Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nasal børsting prøvetaking og prosessering ved hjelp av digital høyhastighets ciliary videomikroskopi - tilpasning for COVID-19-pandemien

Published: November 7, 2020 doi: 10.3791/61949
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 4, 5, 1,6, 2, 1,7
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

Summary

For å garantere en vellykket og høy kvalitet ciliær funksjonsanalyse for PCD-diagnose, er en presis og forsiktig metode for prøvetaking og behandling av respiratorisk epitel avgjørende. For å fortsette å tilby PCD-diagnostisk tjeneste under COVID-19-pandemien, har ciliary videomicroscopy-protokollen blitt oppdatert for å inkludere passende infeksjonskontrolltiltak.

Abstract

Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en genetisk bevegelig ciliopati, som fører til betydelig otosinopulmonal sykdom. PCD-diagnose blir ofte oversett eller forsinket på grunn av utfordringer med ulike diagnostiske modaliteter. Ciliær videomikroskopi, ved hjelp av Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), et av de diagnostiske verktøyene for PCD, regnes som den optimale metoden for å utføre ciliær funksjonell analyse (CFA), bestående av ciliær beatfrekvens (CBF) og beatmønster (CBP) analyse. DHSV mangler imidlertid standardisert, publisert operasjonsprosedyre for behandling og analyse av prøver. Den bruker også levende luftveisepitel, et betydelig infeksjonskontrollproblem under COVID-19-pandemien. For å fortsette å tilby en diagnostisk tjeneste under denne helsekrisen, har den ciliære videomikroskopiprotokollen blitt tilpasset for å inkludere tilstrekkelige infeksjonskontrolltiltak.

Her beskriver vi en revidert protokoll for prøvetaking og laboratoriebehandling av cilierte luftveisprøver, som fremhever tilpasninger som er gjort for å overholde smitteverntiltakene mot covid-19. Representative resultater av CFA fra nesebørsteprøver oppnådd fra 16 friske personer, behandlet og analysert i henhold til denne protokollen, er beskrevet. Vi illustrerer også viktigheten av å skaffe og behandle epiteliale cilierte strimler av optimal kvalitet, da prøver som ikke oppfyller kvalitetsvalgskriterier, nå tillater CFA, noe som potensielt reduserer den diagnostiske påliteligheten og effektiviteten til denne teknikken.

Introduction

Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en arvelig heterogen bevegelig ciliopati, der respiratoriske cilier er stasjonære, langsomme eller dyskinetiske, noe som fører til nedsatt mukociliær clearance og kronisk oto-sino-lungesykdom 1,2,3,4. De kliniske manifestasjonene av PCD er kronisk våt hoste og kronisk nesetetthet som starter i tidlig barndom, tilbakevendende eller kroniske øvre og nedre luftveisinfeksjoner som fører til bronkiektasier, og tilbakevendende eller kronisk otitis media og bihulebetennelse 5,6,7. Omtrent halvparten av PCD-pasientene har organlateralitetsdefekter som situs inversus eller situs ambiguus. Noen pasienter presenterer også infertilitetsproblemer på grunn av immotile sædceller hos menn og immotile cilia i egglederne hos kvinner 1,2,8. PCD er sjelden, men forekomsten er vanskelig å definere, og varierer fra 1:10 000 til 1:20 000 9,10. Den reelle forekomsten av PCD antas imidlertid å være høyere på grunn av vanskeligheter med diagnostisering og manglende klinisk mistanke. Symptomer på PCD etterligner vanlige respiratoriske manifestasjoner ved andre akutte eller kroniske luftveislidelser, og de diagnostiske utfordringene ved å bekrefte diagnosen er velkjente, noe som fører til mangelfull behandling og oppfølging 2,5,9,11.

Ciliær videomikroskopi, ved hjelp av Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), er et av diagnoseverktøyene for PCD 4,8,12,13. DHSV regnes som den optimale metoden for å utføre ciliær funksjonsanalyse (CFA), bestående av ciliary beat frequency (CBF) og beat pattern (CBP) analyse 2,14,15,16. DHSV bruker levende respiratorisk epitel, vanligvis hentet fra nesebørsting13.

I lys av det nåværende COVID-19-utbruddet er bekreftelse av en PCD-diagnose nå enda viktigere ettersom bevis tyder på at underliggende luftveissykdom kan føre til verre utfall etter COVID-19-infeksjon17,18. En trygg og effektiv PCD-diagnostisk tjeneste under den nåværende pandemien vil også gi bekreftede PCD-pasienter mulighet til å dra nytte av ytterligere beskyttelsestiltak, sammenlignet med befolkningengenerelt 19.

Overføring av covid-19 skjer primært gjennom dråpespredning20. Høyt overføringspotensial fra asymptomatiske (eller minimalt symptomatiske) pasienter antydes av den høye virusbelastningen i neseprøve20. I tillegg, hvis viruspartikler blir aerosoliserte, forblir de i luften i minst 3 timer21. Derfor blir respiratoriske helsepersonell utsatt for et høyt reservoar av virusbelastning mens de utfører klinisk behandling og prøveinnsamling for diagnostiske teknikker22. Videre utsetter manipulering av levende luftveisprøver teknikeren for COVID-19-forurensning. Mens anbefalinger for beste praksis for respiratoriske leger og ØNH-kirurger som tar vare på COVID-19-pasienter blir implementert23, mangler det anbefalinger for å utføre DHSV under COVID-19-pandemien.

For å kunne fortsette å tilby en PCD-diagnostisk tjeneste, samtidig som sikkerheten til helsearbeideren (utfører prøveinnsamling) og tekniker (utfører prøvebehandling), måtte ciliary videomicroscopy-protokollen tilpasses under COVID-19-pandemien. Teknikken for ciliary videomikroskopi er for tiden begrenset til forskningstjeneste og spesialiserte diagnostiske sentre, da CFA krever omfattende opplæring og erfaring. Videre er det for tiden mangel på standardisering og presis driftsprosedyre for behandling og analyse av prøver ved bruk av DHSV 4,13.

Målet med denne artikkelen er å beskrive standard driftsprosedyrer for DHSV, med særlig henvisning til smitteverntiltak og sikkerhet ved prøvetaking og prosessering av levende neseepitel. Dette vil gjøre det mulig for PCD-diagnose og omsorg av høy kvalitet å fortsette, til tross for det nåværende COVID-19-utbruddet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Godkjenning ble innhentet fra Liège sykehus-fakultetets etiske komité og Universitetsavdelingen for hygiene og helsevern på arbeidsplassen.

1. Prøvetaking av respiratorisk ciliert epitel

  1. Sørg for at forsøkspersonene er infeksjonsfrie i minst 4-6 uker, og fri for nasal og inhalert medisinering, før prøvetaking.
  2. Forbered supplert M199-preparat: Supplement Cell Culture Medium 199 (M199) (500 ml) med antibiotikaoppløsning (5 ml streptomycin / penicillin (50 μg / ml)) og antifungal løsning (5 ml amfotericin B (2,5 μg / ml)).
  3. Forbered 2 (en for hvert nesebor) 15 ml koniske rør med lokk, og fyll hver av dem med 3 ml supplert M199.
  4. Forbered en bronkial cytologibørste (tykkelse: 2 mm og lengde: 11 mm). Klipp enden av ledningen for å sikre at børsten er ca. 15 cm lang (figur 1A,B). For å holde børsten når du utfører nesebørstingen, bruk en Weil-Blakesley nesetang (figur 1B).
  5. COVID-19-tilpasning: Unngå å behandle en levende neseepitelprøve med ukjent status for COVID-19, test pasienten for COVID-19 48 til 72 timer før nesebørstingen for ciliær videomikroskopi. Denne COVID-19-testen består av polymerasekjedereaksjon fra en nasofarynksprøve24,25. Siden pasientens status for COVID-19 er ukjent på dette tidspunktet, må lege og ansatte være tilstrekkelig beskyttet23,26, inkludert FFP2-maske, hansker, ansiktsskjerm eller vernebriller og langermet vannavstøtende kjole. Ved utilgjengelig, umulig eller tvilsom PCR-testing, gjøres all behandling av nesebørsting i L2 biosikkerhetslaboratorium. Ved positiv COVID-19-status, utsett PCD-diagnosetesting og vurder alternative tilnærminger for å håndtere pasienten.
    FORSIKTIGHET: Denne nasofarynksprøven for COVID-19-testing kan indusere sekundær ciliær dyskinesi ved å skade nasal respiratorisk ciliærepitel27,28. For å unngå dette, introduser en tynn bomullspinne i nesehulen opp til nasopharynx under stiv endoskopisk kontroll, unngå å skade turbinatene eller septumet. Prøven tas deretter fra nasopharynx og fjerner bomullspinnen under kontroll av det stive endoskopet. Med tilstrekkelig utstyr kan en 0 ° stiv endoskopi enkelt utføres hos voksne og barn uten traumer.

2. Innhenting av respiratoriske cilierte epitelprøver

COVID-19-tilpasning: Selv om pasientens COVID-19-status er negativ, på grunn av falsk negativ rate, blir pasienten bedt om å holde en kirurgisk maske på munnen under prosedyren, og hansker, FFP2-maske og ansiktsskjold bæres av legen.

  1. Nasal børsting forberedelse
    1. Be pasienten om å blåse nesen.
    2. Utfør nesebørsting under nasal endoskopi eller blindet. Hvis du bruker en nasal endoskopi, undersøk de 2 neseborene før nesebørstingen (ikke gjenta hvis det er gjort 48-72 tidligere for COVID-19 nesepinne). Undersøkelse gjør det mulig å verifisere tilstanden til slimhinner (en høy grad av betennelse kan forårsake blødning når nesebørsting utføres, ...), tilstanden til dårligere turbinat (for eksempel for å utelukke tilstedeværelse av telangiektasi), og hvis septum nasal er rett (figur 1C).
    3. Be pasienten om å legge seg ned, eller å sitte komfortabelt, hodet hviler bakover på stolen (fordi nesebørstingen forårsaker en refleks for å bevege hodet tilbake). En annen pleier holder hodet under nesebørstingen, spesielt hos barn.
    4. Rist børsten i supplert M199 før nesebørsting (fuktighet av børsten reduserer irritasjon fra børsting).
      MERK: Børsten kan være fuktet i den supplerte M199; Hvis pasienten er allergisk mot antibiotika (penicillin og streptomycin er tilstede i det supplerte cellekulturmediet), fukt børsten i saltvann.
  2. Nesebørsting
    1. Sett forsiktig inn nesebørstingen uten lokal eller generell anestesi13. Hvis du bruker nasal endoskopi, plasser endoskopet ved inngangen til nesen for å visualisere det dårligere neseturbinatet, og sett deretter cytologibørsten inn i nesen. Hvis du utfører en "blindet" nesebørsting, stikk børsten inn i nesen, etter nesegulvet (figur 1D).
      MERK: Noen diagnostiske sentre bruker lokalbedøvelse med en tampong av nafazolin for å utføre nesebørsting.
    2. Beveg børsten bakover og fremre flere ganger over den bakre delen av det nedre neseturbinatet og trekk deretter ut. Operatøren skal føle at børsten gnir epitelet, og pasienten kan føle ensidig vannaktig øye på siden av børstingen.
      MERK: Hvis nesebørstingen utføres for anteriort, vil ingen cilierte celler oppnås, da det fremre nesehulen er foret med et ikke-ciliert overgangsepitel.
    3. Etter prøvetaking, plasser umiddelbart nesebørsteprøver i kulturmediet. Respiratoriske epitelstrimler løsnes ved å bearbeide børsten i røret som inneholder den tilsatte M199, og lukk deretter røret (figur 1E).
    4. COVID-19-tilpasning: Ikke løsne epitelstriper ved å riste børsten i den supplerte M199 umiddelbart etter prøvetaking. Plasser børsten i røret, kutt ledningen slik at den kan passe helt inn i røret, og lukk røret umiddelbart. Legg prøven i en lufttett dobbel pose.

Figure 1
Figur 1: Nesepusseteknikk. (A) Hele bronkial cytologibørste (B) Klar til børste: børsteenden av ledningen er kuttet (ca. 15 cm lang) og holdes av en Weil-Blakesley nesetang (C) Endoskopisk utsikt over nesehulen: septum (1) dårligere turbinat (2) og midtre turbinat (3) (D) Nesebørsting utføres på bakre del av det nedre turbinatet (2). Neseseptum (1) Midtre turbinat (3). (E) Respirasjonsepitelstripene løsnes ved å riste børsten i det supplerte M199-cellekulturmediet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Respiratorisk ciliert epitelbehandling

  1. Analyser nesebørsteprøver under mikroskop innen 9 timer etter prøvetaking, da både CBF og CBP er stabile innenfor denne tidsrammen (upubliserte data).
  2. Bruk et oppreist eller invertert lysmikroskop, med en x100 olje-nedsenking fasekontrast eller en interferenskontrastlinse. Ideelt sett bør du plassere mikroskopet på et vibrasjonsdempende bord fordi ciliærslag kan bli utsatt for artefakter på grunn av ytre vibrasjoner (f.eks. fra laboratoriebenken)13.

COVID-19-tilpasning: Operatøren bruker personlig verneutstyr for å utføre nasal behandling, inkludert FFP2-maske, hansker og langermet vannavstøtende kjole.

  1. Forbered visualiseringskammeret.
    1. Suspender de cilierte epitelstrimlene i et laboratoriebygd åpent visualiseringskammer, slik at cilia kan slå fritt mens de analyseres under mikroskopet. Dette kammeret er opprettet ved separasjon av en dekselslipp (22 mm x 40 mm) og et glassglass med to tilstøtende firkantede dekselslipp (20 mm x 20 mm), adskilt med en avstand på 15 mm, og limt på glassglasset12 (figur 2, figur 4A).

COVID-19-tilpasning: Det laboratoriebygde kammeret beskrevet ovenfor er åpent, og tillater gass- og fuktighetsutveksling mellom prøven og miljøet13. I sammenheng med COVID-19-pandemien er det mulig å bruke et lukket visualiseringskammer ved hjelp av en dobbeltsidig fast avstandsstykke, 0,25 mm dybde (figur 3, figur 4B). Avstandsstykket sitter fast på glassglasset, og deretter sitter et deksel (22 mm x 40 mm) fast på toppen av avstandsstykket.

Figure 2
Figur 2: Montering av det laboratoriebygde åpne kammeret. (A) De 2 firkantede dekslene (20 mm x 20 mm) er plassert på glassglasset. (B) De firkantede dekselene er atskilt med en avstand på ca. 15 mm, og limt på glassglasset. (C) Kammeret er fylt mellom de to tilstøtende firkantede dekselslippene med en liten prøve (ca. 60 μL) ciliert epitel i supplert M199. (D) Et langt rektangulært deksel (22 mm x 40 mm) er plassert på de to tilstøtende firkantede dekselslippene og dekker kammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Montering av det lukkede kammeret ved hjelp av et dobbeltsidig fast avstandsstykke. (A) Glassglasset og det dobbeltsidige faste avstandsstykket. (B) Beskyttelsen fjernes på den ene siden av avstandsstykket, og avstandsstykket sitter deretter fast på glassglasset. (C) Beskyttelsen fjernes fra den andre siden av det dobbeltsidige faste avstandsstykket, og deretter fylles avstandsstykket med en liten prøve (ca. 60 μL) ciliert epitel i supplert M199. (D) Et langt rektangulært deksel (22 mm x 40 mm) sitter fast på avstandsstykket og lukker kammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk diagram som viser de viktigste visualiseringskamrene som brukes til å utføre ciliær videomikroskopi ved hjelp av digital høyhastighets videomikroskopi (DHSV). (A) Den åpne hengende dråpeteknikken: den cilierte prøven er suspendert i en dråpe cellekulturmedium i et åpent kammer opprettet ved separasjon av en deksellapp og et glassglass av to tilstøtende deksler. (B) Den lukkede hengende dråpeteknikken: den cilierte prøven er suspendert i en dråpe cellekulturmedium i et lukket kammer opprettet av et avstandsstykke klemt mellom en glassside og en dekselglid. Avstandsstykket fester seg godt på både glasssliden og dekselet. Gjengitt og modifisert fra Kempeneers et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Kontroll av temperatur
    1. Omgi mikroskopet med bobleplast (figur 5A,B).
    2. Fest linsevarmeren rundt målet ved hjelp av en borrelåsstropp (figur 5C)
    3. Slå på objektivvarmerens kontroller 1 time før kontrolltemperaturkontrollen utføres.
    4. Slå på mikroskopet og kontroller at mikroskopet som er satt opp er ferdig, da mengden lys gjennom prøven kan endre temperaturen på lysbildet.
    5. Slå på kontrolleren for den oppvarmede esken (figur 5D).
    6. Kontroller at referansesonden fungerer som den skal før du starter. Hold referanseprobespissen mellom fingrene; Det skal måle kroppstemperaturen.
    7. Sett frie medier midt på lysbildet, mellom de to tilstøtende firkantede dekselene (20 mm x 20 mm) limt på den.
    8. Plasser spissen av referansesonden i den supplerte M199. Deksel med rektangulær deksel (22 mm x 40 mm). Forsikre deg om at sonden er helt omgitt av media (ellers kan temperaturen falle).
    9. COVID-19-tilpasning: For å utføre temperaturkontrollen i det lukkede kammeret ved hjelp av et avstandsstykke, kutt den ene siden av avstandsstykket (dette hullet må ha samme størrelse som referansesonden). Fest avstandsstykket på glassglasset, plasser gratis medier midt på avstandsstykket. Plasser spissen av referansesonden i løsningen, gjennom hullet på avstandsstykket, og fest deretter et rektangulært deksel (22 mm x 40 mm) på avstandsstykket.
    10. Plasser lysbildet i platen på den oppvarmede boksen. Lukk den oppvarmede boksen med lokket.
    11. Tilsett olje på olje-nedsenkingsmålet.
    12. Plasser den oppvarmede boksen på mikroskopstadiet.
    13. Juster temperaturen på platen og lokket (temperaturen på lokket skal være 2 °C høyere enn temperaturen på platen for å unngå kondens) for å måle 37 °C med referansesonden i mediet.
    14. Vent 5 minutter (tid som kreves for å øke temperaturen i prøven til 37 °C).
    15. Juster objektivet, flytt det nærmere lysbildet til du berører dekselet med spissen av linsen.
    16. Flytt målet for å se midten av sonden i mikroskopet.
      MERK: Forsikre deg om at sonden er sett på dataskjermen (for å kontrollere at kamerasystemet fungerer før du ser på den cilierte prøven). Når du ser på midten av sonden, er skjermen helt svart.
    17. Juster temperaturen på linsevarmeren (for å kompensere for tap av temperatur når olje-nedsenkingslinsen er i kontakt med dekselet). Pass på å måle 37 °C med referansesonden i mediet når objektivet berører dekselet.
      MERK: Ideelt sett bør du arbeide i et rom med kontrollert temperatur, slik at disse temperaturene ikke endres. Hvis temperaturen i rommet ikke er kontrollert, bør du utføre denne temperaturkontrollen hver dag før du utfører ciliary videomikroskopi.
    18. Etter å ha kontrollert temperaturen, fjern lysbildet fra den oppvarmede boksen.
    19. Rengjør lysbildet og spissen av referansesonden med alkohol og legg bort.
    20. Rengjør linsen med isopropanol og linserensevev med sirkulære bevegelser.

Figure 5
Figur 5: Utstyr brukt i DHSV-laboratoriet. (A) Mikroskopet utstyrt med en 100x olje-nedsenking fasekontrastlinse, er plassert på et anti-vibrasjonsbord for å unngå at eksterne vibrasjoner forårsaker artefakter for ciliær funksjonsanalyse (B) Mikroskopet er omgitt av bobleplast for å forhindre varmetap fra omgivende luft. (C) Oljenedsenkingsmålet skaper varmetap. Dette kan forhindres ved hjelp av en linsevarmer (piler). (D) Prøven varmes opp ved hjelp av en varmeboks. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Fremstilling av de respiratoriske cilierte epitelprøvene

  1. Rist røret forsiktig for å la cilia spre seg ut gjennom hele røret (for å unngå at cilia sitter fast på andre ciliated strimler, slim eller rusk, som hindrer dem i å slå fritt).
    MERK: Dette trinnet er viktig for å oppnå "optimale kanter" av ciliert epitel (figur 12).
  2. Trekk opp ca. 50 μl ciliert epitel i supplert M199 i midten av røret med en pipette.
  3. Sett prøven på det laboratoriebygde kammeret (mellom de to tilstøtende firkantede dekselslippene (20 mm x 20 mm)) og deksel med et rektangulært deksel (22 mm x 40 mm). Vær forsiktig så du ikke legger til bobler.
  4. COVID-19-tilpasning: Utfør trinn 4.1-4.3 i et mikrobiologisk sikkerhetsskap. Prosedyre i mikrobiologisk sikkerhetsskap.
    1. Slå på det mikrobiologiske sikkerhetsskapet 10 minutter før du klargjør prøven (for å sikre at miljøet er sterilt).
    2. Før enhver håndtering, desinfiser hele det mikrobiologiske sikkerhetsskapet med 70% etanol.
    3. Desinfiser alt nødvendig materiale med 70% etanol før du legger det i det mikrobiologiske sikkerhetsskapet.
    4. Åpne de 15 ml koniske rørene som inneholder prøvene bare én gang under det mikrobiologiske sikkerhetsskapet, og løsne deretter epitelstrimlene ved å bearbeide børsten (med Weil-Blakesley nesetang) i supplert M199.
    5. Fest avstandsstykket på glassglasset og fjern beskyttelsen fra det dobbeltsidige fastlåste avstandsstykket.
    6. Rist røret forsiktig for å la flimmerhårene spre seg ut gjennom hele røret.
    7. Trekk opp en liten prøve av ciliert epitel i supplert M199 fra midten av røret med en pipette (ca. 60 μL) og fyll inhalasjonskammeret.
    8. Sett det rektangulære dekselet (22 mm x 40 mm) på avstandsstykket for å lukke kammeret.
    9. Desinfiser sklien før du går ut av det mikrobiologiske sikkerhetsskapet.
    10. Fjern sklien fra det mikrobiologiske sikkerhetsskapet.
    11. Bytt hansker når du går ut av det mikrobiologiske sikkerhetsskapet.
    12. Vent 10 minutter før du slår av det mikrobiologiske sikkerhetsskapet etter bruk (for å sikre at miljøet i det mikrobiologiske sikkerhetsskapet er sterilt før døren lukkes).
  5. Plasser lysbildet i platen på den oppvarmede boksen. Lukk den oppvarmede boksen med lokket.
  6. Tilsett olje på olje-nedsenkingsmålet.
  7. Plasser den oppvarmede boksen på mikroskopets scene.
  8. Slå på den oppvarmede boksen og linsevarmeren.
    MERK: Linsevarmeren må være slått på 1 time før bruk.
  9. Juster temperaturinnstillingene til den oppvarmede esken og kontrollene for objektivovnen i henhold til verdiene som ble oppnådd i trinn 3.4.
  10. Vent i 5 minutter (tiden det tar å øke prøvetemperaturen til opptil 37 °C ved bruk av forhåndsbestemte innstillinger for både varmeboksen og objektivovnen).
  11. Nærme deg målet til lysbildet til du berører dekselet med spissen av linsen.

5. Visualisere respiratoriske ciliated kanter

  1. Fest høyhastighets videokameraet på mikroskopet, koble kameraet til datamaskinen og slå på kameraet.
  2. Slå på datamaskinen.
  3. Koble det digitale høyhastighets videomikroskopikameraet til datamaskinen (slik at bildet som ses gjennom okularlinsene, projiseres på skjermen) via programvaren.
    1. Åpne programvaren, og deretter åpnes hovedmenyen automatisk (figur 6A).
      MERK: Programvaren er programmet som brukes i laboratoriet for bildeinnsamling og behandling. Systemet gjør det mulig å ta opp og spille av videosekvenser med redusert bildefrekvens eller bilde for bilde. Den kan lastes ned gratis.
    2. Åpne kamera (figur 6A).
    3. Når Camera enumeration-filter vises, velger du OK (figur 6B).
    4. Velg Oppdater liste; velg navnet på kameraet; velg Grensesnitt: Ekspert, og velg deretter Åpne (figur 6C).
    5. På kameraets kontrolllinje øverst på den forankrede dialogmenyen velger du Live (figur 6D).
    6. Velg Spill av for å vise bildet og Stopp for å fullføre visningen (figur 6D).

Figure 6
Figur 6: Beskrivelse av bruken av programvaren: visualisering av respiratoriske cilierte kanter på skjermen. (A) Hovedmenyen vises direkte når du åpner programvaren. (b) Lukk filteret for kameranummerering. (C) Velg kamera og velg Grensesnitt: Ekspert. (D) Live-modus gjør det mulig å visualisere på skjermen bildet sett gjennom mikroskopet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Juster innstillingen for kameraopptak (øverst til høyre) (figur 7).
    1. På Opptaksinnstillinger velger du Kamera, og justerer deretter bildefrekvensen: Frekvens (Hz): 500 (se nedenfor) (figur 7A).
    2. På Innstillinger for brukeranskaffelse velger du Kamera og justerer deretter interesseområdet (ROI) (figur 7A).
      MERK: ROI beregnes ved hjelp av en gradert skala som vises med x100 olje-nedsenkingsmålet og projiseres på skjermen, for å definere antall piksler som tilsvarer 50 μm (slik du vil registrere cilierte kanter som måler omtrent 50 μm (se nedenfor)).
    3. På Innstillinger for anskaffelse velger du Ta opp, og deretter justerer du varigheten på videoen og det totale antallet bilder som er tatt opp (en varighet på 2 sekunder, tilsvarer 1000 bilder hvis den valgte bildefrekvensen er 5OO Hz) (figur 7B).
      MERK: Etter vår erfaring er minimum 2 sekunder videolengde nødvendig for å tillate en fullstendig analyse av både CBF og CBP.
    4. Velg Fil og deretter Lagre kamera-Cfg for å lagre den nye anskaffelsesinnstillingen (skriv inn et navn og om nødvendig en kommentar for denne nye konfigurasjonen) (figur 7C,D).
    5. Hvis du vil åpne denne nye kamerakonfigurasjonen, åpner du File and Load Camera Cfg (figur 7C).

Figure 7
Figur 7: Beskrivelse av bruken av programvaren: justering av kameraopptaksinnstillingene for videoopptak av de slagende cilierte kantene. (A) På anskaffelsesinnstillingen Kamera justerer du interesseområdet (ROI) og bildefrekvensen for videoopptak (Rate). (B) På opptaksinnstillingen Record justerer du varigheten av videoopptaket (antall bilder som trengs for den valgte opptaksvarigheten, i henhold til bildefrekvensen valgt tidligere). (C) Disse nye kamerakonfigurasjonsinnstillingene kan lagres ved hjelp av funksjonen Lagre kamera Cfg . Last inn kamera Cfg gjør det mulig å åpne de lagrede konfigurasjonsinnstillingene på nytt for videre bruk. (D) De nye innstillingene for kamerakonfigurasjon kan navngis, og en kommentar kan legges til om nødvendig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Se gjennom okulære linser og søk etter celler eller rusk i prøven, og fokuser.
  2. Kontroller at bildet er synlig på skjermen, og forbedre kvaliteten på bildet ved å justere kondensatoren (og DIC-prismet hvis du bruker et interferenskontrastobjektiv), og juster fokus om nødvendig.
  3. Søk etter strimler av ciliated epitel.

6. Valg av respiratoriske cilierte kanter

MERK: Det eksperimentelle systemet gjør det mulig å slå cilia i tre forskjellige plan: en sidelengs profil, som slår direkte mot observatøren, og fra rett over (figur 8).

Figure 8
Figur 8: DHSV-teknikken gjør det mulig å slå cilia i tre forskjellige plan. (A) i sidelengs profil. (B) slå direkte mot observatøren og. (C) fra rett ovenfra. Gjengitt fra Kempeneers et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Registrer bare intakte uforstyrrede cilierte epitelkanter som måler minst 50 μm i lengde.
  2. For registreringer gjort på sidelengs profil, bestem kvaliteten på kanten i henhold til Thomas et al.29 scoring system (figur 9). Bruk bare normale kanter (figur 9A) eller kanter med mindre fremspring (figur 9B) for ciliær funksjonsanalyse. Utelat isolerte celler (figur 9E).

Figure 9
Figur 9: Representativt bilde av skåringssystemet av Thomas et al29 for forskjellig kvalitet på cilierte epitelkanter. (A) Normal kant: definert som en intakt ensartet ciliert epitelstripe > 50 μm i lengde (B) Ciliated edge med mindre fremspring: definert som en kant >50 μm i lengde, med celler som projiserer ut av epitelkantlinjen, men uten punkt av den apikale cellemembranen som projiserer over spissene av cilia på de tilstøtende cellene (C) Ciliated edge med store fremspring: definert som en kant >50 μm i lengde, med celler som projiserer ut av epitelkantlinjen, med minst ett punkt av den apikale cellemembranen som projiserer over spissene av cilia på de tilstøtende cellene (D) Isolert ciliert celle: definert som den eneste cilierte cellen på en epitelkant >50 μm i lengde (E) Enkeltceller: definert som cilierte celler som ikke har kontakt mellom seg selv eller noen annen celletype. Skala bar: 5,5 μm. Gjengitt fra Thomas et al.29Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Utfør CFA ved å bruke bare cilia fri for slim og rusk, og slå i profilen som er valgt for den registrerte kanten. Velg bare cilierte kanter som tillater minst 2 CBF- og CBP-evalueringer (se nedenfor) langs kanten.
  2. Bruk kun for CFA-prøver som gir minst 6 kanter som slår i sidelengs profil og oppfyller kriteriene ovenfor; Analyser maksimalt 20 kanter i sidelengs profil.
  3. Bruk minst 1 ekstra kant av flimmerhårene som slår fra over observatørprofilen for å karakterisere CBP.

7. Ta opp ciliated edge

  1. Ta opp den bankende flimmerhårkanten med en kamerabildefrekvens på 500 bilder per sekund, og projiser på en skjerm med høy oppløsning. En minimum bildefrekvens på 400 Hz er nødvendig for å tillate analyse av både CBF og CBP13. Ta opp én kant med en bildefrekvens på 30 bilder per sekund for å evaluere effektiviteten til partikkelklaring.
  2. Velg Live på kameraets kontrolllinje øverst på den forankrede dialogmenyen (figur 6D)
  3. Velg Spill av for å vise bildet og Stopp for å fullføre visningen (figur 6D)
  4. Hvis du vil registrere en kant, trykker du på Record (figur 6D). For å se opptaket før du lagrer, gå på kamerakontrolllinjen øverst i den forankrede dialogmenyen og velg Avspilling. Velg Spill av for å vise videoen som er tatt opp, og Stopp for å fullføre visningen (figur 10A).
    MERK: Slutt å se på den registrerte kanten før du lagrer.

Figure 10
Figur 10: Beskrivelse av bruken av programvaren. (A) avspillingsmodus. Hvis du vil se gjennom en innspilt videosekvens der du slår ciliated edge, velger du avspillingsmodus. Velg Spill av for å vise bildet og Stopp for å fullføre visningen. Berømmelsesraten kan justeres for å forbedre analysen av ciliærfunksjonen (B, C) Lagre videoopptakene av å slå cilierte kanter (B) For å lagre videoen, velg Fil og deretter Lagre anskaffelser. (C) Skriv inn navnet på den innspilte videoen og velg plasseringen der videoen skal spilles inn. Kontroller at opptaket er lagret som en . RAW-fil (D) Valg av opptak av festede kanter som skal analyseres: Hvis du vil åpne et videoopptak, velger du Fil, Åpne og deretter Bilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Lagre videoen i databasen (figur 10B,C).
    1. Åpne Fil øverst til venstre, og lagre deretter oppkjøp (figur 10B).
    2. Skriv inn navnet på den innspilte videoen i Lagre anskaffelser, og kontroller at opptaket er lagret som et RAW-filformat (figur 10C).
  2. Når videoen er lagret, går du tilbake til live-modus (gå tilbake til kameraets kontrolllinje øverst på den forankrede dialogmenyen og velg live) (figur 6D).
  3. Gjenta prosedyren for å registrere antall kanter som oppfyller utvalgskriteriene som kreves for CFA.
    MERK: Det er mulig å registrere flere slagende ciliated kanter som oppfyller utvalgskriteriene fra ett lysbilde, innen maksimalt 20 minutter etter forberedelsen av lysbildet (for å unngå uttørking). Etter 20 minutter, hvis det ikke er mulig å skaffe nok kanter som oppfyller utvalgskriteriene, må du forberede et nytt lysbilde.
  4. Fjern lysbildet fra den oppvarmede boksen.
  5. Fjern det rektangulære dekselet og kast det i den spesifikke beholderen for farlig medisinsk avfall.
  6. Rengjør lysbildet (med de to kvadratiske dekselene limt på det) med 70% etanol og absorberende papir. Når lysbildet er rent, kan det brukes igjen.
  7. COVID-19-tilpasning: Plasser lysbildet med dekselet og avstandsstykket i en lufttett pose, fjern hansker og maske og legg dem i den lufttette posen. Plasser den lufttette posen i den spesifikke beholderen for farlig medisinsk avfall.

8. Ciliær funksjonsanalyse

  1. Foreløpig forberedelse for å utføre den manuelle CBF- og CBP-evalueringen
    1. Åpne programvaren.
    2. Åpne Fil øverst til venstre, deretter Åpne og deretter Bilder (figur 10D).
    3. Velg videoen du vil analysere.
    4. Gå til kameraets kontrolllinje øverst i den forankrede dialogmenyen, og velg Avspilling (figur 10A). Velge Spille for å vise videoen som er tatt opp og Stopp for å fullføre visningen.
  2. Manuell ciliær beatfrekvens (CBF) analyse
    1. Utfør evalueringen av CBF bare ved å bruke sidelengs kanter.
    2. Del de cilierte kantene i omtrent 5 tilstøtende områder, som hver måler omtrent 10 μm (figur 11).
    3. Identifiser og visualiser flimmerhår eller grupper av flimmerhår med redusert bildefrekvens, og maksimalt 2 CBF-målinger gjøres i hvert område, noe som resulterer i maksimalt 10 CBF-målinger langs hver kant (figur 11).
    4. Registrer antall rammer som kreves for at en gruppe cilia skal fullføre 5 taktsykluser.
    5. Konverter til CBF ved en enkel beregning: (CBF = opptak bildefrekvens (Hz) / (antall bilder for 5 slag) x 5) 13,16,30. Immotile cilia er rapportert å ha en CBF på 0 Hz13.
      MERK: Juster bildefrekvensen når du spiller av de innspilte videoene (figur 10A). Dette er spesielt nyttig når cilia analysert slå veldig sakte. Å øke bildefrekvensen bidrar til å definere om cilia slår veldig sakte eller er immotile.
    6. For hver prøve beregnes gjennomsnittlig CBF som gjennomsnitt (SD) eller (95 % KI) av all CBF registrert i sidelengs profil, inkludert statiske flimmerhår.

Figure 11
Figur 11: Representativt bilde av en optimal kvalitetskant, og inndelingen i 5 områder for å tillate CFA-analyse. En ciliert epitelkant av optimal kvalitet er fragmentert i 5 tilstøtende områder som hver måler 10 μm. Maksimalt 2 CBF-målinger (og 2 CBP-evalueringer) gjøres i hvert område, noe som resulterer i maksimalt 10 CBF-målinger (og CBP-evalueringer) langs hver kant. Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Manuell ciliary beat mønster (CBP) analyse
    1. For å evaluere markørene for dyskinesi, bruk kun sideveisprofilen; bruk flyene mot observatøren og ovenfra for å karakterisere typen CBP13. Det finnes ulike metoder og poeng for CBP-evaluering. Nedenfor beskrives metoden som brukes i laboratoriet med definisjonen av markørene for dyskinesi.
    2. Prosentandelen av hver distinkte CBP i utvalget
      1. For hver flimmerhår eller gruppe av flimmerhår som er identifisert og brukt til CBF-måling (figur 11), utfør en CBP-analyse med redusert bildefrekvens: sammenlign den nøyaktige banen tatt av flimmerhårene i løpet av en full taktsyklus med den normale CBP observert på DHSV-analysen12,30.
      2. Tilordne en distinkt CBP (normal, immotil, stiv, sirkulær, asynkron (ukoordinert ciliær juling) eller dyskinetisk13) til hver cilia eller gruppe av cilia analysert.
      3. For hver prøve beregner du prosentandelen av hver distinkte CBP i utvalget; CBP som tilskrives utvalget er den dominerende CBP observerte.
    3. Beregn de 3 markørene for dyskinesi.
      1. Beregn immotilitetsindeksen (IMI): prosentandelen immotile cilier i prøven (antall CBF = 0 / totalt antall CBF-avlesninger i prøven X 100). Uttrykk IMI som gjennomsnitt (SD) eller (95 % KI)1,16,31.
      2. Beregn dyskinesi score (DKS). Del hver ciliated kant i kvadranter, og antall kvadranter med dyskinetisk (eller unormalt slående) cilia bestemmes. Dette gjør det mulig å beregne en DKS mellom 0 og 4 (0: normal CBP gjennom kanten; 1: unormal CBP i ≤ 25% av flimmerhårene; 2: unormal CBP i ≤ 50% av cilia; 3: unormalt taktmønster i ≤ 75% av cilia; og 4: unormal CBP i alle cilia). Median DKS (interkvartilbredde) er beregnet for utvalget16,29.
      3. Beregn prosentandelen av normale slag: definert som prosentandelen av flimmerhår med normal CBP i utvalget (antall normale CBP-avlesninger / totalt antall CBP-avlesninger for prøven x100).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å illustrere effektiviteten av teknikken, presenterer vi resultatene av CFA i en serie på 16 friske voksne frivillige (5 menn, aldersgruppe 22-54 år).

Nesebørsteprøver fra 14 (4 menn, aldersgruppe 24-54 år) av totalt 16 frivillige ga nok passende epitelkanter som tilfredsstilte utvalgskriteriene som trengs for å utføre CFA. Fra disse 14 nesebørsteprøvene ble totalt 242 cilierte kanter registrert, og 212 kanter oppfylte de definerte inklusjonskriteriene og ble analysert. Alle disse kantene ble registrert i sidelengs profil (cilia slo ovenfra observatøren ble registrert og analysert for hver frivillig for å vurdere om en sirkulær CBP ble observert13, men disse kantene ble ikke inkludert for CFA). Totalt 807 CBF-målinger og CBP-evaluering ble oppnådd fra de analyserte flimmerhårene eller gruppene av cilier (tabell 1). De detaljerte resultatene av CFA for hver friske forsøksperson er presentert i tabell 1.

Gjennomsnittlig CBF (± standardavvik) for de 14 forsøkspersonene hvis utvalg oppfylte inklusjonskriteriene var 14,79 (± 2,17) Hz. Dette stemmer overens med tidligere publiserte referansedata i laboratorier som utfører DHSV ved en kontrollert temperatur på 37 °C 16,29,30, mens CBF-målinger i laboratorier som utfører DHSV ved romtemperatur er lavere15,32,33. Gjennomsnittlig (± standardavvik) prosentandel av normal CBP for friske forsøkspersoner var 78,82 (± 14,73), og for hver av disse friske personene var det dominerende taktmønsteret normalt. Ingen flimmerhår ble funnet å slå i et sirkulært slagmønster hos de friske personene, som rapportert tidligere16,34.

Gjennomsnittlig IMI (± standardavvik) var 2,27 (± 2,3) % og median DSK (interkvartilbredde) var 0 (0-1). Disse verdiene var lik tidligere publikasjon om friske voluteers16,29. Det er interessant å merke seg at DSK og CBF var lik verdiene rapportert av Thomas et al fra analysen oppnådd ved valg av bare normale kanter eller kanter med mindre projeksjon (figur 9), noe som gjenspeiler viktigheten av å analysere bare kanter som oppfyller inklusjonskriteriene29. Hvis de brukte kanter av lav kvalitet, rapporterte de en lavere CBF, og en høyere DKS29. Dette illustrerer at bruk av epitelkanter som ikke oppfyller seleksjonskriteriene, feilaktig kan føre til en PCD-diagnose.

Derfor, for å brukes som et PCD-diagnostisk verktøy, bør CFA fra nesebørsteprøver utføres ved bruk av epitelstrimler av optimal kvalitet (figur 12A), oppnådd ved optimal behandling av nesebørsteprøver og et optimalt kantvalg. Som rapportert i protokollen, bør bare intakte uforstyrrede cilierte epitelkanter på minst 50 μm i lengde brukes, og CFA bør utføres med bare cilia fri for slim og rusk. I sidelengs profil bør slagkanter som tillater mindre enn 2 evaluering av CBF og CBP utelukkes.

Videre kan røde blodlegemer og slim blokkere flimmerhårene, eller skjule flimmerhårene for observatøren (figur 12B). Mengden av slim kan begrenses ved å be pasienten om å blåse nesen før nesebørsting, og for å unngå å utføre nesebørsting under akutt nesebetennelse (betennelse øker mengden slim, og risikoen for blødning under nesebørsting). Videre må nesebørstingen være skånsom for å begrense lett blødning og dermed mengden røde blodlegemer. Men på den annen side, hvis børsten ikke presser hardt mot den nedre neseturbinen, kan det hende at nesebørsteprøven ikke inneholder nok cilierte epitelstrimler av høy kvalitet (figur 12C,D).

Til slutt, hvis nesebørstingen utføres på den fremre delen av nesehulen, vil det ikke oppnås cilierte celler, da denne delen av nesen er foret med et ikke-ciliert overgangsepitel (figur 12E). Derfor er kvaliteten på nesebørsteprøven viktig for å gi minimum 6 kanter av flimmerhårene som slår i sidelengs profil (og 1 kant av flimmerhårene som slår ovenfra) som oppfyller inklusjonskriteriene.

Av de 16 friske frivillige ble 2 nesebørsteprøver ekskludert for CFA. Én forsøksperson ble ekskludert fordi utvalget ikke kunne gi det nødvendige antallet cilierte kanter som oppfylte inklusjonskriteriene, med hovedsakelig isolerte celler funnet i utvalget (figur 12D). Det andre forsøkspersonen ble ekskludert fordi alle registrerte epitelkanter (n = 7) var ikke-cilierte (figur 12E), noe som tyder på at nesebørstingen var for fremre og ikke riktig utført på den nedre turbinaten. Denne konklusjonen ble trukket fordi faget var en sunn frivillig. Gjentatte nesebørsteprøver som bare gir ikke-cilierte epitelkanter hos en pasient med mistanke om PCD, kan føre til en diagnose av redusert generering av flere motile cilier (RGMC), en mukociliær clearance lidelse forårsaket av svikt i ciliogenese 3,35,36.

På grunn av COVID-19-pandemien måtte diagnosesenteret ved Universitetet i Liège tilpasse ciliary videomicroscopy-protokollen. Før pandemien brukte vi et åpent visualiseringskammer som muliggjorde utveksling av gass og fuktighet mellom prøven og miljøet. Da dette potensielt kunne føre til forurensning av operatøren og/eller miljøet, byttet vi til et lukket visualiseringskammer, og hermetisiteten til dette kammeret for gass og væske ble testet. Figur 13 viser tetningstesten av det lukkede visualiseringskammeret ved hjelp av et dobbeltsidig fast avstandsstykke. Hermetisiteten ble testet ved å fylle kammeret med 60 μL Trypan blå og luft, og deretter nedsenke kammeret i vann i løpet av 4 timer. Da vi ikke observerte Trypan blå lekkasje eller luftbobler i vannet i løpet av 4 timer, konkluderte vi med at kammeret var hermetisk forseglet for både væske og gass. Bruken av dette lukkede visualiseringskammeret for å utføre ciliær videomikroskopi under pandemien er godkjent av Department for Hygiene and Health Protection at Work ved University of Liege.

Frisk frivillig Nei. Av Edge innspilt Nei. Antall analyserte kanter Antall CBF-målinger CBF (Hz)
(Gjennomsnitt ± SD)		 Normal CBP (%)
(Gjennomsnitt ± SD)		 IMI (%)
(Gjennomsnitt ± SD)		 DSK Median
(Interkvartilbredde)
1 21 16 52 16.59 ± 3,83 82.7 0 0 (0-2)
2 11 7 34 18,4 ± 5,32 97.1 0 0 (0-1)
3 12 11 48 12.12 ± 1,87 91.7 0 0 (0-2)
4 20 20 60 15.18 ± 3.29 86.7 1.67 0 (0-1)
5 18 14 54 11,82 ± 3,97 87 3.7 0 (0-1)
6 15 11 51 16.23 ± 5.5 76.5 5.9 1 (1-2)
7 21 18 60 14.37 ± 4.12 68.3 3.3 1 (0-2)
8 19 18 51 14.12 ± 4,79 74.5 5.9 1 (0-2)
9 17 17 37 16,77 ± 4,74 89.2 0 0 (0-2)
10 15 15 69 16.49 ± 4,44 75.4 2.9 1 (1-2)
11 15 14 77 14.53 ± 2,42 81.8 0 0 (0-2)
12 16 11 48 15.27 ± 2,38 81.3 0 0 (0-2)
13 24 22 72 14,8 ± 4,07 86.1 4.17 0 (0-2)
14 18 18 94 10,4 ± 3,43 79.8 4.26 1 (0-1)
Total: 242 212 807 14,79 ± 2,17 82,72 ± 7,62 2,27 ± 2.3 0 (0-1)

Tabell 1: Representative resultater av antall kanter registrert og analysert, antall oppnådde CBF-målinger og verdiene av CBF, prosentandel av normal CBP, IMI, DSK hos 14 friske personer, etter denne protokollen. CBF = ciliary beat frequency, CBP = ciliary beat pattern, IMI = immotility index og DSK = dyskinesi score.

Figure 12
Figur 12: Figur som illustrerer kompleksiteten ved nesebørsting. (A) "Optimal kvalitet epitelial stripe": intakt ensartet ciliated epithelia stripe > 50 μm i lengde, slik at mer enn 2 cilia eller gruppe av cilia som skal brukes til CBF og CBP evaluering (dvs. cilia slår fritt i sidelengs profil, uten å bli sittende fast i slim eller rusk). (B) Bilde som representerer en stor mengde celler og slim som sitter fast over en ciliated epitelstripe, hindrer cilia å slå fritt, og gjemmer cilia fra observatøren. (C) Kvaliteten på den registrerte kanten er utilstrekkelig, da det er en kant med hovedprojeksjon29. (D) Enkelt ciliert celle, som ikke kan brukes til ciliær funksjonell analyse. (E) Nesebørstingen er utført på fremre del av nesehulen, foret med et ikke-ciliert overgangsepitel. Derfor ble ingen cilierte celler oppnådd. Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 13
Figur 13: Tetningstest av avstandsstykke med gass og Trypan Blue-løsning. Hermeticiteten til avstandsstykket ble testet ved å fylle kammeret med 60 μL trypanblå og luft, og deretter nedsenke kammeret i vann i 4 timer. Da vi ikke observerte trypanblå lekkasje eller luftbobler i vannet i løpet av de 4 timene, konkluderte vi med at kammeret var hermetisk for både gass og væske. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne rapporten tar sikte på å gi en standard operasjonsprosedyre for CFA ved bruk av nesebørsteprøver, med justeringer gjort for passende infeksjonskontrollhensyn under COVID-19-pandemien. PCD-diagnose er utfordrende, og krever i dag et panel av ulike diagnostiske tester, i henhold til internasjonale anbefalinger, inkludert nasal nitrogenoksidmåling, CFA ved bruk av DHSV, ciliær ultrastrukturell analyse ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), merking av ciliærproteiner ved bruk av immunfluorescens og genetisk testing for PCD som forårsaker gener 4,37. Foreløpig vil ingen enkelt test diagnostisere hver pasient med PCD 4,37. I henhold til European Respiratory Society-retningslinjene er det bare ultrastrukturelle defekter ved TEM og bi-alleliske mutasjoner i PCD-fremkallende gener som kan bekrefte en PCD-diagnose. Dessverre har disse testene en 15-30% rate av falske negative resultater 4,37,38,39. DHSV har fordelen av å ha en høyere sensitivitet og spesifisitet for PCD-diagnose (henholdsvis 0,95-1,00 og 0,91-0,96) 31,38,40,41, men nyere internasjonale anbefalinger uttalte at DHSV for tiden ikke er tilstrekkelig standardisert til å bekrefte en PCD-diagnose 4,37. Faktisk er det mangel på presis operasjonsprosedyre for ciliated prøvepreparering og prosessering, mangel på standardisert CFA-metode og normative funksjonelle analysedata for tolkning av ciliærfunksjon 4,8,13,16,34,38,40. Dette papiret foreslår en protokoll som brukes i senteret for å skaffe og behandle respiratoriske cilierte epitelprøver, og for ciliær funksjonell evaluering. Siden det for øyeblikket ikke er noen internasjonal konsensus for en DHSV-protokoll, kan noen trinn i prosessen variere mellom sentre. Variasjon i faktorer som temperatur under ciliær videomikroskopi, medium brukt og kvalitet på analyserte epitelkanter kan alle påvirke ciliærfunksjonen13.

Variasjon i temperaturen satt opp under DHSV-analyse eksisterer mellom sentre, med noen som anbefaler DHSV utføres ved romtemperatur13. Vi anbefaler at prøveanalyse gjøres ved 37 °C. Dette øker kompleksiteten i oppsettet, men en PCD-diagnose kan bli oversett hvis CBP-analyse utføres under 37 °C. Jackson et al. rapporterte en temperaturfølsom variant av PCD, som presenterte et normalt koordinert taktmønster når flimmerhårene ble observert ved romtemperatur, men et unormalt hyperhyppig og dyskinetisk mønster ved 37 °C42. Videre har det blitt godt beskrevet at CBF varierer med temperatur, med et sigmoidalt forhold43,44, slik at CBF-referansedata varierer i henhold til temperaturen som brukes til å utføre DHSV.

Videre er det for tiden mangel på standardisering i den manuelle og/eller datamaskinassisterte metoden for CBF- og CBP-evaluering13. I dette papiret foreslår vi den manuelle CBF- og CBP-evalueringsteknikken som brukes i laboratoriet vårt.

Siden manuell behandling av DHSV-data innebærer en viss subjektivitet og er tidkrevende, har en rekke programvareapplikasjoner blitt utviklet for CBF- og CBP-vurdering, ved hjelp av forskjellige halvautomatiserte (som involverer valg av spesifikke interesseområder (ROI) for å undersøke) eller helautomatiske programmer 34,45,46 (analysere hele det fangede bildet). Alle programmer bruker variasjonen i lysintensitet i pikslene til de innspilte videobildene over tid for å beregne CBF. Imidlertid involverer de fleste programmer manuell eller automatisert utelukkelse av spesifikke data for å redusere støy: områder med stasis, områder der CBF eller ciliary beat amplitude (CBA) faller under de bestemte terskelverdiene. En sammenligning mellom manuell og automatisert CBF-evaluering er kun publisert for ett program45, og viste ingen signifikant forskjell (paret t-test, p=0,64). Nylige resultater på 75 PCD-pasienter viste ingen signifikant forskjell mellom CBF-evaluering oppnådd ved Fast Fourier-transformasjon (FFT) og kymografi47. Ulike dataassisterte programvarer for CBP-analyse har blitt utviklet 48,49,50, for det meste involverer evaluering av CBP i begrensede avkastninger, men for øyeblikket er ingen kommersielt tilgjengelige 48.

Så vidt vi vet, er dette den første publiserte standard operasjonsprosedyren for CFA ved bruk av DHSV. CFA ved hjelp av ferske nesebørsteprøver har noen begrensninger; De fleste av disse kan overvinnes ved å utføre en re-analyse av ciliær funksjon etter dyrking av respiratoriske ciliated celler. For det første kan infeksjon, betennelse eller skade under prøvetaking føre til sekundære ciliære funksjonsavvik. Kulturen av respiratoriske cilierte celler kan forbedre nøyaktigheten av DHSV, spesielt for å utelukke falske positive resultater27. For det andre, som PCD-pasienter som er tilstede med kronisk respiratorisk betennelse og infeksjon, kan dyrking av ciliert epitel være nødvendig, da det kan være vanskelig å finne et 4-6 ukers gap uten infeksjon for å utføre en nesebørstingsprosedyre. For det tredje kan kvaliteten på nesebørsteprøven ikke være tilstrekkelig til å gi det nødvendige antall kanter av høy kvalitet, spesielt hos små barn. Dyrking av prøvene kan bidra til å overvinne dette problemet. Endelig kan CFA være vanskelig hvis prøven inneholder mange celleavfall eller en høy belastning av slim; Dette kan også løses hvis CFA utføres etter cellekultur. Videre er omfattende personalopplæring i erfarne sentre kritisk, da påvisning av CBP-abnormiteter fortsatt er sterkt avhengig av erfaringen til etterforsker 4,13. Utviklingen og valideringen av automatisert CBP-evalueringsprogramvare vil potensielt forbedre denne brukeravhengige variasjonen og utvide bruken av DHSV for PCD-diagnostiske formål.

Resultatene viser også viktigheten av nesepusseteknikk for å tillate effektiv CFA. Forsiktig nesebørsting teknikk øker evnen til å oppnå optimal kvalitet epitelial ciliated strimler. Spesielt neseblåsing før prosedyren begrenser slim, utfører forsiktig børsting reduserer røde blodlegemer og riktig plassering av børsten øker suksessraten for å oppnå ciliert epitel som børsting av den fremre delen av nesehulen bringer tilbake ikke-ciliated epitel.

På grunn av helsekrisen i COVID-19-pandemien har infeksjonskontrollhensyn ført til at vi har tilpasset mange aspekter av de ciliære videomikroskopiprotokollene. Før pandemien brukte vi et åpent laboratoriebygget kammer. Fordelene ved dette kammeret inkluderer dets enkelhet og hurtighet å forberede og bruke, kostnader og evnen til gjenbruk etter rengjøring. Det er imidlertid noen viktige forbehold. Mengden medium er viktig: ciliated strimler må være godt hydrert for å slå ordentlig, men for mye media vil spyle ut av det åpne kammeret og blande seg med oljen, og forhindre et godt bilde. Videre må prøvene observeres innen maksimalt 20 minutter for å unngå uttørking. Dette kan potensielt overvinnes hvis ytterligere M199-medium tilsettes ved hjelp av en sprøyte rett under dekslet. I sammenheng med COVID-19-pandemien er det største problemet med det åpne kammeret at det tillater gass- og fuktighetsutveksling mellom preparatet og miljøet13. Det er en potensiell risiko for laboratorie- og operatørforurensning hvis prøven er infisert av COVID-19. Vi identifiserte et lukket visualiseringskammer ved hjelp av et avstandsstykke, og demonstrerte effektiviteten. Vi har endret protokollen, fra nesebørsting til lysbildeforberedelse og analyse, for å ta hensyn til strenge smitteverntiltak for å forhindre overføring av COVID-19. Disse tilpasningene har gjort det mulig for oss å fortsette å tilby en PCD-diagnostisk tjeneste, uten å bruke et nivå 2 biosikkert laboratorium. Gitt den usikre lengden på denne nåværende helsekrisen, og viktigheten av å fortsette å tilby viktige PCD-diagnostiske tjenester som DHSV, gjør tilpasningene som foreslås i dette papiret det mulig å utføre CFA uten å utnytte L2 biosikkerhetslaboratorieressurser, obligatorisk for andre viktige aktiviteter under denne helsekrisen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Disse forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier og alle teammedlemmer av PCD diagnostiske senter i Paris-Est for deres tilgjengelighet og hjertelig velkomst under besøket til deres PCD-diagnostiske senter, og de mange utvekslingene. Vi takker også Robert Hirst og alle teammedlemmer ved PCD-senteret i Leicester for deres velkomst og tid, råd og ekspertise.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , Supplement 1 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics - The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O'Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, Suppl 1 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a, Ammons, B. a, Wyatt, T. a All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, Pt 2 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 165 primær ciliær dyskinesi ciliær videomikroskopi ciliær beatfrekvens ciliærrytmemønster ciliær funksjonsanalyse nesebørsting respiratorisk ciliert epitel COVID-19
Nasal børsting prøvetaking og prosessering ved hjelp av digital høyhastighets ciliary videomikroskopi - tilpasning for COVID-19-pandemien
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bricmont, N., Benchimol, L.,… More

Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A. L., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M. C., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter