Summary
For at garantere en vellykket ciliær funktionel analyse af høj kvalitet til PCD-diagnose er en præcis og omhyggelig metode til prøveudtagning og behandling af åndedrætsepitel afgørende. For fortsat at kunne levere PCD-diagnosticeringstjeneste under COVID-19-pandemien er den ciliære videomikroskopiprotokol blevet opdateret til at omfatte passende infektionskontrolforanstaltninger.
Abstract
Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en genetisk bevægelig ciliopati, der fører til signifikant otosinopulmonal sygdom. PCD-diagnose overses ofte eller forsinkes på grund af udfordringer med forskellige diagnostiske modaliteter. Ciliær videomikroskopi ved hjælp af Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), et af de diagnostiske værktøjer til PCD, betragtes som den optimale metode til at udføre ciliær funktionel analyse (CFA), der består af ciliary beat frequency (CBF) og beat pattern (CBP) analyse. DHSV mangler imidlertid standardiseret, offentliggjort driftsprocedure til behandling og analyse af prøver. Det bruger også levende respiratorisk epitel, et betydeligt infektionskontrolproblem under COVID-19-pandemien. For fortsat at yde en diagnostisk service under denne sundhedskrise er ciliary videomikroskopi-protokollen blevet tilpasset til at omfatte passende infektionskontrolforanstaltninger.
Her beskriver vi en revideret protokol for prøveudtagning og laboratoriebehandling af cilierede åndedrætsprøver, der fremhæver tilpasninger foretaget for at overholde COVID-19-infektionskontrolforanstaltninger. Repræsentative resultater af CFA fra næsebørstningsprøver opnået fra 16 raske forsøgspersoner, behandlet og analyseret i henhold til denne protokol, er beskrevet. Vi illustrerer også vigtigheden af at opnå og behandle epitelcilierede strimler af optimal kvalitet, da prøver, der ikke opfylder kvalitetsudvælgelseskriterierne, nu giver mulighed for CFA, hvilket potentielt reducerer den diagnostiske pålidelighed og effektiviteten af denne teknik.
Introduction
Primær ciliær dyskinesi (PCD) er en arvelig heterogen bevægelig ciliopati, hvor respiratoriske cilier er stationære, langsomme eller dyskinetiske, hvilket fører til nedsat mucociliær clearance og kronisk oto-sino-lungesygdom 1,2,3,4. De kliniske manifestationer af PCD er kronisk våd hoste og kronisk tilstoppet næse, der starter i tidlig barndom, tilbagevendende eller kroniske øvre og nedre luftvejsinfektioner, der fører til bronchiectasis og tilbagevendende eller kronisk otitis media og bihulebetændelse 5,6,7. Ca. halvdelen af PCD-patienter har organlateralitetsdefekter såsom situs inversus eller situs ambiguus. Nogle patienter har også problemer med infertilitet på grund af immotile sædceller hos mænd og immotile cilier i æggelederne hos kvinder 1,2,8. PCD er sjælden, men forekomsten er vanskelig at definere og varierer fra 1:10.000 til 1:20.000 9,10. Den reelle forekomst af PCD menes imidlertid at være højere på grund af vanskeligheder med diagnosticering og manglende klinisk mistanke. Symptomer på PCD efterligner almindelige respiratoriske manifestationer af andre akutte eller kroniske luftvejssygdomme, og de diagnostiske udfordringer ved at bekræfte diagnosen er velkendte, hvilket fører til utilstrækkelig behandling og opfølgning 2,5,9,11.
Ciliær videomikroskopi, ved hjælp af Digital High-Speed Videomikroskopi (DHSV), er et af de diagnostiske værktøjer til PCD 4,8,12,13. DHSV betragtes som den optimale metode til at udføre ciliær funktionel analyse (CFA), der består af ciliary beat frequency (CBF) og beat pattern (CBP) analyse 2,14,15,16. DHSV bruger levende respiratorisk epitel, normalt opnået ved nasal børstning13.
I lyset af det nuværende COVID-19-udbrud er bekræftelse af en PCD-diagnose nu endnu vigtigere, da beviser tyder på, at underliggende luftvejssygdomme kan føre til dårligere resultater efter COVID-19-infektion17,18. En sikker og effektiv diagnosticeringstjeneste for udviklingsvenlig politikkohærens under den nuværende pandemi vil også gøre det muligt for bekræftede patienter med udviklingsvenlig politikkohærens at drage fordel af yderligere beskyttelsesforanstaltninger sammenlignet med befolkningen som helhed19.
Overførsel af COVID-19 sker primært gennem dråbespredning20. Højt potentiale for transmission fra asymptomatiske (eller minimalt symptomatiske) patienter antydes af den høje virale belastning i næseprøve20. Derudover, hvis virale partikler bliver aerosoliseret, forbliver de i luften i mindst 3 timer21. Derfor udsættes respiratorisk sundhedspersonale for et højt reservoir af viral belastning, mens de udfører klinisk pleje og prøveindsamling til diagnostiske teknikker22. Desuden udsætter manipulation af levende åndedrætsprøver teknikeren for COVID-19-kontaminering. Mens anbefalinger om bedste praksis for respiratoriske læger og ØNH-kirurger, der plejer COVID-19-patienter, implementeres23, mangler der anbefalinger til udførelse af DHSV under COVID-19-pandemien.
For fortsat at kunne levere en udviklingsvenlig udviklingsdiagnostisk tjeneste og samtidig garantere sundhedsarbejderens sikkerhed (udføre prøveindsamling) og tekniker (udføre prøvebehandling) måtte ciliær videomikroskopiprotokollen tilpasses under covid-19-pandemien. Teknikken til ciliær videomikroskopi er i øjeblikket begrænset til forskningsservice og specialiserede diagnostiske centre, da CFA kræver omfattende træning og erfaring. Desuden mangler der i øjeblikket standardisering og præcis driftsprocedure til behandling og analyse af prøver ved hjælp af DHSV 4,13.
Formålet med dette papir er at beskrive standardprocedurer for DHSV med særlig henvisning til infektionskontrolforanstaltninger og sikkerhed ved prøveudtagning og behandling af levende næseepitel. Dette vil gøre det muligt at fortsætte diagnosticering og pleje af udviklingsvenlig politikkohærens af høj kvalitet på trods af det nuværende covid-19-udbrud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev opnået godkendelse fra Liège hospital-fakultetets etiske udvalg og universitetets afdeling for hygiejne og sundhedsbeskyttelse på arbejdspladsen.
1. Prøveudtagning af respiratorisk cilieret epitel
- Sørg for, at forsøgspersonerne er fri for infektion i mindst 4-6 uger og fri for nasal og inhaleret medicin, før prøveudtagning.
- Forbered suppleret M199-præparat: Supplement Cell Culture Medium 199 (M199) (500 ml) med antibiotikaopløsning (5 ml streptomycin / penicillin (50 μg / ml)) og svampedræbende opløsning (5 ml amphotericin B (2,5 μg / ml)).
- Forbered 2 (et til hvert næsebor) 15 ml koniske rør med låg, og fyld hver af dem med 3 ml suppleret M199.
- Forbered en bronchial cytologibørste (tykkelse: 2 mm og længde: 11 mm). Klip enden af tråden for at sikre, at børsten er ca. 15 cm lang (figur 1A, B). For at holde børsten, når du udfører næsebørstningen, skal du bruge en Weil-Blakesley næsetang (figur 1B).
- COVID-19-tilpasning: Undgå at behandle en levende nasal epitelprøve med ukendt status for COVID-19, test patienten for COVID-19 48 til 72 timer før næsebørstningen for ciliær videomikroskopi. Denne COVID-19-test består af polymerasekædereaktion fra en nasopharyngeal vatpindprøve24,25. Da patientens status for COVID-19 er ukendt på dette tidspunkt, skal læge og personale være tilstrækkeligt beskyttet23,26, inklusive FFP2-maske, handsker, ansigtsskærm eller beskyttelsesbriller og langærmet vandafvisende kjole. I tilfælde af utilgængelig, umulig eller tvivlsom PCR-test, foretages al behandling af næsebørstning i L2 biosikkerhedslaboratorium. I tilfælde af positiv COVID-19-status skal du udsætte PCD-diagnosetest og overveje alternative tilgange til håndtering af patienten.
FORSIGTIGHED: Denne nasopharyngeal vatpindprøveudtagning til COVID-19-test kan fremkalde sekundær ciliær dyskinesi ved at beskadige næserespiratorisk ciliærepitel27,28. For at undgå dette skal du indføre en tynd vatpind i næsehulen op til nasopharynx under stiv endoskopisk kontrol, undgå at skade turbinaterne eller septumet. Prøven tages derefter fra nasopharynx og fjerner vatpinden under kontrol af det stive endoskop. Med passende udstyr udføres en 0 ° stiv endoskopi let hos voksne og børn uden traumer.
2. Indhentning af respiratoriske cilierede epitelprøver
COVID-19-tilpasning: Selvom patientens COVID-19-status er negativ på grund af falsk-negativ sats, bliver patienten bedt om at holde en kirurgisk maske på munden under proceduren, og handsker, FFP2-maske og ansigtsskærm bæres af lægen.
- Forberedelse af næsebørstning
- Bed patienten om at blæse hans / hendes næse.
- Udfør nasal børstning under nasal endoskopi eller blindet. Hvis du bruger en nasal endoskopi, skal du undersøge de 2 næsebor inden næsebørstningen (gentag ikke, hvis det gøres 48-72 tidligere for COVID-19 næsepind). Undersøgelse gør det muligt at verificere tilstanden af slimhinde (en høj grad af betændelse kan forårsage blødning, når nasal børstning udføres, ...), tilstanden af ringere turbinat (for at udelukke tilstedeværelsen af telangiectasia for eksempel), og hvis septum nasal er lige (figur 1C).
- Bed patienten om at ligge ned eller sidde komfortabelt, hovedet hviler baglæns på stolen (fordi næsebørstningen får en refleks til at bevæge hovedet tilbage). En anden omsorgsperson holder hovedet under næsebørstningen, især hos børn.
- Ryst børsten i den supplerede M199 inden næsebørstning (fugtning af børsten reducerer irritation fra børstning).
BEMÆRK: Børsten kan fugtes inden for den supplerede M199; Hvis patienten er allergisk over for antibiotika (penicillin og streptomycin er til stede i det supplerede cellekulturmedium), fugt børsten i saltvand.
- Næsebørstning
- Indsæt forsigtigt næsebørstningen uden lokalbedøvelse eller generel anæstesi13. Hvis du bruger nasal endoskopi, skal du placere endoskopet ved indgangen til næsen for at visualisere det ringere nasale turbinat, og indsæt derefter cytologibørsten i næsen. Hvis du udfører en "blindet" næsebørstning, skal du indsætte børsten i næsen efter næsebunden (figur 1D).
BEMÆRK: Nogle diagnostiske centre bruger lokalbedøvelse med en tampon naphazolin til at udføre nasal børstning. - Flyt børsten bagud og anteriort flere gange over den bageste del af det ringere nasale turbinat, og træk dig derefter tilbage. Operatøren skal føle, at børsten gnider epitelet, og patienten kan føle ensidigt vandigt øje på siden af børstningen.
BEMÆRK: Hvis næsebørstningen udføres for anteriort, opnås der ingen cilierede celler, da det forreste næsehulrum er foret med et midlertidigt ikke-cilieret epitel. - Efter prøveudtagning placeres straks næsebørsteprøver i kulturmediet. De opnåede respiratoriske epitelstrimler løsnes ved at omrøre børsten i røret indeholdende den supplerede M199 og derefter lukke røret (figur 1E).
- COVID-19-tilpasning: Epitelstrimlerne må ikke løsnes ved at omrøre børsten i den supplerede M199 umiddelbart efter prøveudtagningen. Placer børsten i røret, skær ledningen, så den kan passe helt inde i røret, og luk røret med det samme. Anbring prøven i en lufttæt dobbeltpose.
- Indsæt forsigtigt næsebørstningen uden lokalbedøvelse eller generel anæstesi13. Hvis du bruger nasal endoskopi, skal du placere endoskopet ved indgangen til næsen for at visualisere det ringere nasale turbinat, og indsæt derefter cytologibørsten i næsen. Hvis du udfører en "blindet" næsebørstning, skal du indsætte børsten i næsen efter næsebunden (figur 1D).
Figur 1: Næsebørstningsteknik. (A) Hele bronkial cytologibørste (B) Klar til børste: børstenden af ledningen skæres (ca. 15 cm lang) og holdes af en Weil-Blakesley næsetang (C) Endoskopisk billede af næsehulen: septum (1) ringere turbinat (2) og midterste turbinat (3) (D) Næsebørstning udføres på den bageste del af det ringere turbinat (2). Næseskillevæg (1) Midterste turbinat (3). (E) Respiratoriske epitelstrimler løsnes ved at ryste børsten i det supplerede M199-cellekulturmedium. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Respiratorisk cilieret epitelbehandling
- Analyser næsebørstningsprøver under mikroskop inden for 9 timer efter prøveudtagning, da både CBF og CBP er stabile inden for denne tidsramme (ikke-offentliggjorte data).
- Brug et opretstående eller et omvendt lysmikroskop med en x100 olienedsænkningsfasekontrast eller en interferenskontrastlinse. Ideelt set skal mikroskopet placeres på et antivibrationsbord, fordi ciliary slag kan være udsat for artefakter på grund af eksterne vibrationer (f.eks. Fra laboratoriebænken)13.
COVID-19-tilpasning: Operatøren bruger personlige værnemidler til at udføre nasal behandling, herunder FFP2-maske, handsker og langærmet vandafvisende kjole.
- Forbered visualiseringskammeret.
- Suspender de cilierede epitelstrimler i et laboratoriebygget åbent visualiseringskammer, så cilia kan slå frit, mens de analyseres under mikroskopet. Dette kammer er skabt ved adskillelse af en dæksel (22 mm x 40 mm) og en glasglide med to tilstødende firkantede dæksler (20 mm x 20 mm), adskilt af en afstand på 15 mm og limet på glasskinnen12 (figur 2, figur 4A).
COVID-19-tilpasning: Det ovenfor beskrevne laboratoriebyggede kammer er åbent og tillader gas- og fugtighedsudveksling mellem prøven og miljøet13. I forbindelse med COVID-19-pandemien er det muligt at bruge et lukket visualiseringskammer ved hjælp af en dobbeltsidet fast afstandsstykke, 0,25 mm dybde (figur 3, figur 4B). Afstandsstykket sidder fast på glasglasset, og derefter sidder en dæksel (22 mm x 40 mm) fast oven på afstandsstykket.
