Summary
질량 분광 검출을 가진 영양 절이로카보네이트 기지를 둔 공유 라벨을 수행하기 위한 실험 절차가 설명됩니다. Diethylpyrocarbonate는 단순히 관심있는 단백질 또는 단백질 복합체와 혼합되어 용매접근 가능한 아미노산 잔류물의 변형으로 이어집니다. 상기 변형된 잔류물은 프로테오리스틱 소화 및 액체 크로마토그래피/질량 분석 후 확인할 수 있다.
Abstract
단백질의 고차 구조를 특성화하는 것은 그 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 질량 분석법 (MS)는 특히 전통적인 방법으로 연구하기 어려운 단백질 시스템을 위해이 목적을위한 강력한 도구로 부상했습니다. MS에 의해 단백질의 구조를 연구하기 위해 단백질의 구조적 정보를 질량에 인코딩하는 용액에서 특정 화학 반응이 수행됩니다. 특히 효과적인 한 가지 접근법은 용매접근 가능한 아미노산 측망을 공유적으로 수정하는 시약을 사용하는 것입니다. 이러한 반응은 프로테오리스틱 소화 및 탠덤 질량 분광과 결합될 때 잔류물 수준의 해상도로 국소화될 수 있는 질량 증가로 이어집니다. 여기에서는 MS 검출과 함께 공유 라벨링 시약으로 디틸피로카보네이트(DEPC)를 사용하는 것과 관련된 프로토콜을 설명합니다. DEPC는 평균 단백질에 잔류물의 최대 30%까지 라벨을 부착할 수 있는 고전기분자로, 우수한 구조적 분해능을 제공한다. DEPC는 MS와 함께 β2-마이크로글로불린과 같은 작은 단일 도메인 단백질에 대한 구조적 정보를 단일 클론 항체와 같은 대형 다중 도메인 단백질에 성공적으로 사용하였다.
Introduction
단백질은 거의 모든 생리 학적 과정에서 필수적인 생체 분자입니다. 단백질이 수행하는 다양한 기능은 그들이 채택하는 구조와 다른 생체 분자와의 상호 작용 때문에 가능합니다. 더 깊은 수준에서 단백질 기능을 이해하려면 생화학 적 및 생물리학적 도구가 이러한 중요한 구조적 특징과 상호 작용을 해명해야합니다. 전통적으로 X선 결정학, 극저온 전자 현미경 검사법 및 핵 자기 공명(NMR) 분광기는 단백질 구조를 드러내기 위해 원하는 원자 수준의 세부 사항을 제공했습니다. 그러나, 수많은 단백질 시스템은 가난한 결정화 행동, 제한된 단백질 가용성, 과도한 샘플 이질성 또는 분자량 제한 때문에 이러한 기술에 의해 심문될 수 없습니다. 따라서 이러한 한계를 극복하는 새로운 분석 방법이 등장했습니다. 단백질 구조 정보를 제공할 수 있는 새로운 기술 중에는 질량 분석법이 있습니다.
질량 분석법(MS)은 분자의 질량 대전(m/z) 비율을 측정하므로 단백질의 질량에 원하는 구조 정보를 인코딩하여 단백질 고차 구조 정보를 얻어야 합니다. 이 정보를 인코딩하기 위한 몇 가지 접근법이 개발되었으며, 여기에는 수소-중수소 교환(HDX)1,2,3,4,화학적 교차연결(XL)5,6,및 공유 라벨링(CL)7,8,9,10을포함한다. HDX에서 백본 아마이드 수소는 용매 접근성 및 H 결합 정도에 의존하는 비율로 약간 더 대규모 중음판으로 교환됩니다. HDX의 범위는 질량 분광계에 의해 이러한 단편을 분리하고 측정하기 전에 펩티드 단편으로 단백질을 빠르게 소화하거나 하향식 실험에서 단백질을 해리시킴으로써 국소화될 수 있다. 교환 속도를 결정하는 것은 단백질 역학에 대한 추가 통찰력을 제공합니다. HDX는 백 교환과 관련된 과제와 재현성을 극대화하기 위한 특수 장비의 필요성에도 불구하고 단백질 구조를 특성화하는 데 유용한 도구로 입증되었습니다. XL-MS에서 단백질은 주어진 단백질 내 또는 두 단백질 사이 인접한 잔류물 측사슬을 공유적으로 연결하는 양기능 시약으로 반응합니다. 이를 통해 XL-MS는 단백질 구조를 특성화하는 데 사용할 수 있는 거리 제약조건을 제공할 수 있습니다. 교차 연결된 단백질의 영역은 액체 크로마토그래피(LC)-MS 분석 뒤에 단백질 분해성 소화에 의해 확인될 수 있다. XL-MS는 내부 세포를 포함하여 다양한 단백질 복합체를 연구하는 데 사용되어 온 다목적 도구이지만 XL 제품의 식별은 어렵고 특수 소프트웨어가 필요합니다.
CL-MS는 단백질 구조와 상호 작용을 연구하기 위하여 상호 보완적이고 때때로 대체MS 기지를 둔 공구로 최근에 등장했습니다. CL-MS에서 단백질 또는 단백질 복합체는 용매 에 노출된 측망(도1)과반응할 수 있는 모노 기능 시약으로 공유적으로 변형된다. 상이한 조건하에서 단백질 또는 단백질 복합체의 변형 정도를 비교함으로써, 형태 변화, 결합 부위 및 단백질 단백질 계면이 드러나게 될 수 있다. CL 반응 후, 현장별 정보는 종종 단일 아미노산 수준에서 단백질이 프로테오틸리티로 소화되고, 펩티드 단편이 LC에 의해 분리되고, 변형된 부위가 탠덤 MS(MS/MS)를 사용하여 식별되는 전형적인 상향식 프로테오믹스 워크플로우를 사용하여 얻을 수 있다. 바이오콩주게이트 화학의 풍부한 역사는 CL-MS 실험에 사용할 수있는 수많은 시약을 만들었습니다. CL 시약은 (i) 특정 및 (ii) 비특이적 두 가지 일반적인 범주로 나뉩니다. 특정 시약은 단일 기능 군(예: 무료아민)8,10과 반응하여 구현하기 쉽지만 제한된 구조 정보를 제공하는 경향이 있다. 비특이적 시약은 광범위한 측면 사슬과 반응하지만, 종종 레이저 나 싱크로트론 소스와 같은 특수 장비가 이러한 반응성 종을 생산해야합니다. 하이드록실 라디칼은 하이드록실 라디칼 발자국(HRF)7,11,12,13실험에서 다양한 조건하에서 다양한 단백질 및 단백질 복합체를 연구하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 비특이적 시약이다.
