Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Отбор проб и обработка носовых зубов с помощью цифровой высокоскоростной цилиарной видеомикроскопии – адаптация к пандемии COVID-19

Published: November 7, 2020 doi: 10.3791/61949
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 4, 5, 1,6, 2, 1,7
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

Summary

Чтобы гарантировать успешный и высококачественный цилиарный функциональный анализ для диагностики ПМД, необходим точный и тщательный метод отбора проб и обработки респираторного эпителия. Для продолжения оказания услуг по диагностике ПМС во время пандемии COVID-19 протокол цилиарной видеомикроскопии был обновлен с учетом соответствующих мер инфекционного контроля.

Abstract

Первичная цилиарная дискинезия (ПЦД) представляет собой генетическую подвижную цилиопатию, приводящую к значительному отозинолегочному заболеванию. Диагноз PCD часто пропускается или задерживается из-за проблем с различными методами диагностики. Цилиарная видеомикроскопия с использованием цифровой высокоскоростной видеомикроскопии (DHSV), одного из диагностических инструментов для ПМД, считается оптимальным методом для выполнения цилиарного функционального анализа (CFA), включающего анализ частоты цилиарных биений (CBF) и паттерна биения (CBP). Однако в DHSV отсутствует стандартизированная, опубликованная рабочая процедура обработки и анализа образцов. Он также использует живой респираторный эпителий, что является серьезной проблемой инфекционного контроля во время пандемии COVID-19. Для продолжения предоставления диагностических услуг во время этого кризиса в области здравоохранения протокол цилиарной видеомикроскопии был адаптирован для включения адекватных мер инфекционного контроля.

Здесь мы описываем пересмотренный протокол отбора проб и лабораторной обработки мерцательных респираторных образцов, в котором освещаются адаптации, внесенные в соответствии с мерами инфекционного контроля COVID-19. Описаны репрезентативные результаты CFA из образцов чистки носа, полученных от 16 здоровых испытуемых, обработанных и проанализированных в соответствии с этим протоколом. Мы также иллюстрируем важность получения и обработки эпителиальных реснитчатых полосок оптимального качества, поскольку образцы, не соответствующие критериям отбора качества, теперь допускают CFA, что потенциально снижает диагностическую надежность и эффективность этого метода.

Introduction

Первичная цилиарная дискинезия (ПКД) представляет собой наследственную гетерогенную гетерогенную подвижную цилиопатию, при которой дыхательные реснички являются стационарными, медленными или дискинетическими, что приводит к нарушению мукоцилиарного клиренса и хроническому ото-сино-легочному заболеванию 1,2,3,4. Клиническими проявлениями ПМД являются хронический влажный кашель и хроническая заложенность носа, начинающаяся в раннем младенчестве, рецидивирующие или хронические инфекции верхних и нижних дыхательных путей, приводящие к бронхоэктазам, а также рецидивирующий или хронический средний отит и синусит 5,6,7. Примерно у половины пациентов с ПМД наблюдаются дефекты латеральности органов, такие как situs inversus или situs ambiguus. У некоторых пациентов также наблюдаются проблемы с бесплодием из-за неподвижных сперматозоидов у мужчин и неподвижных ресничек в фаллопиевых трубах у женщин 1,2,8. PCD встречается редко, но распространенность трудно определить и колеблется от 1:10 000 до 1:20 000 9,10. Тем не менее, считается, что реальная распространенность PCD выше из-за трудностей в диагностике и отсутствия клинических подозрений. Симптомы PCD имитируют общие респираторные проявления других острых или хронических респираторных заболеваний, и диагностические проблемы подтверждения диагноза хорошо известны, что приводит к неадекватному лечению и последующему наблюдению 2,5,9,11.

Цилиарная видеомикроскопия с использованием цифровой высокоскоростной видеомикроскопии (DHSV) является одним из диагностических инструментов для PCD 4,8,12,13. DHSV считается оптимальным методом для выполнения цилиарного функционального анализа (CFA), включающего анализ частоты цилиарных ударов (CBF) и паттерна биений (CBP) 2,14,15,16. DHSV использует живой респираторный эпителий, обычно получаемый при чистке носа13.

В связи с нынешней вспышкой COVID-19 подтверждение диагноза ПМД в настоящее время становится еще более важным, поскольку фактические данные свидетельствуют о том, что основное респираторное заболевание может привести к худшим исходам после зараженияCOVID-19 17,18. Безопасная и эффективная диагностическая служба PCD во время нынешней пандемии также позволит пациентам с подтвержденным PCD воспользоваться дополнительными защитными мерами по сравнению с населением в целом19.

Передача COVID-19 происходит в основном воздушно-капельнымпутем20. О высокой потенциальной передаче инфекции от бессимптомных (или минимально симптоматических) пациентов свидетельствует высокая вирусная нагрузка в образце20 носа. Кроме того, если вирусные частицы становятся аэрозольными, они остаются в воздухе не менее 3 часов21. Таким образом, работники респираторной медицины подвергаются воздействию высокого резервуара вирусной нагрузки при оказании клинической помощи и сборе образцов для диагностических методов22. Кроме того, манипуляции с живыми образцами дыхательных путей подвергают техника риску заражения COVID-19. В то время как рекомендации передовой практики для респираторных врачей и ЛОР-хирургов, ухаживающих за пациентами с COVID-19, выполняются23, отсутствуют рекомендации по выполнению DHSV во время пандемии COVID-19.

Чтобы продолжать предоставлять услуги по диагностике PCD, обеспечивая при этом безопасность медицинского работника (выполняющего сбор образцов) и лаборанта (выполняющего обработку образца), протокол цилиарной видеомикроскопии должен был быть адаптирован во время пандемии COVID-19. Методика цилиарной видеомикроскопии в настоящее время ограничена исследовательской службой и специализированными диагностическими центрами, так как CFA требует обширной подготовки и опыта. Кроме того, в настоящее время отсутствует стандартизация и точная операционная процедура обработки и анализа образцов с использованием DHSV 4,13.

Целью данной статьи является описание стандартных операционных процедур для DHSV с особым акцентом на меры инфекционного контроля и безопасность при отборе проб и обработке живого эпителия носа. Это позволит продолжить высококачественную диагностику и лечение PCD, несмотря на текущую вспышку COVID-19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Одобрение было получено от комитета по этике больницы и факультета Льежа и Департамента гигиены и охраны здоровья на рабочем месте университета.

