Summary
De experimentella förfarandena för att utföra diethylpyrocarbonate-baserade kovalement märkning med massa spektroskopisk detektion beskrivs. Diethylpyrocarbonat blandas helt enkelt med protein- eller proteinkomplexet av intresse, vilket leder till modifiering av lösningsmedelskomliga aminosyrarester. De modifierade resterna kan identifieras efter proteolytisk matsmältning och vätskekromatografi/masspektrometrianalys.
Abstract
Att karakterisera ett proteins högre ordningsstruktur är avgörande för att förstå dess funktion. Masspektrometri (MS) har dykt upp som ett kraftfullt verktyg för detta ändamål, särskilt för proteinsystem som är svåra att studera med traditionella metoder. För att studera ett proteins struktur av MS utförs specifika kemiska reaktioner i en lösning som kodar ett proteins strukturella information i sin massa. Ett särskilt effektivt tillvägagångssätt är att använda reagenser som kovalent modifierar lösningsmedel tillgängliga aminosyra sidokedjor. Dessa reaktioner leder till massökningar som kan lokaliseras med restnivåupplösning i kombination med proteolytisk matsmältning och tandemmasspektrometri. Här beskriver vi protokollen i samband med användning av diethylpyrocarbonat (DEPC) som ett kovallt märkningsreagens tillsammans med MS-detektion. DEPC är en mycket elektrofil molekyl som kan märka upp till 30% av resterna i det genomsnittliga proteinet, vilket ger utmärkt strukturell upplösning. DEPC har framgångsrikt använts tillsammans med MS för att erhålla strukturell information för små endomänproteiner, såsom β2-mikroglobulin, till stora multidomänproteiner, såsom monoklonala antikroppar.
Introduction
Proteiner är viktiga biomolekyler i praktiskt taget alla fysiologiska processer. De olika funktioner som proteiner utför är möjliga på grund av de strukturer de antar och de interaktioner som de har med andra biomolekyler. För att förstå proteinfunktionen på en djupare nivå behövs biokemiska och biofysiska verktyg för att belysa dessa viktiga strukturella egenskaper och interaktioner. Traditionellt har röntgenkristallografi, kryogen elektronmikroskopi och kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) gett önskad detalj på atomnivå för att avslöja proteinstrukturen. Många proteinsystem kan dock inte förhöras av dessa tekniker på grund av dåligt kristalliseringsbeteende, begränsad proteintillgänglighet, överdriven prov heterogenitet eller molekylär vikt begränsningar. Följaktligen har nyare analysmetoder dykt upp som övervinner dessa begränsningar. Bland de framväxande teknikerna som kan ge proteinstrukturinformation är masspektrometri.
Masspektrometri (MS) mäter en molekyls massa-till-laddning (m/z) förhållande, så protein högre ordning strukturell information måste erhållas genom kodning av önskad strukturell information i proteinets massa. Flera metoder för att koda denna information har utvecklats, inklusive vätedeuteriumutbyte (HDX)1,2,3,4, kemisk korslänkning (XL)5,6och kovamerad märkning (CL)7,8,9,10. I HDX utbyts ryggraden bland väten av något mer massiva deuteriums i takt som är beroende av lösningsmedelstillgänglighet och H-bindningsgrad. Omfattningen av HDX kan lokaliseras genom att snabbt smälta proteinet i peptidfragment innan dessa fragment separeras och mäts med masspektrometern eller genom att proteinet dissocieras i ett uppifrån och ned-experiment. Att bestämma växelkursen ger ytterligare insikt i proteindynamiken. HDX har visat sig vara ett värdefullt verktyg för att karakterisera proteinstrukturen trots utmaningar i samband med back exchange och behovet av specialiserad utrustning för att maximera reproducerbarheten. I XL-MS reageras proteiner med bifunktionella reagenser som kovavrätt kopplar samman intilliggande rester sidokedjor inom ett visst protein eller mellan två proteiner. På så sätt kan XL-MS ge avståndsbegränsningar som kan användas för att karakterisera proteinstrukturen. De regioner av proteinet som är korslänkade kan identifieras genom proteolytisk matsmältning följt av flytande kromatografi (LC)-MS analys. Medan XL-MS är ett mångsidigt verktyg som har använts för att studera en mängd olika proteinkomplex, inklusive inuti celler, är identifiering av XL-produkterna utmanande och kräver specialiserad programvara.
CL-MS har nyligen dykt upp som ett kompletterande och ibland alternativt MS-baserat verktyg för att studera proteinstruktur och interaktioner. I CL-MS modifieras ett protein- eller proteinkomplex kovaly med ett monofunktionellt reagens som kan reagera med lösningsmedelsexponerade sidokedjor (figur 1). Genom att jämföra modifierings utsträckningerna av ett protein- eller proteinkomplex under olika förhållanden kan konformationsförändringar, bindningsställen och proteinproteingränssnitt avslöjas. Efter CL-reaktionen kan platsspecifik information, ofta på en enda aminosyranivå, erhållas med typiska proteomiska arbetsflöden nedifrån och upp där proteiner proteolytiskt smälts, peptidfragment separeras av LC och modifierade platser identifieras med tandem MS (MS/MS). Biokonjugatkemins rika historia har gjort många reagenser tillgängliga för CL-MS-experiment. CL-reagenser tillhör två allmänna kategorier: i) specifika och ii) icke-specifika. Specifika reagenser reagerar med en enda funktionell grupp (t.ex. fria aminer)8,10 och är lätta att genomföra, men de tenderar att ge begränsad strukturell information. Icke-specifika reagenser reagerar med ett brett spektrum av sidokedjor, men kräver ofta specialiserad utrustning som lasrar eller synkrotronkällor för att producera dessa mycket reaktiva arter. Hydroxylradikaler är det vanligaste icke-specifika reagenset, efter att ha applicerats i hydroxylradikala fotavtryck (HRF)7,11,12,13 experiment för att studera ett brett spektrum av proteiner och proteinkomplex under en mängd olika förhållanden.