우리의 연구 그룹은 성공적으로 CL-MS 실험의 맥락에서 단백질 구조 및 상호 작용을 연구하기 위해 영양 hylpyrocarbonate (DEPC)라는 또 다른 상대적으로 비특이적 시약을 사용하였다14,15,16,17,18,19,21,22, 23,24,24,25. DEPC는 특정 라벨링 시약의 단순성(즉, 반응을 수행하기 위해 특수 장비가 필요하지 않습니다)을 제공하며 평균 단백질에서 아미노산의 최대 30%와 반응합니다. 고전기성 시약으로서 DEPC는 시스테인, 히스티딘, 라이신, 티로신, 세린 및 투레오닌 잔류물의 N-terminus 및 뉴클레오필측사슬에 반응할 수 있습니다. 전형적으로, 이러한 반응의 단일 생성물이 생성되어 72.02 Da의 질량 증가가 발생합니다. 이 단일 유형의 제품은 단백질이 하이드록실 라디칼7과반응할 때 생성될 수 있는 최대 55가지 제품과 대조된다. 이러한 간단한 화학은 라벨이 부착 된 사이트의 식별을 용이하게합니다.
여기에서, 우리는 단백질 구조 및 상호 작용을 공부하기 위하여 DEPC 기지를 둔 CL-MS를 사용하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 시약 제제, DEPC 단백질 반응, 단백질 소화 조건, LC-MS 및 MS/MS 파라미터 및 데이터 분석과 관련된 세부 사항이 설명되어 있습니다. 우리는 또한 단백질 금속, 단백질 리간드 및 단백질 단백질 상호 작용뿐만 아니라 가열 시 구조적 변화를 겪고있는 단백질의 예제 결과를 제공하여 DEPC 라벨링의 유용성을 입증합니다.
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Protocol
1. 단백질 및 시약 제제
참고: 이 프로토콜에는 DEPC로 단백질을 라벨링하기 위한 예제 워크플로우가 포함됩니다. 나열된 일부 조건 및 시약 농도는 선택의 단백질에 따라 다를 수 있습니다.
- 1.5 mL 마이크로센심분리기 튜브에 모든 시약 솔루션을 준비합니다.
- pH 7.4에서 10mM 3-(N-morpholino)의 프로파네설포닉산(MOPS) 완충제에서, 일반적으로 수십 개의 μM 범위에서 원하는 농도의 단백질 용액을 준비한다. 대안적으로, 샘플이 DEPC로 반응할 뉴클레오필성 완충제가 포함되어 있는 경우 10mM pH 7.4 MOPS에서 완충교환 기존 단백질 용액을 준비한다. 다른 완충제(예를 들어, 인산염 완충식식염)도 뉴클레오필성 기능성 단이 없는 한 사용될 수 있다.
- 주식 6.9 M DEPC 용액의 1.45 μL을 ACN의 98.55 μL로 파이프하여 건조 아세토닐릴(ACN)으로 100mM DEPC 용액을 준비한다.
참고: 최적의 농도는 그의 및 Lys 잔기23의수에 따라 추정될 수 있더라도, 모든 단백질과 함께 작동할 농도의 아무도 세트가 없습니다. 예를 들어, 50 μM β2-마이크로글로불린 용액의 50 μL을 사용하여, 이 일반적인예(표 1)를사용하여 원하는 어어비를 보장하기 위해 최종 DEPC 농도200 μM(단백질 농도의 4배에 해당)을 위해 100m M DEPC의 0.2 μL로 단백질을 반응한다. DEPC 라벨링은2nd 차순 반응이므로 반응 혼합물에서 단백질 또는 DEPC의 농도를 변경하면 라벨링 속도가 변경됩니다. - 1M 이미다졸 용액을 10 mg의 이미다졸을 계량하고 HPLC 급 수의 146.9 μL에서 용해하여 준비하십시오.
2. 그대로 단백질의 공유 라벨링
- 수조 온도를 37°C로 설정하고 목욕이 안정적인 온도에 도달할 때까지 기다립니다.
참고: 예제 라벨링 프로토콜에 대한 시약 농도 및 볼륨은 표 1에서찾을 수 있습니다. - 새로운 미세원심분리기 튜브에서, 표 1에나열된 볼륨으로 MOPS 버퍼 및 단백질 용액을 혼합한다.
- 단백질과 완충제에 DEPC 용액의 0.2 μL을 추가하여 결과 용액을 적절히 혼합한 다음 반응 혼합물을 함유한 튜브를 37°C 수조에 1분간 배치합니다.
참고: 첨가된 ACN의 부피는 라벨링 반응 중에 단백질 구조의 혼란을 피하기 위해 총 반응량의 1%를 초과해서는 안 됩니다. 반응 시간은 사용자에게 달려 있지만, 예조건하에서 1분 반응은 과라벨과 DEPC14의잠재적 인 가수분해를 최소화한다. - 1분 후, 수조로부터 반응 혼합물을 함유한 튜브를 제거하고 1M 이미다졸 용액의 1 μL로 반응을 담금질하여 나머지 미반응 DEPC를 제거한다.
참고: 반응 혼합물에서 이미다졸의 최종 농도는 반응 혼합물에서 DEPC의 농도가 50배같아야 한다. 이렇게 하면 나머지 비반응DEPC가 폐기됩니다.
3. 상향식 LC-MS를 위한 단백질 다이제스트 준비
참고: 관심 있는 단백질에 따라 사용할 수 있는 소화 조건을 선택합니다. 일반적인 단계는 단백질을 전개하고 어떤 이황화물 결합을 감소시키고 알킬 것을 포함합니다.