Figur 2: Montering af det laboratoriebyggede åbne kammer. (A) De 2 firkantede dæksler (20 mm x 20 mm) anbringes på glasglasset. (B) De firkantede dæksler adskilles med en afstand på ca. 15 mm og limes på glasglasset. (C) Kammeret fyldes mellem de to tilstødende firkantede dæksler med en lille prøve (ca. 60 μL) cilieret epitel i suppleret M199. (D) En lang rektangulær dæksel (22 mm x 40 mm) anbringes på de to tilstødende firkantede dæksler og dækker kammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Montering af det lukkede kammer ved hjælp af en dobbeltsidet fast afstandsstykke. (A) Glasglideren og den dobbeltsidede fastsiddende afstandsstykke. (B) Beskyttelsen fjernes på den ene side af afstandsstykket, og afstandsstykket sidder derefter fast på glasglasset. (C) Beskyttelsen fjernes fra den anden side af det dobbeltsidede fastsiddende afstandsstykke, og derefter fyldes afstandsstykket med en lille prøve (ca. 60 μL) cilieret epitel i suppleret M199. (D) Et langt rektangulært dæksel (22 mm x 40 mm) sidder fast på afstandsstykket og lukker kammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Skematisk diagram, der viser de vigtigste visualiseringskamre, der bruges til at udføre ciliær videomikroskopi ved hjælp af digital højhastighedsvideomikroskopi (DHSV). (A) Den åbne hængende dråbeteknik: den cilierede prøve ophænges i en dråbe cellekulturmedium i et åbent kammer skabt ved adskillelse af en dækseddel og et glasglas ved to tilstødende dæksedler. (B) Den lukkede hængende dråbeteknik: den cilierede prøve suspenderes i en dråbe cellekulturmedium i et lukket kammer skabt af en afstandsstykke klemt mellem en glasside og en dækseddel. Afstandsstykket klæber fast på både glasglideren og dækslet. Reproduceret og modificeret fra Kempeneers et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Kontrol af temperatur
- Omgiv mikroskopet med bobleplast (figur 5A, B).
- Fastgør linsevarmeren omkring målet ved hjælp af en velcrorem (figur 5C)
- Tænd for linsevarmerregulatoren 1 time, før du udfører kontroltemperaturkontrollen.
- Tænd mikroskopet og kontroller, at mikroskopopsætningen er færdig, da mængden af lys gennem prøven kan ændre temperaturen på diaset.
- Tænd for den opvarmede boksstyring (figur 5D).
- Kontroller, at referencesonden fungerer korrekt, før du starter. Hold referencesondespidsen mellem fingrene; Det skal måle kropstemperaturen.
- Sæt frie medier i midten af diaset mellem de to tilstødende firkantede dæksler (20 mm x 20 mm) limet på den.
- Referencesondespidsen anbringes i den supplerende M199. Dæk med et rektangulært dæksel (22 mm x 40 mm). Sørg for, at sonden er helt omgivet af medier (ellers kan temperaturen falde).
- COVID-19-tilpasning: For at udføre temperaturreguleringen i det lukkede kammer ved hjælp af en afstandsstykke skal du skære den ene side af afstandsstykket (dette hul skal have samme størrelse som referencesonden). Sæt afstandsstykket på glasglasset, placer frie medier midt på afstandsstykket. Anbring spidsen af referencesonden i opløsningen gennem afstandsstykkets hul, og sæt derefter et rektangulært dæksel (22 mm x 40 mm) på afstandsstykket.
- Placer diaset i pladen på den opvarmede kasse. Luk den opvarmede kasse med låget.
- Tilsæt olie på olienedsænkningsmålet.
- Placer den opvarmede kasse på mikroskoptrinnet.
- Pladens og lågets temperatur justeres (lågets temperatur skal være 2 °C højere end pladens temperatur for at undgå kondensering) for at måle 37 °C med referencesonden i mediet.
- Vent 5 minutter (det tager tid at hæve prøvens temperatur til 37 °C).
- Juster målet, flyt det tættere på diaset, indtil du berører dækslet med spidsen af objektivet.
- Flyt målet for at se midten af sonden i mikroskopet.
BEMÆRK: Sørg for, at sonden ses på computerskærmen (for at kontrollere, at kamerasystemet fungerer, før du ser på den cilierede prøve). Når du ser midten af sonden, er skærmen helt sort. - Juster temperaturen på linsevarmeren (for at kompensere for temperaturtabet, når olienedsænkningslinsen er i kontakt med dækslet). Sørg for at måle 37 °C med referencesonden i mediet, når målet rører dækslet.
BEMÆRK: Ideelt set skal du arbejde i et rum med en kontrolleret temperatur, så disse opstillede temperaturer ikke ændres. Hvis rummets temperatur ikke kontrolleres, skal du udføre denne temperaturkontrolkontrol hver dag, før du udfører ciliær videomikroskopi. - Når du har kontrolleret temperaturen, skal du fjerne diaset fra den opvarmede boks.
- Rengør diaset og spidsen af referencesonden med alkohol og læg dem væk.
- Rengør linsen med isopropanol og linserenseservietter med cirkulære bevægelser.
Figur 5: Udstyr, der anvendes i DHSV-laboratoriet. (A) Mikroskopet, der er udstyret med en 100x olienedsænkningsfasekontrastlinse, placeres på et antivibrationsbord for at undgå, at eksterne vibrationer forårsager artefakter til ciliær funktionel analyse (B) Mikroskopet er omgivet af bobleplast for at forhindre varmetab fra omgivende luft. (C) Målet om nedsænkning i olie skaber varmetab. Dette kan forhindres ved hjælp af en linsevarmer (pile). D) Prøven opvarmes ved hjælp af en varmeboks. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Fremstilling af respiratoriske cilierede epitelprøver
- Ryst røret forsigtigt for at lade cilia sprede sig ud i røret (for at undgå, at cilia sidder fast på andre cilierede strimler, slim eller snavs, som forhindrer dem i at slå frit).
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at opnå "optimale kanter" af cilieret epitel (figur 12). - Udtag ca. 50 μL cilieret epitel i suppleret M199 midt i røret med en pipette.
- Anbring prøven på det laboratoriebyggede kammer (mellem de to tilstødende firkantede dæksler (20 mm x 20 mm)) og dæk med et rektangulært dæksel (22 mm x 40 mm). Pas på ikke at tilføje bobler.
- COVID-19-tilpasning: Udfør trin 4.1-4.3 i et mikrobiologisk sikkerhedsskab. Procedure i det mikrobiologiske sikkerhedsskab.
- Tænd for det mikrobiologiske sikkerhedsskab 10 minutter før forberedelsen af prøven (for at sikre, at miljøet er sterilt).
- Før håndtering desinficeres hele det mikrobiologiske sikkerhedsskab med 70% ethanol.
- Desinficer alt nødvendigt materiale med 70% ethanol, inden det placeres i det mikrobiologiske sikkerhedsskab.
- De 15 ml koniske rør, der kun indeholder prøverne, åbnes én gang under det mikrobiologiske sikkerhedsskab, og derefter løsnes epitelstrimlerne ved at omrøre børsten (med Weil-Blakesley næsepincet) i suppleret M199.
- Sæt afstandsstykket på glasglasset, og fjern beskyttelsen fra det dobbeltsidede fastsiddende afstandsstykke.
- Ryst røret forsigtigt for at lade cilia sprede sig ud i røret.
- Udtag en lille prøve af cilieret epitel i suppleret M199 fra midten af røret med en pipette (ca. 60 μL) og fyld afstandsstykket.
- Sæt det rektangulære dæksel (22 mm x 40 mm) på afstandsstykket for at lukke kammeret.
- Desinficer objektglasset, inden du kommer ud af det mikrobiologiske sikkerhedsskab.
- Fjern glideren fra det mikrobiologiske sikkerhedsskab.
- Skift handsker, når du forlader det mikrobiologiske sikkerhedsskab.
- Vent 10 minutter, før du slukker for det mikrobiologiske sikkerhedsskab efter brug (for at sikre, at miljøet i det mikrobiologiske sikkerhedsskab er sterilt, før du lukker lågen).
- Placer diaset i pladen på den opvarmede kasse. Luk den opvarmede kasse med låget.
- Tilsæt olie på olienedsænkningsmålet.
- Placer den opvarmede kasse på mikroskopets scene.
- Tænd for den opvarmede boks og linsevarmeren.
BEMÆRK: Linsevarmeren skal tændes 1 time før brug. - Juster temperaturindstillingerne for den opvarmede boks og linsevarmerregulatorerne i henhold til værdier opnået ved trin 3.4.
- Vent 5 minutter (det tager at hæve prøvens temperatur til 37 °C, når der anvendes forudbestemte indstillinger for både den opvarmede kasse og objektivvarmeren).
- Gå hen til målet til lysbilledet, indtil du berører dækslet med spidsen af objektivet.
5. Visualisering af åndedrætscilierede kanter
- Fastgør højhastighedsvideokameraet på mikroskopet, tilslut kameraet til computeren, og tænd kameraet.
- Tænd computeren.
- Tilslut det digitale højhastighedsvideomikroskopikamera til computeren (så billedet, der ses gennem øjenlinserne, projiceres på skærmen) via softwaren.
- Åbn softwaren, og derefter åbnes hovedmenuen automatisk (figur 6A).
BEMÆRK: Softwaren er det program, der bruges i laboratoriet til billedoptagelse og -behandling. Systemet gør det muligt at optage og afspille videosekvenser med en reduceret billedhastighed eller billede for billede. Det kan downloades gratis. - Åbn Kamera (Figur 6A).
- Når filteret Kameraoptælling vises, skal du vælge OK (Figur 6B).
- Vælg Opdater liste; vælg navnet på kameraet; vælg grænsefladen: Ekspert, og vælg derefter Åbn (figur 6C).
- På kameraets kontrollinje øverst i den forankrede dialogmenu skal du vælge Live (figur 6D).
- Vælg Afspil for at få vist billedet og Stop for at afslutte visningen (Figur 6D).
- Åbn softwaren, og derefter åbnes hovedmenuen automatisk (figur 6A).
Figur 6: Beskrivelse af brugen af softwaren: visualisering af åndedrætscilierede kanter på skærmen. (A) Hovedmenuen vises direkte, når softwaren åbnes. (b) Luk kameraets optællingsfilter. (C) Vælg kameraet, og vælg Grænseflade: Ekspert. (D) Live-tilstanden gør det muligt at visualisere billedet set gennem mikroskopet på skærmen. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Juster indstillingen for kameraoptagelse (i øverste højre hjørne) (Figur 7).
- Under Indstillinger for anskaffelse skal du vælge Kamera og derefter justere billedhastigheden: Hastighed (Hz): 500 (se nedenfor) (Figur 7A).
- Under Indstillinger for anskaffelse skal du vælge Kamera og derefter justere interesseområdet (ROI) (Figur 7A).
BEMÆRK: ROI beregnes ved hjælp af en gradueret skala, der vises med x100-olienedsænkningsmålet og projiceres på skærmen, for at definere antallet af pixels svarende til 50 μm (da du vil registrere cilierede kanter, der måler ca. 50 μm (se nedenfor)). - Under Indstillinger for anskaffelse skal du vælge Optag og derefter justere videoens varighed og det samlede antal billeder, der optages (en varighed på 2 sekunder, svarer til 1000 billeder, hvis den valgte billedhastighed er 5OO Hz) (figur 7B).
BEMÆRK: Efter vores erfaring er mindst 2 sekunders videolængde nødvendig for at muliggøre en komplet analyse af både CBF og CBP. - Vælg Filer og derefter Gem kamera Cfg for at gemme den nye anskaffelsesindstilling (indtast et navn og om nødvendigt en kommentar til denne nye konfiguration) (Figur 7C, D).
- For at åbne denne nye kamerakonfiguration skal du åbne Filer og indlæs kamera Cfg (figur 7C).
Figur 7: Beskrivelse af brugen af softwaren: justering af kameraets optagelsesindstillinger til videooptagelse af de bankende cilierede kanter. (A) På anskaffelsesindstillingen Kamera skal du justere interesseområdet (ROI) og billedhastigheden for videooptagelse (Rate). (B) På anskaffelsesindstillingen Optag skal du justere varigheden af videooptagelsen (antal billeder, der er nødvendige for den valgte optagelsesvarighed, i henhold til den tidligere valgte billedhastighed). (C) Disse nye kamerakonfigurationsindstillinger kan gemmes ved hjælp af funktionen Gem kamera Cfg . Indlæs kamera Cfg gør det muligt at genåbne de gemte konfigurationsindstillinger til yderligere brug. (D) De nye kamerakonfigurationsindstillinger kan navngives, og en kommentar kan tilføjes, hvis det er nødvendigt. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Se gennem øjenlinser, og søg efter celler eller snavs i prøven, og fokuser derefter.
- Kontroller, at billedet er synligt på skærmen, og forbedr billedets kvalitet ved at justere kondensatoren (og DIC-prismet, hvis du bruger et interferenskontrastobjektiv), og juster fokus, hvis det er nødvendigt.
- Søg efter strimler af cilieret epitel.
6. Valg af åndedrætscilierede kanter
BEMÆRK: Det eksperimentelle system gør det muligt at se bankende cilier i tre forskellige planer: en sidelæns profil, der slår direkte mod observatøren og direkte ovenfra (figur 8).
Figur 8: DHSV-teknikken gør det muligt at slå cilier i tre forskellige planer. A) i sidelæns profil. (B) slå direkte mod observatøren og (C) direkte ovenfra. Gengivet fra Kempeneers et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Optag kun intakte uforstyrrede cilierede epitelkanter, der måler mindst 50 μm i længden.
- For poster lavet på sidelæns profil, bestem kvaliteten af kanten i henhold til Thomas et al.29 scoringssystem (figur 9). Brug kun normale kanter (figur 9A) eller kanter med mindre fremspring (figur 9B) til ciliær funktionel analyse. Udeluk isolerede celler (figur 9E).
Figur 9: Repræsentativt billede af scoringssystemet af Thomas et al29 for den forskellige kvalitet af cilierede epitelkanter. (A) Normal kant: defineret som en intakt ensartet cilieret epitelstrimmel > 50 μm i længden (B) Cilieret kant med mindre fremspring: defineret som en kant >50 μm i længden, med celler, der rager ud af epitelkantlinjen, men uden noget punkt på den apikale cellemembran, der rager over spidserne af cilierne på de tilstødende celler (C) Cilieret kant med større fremspring: defineret som en kant >50 μm lang, med celler, der rager ud af epitelkantlinjen, med mindst et punkt af den apikale cellemembran, der rager ud over spidserne af cilierne på de tilstødende celler (D) Isoleret cilieret celle: defineret som den eneste cilierede celle på en epitelkant >50 μm i længden (E) Enkeltceller: defineret som cilierede celler, der ikke har nogen kontakt mellem sig selv eller nogen anden celletype. Skalabjælke: 5,5 μm. Gengivet fra Thomas et al.29Klik her for at se en større version af denne figur.
