. Nasenscheidewand (1) Nasenmuschel (3). (E) Die respiratorischen Epithelstreifen werden durch Schütteln der Bürste in dem zugesetzten M199-Zellkulturmedium entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Verarbeitung des respiratorischen Flimmerepithels
- Analysieren Sie Nasenbürstenproben innerhalb von 9 Stunden nach der Probenahme unter dem Mikroskop, da sowohl CBF als auch CBP innerhalb dieses Zeitrahmens stabil sind (unveröffentlichte Daten).
- Verwenden Sie ein aufrechtes oder inverses Lichtmikroskop mit einem x100 Ölimmersions-Phasenkontrast oder einer Interferenzkontrastlinse. Stellen Sie das Mikroskop idealerweise auf einen Antivibrationstisch, da ziliäre Schläge durch äußere Vibrationen (z. B. vom Labortisch) Artefakten ausgesetzt sein können13.
Anpassung an COVID-19: Der Bediener verwendet persönliche Schutzausrüstung, um die Nasenverarbeitung durchzuführen, einschließlich FFP2-Maske, Handschuhe und langärmeliger wasserabweisender Kittel.
- Bereiten Sie die Visualisierungskammer vor.
- Hängen Sie die Flimmer-Epithelstreifen in einer im Labor gebauten offenen Visualisierungskammer auf, damit die Flimmerhärchen während der Analyse unter dem Mikroskop frei schlagen können. Diese Kammer entsteht durch die Trennung eines Deckglases (22 mm x 40 mm) und eines Glasträgers durch zwei benachbarte quadratische Deckgläser (20 mm x 20 mm), die durch einen Abstand von 15 mm voneinander getrennt und auf den Glasträger12 geklebt werden (Figur 2, Figur 4A).
Anpassung an COVID-19: Die oben beschriebene im Labor gebaute Kammer ist offen und ermöglicht den Gas- und Feuchtigkeitsaustausch zwischen der Probe und der Umgebung13. Im Zusammenhang mit der COVID-19-Pandemie ist es möglich, eine geschlossene Visualisierungskammer mit einem doppelseitig geklebten Abstandshalter mit einer Tiefe von 0,25 mm zu verwenden (Abbildung 3, Abbildung 4B). Der Abstandshalter wird auf den Objektträger geklebt, und dann wird ein Deckglas (22 mm x 40 mm) auf den Abstandshalter geklebt.
Abbildung 2: Montage der im Labor gebauten offenen Kammer. (A) Die 2 quadratischen Deckgläser (20 mm x 20 mm) werden auf den Objektträger gelegt. (B) Die quadratischen Deckgläser werden in einem Abstand von ca. 15 mm voneinander getrennt und auf den Objektträger geklebt. (C) Die Kammer wird zwischen den beiden benachbarten quadratischen Deckgläsern mit einer kleinen Probe (ca. 60 μl) Flimmerepithel in supplementiertem M199 gefüllt. (D) Ein langes rechteckiges Deckglas (22 mm x 40 mm) wird auf die beiden benachbarten quadratischen Deckgläser gelegt und deckt die Kammer ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Befestigung der geschlossenen Kammer mit einem beidseitig aufgeklebten Abstandshalter. (A) Der Glasschieber und der doppelseitig verklebte Abstandshalter. (B) Der Schutz wird auf einer Seite des Abstandshalters entfernt und der Abstandshalter wird dann auf den Glasschieber geklebt. (C) Der Schutz wird von der anderen Seite des doppelseitig festsitzenden Abstandshalters entfernt, und dann wird der Abstandshalter mit einer kleinen Probe (ca. 60 μl) Flimmerepithel in ergänztem M199 gefüllt. (D) Ein langes rechteckiges Deckglas (22 mm x 40 mm) wird auf den Abstandshalter geklebt und verschließt die Kammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Schematische Darstellung der wichtigsten Visualisierungskammern, die für die Durchführung der Ziliarvideomikroskopie mit digitaler Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie (DHSV) verwendet werden. (A) Die Technik des offenen hängenden Tropfens: Die Flimmerprobe wird in einem Tropfen Zellkulturmedium in einer offenen Kammer suspendiert, die durch die Trennung eines Deckglases und eines Glasobjektträgers durch zwei benachbarte Deckgläser entsteht. (B) Die Technik des geschlossenen hängenden Tropfens: Die Flimmerprobe wird in einem Tropfen Zellkulturmedium in einer geschlossenen Kammer suspendiert, die durch einen Abstandshalter entsteht, der zwischen einer Glasseite und einem Deckglas eingeklemmt ist. Der Abstandshalter haftet sowohl auf dem Glasschieber als auch auf dem Deckglas. Reproduziert und modifiziert von Kempeneers et al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Kontrolle der Temperatur
- Umgeben Sie das Mikroskop mit Luftpolsterfolie (Abbildung 5A,B).
- Befestigen Sie die Objektivheizung mit einem Velcro Gurt um das Objektiv (Abbildung 5C)
- Schalten Sie den Regler der Objektivheizung 1 Stunde ein, bevor Sie die Kontrolltemperaturprüfung durchführen.
- Schalten Sie das Mikroskop ein und überprüfen Sie, ob das Mikroskop eingerichtet ist, da die Lichtmenge durch die Probe die Temperatur auf dem Objektträger verändern kann.
- Schalten Sie die Steuerung der beheizten Box ein (Abbildung 5D).
- Überprüfen Sie, ob die Referenzsonde ordnungsgemäß funktioniert, bevor Sie beginnen. Halten Sie die Spitze der Referenzsonde zwischen den Fingern. Es sollte die Körpertemperatur messen.
- Legen Sie freie Medien in die Mitte des Objektträgers, zwischen die beiden nebeneinander liegenden quadratischen Deckgläser (20 mm x 20 mm), die darauf geklebt sind.
- Setzen Sie die Referenzsondenspitze in das beiliegende M199 ein. Deckel mit rechteckigem Deckglas (22 mm x 40 mm). Achten Sie darauf, dass die Sonde vollständig von Medien umgeben ist (sonst könnte die Temperatur sinken).
- Anpassung an COVID-19: Um die Temperaturregelung in der geschlossenen Kammer mit einem Abstandshalter durchzuführen, schneiden Sie eine Seite des Abstandshalters ab (dieses Loch muss die gleiche Größe wie die Referenzsonde haben). Kleben Sie den Abstandshalter auf den Objektträger, legen Sie freie Medien in die Mitte des Abstandshalters. Stecken Sie die Spitze der Referenzsonde durch das Loch des Abstandshalters in die Lösung und kleben Sie dann ein rechteckiges Deckglas (22 mm x 40 mm) auf den Abstandshalter.
- Legen Sie den Objektträger in die Platte der beheizten Box. Verschließen Sie die beheizte Box mit dem Deckel.
- Öl auf das Ölimmersionsobjektiv geben.
- Stellen Sie die beheizte Box auf den Mikroskoptisch.
- Stellen Sie die Temperatur der Platte und des Deckels (die Temperatur des Deckels sollte 2 °C höher sein als die Temperatur der Platte, um Kondensation zu vermeiden) so ein, dass sie mit der Referenzsonde im Medium 37 °C messen.