1. Забор проб дыхательного мерцательного эпителия

  1. Перед отбором проб убедитесь, что субъекты не заражены инфекцией в течение как минимум 4-6 недель и не имеют назальных и ингаляционных лекарств.
  2. Приготовьте дополненный препарат M199: добавьте среду для культивирования клеток 199 (M199) (500 мл) раствором антибиотика (5 мл стрептомицина/пенициллина (50 мкг/мл)) и противогрибковым раствором (5 мл амфотерицина B (2,5 мкг/мл)).
  3. Подготовьте 2 (по одной на каждую ноздрю) конических пробирок объемом 15 мл с крышками и заполните каждую из них 3 мл дополненного M199.
  4. Подготовьте кисть для цитологического исследования бронхов (толщина: 2 мм и длина: 11 мм). Отрежьте конец проволоки, чтобы убедиться, что длина щетки составляет около 15 см (рис. 1A, B). Чтобы удерживать щетку при чистке носа, используйте носовые щипцы Weil-Blakesley (рис. 1B).
  5. Адаптация к COVID-19: Избегайте обработки живого образца эпителия носа с неизвестным статусом на COVID-19, проверьте пациента на COVID-19 за 48–72 часа до чистки носа для цилиарной видеомикроскопии. Этот тест на COVID-19 состоит из полимеразной цепной реакции из образца мазка из носоглотки24,25. Поскольку статус пациента на COVID-19 на данный момент неизвестен, врач и персонал должны быть надлежащим образом защищены23,26, включая маску FFP2, перчатки, лицевую маску или очки, а также водостойкий халат с длинными рукавами. В случае недоступного, невозможного или сомнительного ПЦР-тестирования, производится вся обработка чистки носа в лаборатории биобезопасности L2. В случае положительного статуса COVID-19 отложите диагностику PCD и рассмотрите альтернативные подходы к ведению пациента.
    ОСТОРОЖНОСТЬ: Этот забор мазка из носоглотки для тестирования на COVID-19 может вызвать вторичную цилиарную дискинезию, повреждая носовой дыхательный цилиарный эпителий27,28. Чтобы этого избежать, вводят тонкий ватный тампон в полость носа вплоть до носоглотки под жестким эндоскопическим контролем, избегая травмирования носовых раковин или перегородки. Затем образец берется из носоглотки и удаляется ватный тампон под контролем жесткого эндоскопа. При соответствующем оборудовании жесткая эндоскопия 0° легко выполняется взрослым и детям без травм.

2. Получение образцов мерцательного эпителия дыхательных путей

Адаптация к COVID-19: Даже если статус пациента на COVID-19 отрицательный, из-за ложноотрицательного результата пациента просят держать хирургическую маску во рту во время процедуры, а врач носит перчатки, маску FFP2 и лицевой щиток.

  1. Подготовка к чистке носа
    1. Попросите пациента высморкаться.
    2. Выполняют чистку носа под эндоскопию носа или вслепую. Если вы используете эндоскопию носа, осмотрите 2 ноздри перед чисткой носа (не повторяйте, если ранее это было сделано 48-72 для мазка из носа COVID-19). Обследование позволяет проверить состояние слизистой оболочки (высокая степень воспаления может вызвать кровотечение при чистке носа, ...), состояние нижней носовой раковины (например, чтобы исключить наличие телеангиэктазии) и наличие носовой перегородки прямой (рис. 1В).
    3. Попросите пациента лечь или удобно сесть, положив голову назад на стул (потому что чистка носа вызывает рефлекс откидывать голову назад). Второй воспитатель держит голову во время чистки носа, особенно у детей.
    4. Встряхните щетку в дополненном M199 перед чисткой носа (увлажнение щетки уменьшает раздражение от чистки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Щетку можно смочить в дополнении M199; Если у пациента аллергия на антибиотики (пенициллин и стрептомицин присутствуют в дополненной среде для культивирования клеток), смочите кисть в физиологическом растворе.
  2. Чистка носа
    1. Аккуратно вставьте носовую щетку без местной или общей анестезии13. Если вы используете эндоскопию носа, поместите эндоскоп у входа в нос, чтобы визуализировать нижнюю носовую раковину, затем вставьте цитологическую щетку в нос. Если вы выполняете «слепую» чистку носа, вставьте щетку в нос, следуя за дном носа (рис. 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые диагностические центры используют местную анестезию тампоном нафазолина для чистки носа.
    2. Переместите кисть кзади и кпереди несколько раз над задней частью нижней носовой раковины, а затем отойдите. Оператор должен чувствовать, что щетка натирает эпителий, и пациент может почувствовать одностороннее слезотечение на стороне щетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если чистка носа выполняется слишком передне, реснитчатые клетки не будут получены, так как передняя полость носа выстлана переходным нереснитчатым эпителием.
    3. После отбора проб немедленно поместите образцы для чистки носа в питательную среду. Полученные полоски респираторного эпителия вытесняют путем перемешивания щетки в пробирке, содержащей дополненный М199, затем закрывают пробирку (рис. 1Е).
    4. Адаптация к COVID-19: Не смещайте эпителиальные полоски, перемешивая кисть в дополненном M199 сразу после отбора проб. Поместите щетку в трубку, отрежьте проволоку так, чтобы она могла полностью поместиться внутри трубки, и немедленно закройте трубку. Поместите образец в герметичный двойной пакет.

Figure 1
Рисунок 1: Техника чистки носа. (A) Вся щетка для цитологической очистки бронхов (B) Готовая к чистке: чистящий конец проволоки отрезается (длиной около 15 см) и удерживается носовыми щипцами Вейля-Блейксли (C) Эндоскопический вид полости носа: перегородка (1), нижняя носовая раковина (2) и средняя носовая раковина (3) (D) Чистка носа выполняется на задней части нижней носовой раковины (2). Носовая перегородка (1) Средняя носовая раковина (3). (E) Полоски респираторного эпителия смещают путем встряхивания щетки в добавленной среде для культивирования клеток M199. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Обработка дыхательного мерцательного эпителия

  1. Проанализируйте образцы для чистки носа под микроскопом в течение 9 часов после отбора проб, так как и CBF, и CBP стабильны в течение этого периода времени (неопубликованные данные).
  2. Используйте вертикальный или инвертированный световой микроскоп с масляным фазовым контрастом x100 или интерференционно-контрастной линзой. В идеале поместите микроскоп на антивибрационный стол, потому что ресничное биение может быть подвержено артефактам из-за внешних вибраций (например, от лабораторного стола)13.

Адаптация к COVID-19: Оператор использует средства индивидуальной защиты для обработки носа, включая маску FFP2, перчатки и водостойкий халат с длинными рукавами.

  1. Подготовьте камеру визуализации.
    1. Подвешивайте реснитчатые эпителиальные полоски в лабораторной открытой камере визуализации, позволяя ресничкам свободно биться во время анализа под микроскопом. Эта камера создается путем разделения покровного стекла (22 мм х 40 мм) и предметного стекла двумя соседними квадратными покровными стеклами (20 мм х 20 мм), разделенными расстоянием 15 мм, и наклеивается на предметное стекло12 (рисунок 2, рисунок 4А).

Адаптация к COVID-19: Лабораторная камера, описанная выше, открыта и обеспечивает газо- и влагообмен между образцом и окружающей средой13. В условиях пандемии COVID-19 возможно использование закрытой камеры визуализации с использованием двусторонней застрявшей прокладки глубиной 0,25 мм (рис. 3, рис. 4B). Прокладка наклеивается на предметное стекло, а затем поверх прокладки наклеивается крышка (22 мм х 40 мм).