- Udfør CFA ved kun at bruge cilier fri for slim og snavs og slå i profilen valgt til den registrerede kant. Vælg kun cilierede kanter, der tillader mindst 2 CBF- og CBP-evaluering (se nedenfor) langs kanten.
- Brug kun til CFA-prøver, der giver mindst 6 kanter, der slår i sidelæns profil og opfylder ovenstående kriterier; Analysér maksimalt 20 kanter i sidelæns profil.
- Brug mindst 1 ekstra kant af cilia, der slår ovenfra observatørprofilen for at karakterisere CBP.
7. Optagelse ciliated kant
- Optag den bankende ciliakant ved hjælp af en kamerabilledhastighed på 500 billeder i sekundet, og projicer på en skærm med høj opløsning. Der kræves en minimumsbilledhastighed på 400 Hz for at muliggøre analyse af både CBF og CBP13. Optag en kant med en billedhastighed på 30 billeder pr. sekund for at evaluere effektiviteten af partikelafstanden.
- Vælg Live på kameraets kontrollinje øverst i den forankrede dialogmenu (Figur 6D)
- Vælg Afspil for at få vist billedet og Stop for at afslutte visningen (Figur 6D)
- Hvis du vil optage en kant, skal du trykke på Optag (figur 6D). For at se optagelsen, før du gemmer, skal du gå på kameraets kontrollinje øverst i den forankrede dialogmenu og vælge Afspilning. Vælg Afspil for at se den optagede video og Stop for at afslutte visningen (Figur 10A).
BEMÆRK: Stop med at se den optagede kant, før du gemmer.
Figur 10: Beskrivelse af brugen af softwaren. (A) afspilningstilstand. For at gennemgå en optaget videosekvens af at slå ciliated edge skal du vælge afspilningstilstand. Vælg Afspil for at se billedet og Stop for at afslutte visningen. Berømmelsesfrekvensen kan justeres for at forbedre analysen af ciliærfunktionen (B, C) Lagring af videooptagelser af at slå cilierede kanter (B) For at gemme videoen skal du vælge Filer og derefter Gem anskaffelser. (C) Indtast navnet på den optagede video, og vælg placeringen, hvor videoen er optaget. Sørg for, at optagelsen er gemt som en . RAW-fil (D) valg af en optagelse af bankende cilierede kanter, der skal analyseres: Hvis du vil åbne en videooptagelse, skal du vælge Filer og derefter Åbne og derefter Billeder. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Gem videoen i databasen (figur 10B,C).
- Åbn Filer i øverste venstre hjørne, og gem derefter anskaffelser (figur 10B).
- I Gem anskaffelser skal du indtaste navnet på den optagede video og sørge for, at optagelsen er gemt som et RAW-filtypeformat (figur 10C).
- Når videoen er gemt, skal du vende tilbage til live-tilstand (gå tilbage til kameraets kontrollinje øverst i den forankrede dialogmenu, og vælg live) (Figur 6D).
- Gentag proceduren for at registrere antallet af kanter, der opfylder udvælgelseskriterierne for CFA.
BEMÆRK: Det er muligt at optage flere bankende cilierede kanter, der opfylder udvælgelseskriterierne, fra et dias inden for højst 20 minutter efter forberedelsen af diaset (for at undgå udtørring). Hvis det efter 20 minutter ikke er muligt at opnå nok kanter, der opfylder udvælgelseskriterierne, skal du forberede et nyt dias. - Fjern diaset fra den opvarmede boks.
- Fjern det rektangulære dæksel, og smid det i den specifikke beholder til farligt medicinsk affald.
- Rengør objektglasset (med de to firkantede dæksler limet på) med 70% ethanol og absorberende papir. Når diaset er rent, kan det bruges igen.
- COVID-19-tilpasning: Placer glideren med dæksel og afstandsstykke i en lufttæt pose, fjern handsker og maske og læg dem i den lufttætte pose. Anbring den lufttætte pose i den specifikke beholder til farligt medicinsk affald.
8. Ciliary funktionel analyse
- Indledende forberedelse til at udføre den manuelle CBF- og CBP-evaluering
- Åbn softwaren.
- Åbn Filer i øverste venstre hjørne, derefter Åbn og derefter Billeder (Figur 10D).
- Vælg den video, der skal analyseres.
- Gå på kameraets kontrollinje øverst i den forankrede dialogmenu, og vælg Afspilning (figur 10A). Vælg Afspil for at se den optagede video og Stop for at afslutte visningen.
- Manuel analyse af ciliær beatfrekvens (CBF)
- Udfør kun evalueringen af CBF ved hjælp af sidelæns kanter.
- Del de cilierede kanter i ca. 5 tilstødende områder, der hver måler ca. 10 μm (figur 11).
- Identificer og visualiser cilier eller grupper af cilier med en reduceret billedhastighed, og der foretages maksimalt 2 CBF-målinger i hvert område, hvilket resulterer i maksimalt 10 CBF-målinger langs hver kant (figur 11).
- Optag antallet af rammer, der kræves for en gruppe cilia for at fuldføre 5 beatcyklusser.
- Konverter til CBF ved en simpel beregning: (CBF = optagelse billedhastighed (Hz) / (antal billeder til 5 slag) x 5) 13,16,30. Immotile cilia rapporteres at have en CBF på 0 Hz13.
BEMÆRK: Juster billedhastigheden, når du afspiller de optagede videoer (figur 10A). Dette er især nyttigt, når cilia analyseret slår meget langsomt. Forøgelse af billedhastigheden hjælper med at definere, om cilia slår meget langsomt eller er immotile. - For hver prøve beregnes den gennemsnitlige CBF som gennemsnittet (SD) eller (95% CI) af al CBF registreret i sidelænsprofilen, inklusive statiske cilier.
Figur 11: Repræsentativt billede af en optimal kvalitetskant og opdelingen i 5 områder for at muliggøre CFA-analyse. En cilieret epitelkant af optimal kvalitet fragmenteres i 5 tilstødende områder, der hver måler 10 μm. Der foretages maksimalt 2 CBF-målinger (og 2 CBP-evalueringer) i hvert område, hvilket resulterer i maksimalt 10 CBF-målinger (og CBP-evalueringer) langs hver kant. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Manuel analyse af ciliært slåmønster (CBP)
- For at evaluere markørerne for dyskinesi skal du kun bruge sidelænsprofilen; Brug flyene mod observatøren og ovenfra til at karakterisere typen CBP13. Der findes forskellige metoder og scorer for CBP-evaluering. Nedenfor beskrives den metode, der anvendes i laboratoriet med definitionen af markørerne for dyskinesi.
- Procentdelen af hver særskilt CBP i stikprøven
- For hver cilia eller gruppe af cilier, der er identificeret og anvendt til en CBF-måling (figur 11), skal du udføre en CBP-analyse med en reduceret billedhastighed: sammenlign den nøjagtige vej, som cilierne tager under en fuld beatcyklus med den normale CBP, der observeres på DHSV-analysen12,30.
- Tilskriv en tydelig CBP (normal, immotil, stiv, cirkulær, asynkron (ukoordineret ciliary beating) eller dyskinetisk13) til hver cilia eller gruppe af cilia analyseret.
- For hver stikprøve beregnes procentdelen af hver særskilt CBP i stikprøven den CBP, der tilskrives stikprøven, er den fremherskende CBP, der er observeret.