- Warten Sie 5 Minuten (Zeit, die benötigt wird, um die Temperatur der Probe auf 37 °C zu erhöhen).
- Stellen Sie das Objektiv ein und bewegen Sie es näher an den Objektträger, bis Sie das Deckglas mit der Spitze des Objektivs berühren.
- Bewegen Sie das Objektiv, um die Mitte der Sonde im Mikroskop zu sehen.
Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Sonde auf dem Computerbildschirm zu sehen ist (um zu überprüfen, ob das Kamerasystem funktioniert, bevor Sie die Flimmerprobe betrachten). Wenn Sie die Mitte der Sonde betrachten, ist der Bildschirm vollständig schwarz. - Stellen Sie die Temperatur der Objektivheizung ein (um den Temperaturverlust auszugleichen, wenn die Ölimmersionslinse mit dem Deckglas in Kontakt kommt). Achten Sie darauf, mit der Referenzsonde 37 °C im Medium zu messen, wenn das Objektiv das Deckglas berührt.
Anmerkungen: Arbeiten Sie idealerweise in einem Raum mit kontrollierter Temperatur, damit sich diese eingestellten Temperaturen nicht ändern. Wenn die Temperatur des Raumes nicht kontrolliert wird, sollten Sie diese Temperaturkontrolle jeden Tag durchführen, bevor Sie eine Ziliarvideomikroskopie durchführen. - Nachdem Sie die Temperatur überprüft haben, nehmen Sie den Objektträger aus der beheizten Box.
- Reinigen Sie den Objektträger und die Spitze der Referenzsonde mit Alkohol und legen Sie ihn weg.
- Reinigen Sie die Linse mit Isopropanol und Reinigungstüchern mit kreisenden Bewegungen.
Abbildung 5: Geräte, die im DHSV-Labor verwendet werden. (A) Das Mikroskop, das mit einer 100-fachen Ölimmersions-Phasenkontrastlinse ausgestattet ist, wird auf einen Antivibrationstisch gestellt, um zu vermeiden, dass externe Vibrationen Artefakte für die ziliäre Funktionsanalyse verursachen (B) Das Mikroskop ist von Luftpolsterfolie umgeben, um Wärmeverluste durch Umgebungsluft zu verhindern. (C) Das Ölimmersionsobjektiv erzeugt Wärmeverlust. Dies kann mit einer Linsenheizung (Pfeile) verhindert werden. (D) Die Probe wird mit einem Heizkasten erhitzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
4. Präparation der respiratorischen Flimmerepithelproben
- Schütteln Sie die Röhre vorsichtig, damit sich die Flimmerhärchen in der Röhre ausbreiten können (um zu vermeiden, dass Flimmerhärchen an anderen Flimmerstreifen, Schleim oder Schmutz hängen bleiben, die verhindern, dass sie frei schlagen).
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um "optimale Kanten" des Flimmerepithels zu erhalten (Abbildung 12). - Mit einer Pipette werden ca. 50 μl Flimmerepithel in supplementiertem M199 in der Mitte des Röhrchens entnommen.
- Die Probe wird auf die im Labor gebaute Kammer (zwischen den beiden benachbarten quadratischen Deckgläsern (20 mm x 20 mm)) gelegt und mit einem rechteckigen Deckglas (22 mm x 40 mm) abgedeckt. Achten Sie darauf, keine Blasen hinzuzufügen.
- Anpassung an COVID-19: Die Schritte 4.1-4.3 in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank durchführen. Ablauf in der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank.
- Schalten Sie die mikrobiologische Sicherheitswerkbank 10 Minuten vor der Probenvorbereitung ein (um sicherzustellen, dass die Umgebung steril ist).
- Desinfizieren Sie vor jeder Handhabung die gesamte mikrobiologische Sicherheitswerkbank mit 70%igem Ethanol.
- Desinfizieren Sie das gesamte notwendige Material mit 70%igem Ethanol, bevor Sie es in die mikrobiologische Sicherheitswerkbank geben.
- Öffnen Sie die konischen 15-ml-Röhrchen mit den Proben nur einmal unter der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank und entfernen Sie dann die Epithelstreifen, indem Sie die Bürste (mit einer Weil-Blakesley-Nasenzange) in der ergänzten M199 bewegen.
- Kleben Sie den Abstandshalter auf den Glasschieber und entfernen Sie den Schutz von dem doppelseitig festsitzenden Abstandshalter.
- Schütteln Sie die Röhre vorsichtig, damit sich die Flimmerhärchen im gesamten Schlauch ausbreiten können.
- Entnehmen Sie eine kleine Probe des Flimmerepithels in supplementiertem M199 aus der Mitte des Röhrchens mit einer Pipette (ca. 60 μL) und füllen Sie den Spacer.
- Kleben Sie das rechteckige Deckglas (22 mm x 40 mm) auf den Abstandshalter, um die Kammer zu verschließen.
- Desinfizieren Sie den Objektträger, bevor Sie die mikrobiologische Sicherheitswerkbank verlassen.
- Entfernen Sie den Objektträger aus der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank.
- Wechseln Sie die Handschuhe, wenn Sie die mikrobiologische Sicherheitswerkbank verlassen.
- Warten Sie 10 Minuten, bevor Sie die mikrobiologische Sicherheitswerkbank nach Gebrauch ausschalten (um sicherzustellen, dass die Umgebung der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank steril ist, bevor Sie die Tür schließen).
- Legen Sie den Objektträger in die Platte der beheizten Box. Verschließen Sie die beheizte Box mit dem Deckel.
- Öl auf das Ölimmersionsobjektiv geben.
- Stellen Sie die beheizte Box auf den Tisch des Mikroskops.
- Schalten Sie die beheizte Box und die Objektivheizung ein.
Anmerkungen: Die Objektivheizung muss 1 Stunde vor Gebrauch eingeschaltet werden. - Passen Sie die Temperatureinstellungen der beheizten Box und der Linsenheizungsregler entsprechend den in Schritt 3.4 ermittelten Werten an.
- Warten Sie 5 Minuten (Zeit, die erforderlich ist, um die Temperatur der Probe auf 37 °C zu erhöhen, wenn vordefinierte Einstellungen sowohl für die beheizte Box als auch für die Objektivheizung verwendet werden).
- Nähern Sie sich dem Objektträger, bis Sie das Deckglas mit der Spitze des Objektivs berühren.
5. Visualisierung von Wimpernrändern der Atemwege
- Befestigen Sie die Hochgeschwindigkeits-Videokamera am Mikroskop, schließen Sie die Kamera an den Computer an und schalten Sie die Kamera ein.
- Schalten Sie den Computer ein.
- Schließen Sie die digitale Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopiekamera über die Software an den Computer an (so dass das durch die Okularlinsen betrachtete Bild auf den Monitor projiziert wird).
- Öffnen Sie die Software, und das Hauptmenü wird automatisch geöffnet (Abbildung 6A).
HINWEIS: Die Software ist das Programm, das im Labor für die Bildaufnahme und -verarbeitung verwendet wird. Das System ermöglicht es, Videosequenzen aufzunehmen und mit reduzierter Bildrate oder Bild für Bild wiederzugeben. Es kann kostenlos heruntergeladen werden. - Öffnen Sie die Kamera (Abbildung 6A).
- Wenn der Kameraenumerationsfilter angezeigt wird, wählen Sie OK aus (Abbildung 6B).
- Wählen Sie Liste aktualisieren. Wählen Sie den Namen der Kamera aus. Wählen Sie " Schnittstelle: Experte" und dann "Öffnen " aus (Abbildung 6C).
- Wählen Sie in der Kamerasteuerungszeile am oberen Rand des angedockten Dialogmenüs Live aus (Abbildung 6D).
- Wählen Sie " Wiedergabe", um das Bild anzuzeigen, und "Stopp", um die Anzeige abzuschließen (Abbildung 6D).
- Öffnen Sie die Software, und das Hauptmenü wird automatisch geöffnet (Abbildung 6A).
Abbildung 6: Beschreibung der Nutzung der Software: Visualisierung von respiratorischen Flimmerrändern auf dem Monitor. (A) Das Hauptmenü erscheint direkt beim Öffnen der Software. (B) Schließen Sie den Kamera-Enumerationsfilter. (C) Wählen Sie die Kamera aus und wählen Sie Schnittstelle: Experte. (D) Der Live-Modus ermöglicht es, das durch das Mikroskop gesehene Bild auf dem Monitor zu visualisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Passen Sie die Einstellung für die Kameraerfassung (in der oberen rechten Ecke) an (Abbildung 7).
- Wählen Sie unter " Aufnahmeeinstellungen " die Option " Kamera" und passen Sie dann die Bildrate an: Frequenz (Hz): 500 (siehe unten) (Abbildung 7A).
- Wählen Sie unter " Erfassungseinstellungen " die Option " Kamera" und passen Sie dann den Interessenbereich (ROI) an (Abbildung 7A).
HINWEIS: Der ROI wird mit einer Skala berechnet, die mit dem x100-Ölimmersionsobjektiv betrachtet und auf den Monitor projiziert wird, um die Anzahl der Pixel zu definieren, die 50 μm entsprechen (da Sie Flimmerkanten mit einer Größe von ca. 50 μm aufnehmen möchten (siehe unten)). - Wählen Sie unter "Aufnahmeeinstellungen " die Option " Aufzeichnen" und passen Sie dann die Dauer des Videos und die Gesamtzahl der aufgenommenen Bilder an (eine Dauer von 2 Sekunden, entspricht 1000 Bildern, wenn die gewählte Bildrate 5OO Hz beträgt) (Abbildung 7B).
HINWEIS: Unserer Erfahrung nach ist eine Videolänge von mindestens 2 Sekunden erforderlich, um eine vollständige Analyse von CBF und CBP zu ermöglichen. - Wählen Sie " Datei" und dann " Kamera-Cfg speichern", um die neue Erfassungseinstellung zu speichern (geben Sie einen Namen und ggf. einen Kommentar für diese neue Konfiguration ein) (Abbildung 7C,D).
- Um diese neue Kamerakonfiguration zu öffnen, öffnen Sie Datei und laden Sie Camera Cfg (Abbildung 7C).
Abbildung 7: Beschreibung der Verwendung der Software: Anpassung der Kameraerfassungseinstellungen für die Videoaufzeichnung der schlagenden Flimmerkanten. (A) Passen Sie in der Erfassungseinstellung Kamera den Interessenbereich (ROI) und die Bildrate für die Videoaufzeichnung (Rate) an. (B) Passen Sie in der Aufnahmeeinstellung Aufnahme die Dauer der Videoaufnahme an (Anzahl der Bilder, die für die gewählte Aufnahmedauer benötigt werden, entsprechend der zuvor gewählten Bildrate). (C) Diese neuen Kamerakonfigurationseinstellungen können mit der Funktion Kamera speichern gespeichert werden. Load Camera Cfg ermöglicht es, die gespeicherten Konfigurationseinstellungen für die weitere Verwendung erneut zu öffnen. (D) Die neuen Kamerakonfigurationseinstellungen können benannt und bei Bedarf mit einem Kommentar versehen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Sehen Sie durch Okularlinsen und suchen Sie nach Zellen oder Ablagerungen in der Probe und fokussieren Sie dann.
- Überprüfen Sie, ob das Bild auf dem Monitor sichtbar ist, und verbessern Sie die Bildqualität, indem Sie den Kondensor (und das DIC-Prisma bei Verwendung einer Interferenzkontrastlinse) einstellen und ggf. den Fokus anpassen.
- Suche nach Streifen von Flimmerepithel.
6. Auswahl der Wimpernränder für die Atemwege
ANMERKUNG: Das experimentelle System ermöglicht es, schlagende Zilien in drei verschiedenen Ebenen zu betrachten: ein seitliches Profil, das direkt auf den Beobachter zuschlägt, und von direkt oben (Abbildung 8).
Abbildung 8: Die DHSV-Technik ermöglicht es, schlagende Zilien in drei verschiedenen Ebenen zu betrachten. (A) im seitlichen Profil. (B) direkt auf den Betrachter zuschlagen und. (C) direkt von oben. Reproduziert von Kempeneers et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Es werden nur intakte, ununterbrochene Flimmerepithelränder mit einer Länge von mindestens 50 μm aufgezeichnet.
- Für Aufzeichnungen, die auf dem seitlichen Profil gemacht wurden, bestimmen Sie die Qualität der Kante gemäß dem Bewertungssystem von Thomas et al.29 (Abbildung 9). Verwenden Sie nur normale Kanten (Abbildung 9A) oder Kanten mit kleineren Projektionen (Abbildung 9B) für die ziliäre Funktionsanalyse. Schließen Sie isolierte Zellen aus (Abbildung 9E).
Abbildung 9: Repräsentatives Bild des Scoring-Systems von Thomas et al.29 für die unterschiedliche Qualität der Flimmerepithelränder. (A) Normalrand: definiert als ein intakter, einheitlich bewimperter Epithelienstreifen > 50 μm Länge (B) Flimmerrand mit geringfügigen Vorsprüngen: definiert als eine Kante >50 μm Länge, mit Zellen, die aus der epithelialen Randlinie herausragen, aber ohne Punkt der apikalen Zellmembran, der über die Spitzen der Flimmerhärchen auf die benachbarten Zellen hinausragt (C) Flimmerrand mit Hauptvorsprüngen: definiert als eine Kante >50 μm Länge, mit Zellen, die aus der epithelialen Randlinie herausragen, wobei mindestens ein Punkt der apikalen Zellmembran über die Spitzen der Flimmerhärchen auf die benachbarten Zellen hinausragt (D) Isolierte Flimmerzelle: definiert als die einzige Flimmerzelle an einem Epithelrand >50 μm Länge (E) Einzelzellen: definiert als Flimmerzellen, die keinen Kontakt untereinander oder zu einem anderen Zelltyp haben. Maßstabsleiste: 5,5 μm. Reproduziert von Thomas et al.29Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Führen Sie die CFA durch, indem Sie nur Zilien verwenden, die frei von Schleim und Schmutz sind, und schlagen Sie in dem Profil, das für die aufgezeichnete Kante ausgewählt wurde. Wählen Sie nur Flimmerkanten aus, die mindestens 2 CBF- und CBP-Auswertungen (siehe unten) entlang der Kante zulassen.