Figure 2
Рисунок 2: Монтаж открытой камеры, построенной в лаборатории. (A) 2 квадратных покровных стекла (20 мм x 20 мм) помещаются на предметное стекло. (B) Квадратные крышки отделяются друг от друга на расстоянии около 15 мм и приклеиваются к предметному стеклу. (C) Камера заполняется между двумя соседними квадратными покровными шликерами небольшим образцом (приблизительно 60 мкл) мерцательного эпителия в дополненном M199. (D) Длинное прямоугольное защитное стекло (22 мм х 40 мм) помещается на два соседних квадратных защитного стекла и закрывает камеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Монтаж закрытой камеры с помощью двусторонней застрявшей распорки. (A) Стеклянное стекло и двухсторонняя застрявшая прокладка. (B) Защита снимается с одной стороны прокладки, а затем прокладка застревает на предметном стекле. (C) Защита снимается с другой стороны двусторонней застрявшей прокладки, а затем прокладка заполняется небольшим образцом (приблизительно 60 мкл) мерцательного эпителия в дополненном M199. (D) Длинное прямоугольное защитное стекло (22 мм x 40 мм) наклеивается на распорку и закрывает камеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Принципиальная схема, показывающая основные камеры визуализации, используемые для выполнения цилиарной видеомикроскопии с использованием цифровой высокоскоростной видеомикроскопии (DHSV). (A) Метод открытой подвесной капли: реснитчатый образец суспендирован в капле среды для культивирования клеток в открытой камере, созданной путем разделения покровного стекла и предметного стекла двумя соседними покровными стеклами. (B) Метод закрытой подвесной капли: реснитчатый образец суспендирован в капле среды для культивирования клеток в закрытой камере, созданной прокладкой, зажатой между стеклянной стороной и покровным стеклом. Прокладка прочно прилегает как к предметному стеклу, так и к крышке. Воспроизведено и изменено из Kempeneers et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Контроль температуры
    1. Окружите микроскоп пузырчатой пленкой (рис. 5A, B).
    2. Прикрепите нагреватель объектива к объективу с помощью Velcro ремешка (рис. 5C)
    3. Включите контроллер нагревателя объектива за 1 час до выполнения контрольной проверки температуры.
    4. Включите микроскоп и убедитесь, что настройка микроскопа завершена, так как количество света, проходящего через образец, может изменить температуру на предметном стекле.
    5. Включите контроллер нагревательной коробки (рис. 5D).
    6. Перед запуском убедитесь, что эталонный пробник работает правильно. Зажмите наконечник эталонного зонда между пальцами; Следует измерять температуру тела.
    7. Положите свободный носитель в середину предметного стекла, между двумя соседними квадратными накладками (20 мм х 20 мм), приклеенными к нему.
    8. Поместите наконечник эталонного зонда в дополненный M199. Обложка прямоугольным покровным стеклом (22 мм x 40 мм). Убедитесь, что зонд полностью окружен средой (иначе температура может упасть).
    9. Адаптация к COVID-19: Чтобы выполнить контроль температуры в закрытой камере с помощью прокладки, отрежьте одну сторону прокладки (это отверстие должно быть того же размера, что и эталонный щуп). Наклейте прокладку на предметное стекло, поместите свободный носитель в середину прокладки. Поместите наконечник эталонного зонда в раствор через отверстие прокладки, затем наклейте на прокладку прямоугольное защитное стекло (22 мм x 40 мм).
    10. Поместите горку в пластину обогреваемой коробки. Закройте нагретую коробку крышкой.
    11. Добавьте масло на масляный погружной объектив.
    12. Поместите нагретый ящик на столик микроскопа.
    13. Отрегулируйте температуру пластины и крышки (температура крышки должна быть на 2 °C выше, чем температура пластины, чтобы избежать образования конденсата), чтобы измерить 37 °C эталонным зондом в среде.
    14. Подождите 5 минут (время, необходимое для повышения температуры образца до 37 °C).
    15. Отрегулируйте объектив, перемещая его ближе к слайду до касания покровного стекла кончиком объектива.
    16. Переместите объектив так, чтобы увидеть середину зонда в микроскопе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что зонд виден на экране компьютера (чтобы убедиться, что система камер работает, прежде чем смотреть на реснитчатый образец). При просмотре середины зонда экран полностью черный.
    17. Отрегулируйте температуру нагревателя объектива (чтобы компенсировать потерю температуры при контакте масляной линзы с покровным стеклом). Обязательно измерьте 37 °C эталонным зондом в среде, когда объектив касается защитного стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале работайте в помещении с контролируемой температурой, чтобы эти установленные температуры не менялись. Если температура в помещении не контролируется, вы должны выполнять эту контрольную проверку температуры каждый день перед выполнением цилиарной видеомикроскопии.
    18. Проверив температуру, снимите предметное стекло с нагреваемой коробки.
    19. Очистите предметное стекло и наконечник эталонного зонда спиртом и уберите.
    20. Очистите линзу изопропанолом и очистите линзы салфетками круговыми движениями.

Figure 5
Рисунок 5: Оборудование, используемое в лаборатории DHSV. (A) Микроскоп, оснащенный 100-кратной масляной фазово-контрастной линзой, помещается на антивибрационный стол, чтобы избежать того, чтобы внешние вибрации вызывали артефакты для анализа цилиарного функционала (B) Микроскоп окружен пузырчатой пленкой для предотвращения потери тепла из окружающего воздуха. (C) Цель погружения в масло создает потери тепла. Предотвратить это можно с помощью обогревателя объектива (стрелки). (D) Образец нагревается с помощью нагревательной камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Подготовка образцов дыхательного мерцательного эпителия