- Beregn de 3 markører for dyskinesi.
- Beregn immotilitetsindekset (IMI): procentdelen af immotile cilier i prøven (antal CBF = 0 / samlet antal CBF-aflæsninger i prøven X 100). IMI udtrykkes som middelværdi (SD) eller (95 % CI)1,16,31.
- Beregn dyskinesi score (DKS). Opdel hver cilieret kant i kvadranter, og antallet af kvadranter med dyskinetiske (eller unormalt slående) cilia bestemmes. Dette gør det muligt at beregne en DKS mellem 0 og 4 (0: normal CBP i hele kanten; 1: unormal CBP i ≤ 25% af cilierne; 2: unormal CBP i ≤ 50% af cilierne; 3: unormalt slagmønster i ≤ 75% af cilierne og 4: unormal CBP i alle cilier). Medianen DKS (interkvartilt interval) beregnes for prøven16,29.
- Beregn procentdelen af normal piskning: defineret som procentdelen af cilier med en normal CBP i prøven (antal normale CBP-aflæsninger / samlet antal CBP-aflæsninger for prøven x100).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at illustrere effektiviteten af teknikken præsenterer vi resultaterne af CFA i en serie på 16 raske voksne frivillige (5 mænd, aldersgruppe 22-54 år).
Næsebørstningsprøver fra 14 (4 mænd, aldersgruppe 24-54 år) ud af de i alt 16 frivillige gav nok passende epitelkanter, der opfyldte udvælgelseskriterierne for at udføre CFA. Fra disse 14 næsebørstningsprøver blev der registreret i alt 242 cilierede kanter, og 212 kanter opfyldte de definerede inklusionskriterier og blev analyseret. Alle disse kanter blev registreret i sidelæns profil (cilier, der slog ovenfra observatøren, blev registreret og analyseret for hver frivillig for at vurdere, om en cirkulær CBP blev observeret13, men disse kanter blev ikke inkluderet i CFA). I alt 807 CBF-målinger og CBP-evaluering blev opnået fra cilierne eller grupper af cilier analyseret (tabel 1). De detaljerede resultater af CFA for hver sund forsøgsperson er præsenteret i tabel 1.
Den gennemsnitlige CBF (± standardafvigelse) for de 14 forsøgspersoner, hvis prøver opfyldte inklusionskriterierne, var 14,79 (± 2,17) Hz. Dette stemmer overens med tidligere offentliggjorte referencedata i laboratorier, der udfører DHSV ved en kontrolleret temperatur på 37 °C 16,29,30, mens CBF-målinger i laboratorier, der udfører DHSV ved stuetemperatur, er lavere15,32,33. Den gennemsnitlige (± standardafvigelse) procentdel af normal CBP for de raske forsøgspersoner var 78,82 (± 14,73), og for hver af disse raske forsøgspersoner var det fremherskende rytmemønster normalt. Ingen cilier blev fundet at slå i et cirkulært slagmønster hos de raske forsøgspersoner, som tidligere rapporteret16,34.
Den gennemsnitlige IMI (± standardafvigelse) var 2,27 (± 2,3) %, og medianen DSK (interkvartilt interval) var 0 (0-1). Disse værdier svarede til tidligere publikation om sunde voluterer16,29. Det er interessant at bemærke, at DSK og CBF lignede de værdier, der blev rapporteret af Thomas et al fra analysen opnået ved udvælgelse af kun normale kanter eller kanter med mindre projektion (figur 9), hvilket afspejler vigtigheden af kun at analysere kanter, der opfylder inklusionskriterierne29. Hvis de brugte kanter af lav kvalitet, rapporterede de en lavere CBF og en højere DKS29. Dette illustrerer, at brug af epitelkanter, der ikke opfylder udvælgelseskriterierne, fejlagtigt kan føre til en PCD-diagnose.
For at blive brugt som et PCD-diagnostisk værktøj bør CFA fra næsebørstningsprøver derfor udføres ved hjælp af epitelstrimler af optimal kvalitet (figur 12A), opnået ved en optimal behandling af næsebørstningsprøver og et optimalt kantvalg. Som rapporteret i protokollen bør der kun anvendes intakte uforstyrrede cilierede epitelkanter på mindst 50 μm i længden, og CFA bør udføres ved kun at bruge cilier fri for slim og snavs. I sidelæns profil bør slåkanter, der tillader mindre end 2 evaluering af CBF og CBP, udelukkes.
Desuden kan røde blodlegemer og slim blokere frie cilier, der slår eller skjule cilier for observatøren (figur 12B). Mængden af slim kan begrænses ved at bede patienten om at blæse næsen før næsebørstning og undgå at udføre næsebørstning under akut næsebetændelse (betændelse øger mængden af slim og risikoen for blødning under næsebørstning). Desuden skal næsebørstning være skånsom for at begrænse let blødning og dermed mængden af røde blodlegemer. Men på den anden side, hvis børsten ikke trykker fast mod det ringere nasale turbinat, indeholder næsebørstningsprøven muligvis ikke nok cilierede epitelstrimler af høj kvalitet (figur 12C, D).
Endelig, hvis næsebørstningen udføres på den forreste del af næsehulen, opnås der ingen cilierede celler, da denne del af næsen er foret med et overgangs ikke-cilieret epitel (figur 12E). Derfor er kvaliteten af næsebørstningsprøven vigtig for at give mindst 6 kanter cilia, der slår i sidelæns profil (og 1 kant cilia, der slår ovenfra), der opfylder inklusionskriterierne.
Ud af de 16 raske frivillige blev 2 næsebørstningsprøver ekskluderet for CFA. Et emne blev ekskluderet, fordi prøven ikke kunne give det krævede antal cilierede kanter, der opfyldte inklusionskriterierne, med hovedsageligt isolerede celler fundet i prøven (figur 12D). Det andet emne blev udelukket, fordi alle de registrerede epitelkanter (n = 7) var ikke-cilierede (figur 12E), hvilket tyder på, at næsebørstningen var for anterior og ikke korrekt udført på det ringere turbinat. Denne konklusion blev draget, fordi emnet var en sund frivillig. Gentagne næsebørstningsprøver, der kun giver ikke-cilierede epitelkanter hos en patient med mistanke om PCD, kan føre til en diagnose af en reduceret generation af flere bevægelige cilier (RGMC), en mucociliær clearance lidelse forårsaget af svigt i ciliogenese 3,35,36.
På grund af COVID-19-pandemien måtte diagnosecentret ved universitetet i Liège tilpasse ciliary videomikroskopi-protokollen. Før pandemien brugte vi et åbent visualiseringskammer, der tillod gas- og fugtighedsudveksling mellem prøven og miljøet. Da dette potentielt kunne føre til forurening af operatøren og/eller miljøet, skiftede vi til et lukket visualiseringskammer, og dette kammers hermeticitet for gas og væske blev testet. Figur 13 viser tætningstesten af det lukkede visualiseringskammer ved hjælp af en dobbeltsidet fast afstandsstykke. Hermeticiteten blev testet ved at fylde kammeret med 60 μL trypanblåt og luft og derefter nedsænke kammeret i vand i løbet af 4 timer. Da vi ikke observerede Trypan blå lækage eller luftbobler i vandet i løbet af 4 timer, konkluderede vi, at kammeret var hermetisk forseglet for både væske og gas. Brugen af dette lukkede visualiseringskammer til at udføre ciliær videomikroskopi under pandemien er blevet godkendt af afdelingen for hygiejne og sundhedsbeskyttelse på arbejdspladsen ved universitetet i Liège.