- 반응 혼합물에 적절한 전개 시약을 추가하여 단백질을 펼칩니다.
참고: 일반적인 전개 제는 ACN을 포함, 우레아, 및 guanidine 염산염 (GuHCl). - Tris(2-carboxyethyl)와 요오도아세타미드(IAM)의 솔루션을 각각 5mg의 무게를 측정하고 10mM pH 7.4 MOPS 버퍼의 174.4 및 270.3 μL의 새로운 미세 센트심분리기 튜브에서 용해하여 각각 알킬 수 있는 완화를 준비한다.
- 100mM TCEP의 2μL(반응 혼합물의 최종 농도 2mM)를 반응 혼합물에 추가하고 실온에서 3분 동안 반응하여 이황화물 결합을 줄입니다.
참고: TCEP의 최종 농도는 용액에 존재하는 이황화물 결합 당 단백질 농도의 40배와 같아야 한다. - Alkylate는 어둠 속에서 30 분 동안 100 mM IAM 용액 (반응 혼합물에서 4 mMM의 최종 농도)의 4 μL로 시스테인을 감소시유증을 감소시킴니다. IAM은 빛에 민감하며 직접 조명아래에서 분해됩니다.
참고: 용액에서 IAM의 최종 농도는 TCEP에 사용되는 농도의 두 배, 또는 이황화물 결합 당 단백질 농도의 80배여야 합니다. - 트립신이나 키모트립신과 같은 적절한 효소로 단백질을 소화합니다. 37°C에서 3시간 소화를 위한 10:1 단백질:효소 비300스트로크/분의 흔들림 속도로 전형적으로 DEPC 라벨 단백질에 충분하다. 토론을 참조하십시오.
- 소화 후, 소화된 펩타이드로부터 고정화 효소를 원심분리하여 5분간 12,000rpm으로 분리한다.
- LC-MS/MS로 즉시 샘플을 분석하거나 액체 질소로 시료를 플래시 동결하여 시료 분해 및 라벨 손실을 최소화합니다. LC-MS/MS 분석을 위해 준비될 때까지 < -20°C에 플래시 냉동 샘플을 저장합니다.
4. LC-MS/MS 분석
참고: 상향식 프로테오믹스에 대한 표준 LC-MS/MS 파라미터를 사용하여 프로테오리틱 펩티드 단편의 표지된 부위를 식별할 수 있습니다. 일반적인 예는 아래에 설명되어 있습니다.
- 반전 단계 C18 고정 상을 사용하여 DEPC 표지 펩티드를 분리합니다. 2개의 용매의 전형적인 LC 이동상을 사용하십시오: (A) 물 + 0.1% 포믹산 및 (B) ACN + 0.1% 포믹산그라데이션을 사용하여 (예를 들어, 도 2)펩티드의 최상의 분리를 달성한다.
참고: 분리 시간은 샘플 복잡성에 따라 최적화될 수 있으며, 이동상 유량은 모세관 또는 나노 LC사용 여부에 따라 달라집니다. - 온라인 LC-MS 및 MS/MS를 수행할 수 있는 질량 분광계를 사용하여 펩타이드에서 DEPC 수정 부위를 식별합니다. 실험에서 우리는 여러 유형의 질량 분광계를 성공적으로 사용했습니다. LC-MS 분석 과정에서 많은 펩타이드의 MS/MS를 자동으로 수행할 수 있는 모든 질량 분광계가 적합해야 합니다. 관련 MS 매개 변수는 다음과 같습니다 : 일반 ESI에 대한 ESI 소스 전압 = -4000 V; -2000 나노 스프레이V; 궤도 랩 해상도 = 60,000; 동적 제외 기간 = 30s; MS/MS 활성화 유형: CID, ETD 또는 둘 다; 질량 스캔 범위 = 200-2,000; 자동 게인 제어 = 4.0E5 (궤도랩의 MS1) 및 5.0E4 (선형 쿼드러폴 이온 트랩의 MS2).
- LC 시스템에 소화된 라벨이 부착된 단백질 샘플을 적재하고 주입하고 LC-MS/MS 인수를 시작합니다. 샘플이 플래시-냉동된 경우 분석 전에 해동합니다. LC 유출물을 전환하여 처음 5분 동안 낭비하여 과도한 염이 ESI 소스에 들어가지 않도록 하십시오.
참고: 5 μL 주입 루프는 일반적으로 활용되어 LC-MS/MS에 약 2.5 μg의 단백질을 주입할 수 있습니다. 이는 샘플 인젝터를 막지 않도록 LC의 하중 조건에 따라 달라집니다.
5. 데이터 분석
- DEPC 라벨 사이트를 식별하고 사용되는 질량 분광계에 적합한 소프트웨어를 사용하여 펩타이드 피크 영역을 정량화합니다.
- DEPC 추가(72.02 Da) 및 카르바미도메틸화(57.02 Da)를 변수 수정으로 포함한다. MS/MS 분석에 대한 추가 검색 매개 변수는 다음과 같습니다: 최대 누락된 분열 = 3; 조각 이온 유형 = b 및 y; 전구체 m/z 공차 = 10 ppm (쿼드러폴 이온 트랩 질량 분광계를 사용하는 경우이 값은 더 높아야합니다); 단편 m/z 공차 = 0.5 Da (고해상도 질량 분광계가 제품 이온 스캔에 사용되는 경우 이 값은 낮아야 합니다); 전구체 충전 = 1-4.
참고: 다른 데이터베이스 검색 알고리즘에는 다른 채점 시스템이 있으며 수정 수준이 낮을 수 있으므로 많은 데이터베이스 검색 알고리즘이 DEPC 수정 펩티드를 식별하는 데 어려움을 가질 수 있습니다. 점수 컷오프를 조정하는 것은 더 많은 표지된 펩티드를 식별하기 위하여 필요할 수 있습니다. 그렇다면 MS/MS 데이터의 수동 심문을 사용하여 저득점 펩티드를 확인해야 합니다. DEPC 라벨의 가수분해 의 생성물은 가수분해 된 DEPC가 뉴클레오필 측 사슬에 더 이상 반응하지 않기 때문에 데이터 검색에 포함되지 않습니다. - 펩티드의 수정 및 수정되지 않은 버전의 크로마토그래픽 피크 영역을 사용하여 잔류 물 수준 수정 백분율을 결정합니다.