  1. Осторожно встряхните трубку, чтобы реснички распространились по всей трубке (чтобы реснички не застряли на других реснитчатых полосках, слизи или мусоре, которые мешают им свободно биться).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для получения «оптимальных краев» мерцательного эпителия (рис. 12).
  2. Извлеките примерно 50 мкл мерцательного эпителия в дополненном M199 в середине трубки с помощью пипетки.
  3. Поместите образец в лабораторную камеру (между двумя соседними квадратными покровными шликерами (20 мм x 20 мм)) и накройте прямоугольным покровным стеклом (22 мм x 40 мм). Будьте осторожны, чтобы не добавить пузырьки.
  4. Адаптация к COVID-19: Выполните шаги 4.1-4.3 в шкафу микробиологической безопасности. Процедура в кабинете микробиологической безопасности.
    1. Включите шкаф микробиологической безопасности за 10 минут до подготовки образца (чтобы убедиться, что среда стерильна).
    2. Перед любым обращением продезинфицируйте весь шкаф микробиологической безопасности 70% этанолом.
    3. Продезинфицируйте весь необходимый материал 70% этанолом перед помещением в шкаф микробиологической безопасности.
    4. Откройте конические пробирки объемом 15 мл, содержащие образцы, только один раз под шкафом микробиологической безопасности, затем вытесните эпителиальные полоски, перемешивая щетку (с помощью назальных щипцов Вейла-Блейксли) в дополненном M199.
    5. Наклейте проставку на предметное стекло и снимите защиту с двусторонней застрявшей прокладки.
    6. Осторожно встряхните трубку, чтобы реснички распространились по всей трубке.
    7. Извлеките небольшой образец мерцательного эпителия в дополненном M199 из середины пробирки с помощью пипетки (примерно 60 мкл) и заполните спейсер.
    8. Наклейте прямоугольное покровное стекло (22 мм x 40 мм) на распорку, чтобы закрыть камеру.
    9. Продезинфицируйте предметное стекло перед выходом из шкафа микробиологической безопасности.
    10. Извлеките затвор из шкафа микробиологической безопасности.
    11. Меняйте перчатки при выходе из шкафа микробиологической безопасности.
    12. Подождите 10 минут, прежде чем выключать шкаф микробиологической безопасности после использования (чтобы убедиться, что среда шкафа микробиологической безопасности стерильна, прежде чем закрывать дверцу).
  5. Поместите горку в пластину обогреваемой коробки. Закройте нагретую коробку крышкой.
  6. Добавьте масло на масляный погружной объектив.
  7. Поместите нагретый ящик на столик микроскопа.
  8. Включите коробку с подогревом и обогреватель объектива.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обогреватель объектива необходимо включить за 1 час до использования.
  9. Отрегулируйте настройки температуры нагревательной камеры и контроллеров нагревателя объектива в соответствии со значениями, полученными на шаге 3.4.
  10. Подождите 5 минут (время, необходимое для повышения температуры образца до 37 °C при использовании заданных настроек как для нагреваемой камеры, так и для нагревателя объектива).
  11. Подойдите объектив к предметному стеклу до тех пор, пока не коснетесь кончиком объектива покровного стекла.

5. Визуализация дыхательных реснитчатых краев

  1. Закрепите высокоскоростную видеокамеру на микроскопе, подключите камеру к компьютеру и включите камеру.
  2. Включите компьютер.
  3. Подключите цифровую высокоскоростную видеомикроскопическую камеру к компьютеру (чтобы изображение, просматриваемое через окулярные линзы, проецировалось на монитор) с помощью программного обеспечения.
    1. Откройте программное обеспечение, после чего автоматически откроется главное меню (рисунок 6A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение представляет собой программу, используемую в лаборатории для получения и обработки изображений. Система позволяет записывать и воспроизводить видеопоследовательности с пониженной частотой кадров или кадр за кадром. Его можно скачать бесплатно.
    2. Откройте камеру (рис. 6A).
    3. Когда появится фильтр перечисления камер, выберите OK (рисунок 6B).
    4. Выберите Обновить список; выбрать название камеры; выберите Interface: Expert, затем выберите Open (Открыть (рисунок 6C).
    5. В строке управления камерой в верхней части пристыкованного диалогового меню выберите Live ( Прямой эфир ) (рис. 6D).
    6. Выберите Play для просмотра изображения и Stop для завершения просмотра (рисунок 6D).

Figure 6
Рисунок 6: Описание использования программного обеспечения: визуализация дыхательных реснитчатых краев на мониторе. (A) Главное меню появляется непосредственно при открытии программного обеспечения. (B) Закройте фильтр перечисления камеры. (C) Выберите камеру и выберите Интерфейс: Эксперт. (D) Режим реального времени позволяет визуализировать на мониторе изображение, увиденное через микроскоп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Отрегулируйте настройку захвата камеры (в правом верхнем углу) (рис. 7).
    1. В разделе «Настройки съемки » выберите «Камера», затем отрегулируйте частоту кадров: Частота (Гц): 500 (см. ниже) (рис. 7A).
    2. В разделе «Настройки съемки» выберите «Камера», затем отрегулируйте интересующую область (ROI) (рис. 7A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рентабельность инвестиций рассчитывается с использованием градуированной шкалы, просматриваемой с помощью объектива x100 для погружения в масло и проецируемой на монитор, чтобы определить количество пикселей, соответствующее 50 мкм (так как вы хотите записать реснитчатые края размером примерно 50 мкм (см. ниже)).
    3. В настройках захвата выберите «Запись», затем отрегулируйте продолжительность видео и общее количество записанных кадров (продолжительность 2 секунды, соответствует 1000 кадров, если выбрана частота кадров 5OO Гц) (рис. 7B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, для полного анализа как CBF, так и CBP необходима продолжительность видео не менее 2 секунд.
    4. Выберите «Файл», затем «Сохранить камеру Cfg», чтобы сохранить новую настройку сбора данных (введите имя и, при необходимости, комментарий для этой новой конфигурации) (рис. 7, C, D).
    5. Чтобы открыть эту новую конфигурацию камеры, откройте File and Load Camera Cfg (рисунок 7C).

Figure 7
Рисунок 7: Описание использования программного обеспечения: настройка параметров съемки камеры для видеозаписи бьющих реснитчатых краев. (A) В настройках захвата Камера отрегулируйте интересующую область (ROI) и частоту кадров для видеозаписи (Скорость). (B) В настройках захвата «Запись» отрегулируйте продолжительность видеозаписи (количество кадров, необходимое для выбранной продолжительности записи, в соответствии с частотой кадров, выбранной ранее). (C) Эти новые настройки конфигурации камеры можно сохранить с помощью функции Save camera Cfg . Load Camera Cfg позволяет повторно открыть сохраненные настройки конфигурации для дальнейшего использования. (D) Новые параметры конфигурации камеры могут быть названы, и при необходимости может быть добавлен комментарий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Смотрите через окулярные линзы и ищите клетки или мусор в образце, а затем фокусируйтесь.
  2. Убедитесь, что изображение видно на мониторе, и улучшите качество изображения, отрегулировав конденсатор (и призму DIC при использовании интерференционно-контрастной линзы) и при необходимости отрегулируйте фокусировку.
  3. Поиск полосок мерцательного эпителия.

6. Выбор дыхательных реснитчатых краев

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная система позволяет рассматривать бьющиеся реснички в трех различных плоскостях: боковой профиль, бьющийся прямо в сторону наблюдателя, и прямо сверху (рис. 8).

Figure 8
Рисунок 8: Техника DHSV позволяет рассматривать взбивание ресничек в трех различных плоскостях. (А) в боковом профиле. (B) удар прямо в сторону наблюдателя и. (C) прямо сверху. Воспроизведено по Kempeneers et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Записывайте только неповрежденные неповрежденные реснитчатые края эпителия длиной не менее 50 мкм.
  2. Для записей, сделанных на боковом профиле, определите качество кромки в соответствии с системой подсчета баллов Thomas et al.29 (рис. 9). Используйте только нормальные ребра (рис. 9А) или ребра с незначительными выступами (рис. 9Б) для цилиарного функционального анализа. Исключите изолированные клетки (рис. 9E).

Figure 9
Рисунок 9: Репрезентативное изображение системы подсчета баллов Томаса идр. 29 для различного качества реснитчатых краев эпителия. (A) Нормальный край: определяется как неповрежденная однородная полоска реснитчатого эпителия > длиной 50 мкм (B) Реснитчатый край с незначительными выступами: определяется как край длиной >50 мкм, с клетками, выступающими из линии эпителиального края, но без точки апикальной клеточной мембраны, выступающей над кончиками ресничек на соседние клетки (C) Реснитчатый край с крупными выступами: определяется как край длиной >50 мкм, с клетками, выступающими из линии эпителиального края, по крайней мере, с одной точкой апикальной клеточной мембраны, выступающей над кончиками ресничек на соседние клетки (D) Изолированная реснитчатая клетка: определяется как единственная реснитчатая клетка на эпителиальном краю длиной >50 мкм (E) Одиночные клетки: определяются как реснитчатые клетки, которые не имеют контакта между собой или любым другим типом клеток. Масштабная линейка: 5,5 мкм. Воспроизведено из Thomas et al.29Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Выполняйте CFA, используя только реснички, свободные от слизи и мусора, и взбивая в профиль, выбранный для записанного края. Выбирайте только реснитчатые края, которые позволяют оценить не менее 2 CBF и CBP (см. Ниже) по краю.
  2. Используйте для CFA только те образцы, которые дают не менее 6 ребер, бьющихся в боковом профиле и отвечающих вышеуказанным критериям; Проанализируйте не более 20 ребер в боковом профиле.
  3. Используйте как минимум 1 дополнительный край ресничек, бьющих над профилем наблюдателя, чтобы охарактеризовать CBP.

7. Запись реснитчатого края

  1. Запишите бьющийся край ресничек, используя частоту кадров камеры 500 кадров в секунду, и проецируйте их на монитор с высоким разрешением. Минимальная частота кадров 400 Гц необходима для анализа как CBF, так и CBP13. Запишите один край с частотой кадров 30 кадров в секунду, чтобы оценить эффективность зазора от твердых частиц.
  2. Выберите Live на линии управления камерой в верхней части пристыкованного диалогового меню (рис. 6D)
  3. Выберите Play для просмотра изображения и Stop для завершения просмотра (рисунок 6D)
  4. Чтобы записать ребро, нажмите кнопку Record (рисунок 6D). Чтобы просмотреть запись перед сохранением, перейдите на строку управления камерой в верхней части закрепленного диалогового меню и выберите « Воспроизведение». Выберите «Воспроизвести », чтобы просмотреть записанное видео, и «Стоп», чтобы завершить просмотр (рисунок 10A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прекратите просмотр записанного края перед сохранением.

Figure 10
Рисунок 10: Описание использования программного обеспечения. (A) режим воспроизведения. Чтобы просмотреть записанный видеоряд ударов по реснитчатому краю, выберите Режим воспроизведения. Выберите «Воспроизвести», чтобы просмотреть изображение, и «Стоп», чтобы завершить просмотр. Скорость известности может быть скорректирована для улучшения анализа цилиарной функции (B, C) Сохранение видеозаписей биения реснитчатых краев (B) Чтобы сохранить видео, выберите «Файл», затем «Сохранить приобретения». (C) Введите название записанного видео и выберите место, где записывается видео. Убедитесь, что запись сохранена в формате . RAW-файл (D) Выбор записи бьющихся реснитчатых краев, подлежащих анализу: Чтобы открыть видеозапись, выберите «Файл», затем «Открыть», затем «Изображения». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Сохраните видео в базе данных (рис. 10B,C).
    1. Откройте «Файл» в левом верхнем углу и сохраните полученные данные (рисунок 10B).
    2. В поле Save acquisitions введите имя записанного видео и убедитесь, что запись сохранена в формате RAW (рис. 10C).
  2. Когда видео будет сохранено, вернитесь в режим прямой трансляции (вернитесь к строке управления камерой в верхней части закрепленного диалогового меню и выберите прямую трансляцию) (рисунок 6D).
  3. Повторите процедуру, чтобы записать количество ребер, отвечающих критериям выбора, необходимым для CFA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно записать несколько бьющихся реснитчатых краев, отвечающих критериям отбора, с одного предметного стекла в течение максимум 20 минут после приготовления предметного стекла (чтобы избежать высыхания). Через 20 минут, если нет возможности получить достаточное количество краев, соответствующих критериям выбора, подготовьте новый слайд.
  4. Снимите горку с нагреваемой коробки.
  5. Снимите прямоугольное покровное стекло и бросьте его в специальный контейнер для опасных медицинских отходов.
  6. Очистите предметное стекло (с приклеенными на него двумя квадратными покровными листами) 70% этанолом и впитывающей бумагой. Как только слайд очистится, его можно использовать снова.
  7. Адаптация к COVID-19: Поместите предметное стекло с защитным стеклом и прокладкой в герметичный пакет, снимите перчатки и маску и поместите их в герметичный пакет. Поместите герметичный пакет в специальный контейнер для опасных медицинских отходов.

8. Цилиарный функциональный анализ

  1. Предварительная подготовка к проведению ручной оценки CBF и CBP
    1. Откройте программное обеспечение.
    2. Откройте « Файл » в левом верхнем углу, затем « Открыть », а затем «Изображения» (рисунок 10D).
    3. Выберите видео для анализа.
    4. Перейдите на строку управления камерой в верхней части закрепленного диалогового меню и выберите «Воспроизведение» (рис. 10A). Выберите « Воспроизвести », чтобы просмотреть записанное видео, и «Стоп», чтобы завершить просмотр.
  2. Ручной анализ частоты цилиарных ударов (CBF)
    1. Выполняйте оценку CBF, используя только боковые края.
    2. Разделите реснитчатые края примерно на 5 смежных областей, каждая из которых имеет приблизительный размер 10 мкм (рис. 11).
    3. Идентифицируйте и визуализируйте реснички или группы ресничек с пониженной частотой кадров, и в каждой области выполняется не более 2 измерений CBF, в результате чего получается не более 10 измерений CBF вдоль каждого края (рис. 11).
    4. Запишите количество кадров, необходимое группе ресничек для завершения 5 циклов ударов.
    5. Преобразуйте в CBF простым расчетом: (CBF = частота кадров записи (Гц)/(количество кадров за 5 ударов) x 5)13,16,30. Сообщается, что неподвижные реснички имеют CBF 0 Гц13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте частоту кадров при воспроизведении записанных видео (Рисунок 10A). Это особенно полезно, когда анализируемые реснички бьются очень медленно. Увеличение частоты кадров помогает определить, бьются ли реснички очень медленно или неподвижны.
    6. Для каждого образца рассчитайте среднее значение CBF как среднее значение (SD) или (95% ДИ) всех CBF, зарегистрированных в боковом профиле, включая статические реснички.