- Verwenden Sie nur für CFA-Proben, die mindestens 6 Kanten ergeben, die im seitlichen Profil schlagen und die oben genannten Kriterien erfüllen. Analysieren Sie maximal 20 Kanten im seitlichen Profil.
- Verwenden Sie mindestens 1 zusätzlichen Rand der Flimmerhärchen, der von oberhalb des Beobachterprofils schlägt, um das CBP zu charakterisieren.
7. Aufnahme von Flimmerrand
- Nehmen Sie die schlagende Zilienkante mit einer Kamerabildrate von 500 Bildern pro Sekunde auf und projizieren Sie sie auf einen hochauflösenden Monitor. Eine minimale Bildrate von 400 Hz ist erforderlich, um die Analyse sowohl von CBF als auch von CBP13 zu ermöglichen. Nehmen Sie eine Kante mit einer Bildrate von 30 Bildern pro Sekunde auf, um die Effizienz der Partikelentfernung zu bewerten.
- Wählen Sie Live in der Kamerasteuerungszeile am oberen Rand des angedockten Dialogmenüs (Abbildung 6D)
- Wählen Sie " Wiedergabe ", um das Bild anzuzeigen, und "Stopp", um die Anzeige abzuschließen (Abbildung 6D)
- Um eine Kante aufzuzeichnen, drücken Sie die Aufnahmetaste (Abbildung 6D). Um die Aufnahme vor dem Speichern anzuzeigen, gehen Sie auf die Kamerasteuerungszeile oben im angedockten Dialogmenü und wählen Sie Wiedergabe. Wählen Sie "Wiedergabe", um das aufgenommene Video anzuzeigen, und "Stopp", um die Wiedergabe zu beenden (Abbildung 10A).
HINWEIS: Beenden Sie die Anzeige der aufgezeichneten Kante vor dem Speichern.
Abbildung 10: Beschreibung der Nutzung der Software. (A) Wiedergabemodus. Um eine aufgezeichnete Videosequenz zu überprüfen, in der eine Wimpernkante geschlagen wird, wählen Sie den Wiedergabemodus. Wählen Sie "Wiedergabe", um das Bild anzuzeigen, und "Stopp", um die Anzeige abzuschließen. Die Fame-Rate kann angepasst werden, um die Analyse der Ziliarfunktion zu verbessern (B, C) Speichern der Videoaufzeichnungen von schlagenden Flimmerrändern (B) Um das Video zu sichern, wählen Sie "Datei" und dann "Akquisitionen speichern". (C) Geben Sie den Namen des aufgenommenen Videos ein und wählen Sie die Platzierung aus, an der das Video aufgenommen wird. Stellen Sie sicher, dass die Aufzeichnung als . RAW-Datei (D) Auswahl einer Aufnahme von zu analysierenden Schwebungskanten: Um eine Videoaufzeichnung zu öffnen, wählen Sie "Datei", dann "Öffnen" und dann "Bilder". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Speichern Sie das Video in der Datenbank (Abbildung 10B, C).
- Öffnen Sie die Datei in der oberen linken Ecke und speichern Sie die Erfassungen (Abbildung 10B).
- Geben Sie unter Erfassungen speichern den Namen des aufgezeichneten Videos ein und stellen Sie sicher, dass die Aufnahme im RAW-Dateiformat gespeichert ist (Abbildung 10C).
- Wenn das Video gespeichert ist, kehren Sie in den Live-Modus zurück (gehen Sie zurück zur Kamerasteuerungszeile oben im angedockten Dialogmenü und wählen Sie Live) (Abbildung 6D).
- Wiederholen Sie den Vorgang, um die Anzahl der Kanten zu erfassen, die die für CFA erforderlichen Auswahlkriterien erfüllen.
HINWEIS: Es ist möglich, innerhalb von maximal 20 Minuten nach der Präparation des Objektträgers mehrere Schwebkanten, die den Auswahlkriterien entsprechen, von einem Objektträger aufzunehmen (um ein Austrocknen zu vermeiden). Wenn es nach 20 Minuten nicht möglich ist, genügend Kanten zu erhalten, die den Auswahlkriterien entsprechen, bereiten Sie eine neue Folie vor. - Nehmen Sie den Objektträger aus der beheizten Box.
- Entfernen Sie das rechteckige Deckglas und werfen Sie es in den speziellen Behälter für gefährliche medizinische Abfälle.
- Reinigen Sie den Objektträger (mit den beiden aufgeklebten quadratischen Deckgläsern) mit 70%igem Ethanol und saugfähigem Papier. Sobald der Objektträger sauber ist, kann er wieder verwendet werden.
- Anpassung an COVID-19: Legen Sie den Objektträger mit dem Deckglas und dem Abstandshalter in einen luftdichten Beutel, ziehen Sie Handschuhe und Maske aus und legen Sie sie in den luftdichten Beutel. Legen Sie den luftdichten Beutel in den speziellen Behälter für gefährliche medizinische Abfälle.
8. Ziliäre Funktionsanalyse
- Vorbereitende Vorbereitung zur Durchführung der manuellen CBF- und CBP-Auswertung
- Öffnen Sie die Software.
- Öffnen Sie Datei in der oberen linken Ecke, dann Öffnen und dann Bilder (Abbildung 10D).
- Wählen Sie das zu analysierende Video aus.
- Gehen Sie auf die Kamerasteuerungszeile oben im angedockten Dialogmenü und wählen Sie Wiedergabe (Abbildung 10A). Wählen Sie "Wiedergabe", um das aufgenommene Video anzuzeigen, und "Stopp", um die Wiedergabe zu beenden.
- Manuelle Analyse der Ziliarschlagfrequenz (CBF)
- Führen Sie die Auswertung des CBF nur anhand der seitlichen Kanten durch.
- Teilen Sie die Flimmerkanten in ca. 5 benachbarte Bereiche, die jeweils ca. 10 μm messen (Abbildung 11).
- Identifizieren und visualisieren Sie Zilien oder Gruppen von Zilien mit einer reduzierten Bildrate, und es werden maximal 2 CBF-Messungen in jedem Bereich durchgeführt, was zu maximal 10 CBF-Messungen entlang jeder Kante führt (Abbildung 11).
- Zeichnen Sie die Anzahl der Frames auf, die für eine Gruppe von Zilien erforderlich sind, um 5 Schlagzyklen abzuschließen.
- Konvertieren Sie in CBF durch eine einfache Berechnung: (CBF= Aufnahme-Framerate (Hz)/(Anzahl der Frames für 5 Schläge) x 5)13,16,30. Unbewegliche Zilien werden mit einem CBF von 0 Hz13 angegeben.