Vår forskargrupp har framgångsrikt använt ett annat relativt icke-specifikt reagens som kallas diethylpyrocarbonat (DEPC) för att studera proteinstruktur och interaktioner i samband med CL-MS-experiment14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC erbjuder enkelheten hos specifika märkningsreagenser (dvs. ingen specialiserad utrustning är nödvändig för att utföra reaktionerna), samtidigt som den reagerar med upp till 30% aminosyror i det genomsnittliga proteinet. Som ett mycket elektrofilt reagens kan DEPC reagera med N-ändstationen och de nukleofila sidokedjorna cystein, histidin, lysin, tyrosin, serin och treoninrester. Vanligtvis genereras en enda produkt av dessa reaktioner, vilket resulterar i en massökning på 72,02 Da. Denna enda typ av produkt står i kontrast till de upp till 55 olika produkter som kan produceras när proteiner reagerar med hydroxylradikaler7. Sådan enkel kemi underlättar identifiering av märkta platser.
Här tillhandahåller vi protokoll för att använda DEPC-baserade CL-MS för att studera proteinstruktur och interaktioner. Detaljer i samband med reagenspreparat, DEPC- proteinreaktioner, proteinsammanfattning, LC-MS- och MS/MS-parametrar samt dataanalys beskrivs. Vi demonstrerar också nyttan av DEPC-märkning genom att tillhandahålla exempelresultat från protein-metall- och protein-ligand- och proteinproteininteraktioner samt proteiner som genomgår strukturella förändringar vid uppvärmning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protein- och reagensberedning
Det här protokollet innehåller ett exempelarbetsflöde för att märka ett protein med DEPC. Vissa tillstånd och reagenskoncentrationer som listas kan variera beroende på vilket protein som väljers.
- Förbered alla reagenslösningar i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Förbered en proteinlösning med önskad koncentration, vanligtvis i intervallet tiotals μM, i en 10 mM 3-(N-morpholino)propansulfonsyrabuffert (MOPS) vid pH 7.4. Alternativt bereda en befintlig proteinlösning med 10 mM pH 7,4 MOPS om provet innehåller en nukleofilibuffert som skulle vara reaktiv med DEPC. Andra buffertar (t.ex. fosfatbuffrad saltlösning) kan också användas, så länge de inte har nukleofila funktionella grupper.
- Förbered en 100 mM DEPC-lösning i torr acetonitril (ACN) genom att pipetting 1,45 μL av beståndet 6,9 M DEPC-lösning till 98,55 μL av ACN.
OBS: Det finns ingen uppsättning koncentrationer som fungerar med varje protein, även om de optimala koncentrationerna kan uppskattas baserat på antalet Hans och Lys rester23. Med 50 μL av en 50 μM β2-mikroglobulinlösning reagerar du till exempel proteinet med 0,2 μL av depc på 100 mM för en slutlig DEPC-koncentration på 200 μM (lika med 4x proteinkoncentrationen) för att säkerställa önskat molarförhållande med detta allmänna exempel (tabell 1). DEPC-märkning är en2: a ordningens reaktion, så att ändra antingen koncentrationen av protein eller DEPC i reaktionsblandningen kommer att ändra märkningshastigheten. - Förbered 1 M imidazollösning genom att väga ut 10 mg imidazol och lösa upp i 146,9 μL HPLC-vatten.
2. Kovam märkning av intakt protein
- Ställ in vattenbadtemperaturen på 37 °C och vänta tills badet når en stabil temperatur.
ANMÄRKNING: Reagenskoncentrationer och volymer för ett exempel på märkningsprotokoll finns i tabell 1. - Blanda MOPS-buffert och proteinlösning i de volymer som anges i tabell 1i ett nytt mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 0,2 μL av DEPC-lösningen till proteinet och bufferten, se till att den resulterande lösningen blandas ordentligt och placera sedan röret som innehåller reaktionsblandningen i vattenbadet på 37 °C i 1 minut.
OBS: Volymen acn som tillsätts bör inte överstiga 1% av den totala reaktionsvolymen för att undvika stör av proteinets struktur under märkningsreaktionen. Reaktionstiden är upp till användaren, även om en 1 minuters reaktion under exempelförhållandena minimerar övermärkning och den potentiella hydrolysen av DEPC14. - Efter 1 minut, ta bort röret som innehåller reaktionsblandningen från vattenbadet och släcka reaktionen med 1 μL av 1 M imidazollösningen för att rensa den återstående oredovisade DEPC.
OBS: Den slutliga koncentrationen av imidazol i reaktionsblandningen bör motsvara 50x koncentrationen av DEPC i reaktionsblandningen. Detta säkerställer att återstående oredovisade DEPC rensas.
3. Beredning av proteinsmälta för nedifrån och upp LC-MS
OBS: Välj matsmältningsförhållanden som är mottagliga för proteinet av intresse. Vanliga steg är att utveckla proteinet och minska och alkylera eventuella disulfidbindningar.
- Veckla ut proteinet genom att tillsätta ett lämpligt utfällbar reagens till reaktionsblandningen.
OBS: Vanliga utfällningsmedel inkluderar ACN, urea och guanidinhydroklorid (GuHCl). - Bered lösningar av Tris(2-karboxetyl)fosfin (TCEP) och jodväxtamid (IAM) genom att väga ut 5 mg vardera och lösa upp dem i nya mikrocentrifugrör i 174,4 respektive 270,3 μL 10 mM pH 7,4 MOPS-buffert för reduktions- och alkyleringssteg.
- Minska disulfidbindningarna genom att tillsätta 2 μL av 100 mM TCEP-lösningen (slutlig koncentration på 2 mM i reaktionsblandning) till reaktionsblandningen och reagera i 3 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Den slutliga koncentrationen av TCEP bör motsvara 40x proteinkoncentrationen per disulfidbindning som finns i lösningen. - Alkylat minskade cysteiner med 4 μL av 100 mM IAM-lösningen (slutlig koncentration på 4 mM i reaktionsblandning) i 30 minuter i mörker. IAM är ljuskänsligt och bryts ned under direkt ljus.
OBS: Den slutliga koncentrationen av IAM i lösning bör vara dubbelt så hög koncentration som används för TCEP, eller 80x proteinkoncentrationen per disulfidbindning. - Smält proteinet med ett lämpligt enzym som trypsin eller chymotrypsin. Ett 10:1 protein:enzymförhållande för en 3-timmars matsmältning vid 37 °C med immobiliserat enzym med en skakningshastighet på 300 slag/min är vanligtvis tillräckligt för DEPC-märkta proteiner. Se Diskussion.
- Efter matsmältningen separera det immobiliserade enzymet från de smälta peptiderna genom centrifugation vid 12 000 varv/min i 5 minuter.
- Analysera provet omedelbart med LC-MS/MS eller blixtfrys provet med flytande kväve för att minimera provnedbrytning och etikettförlust. Förvara de blixtfrysta proverna < -20 °C tills de är klara för LC-MS/MS-analys.
4. Analys av LC-MS/MS
OBS: Standard LC-MS/MS parametrar för bottom-up proteomics kan användas för att identifiera märkta platser på proteolytiska peptid fragment. Ett allmänt exempel beskrivs nedan.
- Separera de DEPC-märkta peptiderna med en stationär fas C18 i omvänd fas. Använd en typisk LC-mobilfas av två lösningsmedel: (A) vatten + 0,1% myrsyra och (B) ACN + 0,1% myrsyra med hjälp av en lutning (t.ex. figur 2)för att uppnå bästa möjliga separation av peptider.
OBS: Separationstiden kan optimeras baserat på provkomplexitet, och mobilfasflödet beror på om kapillär- eller nano-LC används. - Använd en masspektrometer som kan göra online LC-MS och MS/MS för att identifiera DEPC-modifieringsplatser på peptiden. I våra experiment har vi framgångsrikt använt flera typer av masspektrometrar. Alla masspektrometer som automatiskt kan utföra MS/MS av många peptider under en LC-MS-analys bör vara lämpliga. Relevanta MS-parametrar inkluderar: ESI-källspänning = -4000 V för vanlig ESI; -2000 V för nanospray; Orbitrap upplösning = 60,000; Dynamisk uteslutningslängd = 30 s; Aktiveringstyp för MS/MS: CID, ETD eller båda; Massskanningsintervall = 200-2 000; Automatisk förstärkningskontroll = 4,0E5 (MS1 i Orbitrap) och 5,0E4 (MS2 i linjär fyrdubbel jonfälla).
- Ladda och injicera det smälta, märkta proteinprovet i LC-systemet och starta förvärvet av LC-MS/MS. Om provet har blixtfrysts, tina före analys. Avled LC-utflödet till avfall under de första 5 minuterna för att undvika att alltför stora salter kommer in i ESI-källan.
OBS: En injektionsslinga på 5 μL används i allmänhet, vilket möjliggör injektion av cirka 2,5 μg protein till LC-MS/MS. Detta beror på belastningsförhållandena för LC för att inte täppa till provinjektorn.
5. Dataanalys
- Identifiera DEPC-etikettplatser och kvantifiera peptidtoppar med lämplig programvara för den masspektrometer som används.
- Inkludera DEPC-tillägg (72,02 Da) och karbamidetylering (57,02 Da) som variabla modifieringar. Ytterligare sökparametrar för MS/MS-analysen är följande: Maximalt antal missade klyftor = 3; Fragmentjontyper = b och y; Prekursor m/z tolerans = 10 ppm (detta värde bör vara högre om en fyrdubbel jonfälla massa spektrometer används); Fragment m/z tolerans = 0,5 Da (detta värde bör vara lägre om en högupplöst masspektrometer används för en produktjonskanning); Prekursorladdning = 1-4.
OBS: Olika databassökningsalgoritmer har olika poängsystem, och många kan ha svårt att identifiera DEPC-modifierade peptider eftersom modifieringsnivåerna kan vara låga. Justering av poängsnittet kan vara nödvändigt för att identifiera mer märkta peptider. I så fall bör manuella förhör av MS/MS-data användas för att verifiera lågpoängspeptider. Produkten av hydrolysen av DEPC-etiketten ingår inte i datasökningen eftersom den hydrolyserade DEPC inte längre är reaktiv mot nukleofila sidokedjor. - Bestäm ändringsprocenten på restnivå med hjälp av de kromatografiska toppområdena i de modifierade och omodifierade versionerna av peptiderna.
OBS: Alla peptider som innehåller de modifierade resterna av intresse måste beaktas och alla laddningsstater som ingår måste finnas i alla uppmätta prover. Peptider med olika joniseringseffektivitet och eluering vid olika tidpunkter gör att detta värde är ett relativt snarare än absolut mått på modifieringen av en viss plats.
där Ai,z representerar toppareal för en given peptid (i) som innehåller rester av intresse och tar hänsyn till alla upptäckta laddningsstater (z). - Bestäm om en märkningsändring mellan ett kontroll- och experimentellt prov är signifikant med hjälp av statistisk utvärdering. Tre replikamätningar för varje prov är typiska, och t-tester används oftast med 95 eller 99% konfidensintervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifiera platser för ändring av tilläggsskydd och ändringsprocent
Masstillskott på grund av kovalsmärkning kan mätas vid a) intakt protein och (b) peptidnivåer8,9. På intakt nivå kan en fördelning av proteinarter med olika antal etiketter erhållas genom direkt analys eller LC-MS av märkta proteinprover. För att erhålla strukturell information med högre upplösning (dvs. platsspecifika märkningsdata) måste mätningar utföras på peptidnivå. Efter märknings- och släckningsstegen utsätts de märkta proteinerna för proteomisk analys nedifrån och upp (dvs. disulfidreduktion, alkylering, proteolytisk matsmältning och LC-MS/MS). Figur 3 visar hur dePC-märkta platserna identifieras och deras modifieringsnivåer beräknas för ett DEPC CL-MS-experiment på proteinet β-2-mikroglobulin (β2m)21. MS/MS används för att sekvensera de märkta peptiderna och fastställa deras DEPC-märkta platser, medan ändringsprocenten beräknas från deras relativa toppområden i extraherade jonkromatogram (se figur 3A).
Kartläggning av proteinytan med DEPC CL-MS
På grund av förhållandet mellan proteintopologi och märkningshastighet har DEPC använts för att studera förändringar i proteinstrukturen med högre ordning (HOS) och identifiera proteininteraktionsplatser8,9. Ett exempel är effekten av Cu(II) bindning på strukturen av β2m. DEPC-ändringshastighetskoefficienter för peptidfragment från obundna β2m och Cu(II)-bundna β2m (b2m-Cu) kan mätas(tabell 2)genom varierande DEPC-koncentrationer och generering av andra ordningens kinetiskatomter 14,24. DEPC-reaktiviteten hos rester i β2m-Cu avslöjar betydande märkningshastighetsförändringar för His31, Ser33 och Thr4, medan andra platser, inklusive olika hans rester, är statistiskt oförändrade. Dessa uppgifter överensstämmer med det faktum att His31, men inte andra hans rester i β2m, binder Cu orsakar strukturella förändringar nära His31 (dvs. Ser33) och nära N-ändstationen (dvs. Thr4) (Figur 4)14,26,27.
DEPC CL-MS för identifiering av förändringar i HOS
DEPC-märkning med MS-detektion är också ett värdefullt verktyg för att karakterisera HOS-förändringar av proteiner, vilket har viktiga konsekvenser för proteinterapier, som för närvarande är det snabbast växande segmentet på läkemedelsmarknaden28. DEPC CL kan identifiera specifika proteinregioner som genomgår strukturella förändringar vid termisk och oxidativ stress18. Efter att β2m utsatts för värmestress, är många rester som genomgår betydande minskningar av märkningsgrader (N-ändstation, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58) grupperade på ena sidan av proteinet, vilket tyder på att denna region av proteinet genomgår en konformationsförändring eller eventuellt förmedlar aggregering (Figur 5A). Utöver dessa rester bildar andra rester med en minskning av märkningen (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94, Lys94) ett kluster på ett annat ansikte av proteinet, vilket indikerar att de oxidationsinducerade konformationsförändringarna inträffar någon annanstans (figur 5B). Annat arbete från vår grupp har också visat att DEPC CL-MS kan upptäcka och identifiera platser för konformationsförändringar i värmestressade monoklonala antikroppsterapier20.
DEPC CL-MS studerar proteinproteininteraktioner
Insikt i protein-protein interaktion platser och aggregering gränssnitt för amyloid-bilda proteiner kan erhållas med hjälp av DEPC märkning samt9. Minskningar av ändringsnivåerna av rester vid oligomerbildning kan avslöja bindningsgränssnitten. DEPC CL-MS användes för att karakterisera pre-amyloid oligomers av β2m, som är proteinet som bildar amyloider i dialys-relaterade amyloidos29, efter att ha initierat amyloid bildas med Cu(II)15,16,26. Att jämföra β2m monomerens dePC-reaktivitet med den pre-amyloid β2m dimer som bildas 2 timmar efter tillsats av Cu II visar att nio resthalter genomgår minskningar av märkningen medan sex rester inte genomgår någon förändring eller liten ökning av märkningen (figur 6A). När dessa ändringar kartläggs på β2m är det omedelbart uppenbart att dimergränssnittet omfattar ABED β-ark av β2m monomerer (Figur 6B)15.
DEPC CL-MS studerar protein-ligand bindning
Ligandbindning till proteiner leder till minskad tillgängligheten för lösningsmedel för rester som interagerar med ligand, och DEPC-baserade CL-MS kan användas för att identifiera ligand-bindande platser på proteiner. Till exempel kan de bindande platserna för epigallocatechin-3-gallat (EGCG) på β2m under amyloidbildande förhållanden identifieras genom betydande minskningar av DEPC-märkning vid resthalterna som begravs av EGCG-bindning. I närvaro av EKGC har Lys6 och Lys91 lägre depc-ändringsprocent (figur 7), och dessa resthalter är grupperade i en region av proteinet, vilket indikerar restskydd på grund av ligandbindning. N-ändstationen, Thr4 och His31 genomgår under tiden ökningar av märknings omfattningar (figur 7), som är vägledande för EKGC-inducerade strukturella förändringar och föreslår att Cu(II) bindande platser på β2m (N-ändstation och His31)14,30,31 kan störas till följd av ECGCbindande 32. Dessutom har bindningsställena för de andra två småmolekylshämmarna av β2m amyloidbildning, rifamycin SV och doxycyklin, identifierats med CL-MS19. I denna studie var dock resultaten enbart av MÄRKNINGen av depc inte tillräckliga för att kartlägga de bindande områdena med tillräcklig strukturell upplösning. Resultat från tre olika CL-reagenser, nämligen DEPC, BD och 1-etyl-3-(3-(dimetyllamino)propyl)karbodiimid - glycinetylester (EDC/GEE) par var nödvändiga för att bättre fastställabindningsställena 19.
Förbättra strukturupplösningen och minska etikettröra
Även om DEPC-märkning orsakar bildandet av en kovalent bindning, kan etikettförlust på grund av hydrolys uppstå, särskilt för Ser, Thr och Tyr rester (Figur 8). Etikettförlust kan minimeras genom att minska tiden mellan DEPC CL-reaktion och LC-MS-analys med korta proteolytiska matsmältningar (t.ex. 2 h matsmältning med immobiliserade enzymer) snarare än över natten matsmältningar. Snabba matsmältningar resulterar i att mer modifierade rester mäts, vilket ökar mängden proteinstrukturinformation. Till exempel leder en 2 h matsmältning med immobiliserad chymotrypsin konsekvent till identifiering av mer DEPC-modifierade rester i β2m (Figur 9)17. Med en natts matsmältning upptäcks cirka 75% av ser-, thr-, tyr-, hans- och lysresterna i β2m, men när tiden mellan märkning och LC-MS reduceras med hjälp av en 2 h matsmältning, detekteras 95% av dessa rester i β2m. De flesta av de nyligen upptäckta modifierade resterna är Tyr och Thr rester som är benägna att hydrolys.
Under vårt arbete med DEPC har vi märkt att Cys rester som kommer från disulfidbindningar modifieras av DEPC i vissa proteiner, även om disulfidbindningarna är intakta under DEPC-märkningsreaktionerna. Sådan märkning av Cys rester sker eftersom fria tioler kan reagera med andra modifierade rester i lösningen (figur 10), vilket leder till så kallad "label scrambling" när karbalytogruppen överförs till Cys rester. Etikettrörning minskar modifieringsnivåerna vid andra restprodukter och ger felaktig proteinstrukturinformation. För att undvika etikettröra måste de fria Cys-tiolen alkyleras helt direkt efter disulfidreduktion33.
Figur 1:Kovande märkningsmasspektrometri (CL-MS). Ett monofunktionellt reagens används för att modifiera lösningsmedelstillgängliga aminosyror och kan användas för att ge platsspecifik information om konformationsförändringar eller interaktionsgränssnitt i proteiner (övre kontra nedre bilden). Det modifierade proteinet smälts proteolytiskt, och de resulterande peptiderna analyseras genom flytande kromatografi (LC) tillsammans med MS och tandem MS (MS/MS). Figuren har anpassats från Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Interactions. Metoder 144,79-93 (2018). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Använd volym (μL) | Koncentration i lösning (μM) | |
| Protein (100 μM, MOPS) | 50 | 50 |
| MOPS (10 mM, pH 7,4) | 48.8 | n/a |
| DEPC (100 mM) | 0.2 | 200 (=4x[protein]) |
| Imidazol (1 M) | 1 | 10 000 (=50x[DEPC]) |
| Total volym | 100 |
Tabell 1. Allmänt DEPC-märkningsprotokoll.
Figur 2. Exempel LC-gradient för separation av peptider. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3 Illustration av hur DEPC-märkta platser identifieras och deras ändringsnivåer beräknas. Efter DEPC-märkning och proteolytisk matsmältning utförs (A) LC-MS-analys av det smälta proteinet. Toppområden med (B) omärkta och (C) märkta peptider i ett kromatogram används för att beräkna märkningsprocenten. Under LC-MS utsätts peptider för CID MS/MS. Tandemmasspektra av (D) omärkta och (E) & (F) märkta peptider som erhålls vid specifika retentionstider används för peptidsekvensering och identifiering av DEPC-märkta platser. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| rest | b2m (på 9000) | b2m-Cu (på 2 m-cu) |
| Thr4 (thr4) | 0.082 ± 0.004 | 0.052 ± 0.009 |
| Hans13 | 0.041 ± 0.003 | 0.033 ± 0.005 |
| Hans31 | 0.010 ± 0.001 | 0.003 ± 0.001 |
| Ser33 (ser33) | 0.010 ± 0.002 | 0.004 ± 0.001 |
| Hans51 | 0.036 ± 0.003 | 0.030 ± 0.004 |
| Ser88 (ser88) | 0.029 ± 0.007 | 0.020 ± 0.006 |
Tabell 2 Platsspecifika DEPC-ändringshastighetskoefficienter (k, M-1s-1)för b2m i avsaknad och närvaro av Cu II.
Figur 4 Användning av DEPC CL-MS för att fastställa effekten av Cu II-bindning på strukturen hos β2m: (A) Kartläggning av proteinytan av resthalterna med betydande minskningar av DEPC-märkningshastigheterna (blå), vilket indikerar förändringar i deras lösningsmedelstillgänglighet vid Cu II-bindning och de som inte har några betydande förändringar i märkningshastigheten (magenta) (PDB-anslutningskod 1JNJ). B) Exempel på platsspecifika kinetiska områden i andra ordningen av reaktionen av β2m med olika koncentrationer av DEPC i närvaro och frånvaro av Cu II. Märkningshastighetskoefficienten (k) kan erhållas från det kinetiska områdets lutning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5 Kovavt märkningsresultat för stressad kontra infödd β2m: (A) Värmespänning - uppvärmning vid 75 °C för 24 h och (B) oxidativ stress - med 3% H2O2 för 24 h. Betydande förändringar i ändringsprocenten visas i blått (minskning av märkning) och rött (ökning av märkning) medan resthalter utan betydande märkningsändringar visas i ljusgrönt (PDB-anslutningskod 1JNJ). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6 Använda DEPC CL-MS för att bestämma dimergränssnittet för pre-amyloid dimer av β2m: (A) Sammanfattning av ändringar av DEPC-ändringsnivån för modifierade rester i monomeren (dvs. t = 0) och dimer 2 h efter tillsats av Cu(II). Resthalter med signifikant minskning av märkningss omfattning betecknas med en asterisk (*). B) Kovanat märkningsresultat kartlagda på β2m-strukturen. Rester med minskad märkning visas i blått och restprodukter utan ändringar eller små ökningar av märkningen visas i rött (pdb-anslutningskod 1LDS). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7 Kovavt märkningsresultat för EGCG-bundet jämfört med obundet b2m. Depc-ändringsprocenten visas för de visade resterna. Statistiskt signifikanta skillnader i den kovamerade märkningsprocenten betecknas med en asterisk (*). Ökningar av märkningen vid EKGC-bindning visas i rött medan minskningar visas i blått. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8 DEPC kovalenta märkningsreaktioner (nukleofila asylersättning) och etikettförlust (hydrolys av karhydratetoxilaterade rester) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 Kartläggning av de uppmätta modifieringsplatserna på β2m. a) Märkta platser efter konventionell nattsmälta och B) märkta platser efter en 2 h matsmältning med immobiliserad chymotrypsin. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 10 Hypotetisk mekanism av DEPC-etikettrörning (Cys capture of carbethoxylated His) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
Flera punkter om experimentell utformning bör övervägas för att säkerställa tillförlitliga märkningsresultat. För det första, för att maximera proteinmärkningen är det nödvändigt att undvika buffertar med starkt nukleofila grupper (t.ex. Tris) eftersom de kan reagera med DEPC och sänka etikettens omfattning. Det är också tänkbart att sådana buffertar skulle kunna reagera med märkta restprodukter, vilket leder till att etiketten tas bort och därför förlust av strukturell information går förlorad. Vi rekommenderar MOPS som buffert, men fosfatbuffrad saltlösning fungerar också. För det andra bör dithiothreitol undvikas för minskning av disulfidbindningar eftersom de fria tioolerna i detta reagens kan reagera med märkta rester och ta bort DEPC-ändringen. Samma kemi är anledningen till att det är viktigt att alkylera reducerade disulfider eftersom fria cys kan orsaka intraproteinetikett som förvränger33. För det tredje är släpningssteget med imidazol (protokoll steg 2.4) avgörande för att stoppa märkningsreaktionen så att eventuell återstående DEPC inte kan fortsätta att reagera med proteinet.
Det är också viktigt att inse att DEPC-märkningsreaktionen är2: a ordningen, vilket innebär att en förändring av antingen protein- eller DEPC-koncentrationen kommer att påverka märkningens omfattning. Vi har empiriskt funnit att ett 4:1 DEPC: proteinkoncentrationsförhållande är ett rimligt värde när proteinet har en koncentration i 10-talet av μM-intervallet, eftersom det tenderar att undvika märkning-inducerade strukturella förändringar14. Det optimala förhållandet mellan DEPC och proteinkoncentration är dock proteinberoende och koncentrationsberoende, och vissa proteiner kräver högre förhållanden för att uppnå tillräcklig märkning. Den optimala DEPC-koncentrationen för att minimera den strukturella stören av märkning av ett visst protein kan uppskattas från antalet lösningsmedel som är tillgängliga för hans och Lysrester 23.
För att undvika variation i märkningsgrader på grund av reagensnedbrytning över tid bör kontroll- och experimentella reaktioner helst utföras samma dag. DEPC genomgår snabb hydrolys när de utsätts för vatten och kommer att försämras under lagring också, så god laboratoriepraxis och reagenshantering är nyckeln. När den inte används ska DEPC-lagerflaskan förvaras i en desiccator.
Ändringar och felsökning
Eftersom DEPC CL är en kinetiskt kontrollerad reaktion styrs märkningshastigheten, och därmed modifieringsnivån, av protein- och reagenskoncentrationer, märkningstid och temperatur. Som nämnts ovan utförs ofta DEPC CL i 1 minut vid 37 °C med ett DEPC till protein molar förhållande på 4 till 1. Vid detta molarförhållande (4x) kan proteiner säkert märkas utan strukturella problem14. DEPC: protein molar förhållanden som är större än 4 kan användas för vissa proteiner, och inte överraskande högre DEPC koncentrationer resulterar i mer omfattande märkning och mer strukturell information. Det säkraste sättet att använda högre DEPC-koncentrationer utan störd struktur är att generera dosresponsområden där reaktiviteten hos ett proteins proteolytiska fragment mäts som en funktion av DEPC-koncentrationen (se figur 4B)14,24. Detta tillvägagångssätt kan dock vara tidskrävande, eftersom det kräver flera mätningar. Nyligen visade vi att den optimala DEPC-koncentrationen kan uppskattas för ett givet protein från antalet och SASA av hans och Lys rester i detproteinet 23. I det senaste arbetet har vi också föreslagit alternativa sätt att bedöma att ett proteins struktur inte störs under CL9,24.
Proteolytisk matsmältning är också ett viktigt steg i DEPC CL-MS, eftersom de peptider som genereras gör det möjligt att lokalisera strukturell information efter LC-MS/ MS-analys. I allmänhet är serinproteaser som trypsin och chymotrypsin effektiva för protein matsmältning. Trypsin används oftare på grund av dess klyvningseffektivitet och specificitet vid C-terminalsidan av Lys och Arg rester. Trypsin klyver dock vanligtvis inte efter DEPC-märkta Lys rester, vilket orsakar missad klyvning vid märkta Lys rester som ibland kan komplicera dataanalys. Aktiviteten hos chymotrypsin, som klyver efter skrymmande hydrofobiska rester, påverkas vanligtvis inte av DEPC-märkning, men detta enzym har lägre klyvningseffektivitet och specificitet än trypsin. Dessutom, för proteiner med många hydrofobiska rester, chymotrypsin kan generera flera korta peptidfragment som kan vara svåra separata och upptäcka under vanliga LC-MS förhållanden.
LC-ESI-MS/MS-analyser av proteinsmälta kräver en stabil elektrospray för att erhålla tillförlitliga semikvantitativa resultat. Kapillär- och nano-LC används ofta separationsplattformar där effektiv separation kan erhållas med små mängder protein. Enligt vår erfarenhet ger dock kapillär-LC mer tillförlitlig kvantitativ information (dvs. modifieringsnivåer) än nano-LC på grund av de högre provmängderna som används. För stora proteiner som smälts in i ett stort antal märkta och omärkta peptider kan koelution av peptider med liknande hydrofobi ske. I dessa fall bör längre LC-gradienter användas för bättre separationer.
Snabb och effektiv MS/MS är viktig för bra sekvenstäckning och etikettplatsidentifiering. Masspektrometrar med fyrdubbla jonfällor är utmärkta instrument för detta ändamål. I allmänhet är CID en vanlig och mycket effektiv metod för peptiddisociation; Vi har dock observerat fall av DEPC etikett scrambling under CID av märkta peptid joner, vilket resulterar i tvetydighet i märkning webbplats identitet34. I dessa något sällsynta fall ger ETD information som är mer tillförlitlig. Följaktligen kan om möjligt alternerande mellan båda dissociationsteknikerna vara till hjälp. Eftersom DEPC kan märka många olika resttyper är det vanligt att isomerer av ett givet peptidfragment genereras som skiljer sig åt i sidokedjan som modifieras. Många gånger kan dessa peptid isomers separeras av LC, även om de tenderar att eluera vid mycket liknande tidpunkter. Denna sannolikhet bör beaktas när ms/ms-uteslutningstider sätts under automatiserade LC-MS/MS-analyser. Vanligtvis bör kortare uteslutningstider än vanligt användas.
Begränsningar
Medan DEPC CL-MS är oerhört fördelaktigt för att studera proteinstruktur och interaktioner, och betydande framsteg har gjorts för att ta itu med en mängd olika proteinsystem, kvarstår vissa begränsningar av denna teknik. Om märkningsförhållandena inte är väl optimerade (t.ex. med för hög koncentration av DEPC) kan övermärkningen stör proteinstrukturen och resultera i felaktig strukturell information14,23,24. Dessutom påverkas noggrannheten och precisionen hos de uppmätta ändringsnivåerna av flera faktorer, inklusive etikettförlust om proverna ligger för långt före LC-MS-analys och fel i de kemiska märkningsstegen. Konsekvens i varje experimentellt steg är viktigt för tillförlitliga resultat. En av de mer utmanande frågorna som för närvarande är förknippade med DEPC-baserade CL-MS är dataanalysprogramvara. Lättillgängliga dataanalysprogram är inte optimerade för att framgångsrikt identifiera peptider med låga ändringsprocent (t.ex. < 1%). Följaktligen har vi utvecklat och använt specialiserad programvara för att göra det möjligt att identifiera peptider med låga modifieringsnivåerlätt 18.
Även om DEPC CL-MS kan ge måttlig protein strukturell upplösning, kan en detaljerad 3D struktur inte erhållas från märkningstekniken. Nyligen har vissa strukturella förutsägelseverktyg baserade på märkningsdata utvecklats35,36. Det krävs dock mer utveckling för att optimalt införliva DEPC-märkningsresultat med beräkningsmodellering för att förutsäga proteinstrukturen.
Betydelse jämfört med alternativa metoder
Den strukturella upplösning som är möjlig med DEPC-baserade CL-MS är måttlig jämfört med tekniker som röntgenkristallografi eller NMR, så det är mest lämpligt att jämföra tekniken med HDX-MS, XL-MS och andra CL-MS, eller fotavtryck, metoder. Som nämndes i introduktionen kompletterar CL-MS HDX-MS eftersom det ger information om sidokedjorna av rester i ett protein, medan HDX-MS rapporterar om ryggradsstruktur och dynamik. Denna komplementaritet gör det möjligt att använda de två teknikerna tillsammans för att få mer strukturell information, vilket har visats av fleragrupper 37,38,39,40,41. En framväxande idé som är relevant för DEPC-baserade CL-MS är den synergistiska information som finns tillgänglig när den används tillsammans med HDX-MS22. På grund av de märkning tidsramar som är associerade med de två teknikerna, DEPC-baserade CL-MS kan ofta klargöra tvetydighet med protein regioner som genomgår minskad HDX. Minskad HDX kan uppstå från antingen minskad lösningsmedel tillgänglighet på grund av bindning eller minskad proteindynamik. DEPC-reaktioner är i sig 2-3 storleksordningar långsammare än HDX-reaktioner, så DEPC-märkning påverkas till stor del inte av förändringar i proteindynamiken så länge de inte åtföljs av förändringar i lösningsmedelstillgängligheten.
CL-MS har vissa fördelar jämfört med HDX-MS experiment i den etiketten scrambling och etikett förlust är minimala när lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas. I HDX-experiment är etikettförlust eller back-exchange en standardfunktion i tekniken, och snabba matsmältningar och LC-separationer vid lågt pH-kort är försök att minimera detta problem. Det är dock viktigt att inse att problemet med återbytet balanseras av det högre antalet märkta webbplatser som vanligtvis mäts i HDX-MS. Märkningsröra är ett större problem i HDX-MS eftersom felaktig information då skulle erhållas, så analysförhållandena måste optimeras för att minimera detta problem.
XL-MS och CL-MS har liknande fördelar när det gäller etikettförlust och förvrängning, eftersom båda innebär bildandet av en kovamerande bindning som är robust nog att förbli under matsmältnings- och LC-MS-analyser. Sekvensering och identifiering av korslänkade peptider är dock mer utmanande än för kovalely märkta peptider, vilket kräver användning av specialiserad programvara. En viktig fördel som XL-MS har jämfört med CL-MS är dess förmåga att tillhandahålla avståndsbegränsningar, vilket kan vara värdefullt när man förutsäger eller begränsar möjliga proteinstrukturer. CL-MS-data har använts för att underlätta proteinstrukturförutsägelse36,42,43, men detta område kräver mer arbete för att fullt ut nå sin potential.
Jämfört med andra CL-MS-metoder, inklusive de som använder specifika eller icke-specifika märkningsreagenser, har DEPC vissa fördelar och nackdelar. Liksom metoder som använder aminosyraspecifika reagenser är DEPC-märkning enkel; Reagenset behöver endast läggas till i urvalet av intresse. Denna enkelhet står i kontrast till metoder som snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) eller synkrotronbaserad HRF som kräver sofistikerade ljuskällor för att producera hydroxylradikaler. Till skillnad från metoder som använder specifika reagenser kan DEPC märka sex olika aminosyror och N-ändstationen, vilket gör det möjligt för det att ge högre strukturell upplösning. Antalet resthalter som kan märkas av DEPC är dock färre än det antal som kan oxideras av hydroxylradikaler, så den strukturella upplösning som erhålls av DEPC-baserade CL-MS är lägre. En praktisk förgrening av färre resthalter som märkts av DEPC är att användningen av reagenset ibland inte ger all önskad strukturell information, och därför kan den dra nytta av att användas tillsammans med andra märkningsreagenser. Vi har nyligen visat värdet av att använda DEPC tillsammans med reagensparet 1-etyl-3-(3-dimetyllaminopropyl)karbodiimid (EDC)/glycinetyleter (GEE), som kan märka glutamat och atypiskarester 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna bekräftar stöd från National Institutes of Health (NIH) under Grant R01 GM075092. Thermo Orbitrap Fusion masspektrometer som används för att förvärva några av de data som beskrivs här förvärvades med medel från National Institutes of Health grant S10OD010645.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
References
- Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
- Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
- Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
- Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
- Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
- Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
- Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
- Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
- Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
- Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
- Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
- Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
- Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
- Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
- Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
- Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
- Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
- Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
- Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
- Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
- Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
- Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
- Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
- Floege, J., Ketteler, M.
- Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
- Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
- Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
- Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
- Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
- Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
- Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
- Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
- Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
- Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
- Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
- Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
- Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
- Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).