Figure 11
Рисунок 11: Репрезентативное изображение оптимального качества края и разделение на 5 областей для анализа CFA. Оптимального качества реснитчатый эпителиальный край фрагментирован на 5 смежных областей размером 10 мкм, каждая размером 10 мкм. В каждой области проводится не более 2 измерений CBF (и 2 оценки CBP), в результате чего получается не более 10 измерений CBF (и оценок CBP) вдоль каждого края. Масштабная линейка = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Ручной анализ цилиарного ритма (CBP)
    1. Для оценки маркеров дискинезии используйте только боковой профиль; использовать плоскости по направлению к наблюдателю и сверху, чтобы охарактеризовать тип CBP13. Существуют различные методы и баллы для оценки CBP. Ниже описан применяемый в лаборатории метод с определением маркеров дискинезии.
    2. Процент каждого отдельного CBP в выборке
      1. Для каждой реснички или группы ресничек, идентифицированных и использованных для измерения CBF (рис. 11), выполните анализ CBP с пониженной частотой кадров: сравните точный путь, пройденный ресничками во время полного цикла ударов, с нормальным CBP, наблюдаемым при анализе DHSV12,30.
      2. Приписывайте отчетливую CBP (нормальная, неподвижная, жесткая, круговая, асинхронная (некоординированное цилиарное биение) или дискинетическая13) каждой ресничкам или группе ресничек.
      3. Для каждого образца рассчитайте процентное содержание каждого отдельного CBP в образце; CBP, приписываемый образцу, является преобладающим наблюдаемым CBP.
    3. Рассчитайте 3 маркера дискинезии.
      1. Рассчитайте индекс иммоторности (IMI): процент неподвижных ресничек в выборке (количество CBF = 0 / общее количество показаний CBF в образце X 100). Выразите IMI как среднее (SD) или (95% ДИ)1,16,31.
      2. Рассчитайте показатель дискинезии (DKS). Разделите каждый реснитчатый край на квадранты, и будет определено количество квадрантов с дискинетическими (или аномально бьющимися) ресничками. Это позволяет рассчитать DKS от 0 до 4 (0: нормальный CBP по всему краю; 1: аномальный CBP у ≤ 25% ресничек; 2: аномальный CBP у ≤ 50% ресничек; 3: аномальный характер биения у ≤ 75% ресничек; и 4: аномальный CBP во всех ресничках). Медиана ДКС (межквартильный диапазон) рассчитана для выборки16,29.
      3. Рассчитайте процент нормального биения: определяется как процентное содержание ресничек с нормальным CBP в образце (количество нормальных показаний CBP / общее количество показаний CBP для образца x100).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы проиллюстрировать эффективность методики, мы представляем результаты CFA в серии из 16 здоровых взрослых добровольцев (5 мужчин, возрастной диапазон 22-54 года).

Образцы для чистки носа от 14 (4 мужчин, возрастной диапазон 24-54 года) из общего числа 16 добровольцев обеспечили достаточно подходящих краев эпителия, которые удовлетворяли критериям отбора, необходимым для выполнения CFA. Из этих 14 образцов для чистки носа было зарегистрировано в общей сложности 242 реснитчатых края, а 212 краев соответствовали определенным критериям включения и были проанализированы. Все эти края были записаны в боковом профиле (реснички, бьющиеся сверху наблюдателя, были записаны и проанализированы для каждого добровольца, чтобы оценить, наблюдался ли круговой CBP13, но эти края не были включены в CFA). В общей сложности 807 измерений CBF и оценка CBP были получены из проанализированных ресничек или групп ресничек (таблица 1). Подробные результаты CFA для каждого здорового субъекта представлены в таблице 1.

Среднее значение CBF (± стандартное отклонение) для 14 испытуемых, чьи образцы соответствовали критериям включения, составило 14,79 (± 2,17) Гц. Это согласуется с предыдущими опубликованными справочными данными в лабораториях, выполняющих DHSV при контролируемой температуре 37 °C 16,29,30, в то время как измерения CBF в лабораториях, выполняющих DHSV при комнатной температуре, ниже15,32,33. Средний (± стандартное отклонение) процент нормального CBP для здоровых добровольцев составил 78,82 (± 14,73) %, и для каждого из этих здоровых субъектов преобладающий паттерн биения был нормальным. У здоровых испытуемых реснички не бились по круговой схеме, как сообщалось ранее16,34.

Среднее значение IMI (стандартное отклонение ±) составило 2,27 (± 2,3) %, а медиана DSK (межквартильный диапазон) составила 0 (0-1). Эти значения были аналогичны предыдущей публикации в отношении здоровых волютников 16,29. Интересно отметить, что DSK и CBF были аналогичны значениям, сообщенным Thomas et al из анализа, полученного при выборе только нормальных ребер или ребер с незначительной проекцией (рис. 9), что отражает важность анализа только тех ребер, которые соответствуют критериям включения29. При использовании кромок низкого качества они сообщали о более низком CBF и более высоком DKS29. Это показывает, что использование эпителиальных краев, которые не соответствуют критериям отбора, может неправильно привести к диагнозу PCD.

Таким образом, для использования в качестве диагностического инструмента PCD CFA из образцов для чистки носа следует проводить с использованием эпителиальных полосок оптимального качества (рис. 12A), полученных путем оптимальной обработки образцов для чистки носа и оптимального выбора краев. Как сообщается в протоколе, следует использовать только неповрежденные неповрежденные края реснитчатого эпителия длиной не менее 50 мкм, а CFA следует выполнять с использованием только ресничек, свободных от слизи и мусора. В боковом профиле следует исключить удары по краям, допускающие менее 2 оценок CBF и CBP.

Кроме того, эритроциты и слизь могут блокировать свободное биение ресничек или скрывать реснички от наблюдателя (рис. 12B). Количество слизи можно ограничить, попросив пациента высморкаться перед чисткой носа и избегать чистки носа во время острого воспаления носа (воспаление увеличивает количество слизи и риск кровотечения во время чистки носа). Кроме того, чистка носа должна быть щадящей, чтобы ограничить небольшое кровотечение и, следовательно, количество эритроцитов. Но, с другой стороны, если щетка не плотно прижимается к нижней носовой раковине, образец для носовой щетки может не содержать достаточного количества высококачественных реснитчатых эпителиальных полосок (рис. 12C, D).

Наконец, если чистка носа выполняется на передней части носовой полости, реснитчатые клетки не будут получены, так как эта часть носа выстлана переходным нереснитчатым эпителием (рис. 12E). Таким образом, качество образца для чистки носа важно для получения как минимум 6 краев ресничек, бьющихся в боковом профиле (и 1 край ресничек, бьющихся сверху), отвечающих критериям включения.

Из 16 здоровых добровольцев 2 образца для чистки носа были исключены из-за CFA. Один субъект был исключен, потому что образец не мог обеспечить необходимое количество реснитчатых краев, отвечающих критериям включения, с преимущественно изолированными клетками, обнаруженными в образце (рис. 12D). Второй субъект был исключен, потому что все зарегистрированные края эпителия (n = 7) были нереснитчатыми (рис. 12E), что позволяет предположить, что чистка носа была слишком передней и не выполнялась должным образом на нижней носовой раковине. Такой вывод был сделан потому, что испытуемый был здоровым добровольцем. Повторные образцы чистки носа, которые дают только нереснитчатые края эпителия у пациента с подозрением на PCD, могут привести к диагнозу снижения генерации множественных подвижных ресничек (RGMC), нарушения мукоцилиарного клиренса, вызванного недостаточностью цилиогенеза 3,35,36.