참고: 변형된 잔류물을 포함하는 모든 펩타이드는 고려해야 하며 포함된 모든 충전 상태는 모든 측정된 샘플에 있어야 합니다. 펩타이드는 상이이온화 효율을 가지며 다른 시기에 용출하면 이 값이 특정 부위의 수정을 절대적인 척도가 아닌 상대적으로 이시킵니다.
여기서I,z는 관심의 잔류물을 포함하는 주어진 펩티드 (i)의 피크 영역을 나타내고 모든 검출 된 전하 상태 (z)를 고려한다. - 통계 평가를 사용하여 컨트롤과 실험 샘플 간의 라벨링 변경이 유의한지 확인합니다. 각 샘플에 대한 세 가지 복제 측정은 일반적이며 t 테스트는 95 또는 99% 신뢰 구간으로 가장 일반적으로 활용됩니다.
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Representative Results
DEPC 수정 사이트 식별 및 수정 비율
공유 라벨링에 의한 질량 첨가는 (a) 그대로 단백질 및 (b) 펩티드 수준8,9에서측정될 수 있다. 그대로 수준에서, 라벨의 다른 수를 가진 단백질 종의 분포는 표지된 단백질 샘플의 직접 분석 또는 LC-MS에서 얻을 수 있다. 고해상도 구조 정보(즉, 사이트 별 라벨링 데이터)를 얻으려면 펩타이드 수준에서 측정을 수행해야 합니다. 라벨링 및 담금질 단계 후, 표지된 단백질은 상향식 프로테오믹 분석(즉, 이황화 감소, 알킬루션, 프로테오리션 소화 및 LC-MS/MS)를 받습니다. 도 3은 DEPC 표지된 부위가 어떻게 식별되고 그들의 변형 수준이 단백질 β-2-마이크로글로불린(β2m)21에대한 DEPC CL-MS 실험에 대해 계산되는지를 나타낸다. MS/MS는 표지된 펩티드를 시퀀스하고 DEPC 표지된 부위를 정확히 찾아내는 데 사용되며, 수정 비율은 추출된 이온 크로마토그램의 상대피크 영역에서 계산됩니다(그림 3A참조).
DEPC CL-MS를 이용한 단백질 표면 매핑
단백질 토폴로지와 라벨링 비율 사이의 관계 때문에 DEPC는 단백질 고차 구조(HOS)의 변화를 연구하고 단백질 상호작용 부위8,9을식별하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어 β2m의 구조에 대한 Cu(II) 결합의 효과가 있다. UNbound β2m 및 Cu(II)-바운드 β2m(b2m-Cu)로부터 펩티드 단편의 DEPC 개질 속도 계수는 DEPC 농도를 변화시키고 2차 운동 플롯14,24를생성하여 측정(표2)을측정할 수 있다. β2m-Cu의 잔류물의 DEPC 반응성은 His31, Ser33 및 Thr4에 대한 상당한 라벨링 속도 변화를 드러내며, 다른 그의 잔류물을 포함한 다른 사이트는 통계적으로 변하지 않습니다. 이들 데이터는 his31이 β2m에 있는 다른 그의 잔류물이 His31(즉, Ser33) 근처의 구조적 변화를 일으키는 데, N-terminus(즉, Thr4)(그림 4)14,26,27에가깝다는 사실과 일치한다.
HOS의 변경 사항을 식별하기 위한 DEPC CL-MS
MS 검출을 갖는 DEPC 라벨링은 또한 단백질에 HOS 변경을 특성화하기 위한 귀중한 도구이며, 이는 현재 제약 시장 중 가장 빠르게 성장하고 있는 단백질치료제(28)에중요한 영향을 미칩니다. DEPC CL은 열 및 산화스트레스(18)에따라 구조적 변화를 겪는 특정 단백질 영역을 식별할 수 있다. β2m이 열 응력에 노출된 후, 라벨링 익스텐트(N-terminus, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58)가 단백질의 한쪽에 군집되어 있어, 이러한 단백질의 영역이 변형 변화 또는 아마도미디어(5A) 응모(종교를형성하거나 미디어)를 형성한다는 것을 시사한다. 이러한 잔류물 이외에, 단백질이 산화 스트레스에 노출된 후, 라벨링이 감소하는 다른 잔류물(Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94)은 단백질의 다른 면에 클러스터를 형성하여 산화 유발 된 규형성 변화가 다른 곳에서 발생함을 나타냅니다(그림 5B). 우리 그룹의 다른 연구는 또한 DEPC CL-MS가 열 스트레스 단클론 항체 치료제(20)의형태 변화의 부위를 감지하고 식별 할 수 있음을 보여 주었다.
DEPC CL-MS는 단백질 단백질 상호 작용을 연구합니다.
단백질 단백질 상호 작용 부위 및 아밀로이드 형성 단백질을 위한 응집 인터페이스에 대한 통찰력은DEPC 라벨링9를 사용하여 얻을 수 있다. 올리고머 형성시 잔류물의 수정 수준이 감소하면 결합 인터페이스가 드러낼 수 있다. DEPC CL-MS는 충석 관련아밀로이드(29)에서아밀로이드를 형성하는 단백질인 β2m의 아밀로이드 전 올리고머를 특성화하기 위해 사용되었으며, Cu(II)15,16,26을통해 아밀로이드 형성을 시작한 후. β2m 단조량의 DEPC 반응성을 Cu(II)를 첨가한 후 2h로 형성되는 아밀로이드 β2m 디머와 비교하면 6개의 잔류물이 라벨링에 변화가 없거나 약간의 증가를 거치지 않으면서 9개의 잔류물이 라벨링이 감소하는 것을나타낸다(도 6A). β2m상에서 이러한 변화를 매핑하면, 이량계계가 β2m 단량체(도6B)15의ABED β 시트를 포함한다는 것이 즉시 명백하다.
DEPC CL-MS는 단백질 리간드 결합을 연구합니다.
단백질에 결합하는 것은 리간드와 상호 작용하는 잔류물의 용매 접근성의 감소로 이끌어 내고, DEPC 기지를 둔 CL-MS는 단백질에 리간드 결합 사이트를 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 아밀로이드 형성 조건 하에서 β2m에 대한 에미갈로케이팅친-3-갈레이트(EGCG)의 결합 부위는 EGCG 결합에 의해 묻혀있는 잔류물에서 DEPC 라벨링의 현저한 감소에 의해 식별될 수 있다. ECGC의 존재에서, Lys6 및 Lys91은 낮은 DEPC 수정 백분율(도 7)을가지고 있으며, 이러한 잔류물은 리간 결합으로 인한 잔류물 보호를 나타내는 단백질의 한 부위에 클러스터된다. 한편 N-terminus, Thr4 및 His31은 ECGC 유도 구조 변화를 나타내는 라벨링 익스텐트(도7)의증가를 겪고 있으며, β2m(N-terminus and His31)14,30,31이 ECGC의 결과로 중단될 수 있음을시사한다. 또한, β2m 아밀로이드 형성, 리파마이신 SV 및 독시사이클린의 다른 2개의 소분자 억제제의 결합 부위는 CL-MS19를사용하여 확인되었다. 그러나 이 연구에서DEPC 라벨만으로는 바인딩 부위에 충분한 구조적 해상도를 매핑하기에 충분하지 않았습니다. 3개의 다른 CL 시약, 즉 DEPC, BD 및 1-ethyl-3-(3-(디메틸아미노)의 프로필)카르보디미드-글리신 에틸 에스테르(EDC/GEE) 쌍의 결과 결합부위(19)를더 잘 찾아낼 필요가 있었다.
구조적 해상도 개선 및 라벨 스크램블링 감소
DEPC 라벨링이 공유 결합의 형성을 유발하더라도, 가수분해로 인한 라벨 손실이 발생할 수 있으며, 특히 Ser, Thr 및 Tyr 잔류물(그림8)에대해 발생할 수 있습니다. 라벨 손실은 야간 소화보다는 짧은 프로테오리스틱 소화(예를 들어, 고정 효소를 사용한 2h 소화)를 사용하여 DEPC CL 반응과 LC-MS 분석 사이의 시간을 감소시킴으로써 최소화될 수 있다. 빠른 소화로 인해 더 많이 변형된 잔류물이 측정되어 단백질 구조 정보의 양이 증가합니다. 예를 들어, 고정된 chymotrypsin을 가진 2h 소화는 지속적으로 β2m에서 더 많은 DEPC 변형 잔류물의 식별으로 이어집니다(도 9)17. β2m에서 Ser, Thr, Tyr, His 및 Lys 잔류물의 약 75%가 야간 소화를 통해 검출되지만, 라벨링과 LC-MS 사이의 시간이 2h 소화를 사용하여 감소하면 β2m에서 이러한 잔류물의 95%가 검출됩니다. 새로 발견된 수정된 잔류물의 대부분은 가수분해되기 쉬운 티르와 Thr 잔류물입니다.
DEPC와의 작업 과정에서, 우리는 일부 단백질에서, 이황화 결합에서 Cys 잔류물이 DEPC에 의해 수정된다는 것을 발견했습니다, 디설파이드 결합은 DEPC 라벨 링 반응 도중 그대로 있더라도. 이러한 Cys 잔류물의 라벨링은 무료 티올이 용액(도10)에서다른 수정된 잔류물과 반응할 수 있기 때문에 발생하며, 카베톡시 그룹이 Cys 잔류물로 옮겨짐에 따라 소위 "라벨 스크램블링"으로 이어진다. 라벨 스크램블링은 다른 잔류물에서 수정 수준을 감소시키고 잘못된 단백질 구조 정보를 제공합니다. 라벨 스크램블링을 피하기 위해 무료 Cys thiols는 이황화물 감소33직후에 완전히 알자야합니다.
그림 1: 공유 라벨 질량 분석법 (CL-MS). 단기능 시약은 용매 접근 가능한 아미노산을 수정하는 데 사용되며 단백질(상단 대 하단 이미지)에서 형성 변화 또는 상호 작용 인터페이스에 대한 사이트별 정보를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 변형된 단백질은 프로테오리티로 소화되고, 생성된 펩타이드는 MS 및 탠덤 MS(MS/MS)와 함께 액체 크로마토그래피(LC)에 의해 분석된다. 그림은 림피키라티, P., 리우, T., 바체, R. W. 계주 라벨링 질량 분광법에서 단백질 구조 및 상호 작용을 연구합니다. 방법 (144),79-93 (2018). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 사용 량(μL) | 용액 농도(μM) | |
| 단백질 (100 μM, MOPS) | 50 | 50 |
| 걸레 (10mM, pH 7.4) | 48.8 | n/a |
| DEPC (100mM) | 0.2 | 200 (=4x[단백질]) |
| 이미다졸 (1M) | 1 | 10,000 (=50x[DEPC]) |
| 총 볼륨 | 100 |
표 1. 일반 DEPC 라벨링 프로토콜.
그림 2. 펩티드 분리를 위한 예용 LC 그라데이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 DEPC 레이블이 지정된 사이트를 식별하고 수정 수준을 계산하는 방법에 대한 예시입니다. DEPC 라벨링 및 프로테오리틱 소화 후, (A) 소화된 단백질의 LC-MS 분석이 수행된다. 크로마토그램에서 (B) 라벨이 부착되지 않은 펩타이드의 피크 영역은 라벨링 백분율을 계산하는 데 사용된다. LC-MS 동안 펩타이드는 CID MS/MS. Tandem 질량 스펙트럼(D) 라벨이 부착되지 않은 및 (E) 및 (F) 특정 보존 시간에 얻어진 펩타이드 의 펩타이드 시퀀싱 및 DEPC 표지 부위의 식별에 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 찌꺼기 | b2m | b2m-Cu |
| Thr4 | 0.082 ± 0.004 | 0.052 ± 0.009 |
| His13 | 0.041 ± 0.003 | 0.033 ± 0.005 |
| His31 | 0.010 ± 0.001 | 0.003 ± 0.001 |
| 세르33 | 0.010 ± 0.002 | 0.004 ± 0.001 |
| His51 | 0.036 ± 0.003 | 0.030 ± 0.004 |
| 세르88 | 0.029 ± 0.007 | 0.020 ± 0.006 |
표 2 Cu(II)의 부재 및 존재 시 b2m에 대한 사이트별 DEPC 수정속도 계수(k,M-1s-1).
그림 4 DEPC CL-MS를 사용하여 β2m구조에 대한 Cu(II) 결합의 효과를 결정한다: (A) DEPC 라벨링 속도(blue)의 현저한 감소와 잔류물의 단백질 표면 매핑, Cu(II) 결합에 따른 용매 접근성의 변화를 나타내는, 라벨링 속도(Magenta) (PDB 액세스디온 코드 1JN)에 큰 변화가 없는 분들. (B) Cu(II)의 존재 및 부재에서 DEPC의 상이한 농도를 가진 β2m의 반응의 현장 별 2차 운동 플롯. 라벨링 속도 계수(k)는 운동 플롯의 경사로부터 얻을 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 응력 대 네이티브 β2m에 대한 공유 라벨링 결과: (A) 열 응력 - 24시간 동안 75°C및 (B) 산화 응력에서 가열 - 24h에 대한 3% H2O2. 수정 비율의 중요한 변화는 파란색(라벨링 감소) 및 빨간색(라벨링 증가)으로 표시되며, 중요한 라벨 변경 없이 잔류물은 옅은 녹색(PDB 가입 코드 1JNJ)으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 DEPC CL-MS를 사용하여 β2m의 아밀로이드 이전 이량에 대한 디머 인터페이스를 결정합니다: (A) 단조량(즉, t = 0) 및 Dimer 2 h를 첨가한 후 변형된 잔류물의 DEPC 수정 수준 변경의 요약(즉, t =0) 및 dimer 2 h를 첨가한 후( II). 라벨링 범위가 현저한 감소와 함께 잔류물은 별표(*)에 의해 표시됩니다. (B) β2m 구조상에 매핑된 공유 라벨링 결과. 라벨이 감소된 잔류물은 파란색으로 표시되며 라벨링이 변경되거나 약간의 증가없이 잔류물이 빨간색으로 표시됩니다(PDB 가입 코드 1LDS). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 EGCG 바인딩 대 언바운드 b2m에 대한 공유 라벨링 결과. 표시된 잔류물에 대해 DEPC 수정 비율이 표시됩니다. 공유 라벨링 비율의 통계적으로 유의한 차이는 별표(*)에 의해 표시됩니다. 감소가 파란색으로 표시되는 동안 ECGC 바인딩에 대한 라벨링 증가가 빨간색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 DEPC 공유 라벨링 반응(뉴클레오필아실 대체) 및 라벨 손실(카베톡시화 잔기의 가수분해)은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 β2m에서 측정된 수정 부위의 매핑. (A) 기존의 야간 소화 후 라벨이 부착된 부위, (B) 고정된 chymotrypsin을 가진 2h 소화 후 표시부위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 DEPC 라벨 스크램블링의 가설 메커니즘 (카베톡시그의 Cys 캡처) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
중요한 단계
신뢰할 수 있는 라벨링 결과를 보장하기 위해 실험 설계에 관한 몇 가지 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 단백질 라벨링을 최대화하기 위해, DEPC와 반응하고 라벨링 범위를 낮출 수 있기 때문에 강력한 뉴클레오필성 그룹(예를 들어, Tris)을 가진 완충을 피할 필요가 있다. 또한 이러한 버퍼가 라벨이 부착된 잔류물로 반응하여 라벨을 제거하여 구조 정보의 손실을 초래할 수 있다고 생각할 수 있습니다. MOPS를 버퍼로 사용하는 것이 좋지만 인산염 완충식식염도 작동합니다. 둘째, 디티오트리톨은 이 시약의 프리 티올이 라벨이 부착된 잔류물로 반응하고 DEPC 수정을 제거할 수 있기 때문에 이황화물 결합의 감소를 피해야 한다. 이 같은 화학은 무료 Cys가 단백질 내 라벨 스크램블링33을일으킬 수 있기 때문에 감소 된 이황화물을 알킬 하는 것이 필수적입니다. 셋째, imidazole를 가진 담금질 단계(Protocol step 2.4)는 라벨링 반응을 중지하는 데 매우 중요하므로 나머지 DEPC는 단백질과 계속 반응할 수 없습니다.
DEPC 라벨링 반응이2nd 순서라는 것을 인정하는 것도 중요하며, 이는 단백질 또는 DEPC 농도를 변경하는 것이 라벨링 정도에 영향을 미친다는 것을 의미합니다. 우리는 경험적으로 4:1 DEPC:단백질 농도 비율이 단백질이 10의 μM 범위에 농도가 있을 때 합리적인 값임을 발견했습니다, 어떤 라벨 유도 구조 변경을 피하기 위하여 경향이 있기 때문에14. 그러나, 최적의 DEPC:단백질 농도 비율은 단백질에 의존적일 뿐만 아니라 농도에 의존하며, 일부 단백질은 충분한 라벨링을 달성하기 위해 더 높은 비율을 요구합니다. 주어진 단백질 라벨링의 구조적 혼란을 최소화하기 위한 최적의 DEPC 농도는 용매의 수로부터 추정될 수 있다.그의 및 리시잔기(23).
시간이 지남에 따른 시약 저하로 인한 라벨링 정도의 가변성을 방지하려면 제어 및 실험 반응이 같은 날에 이상적으로 수행되어야 합니다. DEPC는 물에 노출되면 급속한 가수 분해를 거치며 저장 중에도 저하되므로 좋은 실험실 실습 및 시약 처리가 중요합니다. 사용하지 않을 때는 DEPC 스톡 병을 건조기에 보관해야 합니다.
수정 및 문제 해결
DEPC CL은 기네틱 대조 반응이기 때문에, 라벨링 속도, 따라서 변형 수준은 단백질 및 시약 농도, 라벨링 시간 및 온도에 의해 제어된다. 위에서 나타낸 바와 같이, 종종 DEPC CL은 DEPC대 단백질 어어비를 4 대 1로 37°C에서 1분 동안 수행한다. 이 어어 비(4x)에서 단백질은 구조적 동요 없이 안전하게 표지될 수있다(14). DEPC:4보다 큰 단백질 어금니비는 일부 단백질에 사용될 수 있으며, 놀라울 정도로 높은 DEPC 농도는 더 광범위한 라벨링과 더 많은 구조적 정보를 초래합니다. 구조가 위축되지 않고 더 높은 DEPC 농도를 사용하는 가장 안전한 방법은 단백질의 프로테오리틱 단편의 반응성을 DEPC 농도의 함수로 측정하는 용량 반응 플롯을 생성하는 것이다(도 4B참조)14,24. 그러나 이 방법은 여러 측정이 필요하기 때문에 시간이 많이 걸릴 수 있습니다. 최근에는 최적의 DEPC 농도가단백질(23)에서그의 및 리스 잔류물의 수와 SASA로부터 주어진 단백질을 추정할 수 있음을 입증했다. 최근 작업에서, 우리는 또한 단백질의 구조가 CL9,24 도중 방해되지 않는다는 것을 평가하는 다른 쪽을건의했습니다.
프로테오리컬 소화는 또한 DEPC CL-MS에서 중요한 단계이며, 생성된 펩타이드는 LC-MS/MS 분석 후 구조 정보를 국소화할 수 있게 한다. 일반적으로 트립신과 키모트립신과 같은 세린 프로테아제는 단백질 소화에 효과적입니다. 트립신은 Lys 및 Arg 잔류물의 C 단말 측에서 의 분열 효율과 특이성으로 인해 더 일반적으로 사용됩니다. 그러나 트립신은 일반적으로 DEPC 라벨이 부착된 Lys 잔류물 후에 갈라지지 않으므로 때로는 데이터 분석을 복잡하게 만들 수 있는 레이블이 부착된 Lys 잔류물에서 절단이 누락됩니다. 부피가 큰 소수성 잔류물 후에 갈라지는 chymotrypsin의 활동은, 일반적으로 DEPC 라벨링에 의해 영향을 받지 않습니다, 그러나 이 효소는 트립신 보다는 더 낮은 분열 효율 및 특이성을 가지고 있습니다. 또한, 수많은 소수성 잔류물을 가진 단백질의 경우, chymotrypsin은 표준 LC-MS 조건하에서 분리되고 검출하기 어려울 수 있는 몇 가지 짧은 펩타이드 단편을 생성할 수 있다.
단백질 다이제스트의 LC-ESI-MS/MS 분석은 신뢰할 수 있는 반정성 결과를 얻기 위해 안정적인 전기 스프레이가 필요합니다. 모세관 및 나노 LC는 일반적으로 소량의 단백질로 효율적인 분리를 얻을 수 있는 분리 플랫폼을 사용합니다. 그러나, 우리의 경험에서, 모세관 LC는 사용되는 높은 샘플 양 때문에 나노 LC보다 더 신뢰할 수있는 정량 정보 (즉, 수정 수준)를 제공합니다. 많은 수의 표지및 라벨이 없는 펩타이드로 소화되는 큰 단백질의 경우, 유사한 소수성으로 펩티드의 응용이 발생할 수 있습니다. 이러한 경우 더 나은 분리를 위해 더 긴 LC 그라데이션을 사용해야 합니다.
빠르고 효율적인 MS/MS는 좋은 시퀀스 커버리지 및 라벨 사이트 식별에 중요합니다. 쿼드러폴 이온 트랩이 있는 질량 분광계는 이 목적을 위한 훌륭한 도구입니다. 일반적으로 CID는 펩타이드 해리를 위한 일반적이고 매우 효과적인 방법입니다. 그러나, 우리는 라벨 펩티드 이온의 CID 동안 스크램블링 DEPC 라벨의 경우를 관찰했다, 라벨 사이트 ID에 모호성의 결과(34. 이러한 다소 드문 경우에서 ETD는 보다 신뢰할 수 있는 정보를 제공합니다. 따라서 가능하면 두 해리 기술을 번갈아 가며 하는 것이 도움이 될 수 있습니다. DEPC는 많은 상이한 잔류물 유형에 라벨을 붙일 수 있기 때문에, 주어진 펩티드 단편의 이좀러가 변형되는 사이드 체인에서 다른 것으로 생성되는 것이 일반적이다. 여러 번, 이러한 펩티드 이소머스는 LC에 의해 분리 될 수 있습니다, 그들은 매우 유사한 시간에 elute 하는 경향이 있지만. 자동화된 LC-MS/MS 분석 중에 MS/MS 제외 시간을 설정할 때 이 가능성을 고려해야 합니다. 일반적으로 평소보다 짧은 제외 시간을 사용해야 합니다.
제한
DEPC CL-MS는 단백질 구조와 상호 작용을 연구하는 데 대단히 유익하며 다양한 단백질 시스템을 해결하기 위해 상당한 진전이 있었지만이 기술의 몇 가지 제한은 남아 있습니다. 라벨링 조건이 잘 최적화되지 않은 경우(예를 들어, DEPC의 농도가 너무 높음) 과라벨링을 통해 단백질 구조를 왜곡하고 부정확한 구조 정보를 초래할 수있다(14,23,24). 또한, 측정된 수정 레벨의 정확성과 정밀도는 화학 라벨링 단계에서 LC-MS 분석 및 오류 전에 샘플이 너무 오래 앉아 있는 경우 라벨 손실을 포함한 여러 요인에 의해 영향을 받습니다. 각 실험 단계의 일관성은 신뢰할 수 있는 결과를 위해 중요합니다. 현재 DEPC 기반 CL-MS와 관련된 가장 어려운 문제 중 하나는 데이터 분석 소프트웨어입니다. 쉽게 사용할 수 있는 데이터 분석 프로그램은 낮은 수정 비율(예: < 1%)으로 펩티드를 성공적으로 식별하도록 최적화되지 않습니다. 따라서, 우리는 개발 및 쉽게 식별 할 수있는 낮은 수정 수준을 가진 펩티드를 가능하게하기 위해 전문 소프트웨어를 사용했다18.
DEPC CL-MS는 적당한 단백질 구조 적 해상도를 제공할 수 있더라도, 상세한 3D 구조는 라벨링 기술에서 얻을 수 없습니다. 최근에는 라벨링 데이터를 기반으로 한 일부 구조적 예측 도구가35,36으로개발되었다. 그러나, 단백질 구조를 예측하기 위해 전산 모델링과 DEPC 라벨링 결과를 최적으로 통합하기 위해 더 많은 개발이 필요합니다.
대체 방법에 비해 중요성
DEPC 기반 CL-MS로 가능한 구조적 해상도는 X선 결정학 또는 NMR과 같은 기술과 비교할 때 적당하므로 기술을 HDX-MS, XL-MS 및 기타 CL-MS 또는 발자국 접근 방식과 비교하는 것이 가장 적합합니다. 소개에서 언급한 바와 같이, CL-MS는 단백질에 잔류물의 측면 사슬에 대한 정보를 제공하기 때문에 HDX-MS에 보완적인 반면, HDX-MS는 백본 구조와 역학에 대해 보고합니다. 이러한 상호 보완성을 통해 여러군(37) 38,39,40,41에의해 나타난 바와 같이 두 기술을 함께 사용하여 더 많은 구조적 정보를 얻을 수 있다. DEPC 기반 CL-MS와 관련된 새로운 아이디어는 HDX-MS22와함께 사용할 때 사용할 수 있는 시너지 정보입니다. 두 기술과 관련된 라벨링 기간 때문에 DEPC 기반 CL-MS는 종종 감소 된 HDX를 겪는 단백질 영역과의 모호성을 명확히 할 수 있습니다. 감소된 HDX는 결합 또는 단백질 역학 감소로 인한 용매 접근성 감소로 인해 발생할 수 있습니다. DEPC 반응은 본질적으로 HDX 반응보다 2-3 배 느리기 때문에 DEPC 라벨링은 용매 접근성의 변화를 동반하지 않는 한 단백질 역학의 변화에 크게 영향을 받지 않습니다.
CL-MS는 적절한 예방 조치를 취할 때 레이블 스크램블링 및 라벨 손실이 최소화된다는 점에서 HDX-MS 실험에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. HDX 실험에서 라벨 손실 또는 백 교환은 기술의 표준 기능이며, 낮은 pH에서 빠른 소화 및 LC 분리는 이 문제를 최소화하기 위한 시도이다. 그러나 백 교환 문제는 일반적으로 HDX-MS에서 측정되는 라벨이 붙은 사이트의 수가 많을수록 균형을 이룹니다는 것을 인식하는 것이 중요합니다. 잘못된 정보를 얻을 수 있으므로 이러한 문제를 최소화하기 위해 분석 조건을 최적화해야 하므로 HDX-MS에서 라벨링 레이블지정이 더 큰 문제입니다.
XL-MS와 CL-MS는 모두 소화 및 LC-MS 분석 중에 남아 있을 만큼 견고한 공유 결합의 형성을 포함하기 때문에 라벨 손실 및 스크램블링과 관련하여 유사한 이점을 가지고 있습니다. 그러나 상호 연결된 펩타이드의 시퀀싱 및 식별은 전문 소프트웨어의 사용을 요구하는 공유 라벨펩타이드보다 더 어렵습니다. XL-MS가 CL-MS에 비해 가지고 있는 한 가지 주요 장점은 가능한 단백질 구조를 예측하거나 축소할 때 가치가 있는 거리 제약조건을 제공하는 능력입니다. CL-MS 데이터는 단백질 구조 예측을 용이하게 하기 위해 사용되어 왔다36,42,43,하지만이 지역은 완전히 그것의 잠재력에 도달하기 위해 더 많은 작업이 필요합니다.
특정 또는 비특이적 라벨링 시약을 사용하는 것을 포함하여 다른 CL-MS 방법과 비교할 때 DEPC는 몇 가지 장점과 단점이 있습니다. 아미노산 특정 시약을 사용하는 방법과 마찬가지로 DEPC 라벨링은 간단합니다. 시약은 관심 있는 샘플에만 추가해야 합니다. 이 단순성은 단백질(FPOP) 또는 하이드록실 라디칼을 생산하기 위해 정교한 광원을 필요로 하는 싱크로트론 기반 HRF의 빠른 광화학 적 산화와 같은 방법과 대조됩니다. 특정 시약을 사용하는 방법과 달리 DEPC는 6가지 아미노산과 N-terminus에 라벨을 부착하여 더 높은 구조적 분해능을 제공할 수 있습니다. 그러나 DEPC에 의해 표지될 수 있는 잔류물의 수는 하이드록실 라디칼에 의해 산화될 수 있는 수보다 적기 때문에 DEPC 기반 CL-MS에 의해 얻을 수 있는 구조적 분해능은 낮다. DEPC에 의해 표시되는 잔류물의 한 가지 실질적인 파급 효과는 시약을 사용하는 것이 때때로 원하는 모든 구조 정보를 제공하지 않으므로 다른 라벨링 시약과 함께 사용되는 것이 유익할 수 있다는 것입니다. 최근에는 시약 쌍 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)와 함께 DEPC를 사용하는 가치를 입증했습니다(3-디메틸아미노프로필)카르보디미드(EDC)/글리신 에틸 에테르(GEE),글루타메이트 및 아스파르타테 잔류물19에라벨을 부착할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 그랜트 R01 GM075092에서 건강의 국립 연구소 (NIH)의 지원을 인정합니다. 여기에 설명된 데이터 중 일부를 취득하는 데 사용되는 열 궤도 랩 퓨전 질량 분광계는 국립 보건 원 보조금 S10OD010645의 기금으로 획득되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
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