| Sund frivillig | Nej. Af Edge optaget | Nej. Antal analyserede kanter | Antal CBF-målinger | CBF (Hz) (Gennemsnitlig ± SD) |
Normal CBP (%) (Gennemsnitlig ± SD) |
IMI (%) (Gennemsnitlig ± SD) |
DSK Median (Interkvartilt område) |
| 1 | 21 | 16 | 52 | 16.59 ± 3.83 | 82.7 | 0 | 0 (0-2) |
| 2 | 11 | 7 | 34 | 18.4 ± 5.32 | 97.1 | 0 | 0 (0-1) |
| 3 | 12 | 11 | 48 | 12.12 ± 1.87 | 91.7 | 0 | 0 (0-2) |
| 4 | 20 | 20 | 60 | 15.18 ± 3.29 | 86.7 | 1.67 | 0 (0-1) |
| 5 | 18 | 14 | 54 | 11,82 ± 3,97 | 87 | 3.7 | 0 (0-1) |
| 6 | 15 | 11 | 51 | 16.23 ± 5.5 | 76.5 | 5.9 | 1 (1-2) |
| 7 | 21 | 18 | 60 | 14.37 ± 4.12 | 68.3 | 3.3 | 1 (0-2) |
| 8 | 19 | 18 | 51 | 14.12 ± 4.79 | 74.5 | 5.9 | 1 (0-2) |
| 9 | 17 | 17 | 37 | 16.77 ± 4.74 | 89.2 | 0 | 0 (0-2) |
| 10 | 15 | 15 | 69 | 16.49 ± 4.44 | 75.4 | 2.9 | 1 (1-2) |
| 11 | 15 | 14 | 77 | 14.53 ± 2.42 | 81.8 | 0 | 0 (0-2) |
| 12 | 16 | 11 | 48 | 15.27 ± 2.38 | 81.3 | 0 | 0 (0-2) |
| 13 | 24 | 22 | 72 | 14.8 ± 4.07 | 86.1 | 4.17 | 0 (0-2) |
| 14 | 18 | 18 | 94 | 10.4 ± 3.43 | 79.8 | 4.26 | 1 (0-1) |
| Total: | 242 | 212 | 807 | 14.79 ± 2.17 | 82,72 ± 7,62 | 2.27 ± 2.3 | 0 (0-1) |
Tabel 1: Repræsentative resultater af antallet af registrerede og analyserede kanter, antallet af opnåede CBF-målinger og værdierne af CBF, procentdel af normal CBP, IMI, DSK hos 14 raske forsøgspersoner efter denne protokol. CBF = ciliary beat frekvens, CBP = ciliary beat mønster, IMI = immotilitet indeks og DSK = dyskinesi score.
Figur 12: Figur, der illustrerer kompleksiteten af næsebørstning. A) "epitelstrimmel af optimal kvalitet": intakt ensartet cilieret epitelstrimmel > 50 μm lang, hvilket gør det muligt at anvende mere end 2 cilier eller gruppe af cilier til CBF- og CBP-evaluering (dvs. cilier, der slår frit i sidelæns profil uden at sidde fast i slim eller snavs). (B) Billede, der repræsenterer en stor mængde celler og slim, der sidder fast over en cilieret epitelstrimmel, forhindrer cilia i at slå frit og skjuler cilier for observatøren. (C) Kvaliteten af den registrerede kant er utilstrækkelig, da det er en kant med større projektion29. (D) Enkelt cilieret celle, som ikke kan bruges til ciliær funktionel analyse. (E) Næsebørstningen er udført på den forreste del af næsehulen, foret med et midlertidigt ikke-cilieret epitel. Derfor blev der ikke opnået cilierede celler. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 13: Tætningstest af afstandsstykke med gas og Trypan Blue-opløsning. Hermeticiteten af spacer blev testet ved at fylde kammeret med 60 μL trypanblå og luft og derefter nedsænke kammeret i vand i 4 timer. Da vi ikke observerede trypanblå lækage eller luftbobler i vandet i løbet af de 4 timer, konkluderede vi, at kammeret var hermetisk for både gas og væske. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir har til formål at tilvejebringe en standardprocedure for CFA ved hjælp af næsebørstningsprøver med justeringer foretaget for passende infektionskontrolovervejelser under COVID-19-pandemien. PCD-diagnose er udfordrende og kræver i øjeblikket et panel af forskellige diagnostiske tests i henhold til international anbefaling, herunder nasal nitrogenoxidmåling, CFA ved hjælp af DHSV, ciliær ultrastrukturel analyse ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), mærkning af ciliære proteiner ved hjælp af immunofluorescens og genetisk test for PCD-forårsagende gener 4,37. I øjeblikket vil ingen enkelt test diagnosticere hver patient med PCD 4,37. Ifølge retningslinjerne fra European Respiratory Society er det kun kendetegnende ultrastrukturelle defekter ved TEM og bialleliske mutationer i PCD-forårsagende gener, der kan bekræfte en PCD-diagnose. Desværre har disse test en 15-30% sats for falske negative resultater 4,37,38,39. DHSV har den fordel, at DHSV har den fordel, at det har en højere følsomhed og specificitet for PCD-diagnose (henholdsvis 0,95-1,00 og 0,91-0,96)31,38,40,41, men nylige internationale anbefalinger erklærede, at DHSV i øjeblikket ikke er tilstrækkeligt standardiseret til at bekræfte en PCD-diagnose 4,37. Der mangler faktisk en præcis driftsprocedure for cilieret prøveforberedelse og -behandling, mangel på standardiseret CFA-metode og normative funktionelle analysedata til fortolkning af ciliærfunktion 4,8,13,16,34,38,40. Dette papir foreslår en protokol, der anvendes i centret til opnåelse og behandling af respiratoriske cilierede epitelprøver og til ciliær funktionel evaluering. Da der i øjeblikket ikke er nogen international konsensus for en DHSV-protokol, kan nogle trin i processen variere mellem centre. Variation i faktorer som temperatur under ciliær videomikroskopi, anvendt medium og kvaliteten af analyserede epitelkanter kan alle påvirke ciliærfunktionen13.
Variation i temperaturen, der er indstillet under DHSV-analyse, findes mellem centre, hvor nogle går ind for, at DHSV udføres ved stuetemperatur13. Vi anbefaler, at prøveanalyse udføres ved 37 °C. Dette øger kompleksiteten af opsætningen, men en PCD-diagnose kan blive savnet, hvis CBP-analyse udføres under 37 °C. Jackson et al. rapporterede en temperaturfølsom variant af PCD, der præsenterede et normalt koordineret slagmønster, når cilier blev observeret ved stuetemperatur, men et unormalt hyperhyppigt og dyskinetisk mønster ved 37 ° C42. Desuden er det velbeskrevet, at CBF varierer med temperaturen med et sigmoidalt forhold43,44, således at CBF-referencedata varierer alt efter den temperatur, der bruges til at udføre DHSV.
Desuden mangler der i øjeblikket standardisering i den manuelle og/eller computerstøttede metode til CBF- og CBP-evaluering13. I dette papir foreslår vi den manuelle CBF- og CBP-evalueringsteknik, der anvendes i vores laboratorium.
Da manuel behandling af DHSV-data indebærer en vis subjektivitet og er tidskrævende, er der udviklet en række softwareapplikationer til CBF- og CBP-vurdering ved hjælp af forskellige halvautomatiserede (involverer udvælgelse af specifikke interesseområder (ROI'er) til at undersøge) eller fuldautomatiske programmer 34,45,46 (analyse af hele det optagne billede). Alle programmer bruger variationen i lysintensitet i pixels i de optagede videobilleder over tid til at beregne CBF. De fleste programmer involverer dog manuel eller automatiseret udelukkelse af specifikke data for at reducere støj: områder med stasis, områder, hvor CBF eller ciliary beat amplitude (CBA) falder ind under de særlige tærskelværdier. En sammenligning mellem den manuelle og automatiserede CBF-evaluering er kun blevet offentliggjort for et program45 og viste ingen signifikant forskel (parret t-test, p = 0,64). Nylige resultater på 75 PCD-patienter viste ingen signifikant forskel mellem CBF-evaluering opnået ved Fast Fourier-transformation (FFT) og kymografi47. Forskellige computerassisterede software til CBP-analyse er blevet udviklet 48,49,50, hovedsagelig involverer evaluering af CBP i begrænsede ROI'er, men i øjeblikket er ingen kommercielt tilgængelige 48.
Så vidt vi ved, er dette den første offentliggjorte standardprocedure for CFA, der bruger DHSV. CFA ved hjælp af friske næsebørstningsprøver har nogle begrænsninger; hvoraf de fleste kan overvindes ved at udføre en genanalyse af ciliærfunktionen efter dyrkning af respiratoriske cilierede celler. For det første kan infektion, betændelse eller skade under prøveudtagning føre til sekundære ciliære funktionelle abnormiteter. Kulturen af respiratoriske cilierede celler kan forbedre nøjagtigheden af DHSV, især for at udelukke falske positive resultater27. For det andet, da PCD-patienter har kronisk respiratorisk betændelse og infektion, kan det være nødvendigt at dyrke cilieret epitel, da det kan være vanskeligt at finde et 4-6 ugers mellemrum uden infektion for at udføre en næsebørstningsprocedure. For det tredje er kvaliteten af næsebørstningsprøven muligvis ikke tilstrækkelig til at give det krævede antal kanter af høj kvalitet, især hos små børn. Dyrkning af prøverne kan hjælpe med at løse dette problem. Endelig kan CFA være vanskeligt, hvis prøven indeholder adskillige cellerester eller en høj belastning af slim; dette kan også løses, hvis CFA udføres efter cellekultur. Desuden er omfattende personaleuddannelse i erfarne centre kritisk, da påvisning af CBP-abnormiteter fortsat er stærkt afhængig af investigator 4,13's erfaring. Udvikling og validering af automatiseret CBP-evalueringssoftware vil potentielt forbedre denne brugerafhængige variabilitet og udvide brugen af DHSV til PCD-diagnostiske formål.
Resultaterne viser også vigtigheden af næsebørstningsteknik for at muliggøre effektiv CFA. Omhyggelig næsebørstningsteknik øger evnen til at opnå epitelcilierede strimler af optimal kvalitet. Især næseblæsning før proceduren begrænser slim, udførelse af blid børstning reducerer røde blodlegemer, og korrekt placering af børsten øger succesraten for at opnå cilieret epitel, da børstning af den forreste del af næsehulen bringer ikke-cilieret epitel tilbage.
På grund af COVID-19-pandemiens sundhedskrise har overvejelser om infektionskontrol fået os til at tilpasse mange aspekter af ciliary videomikroskopiprotokollerne. Før pandemien brugte vi et åbent laboratoriebygget kammer. Fordele ved dette kammer inkluderer dets lethed og hurtighed at forberede og bruge, omkostninger og evnen til at genbruge efter rengøring. Der er dog nogle vigtige forbehold. Mængden af medium er vigtig: cilierede strimler skal være godt hydreret for at slå ordentligt, men for meget medie spildes ud af det åbne kammer og blandes med olien, hvilket forhindrer et godt billede. Desuden skal prøverne observeres inden for højst 20 minutter for at undgå udtørring. Dette kan potentielt overvindes, hvis der tilsættes yderligere M199-medium ved hjælp af en sprøjte direkte under dæksedlen. I forbindelse med COVID-19-pandemien er det største problem med det åbne kammer, at det tillader gas- og fugtighedsudveksling mellem præparatet og miljøet13. Der er en potentiel risiko for kontaminering af laboratorier og operatører, hvis prøven er smittet med COVID-19. Vi identificerede et lukket visualiseringskammer ved hjælp af en afstandsstykke og demonstrerede dets effektivitet. Vi har ændret protokollen, fra næsebørstning til diasforberedelse og analyse, for at tage højde for strenge infektionskontrolforanstaltninger, der sigter mod at forhindre COVID-19-transmission. Disse tilpasninger har gjort det muligt for os at fortsætte med at levere en PCD-diagnostisk service uden at bruge et niveau 2 biosikkert laboratorium. I betragtning af den usikre længde af denne nuværende sundhedskrise og vigtigheden af fortsat at levere vigtige PCD-diagnostiske tjenester såsom DHSV, gør de tilpasninger, der foreslås i dette papir, det muligt at udføre CFA uden at bruge L2 biosikkerhedslaboratorieressourcer, der er obligatoriske for andre væsentlige aktiviteter under denne sundhedskrise.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Disse forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier og alle teammedlemmer af PCD-diagnostisk center i Paris-Est for deres tilgængelighed og hjertelig velkomst under besøget på deres PCD-diagnostiske center og de mange udvekslinger. Vi takker også Robert Hirst og alle teammedlemmer på PCD-centret i Leicester for deres velkomst og tid, råd og ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | FisherScientific | 352096 | 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid |
| Amphotericin B | LONZA | 17-836E | Antifungal solution |
| Blakesley-weil nasal forceps | NOVO SURGICAL | E7739-12 | Used to hold the brush to perform the nasal brushing |
| Bronchial cytology brush | CONMED | 129 | Used for nasal brushing |
| Cotton swab | NUOVA APTACA | 2150/SG | Used for COVID-19 testing |
| Digitial high-speed videomicroscopy camera | IDTeu Innovation in motion | CrashCam Mini 1510 | |
| Glass slide | ThermoScientific | 12372098 | Microscope slides used to create the visualization chamber |
| Heated Box | IBIDI cells in focus | 10918 | Used to heat the sample |
| Inverted Light microscope | Zeiss | AXIO Vert.A1 | |
| Lens Heater | TOKAI HIT | TPiE-LH | Used to heat the oil immersion lens |
| Medium 199 (M199), HEPES | TermoFisher Scientific | 12340030 | Cell Culture Medium |
| Motion Studio X64 | IDT Motion | version 2.14.01 | Software |
| Oil | FischerScientific, Carl Zeiss | 11825153 | |
| Rectangular cover slip | VWR | 631-0145 | Used to cover the visualization chamber |
| Spacer (Ispacer) 0.25 mm | Sunjinlab | IS203 | Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber |
| Square cover slip | VWR | 631-0122 | Used for the creation of lab-built open visualization chamber |
| Streptomycin/Penicillin | FisherScientific, Gibco | 11548876 | Antiobiotics solution |
References
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , Supplement 1 1-9 (2015).
- Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
- Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M.
- Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
- Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
- Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
- Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
- Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
- Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
- Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
- Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
- Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
- Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics - The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
- Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
- van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
- Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
- Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
- Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
- Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
- George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O'Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
- Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
- Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, Suppl 1 15 (2015).
- Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
- Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
- Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
- Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
- Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. a, Ammons, B. a, Wyatt, T. a All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, Pt 2 103-111 (2003).
- Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
- Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
- Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W.
- Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).