Из-за пандемии COVID-19 диагностическому центру Льежского университета пришлось адаптировать протокол цилиарной видеомикроскопии. До пандемии мы использовали открытую камеру визуализации, обеспечивающую газо- и влагообмен между образцом и окружающей средой. Поскольку это потенциально может привести к загрязнению оператора и/или окружающей среды, мы перешли на закрытую камеру визуализации, и была проверена герметичность этой камеры для газа и жидкости. На рисунке 13 показано испытание на герметичность закрытой камеры визуализации с использованием двусторонней застрявшей прокладки. Герметичность проверяли, заполняя камеру 60 мкл трипанового синего и воздуха, а затем погружая камеру в воду на 4 часа. Поскольку мы не наблюдали утечки трипанового синего или пузырьков воздуха в воде в течение 4 часов, мы пришли к выводу, что камера была герметично закрыта как для жидкости, так и для газа. Использование этой закрытой камеры визуализации для проведения цилиарной видеомикроскопии во время пандемии было одобрено Департаментом гигиены и охраны здоровья на работе Льежского университета.

Здоровый доброволец Нет. Из Edge Recorded Нет. анализируемых ребер Количество измерений CBF CBF (Гц)
(Среднее значение ± SD)		 Нормальная CBP (%)
(Среднее значение ± SD)		 IMI (%)
(Среднее значение ± SD)		 ДСК Медиана
(Межквартильный диапазон)
1 21 16 52 16.59 ± 3.83 82.7 0 0 (0-2)
2 11 7 34 18.4 ± 5.32 97.1 0 0 (0-1)
3 12 11 48 12.12 ± 1.87 91.7 0 0 (0-2)
4 20 20 60 15.18 ± 3.29 86.7 1.67 0 (0-1)
5 18 14 54 11.82 ± 3.97 87 3.7 0 (0-1)
6 15 11 51 16.23 ±5.5 76.5 5.9 1 (1-2)
7 21 18 60 14.37 ± 4.12 68.3 3.3 1 (0-2)
8 19 18 51 14.12 ± 4.79 74.5 5.9 1 (0-2)
9 17 17 37 16.77 ± 4.74 89.2 0 0 (0-2)
10 15 15 69 16.49 ± 4.44 75.4 2.9 1 (1-2)
11 15 14 77 14.53 ± 2.42 81.8 0 0 (0-2)
12 16 11 48 15.27 ± 2.38 81.3 0 0 (0-2)
13 24 22 72 14.8 ± 4.07 86.1 4.17 0 (0-2)
14 18 18 94 10.4 ± 3.43 79.8 4.26 1 (0-1)
Итог: 242 212 807 14.79 ± 2.17 82.72 ± 7.62 2.27 ± 2.3 0 (0-1)

Таблица 1: Репрезентативные результаты количества зарегистрированных и проанализированных краев, количества полученных измерений CBF и значений CBF, процент нормальных CBP, IMI, DSK у 14 здоровых добровольцев в соответствии с этим протоколом. CBF = частота цилиарных ударов, CBP = цилиарный ритм, IMI = индекс иммоторики и DSK = оценка дискинезии.

Figure 12
Рисунок 12: Рисунок, иллюстрирующий сложность чистки носа. (А) "Эпителиальная полоска оптимального качества": неповрежденная однородная полоска реснитчатого эпителия > длиной 50 мкм, позволяющая использовать более 2 ресничек или группы ресничек для оценки CBF и CBP (т.е. реснички, свободно бьющиеся в боковом профиле, не застревая в слизи или мусоре). (B) Изображение, представляющее большое количество клеток и слизи, застрявших над реснитчатой эпителиальной полоской, препятствующих свободному биению ресничек и скрывающих реснички от наблюдателя. (C) Качество регистрируемого края является недостаточным, так как это ребро с основной проекцией29. (D) Одиночная реснитчатая клетка, которая не может быть использована для цилиарного функционального анализа. (E) Чистка носа была выполнена в передней части носовой полости, выстланной переходным немерцательным эпителием. Поэтому реснитчатых клеток получено не было. Масштабная линейка = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 13
Рисунок 13: Испытание прокладки на герметичность газом и раствором трипанового синего. Герметичность спейсера проверяли, заполняя камеру 60 мкл трипанового синего и воздуха, затем погружая камеру в воду на 4 часа. Поскольку в течение 4 часов мы не наблюдали утечки трипанового синего или пузырьков воздуха в воде, мы пришли к выводу, что камера герметична как для газа, так и для жидкости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот документ направлен на то, чтобы предоставить стандартную операционную процедуру для CFA с использованием образцов для чистки носа с поправками, внесенными с учетом соответствующих соображений инфекционного контроля во время пандемии COVID-19. Диагностика ПМД является сложной задачей и в настоящее время требует проведения ряда различных диагностических тестов в соответствии с международными рекомендациями, включая измерение оксида азота в носу, CFA с использованием DHSV, ультраструктурный анализ цилиарий с использованием просвечивающей электронной микроскопии (TEM), маркировку цилиарных белков с использованием иммунофлуоресценции и генетическое тестирование на гены, вызывающие PCD 4,37. В настоящее время ни один тест не диагностирует каждого пациента с PCD 4,37. Согласно рекомендациям Европейского респираторного общества, только отличительные ультраструктурные дефекты ПЭМ и биаллельные мутации в генах, вызывающих ПМД, могут подтвердить диагноз ПМД. К сожалению, эти тесты имеют 15-30% ложноотрицательных результатов 4,37,38,39. Преимущество DHSV заключается в том, что он имеет более высокую чувствительность и специфичность для диагностики ПМД (0,95-1,00 и 0,91-0,96 соответственно)31,38,40,41, но в последних международных рекомендациях говорится, что в настоящее время DHSV недостаточно стандартизирован для подтверждения диагноза PCD 4,37. Действительно, отсутствует точная операционная процедура подготовки и обработки реснитчатых образцов, отсутствует стандартизированный метод CFA и нормативные данные функционального анализа для интерпретации цилиарной функции 4,8,13,16,34,38,40. В данной работе предлагается протокол, используемый в центре для получения и обработки образцов дыхательных реснитчатых эпителиев, а также для оценки цилиарной функции. Поскольку в настоящее время нет международного консенсуса в отношении протокола DHSV, некоторые этапы процесса могут варьироваться в зависимости от центра. Изменение таких факторов, как температура во время цилиарной видеомикроскопии, используемая среда и качество анализируемых краев эпителия, может влиять на цилиарную функцию13.