HINWEIS: Passen Sie die Bildrate bei der Wiedergabe der aufgenommenen Videos an (Abbildung 10A). Dies ist besonders nützlich, wenn die analysierten Flimmerhärchen sehr langsam schlagen. Durch Erhöhen der Bildrate können Sie feststellen, ob die Flimmerhärchen sehr langsam schlagen oder unbeweglich sind. - Berechnen Sie für jede Probe den mittleren CBF als Mittelwert (SD) oder (95%-KI) aller CBF, die im Seitwärtsprofil aufgezeichnet wurden, einschließlich statischer Zilien.
Abbildung 11: Repräsentatives Bild eines optimalen Qualitätsvorteils und die Aufteilung in 5 Bereiche, um eine CFA-Analyse zu ermöglichen. Ein Flimmerepithelrand mit optimaler Qualität wird in 5 benachbarte Bereiche mit einer Größe von jeweils 10 μm fragmentiert. In jedem Bereich werden maximal 2 CBF-Messungen (und 2 CBP-Auswertungen) durchgeführt, was zu maximal 10 CBF-Messungen (und CBP-Auswertungen) entlang jeder Kante führt. Maßstabsleiste = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Manuelle Analyse des ziliären Schlagmusters (CBP)
- Um die Marker der Dyskinesie zu bewerten, verwenden Sie nur das seitliche Profil. Verwenden Sie die Ebenen in Richtung des Beobachters und von oben, um den Typ von CBP13 zu charakterisieren. Es gibt verschiedene Methoden und Scores für die CBP-Bewertung. Im Folgenden wird die im Labor verwendete Methode mit der Definition der Marker der Dyskinesie beschrieben.
- Der prozentuale Anteil jedes einzelnen CBP innerhalb der Stichprobe
- Führen Sie für jede Zilien oder Gruppe von Zilien, die identifiziert und für eine CBF-Messung verwendet werden (Abbildung 11), eine CBP-Analyse mit reduzierter Bildrate durch: Vergleichen Sie den genauen Weg, den die Zilien während eines vollständigen Schlagzyklus zurückgelegt haben, mit dem normalen CBP, der in der DHSV-Analyse beobachtet wurde12,30.
- Ordnen Sie jeder Zila oder Gruppe von Zilien, die analysiert werden, ein eindeutiges CBP (normal, until, steif, zirkulär, asynchron (unkoordiniertes Ziliarschlagen) oder dyskinetisch13) zu.
- Berechnen Sie für jede Stichprobe den Prozentsatz jedes einzelnen CBP innerhalb der Stichprobe. der CBP, der der Stichprobe zugeschrieben wird, ist der vorherrschende beobachtete CBP.
- Berechnen Sie die 3 Marker der Dyskinesie.
- Berechnen Sie den Imtilitätsindex (IMI): den Prozentsatz der unbeweglichen Zilien innerhalb der Stichprobe (Anzahl der CBF=0/Gesamtzahl der CBF-Messwerte in der Stichprobe X 100). Drücken Sie den IMI als Mittelwert (SD) oder (95%-KI) aus1,16,31.
- Berechnen Sie den Dyskinesie-Score (DKS). Teilen Sie jede Flimmerkante in Quadranten, und die Anzahl der Quadranten mit dyskinetischen (oder abnormal schlagenden) Zilien wird bestimmt. Dadurch kann ein DKS zwischen 0 und 4 berechnet werden (0: normaler CBP am Rand; 1: abnormaler CBP bei ≤ 25 % der Zilien; 2: abnormaler CBP bei ≤ 50 % der Zilien; 3: abnormales Schlagmuster bei ≤ 75 % der Zilien; und 4: abnormaler CBP bei allen Zilien). Der Median DKS (Interquartilsabstand) wird für die Stichprobe16,29 berechnet.
- Berechnen Sie den Prozentsatz des normalen Schlags: definiert als der Prozentsatz der Zilien mit einem normalen CBP innerhalb der Probe (Anzahl der normalen CBP-Messwerte/Gesamtzahl der CBP-Messwerte für die Probe x100).
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Representative Results
Um die Effizienz der Technik zu veranschaulichen, präsentieren wir die Ergebnisse der CFA in einer Serie von 16 gesunden erwachsenen Probanden (5 Männer, Altersspanne 22-54 Jahre).
Nasenputzproben von 14 (4 Männer, Altersspanne 24-54 Jahre) von insgesamt 16 Probanden lieferten genügend geeignete Epithelränder, die die für die Durchführung einer CFA erforderlichen Auswahlkriterien erfüllten. Von diesen 14 Nasenputzproben wurden insgesamt 242 Flimmerränder erfasst, von denen 212 die definierten Einschlusskriterien erfüllten und analysiert wurden. Alle diese Kanten wurden im seitlichen Profil aufgezeichnet (Zilien, die von oben auf den Beobachter schlugen, wurden aufgezeichnet und für jeden Probanden analysiert, um zu beurteilen, ob ein zirkuläres CBP beobachtet wurde13, aber diese Kanten wurden für den CFA nicht berücksichtigt). Insgesamt wurden 807 CBF-Messungen und CBP-Auswertungen aus den untersuchten Zilien bzw. Ziliengruppen gewonnen (Tabelle 1). Die detaillierten Ergebnisse der CFA für jeden gesunden Probanden sind in Tabelle 1 dargestellt.
Der mittlere CBF (± Standardabweichung) für die 14 Probanden, deren Stichproben die Einschlusskriterien erfüllten, betrug 14,79 (± 2,17) Hz. Dies stimmt mit früheren veröffentlichten Referenzdaten in Laboratorien überein, die DHSV bei einer kontrollierten Temperatur von 37 °C durchführen 16,29,30, während CBF-Messungen in Laboratorien, die DHSV bei Raumtemperatur durchführen, niedriger sind15,32,33. Der mittlere Prozentsatz (± Standardabweichung) des normalen CBP für die gesunden Probanden betrug 78,82 (± 14,73) %, und für jeden dieser gesunden Probanden war das vorherrschende Schlagmuster normal. Bei den gesunden Probanden wurden keine Zilien gefunden, die in einem kreisförmigen Schlagmuster schlugen, wie zuvor berichtetwurde 16,34.
Der mittlere IMI (± Standardabweichung) betrug 2,27 (± 2,3) % und der mediane DSK (Interquartilsabstand) 0 (0-1). Diese Werte entsprachen den früheren Veröffentlichungen über gesunde Freiwillige 16,29. Es ist interessant festzustellen, dass die DSK und der CBF den Werten ähnelten, die von Thomas et al. aus der Analyse berichtet wurden, wenn nur normale Kanten oder Kanten mit geringer Projektion ausgewählt wurden (Abbildung 9), was die Bedeutung widerspiegelt, nur Kanten zu analysieren, die die Einschlusskriterien29 erfüllen. Bei der Verwendung von Kanten mit geringer Qualität berichteten sie von einem niedrigeren CBF und einem höheren DKS29. Dies verdeutlicht, dass die Verwendung von Epithelkanten, die nicht den Selektionskriterien entsprechen, fälschlicherweise zu einer PCD-Diagnose führen kann.
Um als PCD-Diagnoseinstrument verwendet zu werden, sollte die CFA aus Nasenbürstenproben daher unter Verwendung von Epithelstreifen optimaler Qualität (Abbildung 12A) durchgeführt werden, die durch eine optimale Verarbeitung von Nasenbürstenproben und eine optimale Kantenauswahl erhalten werden. Wie im Protokoll angegeben, sollten nur intakte, ununterbrochene Flimmerepithelränder mit einer Länge von mindestens 50 μm verwendet werden, und die CFA sollte nur mit Zilien durchgeführt werden, die frei von Schleim und Ablagerungen sind. Im seitlichen Profil sollten Schlagkanten, die weniger als 2 Bewertungen von CBF und CBP ermöglichen, ausgeschlossen werden.
Darüber hinaus können rote Blutkörperchen und Schleim das Schlagen freier Zilien blockieren oder Zilien vor dem Beobachter verbergen (Abbildung 12B). Die Schleimmenge kann begrenzt werden, indem der Patient gebeten wird, sich vor dem Nasenputzen die Nase zu putzen und bei einer akuten Nasenentzündung kein Nasenputzen durchzuführen (eine Entzündung erhöht die Schleimmenge und das Blutungsrisiko beim Nasenputzen). Darüber hinaus muss das Nasenputzen sanft sein, um leichte Blutungen und damit die Anzahl der roten Blutkörperchen zu begrenzen. Wenn die Bürste jedoch nicht fest gegen die untere Nasenmuschel drückt, enthält die Nasenputzprobe möglicherweise nicht genügend hochwertige Flimmerepithelstreifen (Abbildung 12C,D).
Wenn das Nasenputzen schließlich im vorderen Teil der Nasenhöhle durchgeführt wird, werden keine Flimmerzellen erhalten, da dieser Teil der Nase mit einem Übergangsepithel ohne Flimmerepithel ausgekleidet ist (Abbildung 12E). Daher ist die Qualität der Nasenputzprobe wichtig, um mindestens 6 Ränder von Zilien zu erhalten, die im seitlichen Profil schlagen (und 1 Rand von Zilien, die von oben schlagen), die die Einschlusskriterien erfüllen.
Von den 16 gesunden Probanden wurden 2 Nasenputzproben für CFA ausgeschlossen. Ein Proband wurde ausgeschlossen, da die Probe nicht die erforderliche Anzahl von Flimmerrändern aufweisen konnte, die die Einschlusskriterien erfüllten, wobei hauptsächlich isolierte Zellen in der Probe gefunden wurden (Abbildung 12D). Der zweite Proband wurde ausgeschlossen, da alle aufgezeichneten Epithelaränder (n=7) nicht bewimpert waren (Abbildung 12E), was darauf hindeutet, dass das Nasenputzen zu anterior war und an der unteren Nasenmuschel nicht richtig durchgeführt wurde. Diese Schlussfolgerung wurde gezogen, weil es sich bei der Versuchsperson um einen gesunden Freiwilligen handelte. Wiederholtes Nasenputzen, bei dem bei einem Patienten mit Verdacht auf PCD nur nicht bewimperte Epithelränder gefunden werden, könnte zur Diagnose einer reduzierten Bildung multipler beweglicher Zilien (RGMC) führen, einer mukoziliären Clearance-Störung, die durch ein Versagen der Ziliogenese verursacht wird 3,35,36.
Aufgrund der COVID-19-Pandemie musste das diagnostische Zentrum der Universität Lüttich das ziliäre Videomikroskopieprotokoll anpassen. Vor der Pandemie haben wir eine offene Visualisierungskammer verwendet, die den Gas- und Feuchtigkeitsaustausch zwischen der Probe und der Umgebung ermöglicht. Da dies potenziell zu einer Kontamination des Bedieners und/oder der Umgebung führen könnte, haben wir auf eine geschlossene Visualisierungskammer umgestellt und die Dichtigkeit dieser Kammer für Gas und Flüssigkeit getestet. Abbildung 13 zeigt den Dichtigkeitstest der geschlossenen Visualisierungskammer mit einem beidseitig festsitzenden Abstandshalter. Die Hermetik wurde getestet, indem die Kammer mit 60 μl Trypanblau und Luft gefüllt und die Kammer dann 4 Stunden lang in Wasser getaucht wurde. Da wir 4 Stunden lang kein Trypanblau oder Luftblasen im Wasser beobachteten, kamen wir zu dem Schluss, dass die Kammer sowohl für Flüssigkeit als auch für Gas hermetisch abgedichtet war. Die Verwendung dieser geschlossenen Visualisierungskammer zur Durchführung der Ziliarvideomikroskopie während der Pandemie wurde von der Abteilung für Hygiene und Gesundheitsschutz am Arbeitsplatz der Universität Lüttich genehmigt.
| Gesunder Freiwilliger | Nein. Von Edge aufgezeichnet | Nein. der analysierten Kanten | Anzahl der CBF-Messungen | CBF (Hz) (Mittelwert ± SD) |
Normaler CBP (%) (Mittelwert ± SD) |
IMI (%) (Mittelwert ± SD) |
DSK-Median (Interquartilsabstand) |
| 1 | 21 | 16 | 52 | 16.59 ± 3.83 | 82.7 | 0 | 0 (0-2) |
| 2 | 11 | 7 | 34 | 18,4 ± 5,32 | 97.1 | 0 | 0 (0-1) |
| 3 | 12 | 11 | 48 | 12.12 ± 1.87 | 91.7 | 0 | 0 (0-2) |
| 4 | 20 | 20 | 60 | 15.18 ± 3.29 | 86.7 | 1.67 | 0 (0-1) |
| 5 | 18 | 14 | 54 | 11.82 ± 3.97 | 87 | 3.7 | 0 (0-1) |
| 6 | 15 | 11 | 51 | 16.23 ± 5.5 | 76.5 | 5.9 | 1 (1-2) |
| 7 | 21 | 18 | 60 | 14.37 ± 4.12 | 68.3 | 3.3 | 1 (0-2) |
| 8 | 19 | 18 | 51 | 14.12 ± 4.79 | 74.5 | 5.9 | 1 (0-2) |
| 9 | 17 | 17 | 37 | 16.77 ± 4.74 | 89.2 | 0 | 0 (0-2) |
| 10 | 15 | 15 | 69 | 16.49 ± 4.44 | 75.4 | 2.9 | 1 (1-2) |
| 11 | 15 | 14 | 77 | 14.53 ± 2.42 | 81.8 | 0 | 0 (0-2) |
| 12 | 16 | 11 | 48 | 15.27 ± 2.38 | 81.3 | 0 | 0 (0-2) |
| 13 | 24 | 22 | 72 | 14.8 ± 4.07 | 86.1 | 4.17 | 0 (0-2) |
| 14 | 18 | 18 | 94 | 10.4 ± 3.43 | 79.8 | 4.26 | 1 (0-1) |
| Gesamt: | 242 | 212 | 807 | 14.79 ± 2.17 | 82,72 ± 7,62 | 2.27 ± 2.3 | 0 (0-1) |
Tabelle 1: Repräsentative Ergebnisse der Anzahl der aufgezeichneten und analysierten Kanten, der Anzahl der erhaltenen CBF-Messungen und der CBF-Werte, des Prozentsatzes des normalen CBP, IMI, DSK bei 14 gesunden Probanden nach diesem Protokoll. CBF = Ziliarschlagfrequenz, CBP = Ziliarschlagmuster, IMI = Unbeweglichkeitsindex und DSK = Dyskinesie-Score.
Abbildung 12: Abbildung zur Veranschaulichung der Komplexität des Nasenputzens. (A) "Epithelstreifen von optimaler Qualität": intakter, gleichmäßig bewimperter Epithelienstreifen > 50 μm Länge, der es ermöglicht, mehr als 2 Zilien oder eine Gruppe von Zilien für die CBF- und CBP-Bewertung zu verwenden (d. h. Zilien, die im seitlichen Profil frei schlagen, ohne in Schleim oder Ablagerungen stecken zu bleiben). (B) Bild, das eine große Menge von Zellen und Schleim darstellt, die über einem Flimmerepithelstreifen kleben, der verhindert, dass die Flimmerhärchen frei schlagen, und die Flimmerhärchen vor dem Beobachter verbirgt. (C) Die Qualität der aufgezeichneten Kante ist unzureichend, da es sich um eine Kante mit Hauptprojektion29 handelt. (D) Einzelne Flimmerzelle, die nicht für die ziliäre Funktionsanalyse verwendet werden kann. (E) Das Nasenputzen wurde im vorderen Teil der Nasenhöhle durchgeführt, der mit einem nicht bewimperten Übergangsepithel ausgekleidet ist. Daher wurden keine Flimmerzellen erhalten. Maßstabsleiste = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 13: Dichtigkeitstest des Abstandshalters mit Gas und Trypanblau-Lösung. Die Hermetik des Spacers wurde getestet, indem die Kammer mit 60 μl Trypanblau und Luft gefüllt und die Kammer dann 4 Stunden lang in Wasser getaucht wurde. Da wir während der 4 Stunden kein trypanblaues Leck oder Luftblasen im Wasser beobachteten, kamen wir zu dem Schluss, dass die Kammer sowohl für Gas als auch für Flüssigkeit hermetisch war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Papier zielt darauf ab, ein Standardverfahren für CFA unter Verwendung von Nasenbürstenproben bereitzustellen, wobei Anpassungen für angemessene Überlegungen zur Infektionskontrolle während der COVID-19-Pandemie vorgenommen wurden. Die PCD-Diagnose ist eine Herausforderung und erfordert derzeit gemäß internationaler Empfehlung eine Reihe verschiedener diagnostischer Tests, darunter nasale Stickstoffmonoxidmessung, CFA mit DHSV, ziliäre Ultrastrukturanalyse mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Markierung von Ziliarproteinen mittels Immunfluoreszenz und Gentests auf PCD-verursachende Gene 4,37. Derzeit gibt es keinen einzigen Test, der jeden Patienten mit PCD 4,37 diagnostizieren kann. Nach den Richtlinien der European Respiratory Society können nur charakteristische ultrastrukturelle Defekte durch TEM und bi-allelische Mutationen in PCD-verursachenden Genen eine PCD-Diagnose bestätigen. Leider haben diese Tests eine Rate von 15-30% falsch negativer Ergebnisse 4,37,38,39. DHSV hat den Vorteil, dass es eine höhere Sensitivität und Spezifität für die PCD-Diagnose aufweist (0,95-1,00 bzw. 0,91-0,96)31,38,40,41, aber jüngste internationale Empfehlungen besagen, dass DHSV derzeit nicht ausreichend standardisiert ist, um eine PCD-Diagnose zu bestätigen 4,37. In der Tat fehlt es an präzisen Arbeitsanweisungen für die Aufbereitung und Verarbeitung von Flimmerproben, an standardisierten CFA-Methoden und normativen Funktionsanalysedaten für die Interpretation der Ziliarfunktion 4,8,13,16,34,38,40. In dieser Arbeit wird ein Protokoll vorgeschlagen, das im Zentrum für die Gewinnung und Verarbeitung von respiratorischen Flimmerepithelproben und für die Bewertung der Ziliarfunktion verwendet wird. Da es derzeit keinen internationalen Konsens für ein DHSV-Protokoll gibt, können einige Schritte des Prozesses von Zentrum zu Zentrum unterschiedlich sein. Variationen von Faktoren wie der Temperatur während der Ziliar-Videomikroskopie, dem verwendeten Medium und der Qualität der analysierten Epithelränder können die Ziliarfunktion beeinflussen13.
Es gibt Unterschiede in der Temperatureinstellung während der DHSV-Analyse zwischen den Zentren, wobei einige dafür plädieren, DHSV bei Raumtemperatur durchzuführen13. Wir plädieren dafür, die Probenanalyse bei 37 °C durchzuführen. Dies erhöht die Komplexität des Aufbaus, aber eine PCD-Diagnose kann übersehen werden, wenn die CBP-Analyse unter 37 °C durchgeführt wird. Jackson et al. berichteten über eine temperaturempfindliche Variante der PCD, die ein normales koordiniertes Schlagmuster aufwies, wenn Zilien bei Raumtemperatur beobachtet wurden, aber ein abnormales hyperfrequentes und dyskinetisches Muster bei 37 °C42. Darüber hinaus ist gut beschrieben worden, dass CBF mit der Temperatur variiert, mit einer sigmoidalen Beziehung43,44, so dass CBF-Referenzdaten je nach der Temperatur, die zur Durchführung von DHSV verwendet wird, unterschiedlich sind.
Darüber hinaus fehlt es derzeit an einer Standardisierung der manuellen und/oder computergestützten Methode für die CBF- und CBP-Evaluierung13. In diesem Artikel stellen wir die manuelle CBF- und CBP-Bewertungstechnik vor, die in unserem Labor verwendet wird.
Da die manuelle Verarbeitung von DHSV-Daten mit einer gewissen Subjektivität verbunden und zeitaufwändig ist, wurde eine Vielzahl von Softwareanwendungen für die CBF- und CBP-Bewertung entwickelt, wobei verschiedene halbautomatische (mit der Auswahl spezifischer zu untersuchender Regions of Interest (ROIs)) oder vollautomatische Programme verwendet werden 34,45,46 (Analyse des gesamten aufgenommenen Bildes). Alle Programme verwenden die Variation der Lichtintensität in den Pixeln der aufgenommenen Videobilder über die Zeit, um CBF zu berechnen. Die meisten Programme beinhalten jedoch den manuellen oder automatisierten Ausschluss bestimmter Daten, um das Rauschen zu reduzieren: Bereiche mit Stasis, Bereiche, in denen CBF oder ziliäre Schlagamplitude (CBA) unter die bestimmten Schwellenwerte fallen. Ein Vergleich zwischen der manuellen und der automatisierten CBF-Auswertung wurde nur für ein Programm45 publiziert und zeigte keinen signifikanten Unterschied (gepaarter t-Test, p=0,64). Neuere Ergebnisse an 75 PCD-Patienten zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen der CBF-Bewertung mittels Fast-Fourier-Transformation (FFT) und Kymographie47. Es wurden verschiedene computergestützte Software für die CBP-Analyse entwickelt 48,49,50, die meist die Bewertung von CBP in begrenzten ROIs beinhaltet, aber derzeit ist keine kommerziell erhältlich 48.
Unseres Wissens ist dies die erste veröffentlichte Standardarbeitsanweisung für CFA mit DHSV. CFA mit frischen Nasenbürstenproben hat einige Einschränkungen; Die meisten davon können durch eine erneute Analyse der Ziliarfunktion nach der Kultivierung von Flimmerzellen der Atemwege überwunden werden. Erstens können Infektionen, Entzündungen oder Schäden während der Probenahme zu sekundären Funktionsstörungen der Ziliare führen. Die Kultivierung von respiratorischen Flimmerzellen kann die Genauigkeit von DHSV verbessern, insbesondere um falsch positive Ergebnisse auszuschließen27. Zweitens, da PCD-Patienten mit chronischen Atemwegsentzündungen und -infektionen vorliegen, kann die Kultivierung von Flimmerepithel erforderlich sein, da es schwierig sein kann, eine 4-6-wöchige Lücke frei von Infektionen zu finden, um ein Nasenputzverfahren durchzuführen. Drittens reicht die Qualität der Nasenputzprobe möglicherweise nicht aus, um die erforderliche Anzahl hochwertiger Kanten zu erzielen, insbesondere bei kleinen Kindern. Die Kultivierung der Proben könnte helfen, dieses Problem zu lösen. Schließlich kann CFA schwierig sein, wenn die Probe zahlreiche Zelltrümmer oder eine hohe Schleimbelastung enthält. Dies kann auch gelöst werden, wenn CFA nach der Zellkultur durchgeführt wird. Darüber hinaus ist eine umfassende Schulung des Personals in erfahrenen Zentren von entscheidender Bedeutung, da die Erkennung von CBP-Anomalien stark von der Erfahrung des Prüfers abhängt 4,13. Die Entwicklung und Validierung automatisierter CBP-Auswertungssoftware wird diese benutzerabhängige Variabilität potenziell verbessern und den Einsatz von DHSV für PCD-Diagnosezwecke erweitern.
Die Ergebnisse zeigen auch, wie wichtig die Nasenputztechnik ist, um eine effektive CFA zu ermöglichen. Eine sorgfältige Nasenputztechnik erhöht die Fähigkeit, epitheliale Flimmerstreifen von optimaler Qualität zu erhalten. Insbesondere das Putzen der Nase vor dem Eingriff begrenzt den Schleim, das sanfte Zähneputzen reduziert die roten Blutkörperchen und die richtige Platzierung der Bürste erhöht die Erfolgsrate bei der Gewinnung von Flimmerepithel, da das Putzen des vorderen Teils der Nasenhöhle das nicht bewimperte Epithel zurückbringt.
Aufgrund der Gesundheitskrise der COVID-19-Pandemie haben uns Überlegungen zur Infektionskontrolle dazu veranlasst, viele Aspekte der ziliären Videomikroskopieprotokolle anzupassen. Vor der Pandemie nutzten wir eine offene, im Labor gebaute Kammer. Zu den Vorteilen dieser Kammer gehören die einfache und schnelle Zubereitung und Verwendung, die Kosten und die Möglichkeit, sie nach der Reinigung wiederzuverwenden. Es gibt jedoch einige wichtige Vorbehalte. Die Menge des Mediums ist wichtig: Flimmerstreifen müssen gut hydratisiert sein, um richtig zu schlagen, aber zu viel Medium läuft aus der offenen Kammer und vermischt sich mit dem Öl, was ein gutes Bild verhindert. Darüber hinaus müssen die Proben innerhalb von maximal 20 Minuten beobachtet werden, um ein Austrocknen zu vermeiden. Dies kann möglicherweise überwunden werden, wenn zusätzliches M199-Medium mit einer Spritze direkt unter dem Deckglas zugegeben wird. Im Zusammenhang mit der COVID-19-Pandemie besteht das Hauptproblem der offenen Kammer darin, dass sie einen Gas- und Feuchtigkeitsaustausch zwischen dem Präparat und der Umgebung ermöglicht13. Es besteht ein potenzielles Risiko einer Kontamination von Labor und Bediener, wenn die Probe mit COVID-19 infiziert ist. Wir identifizierten eine geschlossene Visualisierungskammer mit einem Abstandshalter und demonstrierten ihre Wirksamkeit. Wir haben das Protokoll vom Nasenputzen bis hin zur Vorbereitung und Analyse des Objektträgers geändert, um strenge Maßnahmen zur Infektionskontrolle zu berücksichtigen, die darauf abzielen, die Übertragung von COVID-19 zu verhindern. Diese Anpassungen haben es uns ermöglicht, weiterhin einen PCD-Diagnoseservice anzubieten, ohne ein biosicheres Labor der Stufe 2 zu verwenden. Angesichts der ungewissen Dauer der aktuellen Gesundheitskrise und der Wichtigkeit, weiterhin wichtige PCD-Diagnosedienste wie DHSV anzubieten, ermöglichen die in diesem Papier vorgeschlagenen Anpassungen die Durchführung von CFA ohne Inanspruchnahme von L2-Biosicherheitslaborressourcen, die für andere wesentliche Aktivitäten während dieser Gesundheitskrise obligatorisch sind.
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Disclosures
Diese Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier und allen Teammitgliedern des PCD-Diagnosezentrums von Paris-Est für ihre Verfügbarkeit und den herzlichen Empfang während des Besuchs in ihrem PCD-Diagnosezentrum und den zahlreichen Austausch. Wir danken auch Robert Hirst und allen Teammitgliedern im PCD-Zentrum von Leicester für ihren Empfang und ihre Zeit, ihren Rat und ihr Fachwissen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | FisherScientific | 352096 | 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid |
| Amphotericin B | LONZA | 17-836E | Antifungal solution |
| Blakesley-weil nasal forceps | NOVO SURGICAL | E7739-12 | Used to hold the brush to perform the nasal brushing |
| Bronchial cytology brush | CONMED | 129 | Used for nasal brushing |
| Cotton swab | NUOVA APTACA | 2150/SG | Used for COVID-19 testing |
| Digitial high-speed videomicroscopy camera | IDTeu Innovation in motion | CrashCam Mini 1510 | |
| Glass slide | ThermoScientific | 12372098 | Microscope slides used to create the visualization chamber |
| Heated Box | IBIDI cells in focus | 10918 | Used to heat the sample |
| Inverted Light microscope | Zeiss | AXIO Vert.A1 | |
| Lens Heater | TOKAI HIT | TPiE-LH | Used to heat the oil immersion lens |
| Medium 199 (M199), HEPES | TermoFisher Scientific | 12340030 | Cell Culture Medium |
| Motion Studio X64 | IDT Motion | version 2.14.01 | Software |
| Oil | FischerScientific, Carl Zeiss | 11825153 | |
| Rectangular cover slip | VWR | 631-0145 | Used to cover the visualization chamber |
| Spacer (Ispacer) 0.25 mm | Sunjinlab | IS203 | Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber |
| Square cover slip | VWR | 631-0122 | Used for the creation of lab-built open visualization chamber |
| Streptomycin/Penicillin | FisherScientific, Gibco | 11548876 | Antiobiotics solution |
References
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- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , Supplement 1 1-9 (2015).
- Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
- Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M.
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