Различия в температуре, установленной во время анализа DHSV, существуют между центрами, при этом некоторые выступают за то, чтобы DHSV проводился при комнатной температуре13. Мы рекомендуем проводить анализ проб при температуре 37 °C. Это увеличивает сложность установки, но диагноз PCD может быть пропущен, если анализ CBP выполняется при температуре ниже 37 °C. Jackson et al. сообщили о температурно-чувствительном варианте PCD, проявляющемся нормальным скоординированным паттерном биения, когда реснички наблюдались при комнатной температуре, но аномальным гиперчастым и дискинетическим паттерном при 37 ° C42. Кроме того, было хорошо описано, что CBF изменяется в зависимости от температуры с сигмоидальной зависимостью43,44, так что справочные данные CBF различаются в зависимости от температуры, используемой для выполнения DHSV.

Кроме того, в настоящее время отсутствует стандартизация ручного и/или компьютерного метода оценки CBF и CBP13. В этой статье мы предлагаем ручную методику оценки CBF и CBP, используемую в нашей лаборатории.

Поскольку ручная обработка данных DHSV сопряжена с некоторой субъективностью и требует много времени, для оценки CBF и CBP было разработано множество программных приложений с использованием различных полуавтоматических (включающих выбор конкретных областей интереса (ROI) для изучения) или полностью автоматизированных программ 34,45,46 (анализируя все отснятое изображение). Все программы используют изменение интенсивности света в пикселях записанных видеоизображений с течением времени для расчета CBF. Тем не менее, большинство программ включают ручное или автоматическое исключение определенных данных для уменьшения шума: областей стазиса, областей, где CBF или амплитуда цилиарных биений (CBA) подпадают под определенные пороговые значения. Сравнение между ручной и автоматизированной оценкой CBF было опубликовано только для одной программы45 и не показало существенной разницы (парный t-критерий, p = 0,64). Недавние результаты с участием 75 пациентов с ПМД не показали существенной разницы между оценкой CBF, полученной с помощью быстрого преобразования Фурье (БПФ) и кимографии47. Было разработано различное компьютерное программное обеспечение для анализа CBP 48,49,50, в основном включающее оценку CBP в ограниченных ROI, но в настоящее время ни одно из них не является коммерчески доступным 48.

Насколько нам известно, это первая опубликованная стандартная операционная процедура для CFA с использованием DHSV. CFA с использованием свежих образцов для чистки носа имеет некоторые ограничения; Большинство из них можно преодолеть, выполнив повторный анализ цилиарной функции после культивирования дыхательных реснитчатых клеток. Во-первых, инфекция, воспаление или повреждение во время отбора проб могут привести к вторичным цилиарным функциональным нарушениям. Культура респираторных реснитчатых клеток может повысить точность DHSV, в частности, исключить ложноположительные результаты27. Во-вторых, поскольку у пациентов с ПХД наблюдается хроническое воспаление дыхательных путей и инфекция, может потребоваться культивирование мерцательного эпителия, поскольку найти 4-6-недельный промежуток, свободный от инфекции, для выполнения процедуры чистки носа может быть сложно. В-третьих, качество образца для чистки носа может быть недостаточным для получения необходимого количества высококачественных краев, особенно у маленьких детей. Культивирование образцов может помочь решить эту проблему. Наконец, CFA может быть затруднен, если образец содержит многочисленные клеточные остатки или высокую нагрузку слизи; это также может быть решено, если CFA выполняется после культивирования клеток. Кроме того, обширная подготовка персонала в опытных центрах имеет решающее значение, поскольку выявление аномалий CBP по-прежнему сильно зависит от опыта исследователя 4,13. Разработка и валидация программного обеспечения для автоматизированной оценки CBP потенциально улучшит эту зависящую от пользователя изменчивость и расширит использование DHSV для целей диагностики PCD.

Результаты также демонстрируют важность техники чистки носа для обеспечения эффективного CFA. Тщательная техника чистки носа увеличивает возможность получения эпителиальных реснитчатых полосок оптимального качества. В частности, сморкание носа перед процедурой ограничивает слизь, выполнение щадящей чистки уменьшает количество эритроцитов, а правильное размещение щетки увеличивает вероятность успеха получения мерцательного эпителия, поскольку чистка передней части полости носа возвращает немерцательный эпителий.

В связи с кризисом в области здравоохранения, вызванным пандемией COVID-19, соображения инфекционного контроля заставили нас адаптировать многие аспекты протоколов цилиарной видеомикроскопии. До пандемии мы использовали открытую лабораторную камеру. К преимуществам этой камеры можно отнести простоту и быстроту приготовления и использования, стоимость и возможность повторного использования после очистки. Однако есть несколько важных предостережений. Количество среды важно: реснитчатые полоски должны быть хорошо увлажнены, чтобы правильно взбиваться, но слишком много среды выльется из открытой камеры и смешается с маслом, что помешает хорошему изображению. Кроме того, образцы необходимо наблюдать в течение максимум 20 минут, чтобы избежать высыхания. Потенциально это можно преодолеть, если добавить дополнительную среду M199 с помощью шприца непосредственно под покровным стеклом. В условиях пандемии COVID-19 основная проблема открытой камеры заключается в том, что она обеспечивает газо- и влагообмен между препаратом и окружающей средой13. Существует потенциальный риск лабораторного заражения и заражения оператора, если образец инфицирован COVID-19. Мы идентифицировали закрытую камеру визуализации с помощью спейсера и продемонстрировали ее эффективность. Мы внесли поправки в протокол, начиная с чистки носа и заканчивая подготовкой и анализом слайдов, чтобы учесть строгие меры инфекционного контроля, направленные на предотвращение передачи COVID-19. Эти изменения позволили нам продолжать предоставлять диагностические услуги PCD без использования биобезопасной лаборатории уровня 2. Учитывая неопределенную продолжительность нынешнего кризиса в области здравоохранения и важность продолжения предоставления основных диагностических услуг PCD, таких как DHSV, адаптации, предлагаемые в этом документе, позволяют проводить CFA без использования лабораторных ресурсов биобезопасности L2, обязательных для других основных видов деятельности во время этого кризиса в области здравоохранения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Этим авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Жана-Франсуа Папона, Бруно Луи, Эстель Эскудье и всех членов команды диагностического центра PCD в Париже за их доступность и сердечный прием во время посещения их диагностического центра PCD, а также за многочисленные обмены мнениями. Мы также благодарим Роберта Херста и всех членов команды центра PCD в Лестере за их прием и время, советы и опыт.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , Supplement 1 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics - The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O'Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, Suppl 1 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a, Ammons, B. a, Wyatt, T. a All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, Pt 2 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 165 первичная цилиарная дискинезия цилиарная видеомикроскопия частота цилиарных биений характер цилиарного биения цилиарный функциональный анализ чистка носа респираторный мерцательный эпителий COVID-19
Отбор проб и обработка носовых зубов с помощью цифровой высокоскоростной цилиарной видеомикроскопии – адаптация к пандемии COVID-19
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bricmont, N., Benchimol, L.,… More

Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A. L., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M. C., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter