Summary
在这里，我们提供了一个微流体芯片和一个自动控制的、高效的循环微流体系统，它回顾了血管化的初始微环境，使内皮细胞（ECs）能够同时受到高光泽剪切应力、跨内皮流动的生理水平和各种血管内皮生长因子（VEGF）分布的刺激。
Abstract
神经血管化通常从现有的正常血管中初始化，初始阶段内皮细胞（ECs）的生物力学微环境与下一个神经血管化过程有显著差异。虽然有很多模型来模拟神经血管化的不同阶段，但仍然缺乏在正常血管微环境的相应刺激下投降神经血管化初始过程的 体外 3D模型。在这里，我们重建了一个 体外 3D模型，模仿神经血管化（MIEN）的初始事件。MIEN 模型包含微流体发芽芯片和自动控制、高效循环系统。形成了一个功能齐全、可喷水的微通道，涂有内皮，并在微流体发芽芯片中模拟发芽过程。神经血管化的最初生理微环境通过微流体控制系统进行回顾，通过该系统，IC将同时暴露在高光泽剪切应力、生理性转皮流和各种血管内皮生长因子（VEGF）分布中。MIEN模型可以很容易地应用于神经化机制的研究，并作为药物筛选和毒理学应用的低成本平台具有潜在的前景。
Introduction
神经血管化发生在许多正常和病理过程1，2，3，4，其中包括成人的两个主要过程，血管生成和动脉生成5。除了最知名的生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）6，机械刺激，特别是血流诱发的剪切应力，在调节血管化7方面非常重要。如我们所知，切变应力的大小和形式在血管的不同部位变化很大，动态变化，对血管细胞8、9、10、11、12有重要影响。先前的研究表明，剪切应力可能影响ECs的各个方面，包括细胞表型变化、信号转导、基因表达，以及与壁画细胞13、14、15、16、17、18、19、20的交流：因此，调节神经血管化21，22，23，24。
因此，为了更好地了解神经血管化，在体外重建自然细胞微环境的过程非常重要。最近，利用微制造和微流体技术的进步，建立了许多模型，以制造微型容器，并精确控制微环境25、26、27。在这些模型中，微容器可以产生水凝胶28，29，多二甲基硅氧烷（PDMS）微流体芯片30，31，32或3D生物打印33，34。微环境的某些方面， 如光切变应力22、23、35、36、转肠皮流37、38、39、40、生化梯度血管因子41、42、应变/拉伸43、44、45，并与其他类型的细胞共同培养32、46已被模仿和控制。通常，使用大型储水器或注射器泵提供灌注介质。这些模型中的跨内皮流是由水库和微管22、23、38、40之间的压力下降造成的。然而，机械微环境很难以这种方式持续保持。如果使用具有高剪切应力的高流速进行注水，横皮流将增加，然后超过生理水平。先前的研究表明，在血管化初期，由于完整的ECs和地下室膜，转皮流的速度非常低，通常低于0.05μm/s8。同时，虽然血管系统中的光刻剪压力差异很大，但平均值为5-20 dyn/cm2、11、47，相对较高。目前，以往作品的转肠皮流速一般保持在0.5-15微米/s 22、38、39、40之间，光切变应力一般在10~223以下。不断使ECs同时暴露在高光泽剪切应力和跨内皮流动的生理水平中仍然是一个困难的课题。
在本研究中，我们描述了一个 体外 3D模型，以模拟神经血管化（MIEN）的初始事件。我们开发了微流体芯片和自动控制、高效循环系统，形成注水微管，模拟发芽过程48。通过 MIEN 模型，首先对神经血管化初期刺激的 IC 微环境进行了重新概括。EC 可以同时受到高光泽剪切应力、跨内皮流的生理水平和各种 VEGF 分布的刺激。我们详细描述了建立MIEN模型的步骤和需要注意的要点，希望为其他研究人员提供参考。
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Protocol
1. 晶圆准备
注：此协议是针对本研究期间使用的 SU-2075 负光抗光片的特异性。
- 用甲醇和异丙醇在旋转涂层上清洁硅晶圆 3 到 5 次如下：先在 500 rpm 下旋转 15 s，然后在 3，000 rpm 下旋转 60 s。
- 将硅晶圆转移到热板上，热板预热至 180 °C，并将晶圆烘烤 10 分钟。
- 将硅晶圆从热板中取出，冷却至室温。在继续旋转涂层之前，用压缩空气再次清洁晶圆。将 SU-8 2075 光抗光片的 4 mL 涂抹到晶圆的中心。
- 在旋转涂层上获得 70μm 的功能高度如下：先在 500 rpm 下旋转 12 s，然后在 2，100 rpm 下旋转 50 s。
- 在热板上软烤晶圆如下：先在 65 °C 下烘烤 8 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 20 分钟。 接下来，将硅晶圆从热板中取出，在光刻前冷却至室温。
- 将光罩放在照相胶片上。用光刻设备曝光晶圆，总曝光量达到200mJ/cm2。
注：光面具包含九组芯片的图案，因此它每次可以制造九组微流体发芽芯片。 - 将晶圆暴露在热板上如下：先在 65 °C 下烘烤 5 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 20 分钟。 接下来，将硅晶圆从热板中取出，冷却至室温，然后再开发。
- 将晶圆转移到装满 SU-8 开发人员 （PGMEA） 的玻璃培养皿中，以开始开发。
警告：开发人员对眼睛和呼吸道有刺激性。在烟雾罩中执行开发。操作过程中佩戴飞溅护目镜、氮化物手套和航空口罩。 - 沿着流程通道的方向轻轻摇动菜盘，10 分钟后更换开发人员。
- 重复步骤 1.9 3-5 次，直到可以清楚地观察到模式。
注：确保晶圆上没有光照面残留物，否则将再次冲洗开发人员中的晶圆。 - 将晶圆转移到预热的热板中，设置为 120 °C，烘烤 30 分钟。
- 将 35μL 的硅烷吹到盖片上，然后将盖片和晶圆一起放入干燥器中并拉真空。密封干燥器，将晶圆在真空下保持 4 小时，以对晶圆进行西兰化，以防止 PDMS 在软光刻过程中粘附。
小心：硅烷是有毒的。为了防止中毒，在烟雾罩中进行西兰化，在处理时戴上氮化物手套。 - 从干燥器释放真空。将西兰晶圆取出到预热的热板上，在 65 °C 下烘烤 2 小时。
- 将晶圆存放在干净的培养皿中，直到需要为止。
2. 微流体发芽芯片制造
- 将 20 克基剂和 2 克固化剂（10：1 比）组合在塑料烧杯中，并将其与搅拌棒彻底混合。
- 将烧杯放入干燥器中，拉真空1小时，以去除PDMS混合物中的气泡。
- 将 PDMS 混合物倒入培养皿中的晶圆上，将培养皿放回干燥器中，再脱气 30 分钟。
注：使用双面胶带将晶圆粘在培养皿底部，以确保晶圆在脱糖和固化过程中保持水平，是很有帮助的。 - 将培养皿从干燥剂中取出，放入 80 °C 干烤箱中 3 小时治愈。
- 小心地将 PDMS 层与晶圆分离，并根据图案用手术刀将层切成 9 个芯片。
注意：分离后保持功能侧起。 - 分别使用 1 毫米和 3.5 mm 活检冲孔从每个芯片中冲出两个水凝胶注射端口和四个介质注入端口。
- 用无残留胶带清洁打孔芯片，以去除 PDMS 残留物。将芯片和九个玻璃盖片放入等离子清洁剂中，用氧等离子体处理30s，在表面形成共价粘结。
- 取出芯片和盖片。将芯片的功能侧连接到盖片上。
- 将连接的芯片放入 80 °C 干烤箱 1 小时，以增强粘合。
- 使用前自动切除芯片，并在手术的其余部分保持无菌。
3. 表面改性和水凝胶注入
- 对于每个芯片，管道 40 μL 的 1 毫克/mL 多 D-赖氨酸 （PDL），并将其从水凝胶注入端口注入芯片中的通道。
注意：确保 PDL 填充通道，尤其是在端口附近的狭窄通道中。 - 在37°C下孵化芯片4小时，以改变PDMS的表面。
- 从水凝胶注水口将200μL的无菌水输送到芯片的通道中，以洗掉PDL。
- 将芯片放入 120 °C 干烤箱 3 小时，以恢复疏水性。
- 将无菌管放在冰上，计算用于以下方程的I型胶原蛋白的体积。
最终体积 （50μL） x 最终胶原蛋白浓度 （本研究中的 3 毫克/mL） / 瓶子中的浓度 = 要添加的胶原蛋白体积 - 计算 NaOH 的体积，用作以下方程。
（要添加的胶原蛋白体积） x 0.023 = 卷 1 N NaOH - 在管中准备 50 μL 的水凝胶作为以下协议：加入 5 μL 的 10 倍 PBS，0.5 μL 的酚红色，计算体积为 1 N NaOH，4 μL 的 1 毫克/mL 纤维素，依次计算 I 型胶原蛋白的体积。添加适当的 dH2O 量，使总体积达到 50 μL。
注：在冰上执行所有操作。使用苯酚红色作为酸性指标，以帮助视觉确定水凝胶的pH值。当 pH 值约为 7.4 且刚度约为 15 kPa49时，最终水凝胶最终变成橙色。 - 每个芯片的管道 2-3 μL 水凝胶，然后从水凝胶注入端口缓慢地将其注入中央水凝胶通道。
- 在37°C下孵化芯片30分钟，以允许凝胶化。
注意：如果芯片不立即使用，将芯片密封到密封的盒子中，放入 1 mL 的无菌水中。密封芯片最多可在 37 °C 下存放 24 小时。
4. 细胞播种
- 将 125μg/mL 纤维素的 20 μL 吹入细胞培养通道的一个介质注射端口。
- 切一个移液器尖端，用剪刀将细胞培养通道的端口安装好。
- 将移液器尖端插入细胞培养通道的其他介质注入端口。然后，从细胞培养通道中吹出空气，用纤维素填充空气。
- 在37°C下孵育芯片1小时。
- 在细胞播种之前，将 20 μL 的 ECM 介质输送到每个介质注入端口，并在 37 °C 下孵育芯片 30 分钟。
- 然后，在所有媒体注塑端口中移出所有媒体。
- 接下来，将5μL的细胞悬浮液吹入细胞培养通道的一个介质注射端口。然后，内皮细胞在差分静液压下迅速扩散到整个通道。
注：通过尝试从培养瓶中切除人类脐带内皮细胞（HUVECs），并在400 x g下将其离心，来准备细胞悬浮。然后，将细胞重新悬在管子中的 107 个细胞/mL 中。 - 将大约 4-6 μL 的 ECM 介质添加到其他端口以调整静水压力并停止细胞移动。
- 将芯片取出到细胞孵化器。然后，每30分钟交出一次芯片，直到细胞内皮细胞在细胞培养通道的内部表面涂层2小时后（图1）。
注意：要使芯片倒置，请在盖片背面吹一点水。然后芯片可以连接到培养皿的封面上。 - 使用移液器尖端非常小心地去除注射端口中连接的细胞。
- 然后，将四个带刺的女性 Luer 适配器插入媒体注入端口，并填充 ECM 介质。
注意：适配器可以作为流体储液罐，为通道中的细胞提供营养。 - 将芯片取出到细胞孵化器中。每12小时更换一次吕尔适配器中的 ECM 介质。
5. FITC-德克斯特兰扩散渗透性的测量
注：为评估微容器的屏障功能，评估有或无细胞衬里EC培养通道的扩散渗透性。
- 拿出一个微流体发芽芯片与水凝胶注入。
- 重复步骤 4.1-4.6。
- 删除所有 Luer 适配器，并在四个媒体注入端口中移出所有媒体。
- 将芯片放置在结肠激光扫描显微镜上。
- 含有 500μg/mL 40 kDa FITC-dextran 的文化介质的管道 5 μL 到细胞培养通道的一个端口。
注：40 kDa FITC-德克斯特兰的分子大小与VEGF-165（39-45 kDa）相似。 - 每3s捕获图像30 s。因此，测量没有细胞内衬的扩散渗透性。
- 在 HUVEC 汇入细胞培养通道后取出微流体发芽芯片。
- 重复步骤 5.3-5.5。
- 每3s捕获图像30 s。因此，测量细胞内衬的扩散渗透性。
- 使用以下修改的方程50量化荧光强度随时间的变化来计算扩散渗透性。
Pd=（I2-I1）/（I1-Ib）。Δt）•已/天
其中，Pd是扩散渗透系数，I1是初始时间点的平均强度，I2是三角洲时间后的平均强度（Δt），I b是背景强度，S是荧光图像通道区域，d是荧光图像中微柱的总间隔。在本作品中，Δt设置为9s。
注：目前的方程与原来的50略有不同，由于芯片中荧光的扩散方向只是从EC通道到水凝胶通道，这不像圆形管扩散到所有径向方向。
6. 微流体控制系统设置
注：本研究中的微流体控制系统由微注射器泵、电磁夹阀、气泡陷阱芯片、微流体芯片、微渗透泵和储层组成。系统的每个部分都可以被能够执行相同功能的替代功能所取代。
- 气泡陷阱芯片制造
注意：气泡陷阱芯片用于去除循环中的气泡。该芯片由三个 PDMS 层组成。顶层采用软光刻结构，形成网格结构作为液室。网格结构的每个通道宽 100μm。底层是带孔的 PDMS 区块。在两层之间，铺设了 100μm 薄的 PDMS 薄膜。- 重复步骤 1，为气泡陷阱芯片准备晶圆。
- 重复步骤 2.1-2.5 以制造气泡陷阱芯片的顶层和下层。
注：顶层的光照面包含三组图案，因此根据图案将 PDMS 层切割为三个芯片。 - 使用 3.5 mm 活检冲孔在顶层入口和出口通道末端打六个孔。
- 根据上层的图案，使用 6 毫米活检冲孔在底层的相应位置打两个孔。
- 重复步骤 2.1-2.2 准备 10 克 PDMS 混合物，并将其倒在清洁硅晶圆的中心。
- 通过应用以下旋转协议来制作 100μm PDMS 薄膜：在 500 rpm 下旋转 15 s，将旋转速度提高到 1，300 rpm，并在此保持 45 s。
- 将晶圆转移到设置为 180 °C 的预热热板中，烘烤 30 分钟。
- 用无残留胶带清洁打孔层，以去除 PDMS 残留物。将顶层和晶圆放入等离子清洁剂中，用氧等离子体处理30s，在表面形成共价粘结。
- 取出顶层和晶圆。将顶层的功能侧连接到 PDMS 胶片上。
- 用针头沿着顶层边缘小心地切割薄膜。
- 慢慢地将薄膜与晶圆分离，并在分离后翻开芯片，使薄膜侧面向上。
- 将底层并连接芯片放入等离子清洁剂中，再用氧等离子体处理30s。
- 取出底层并连接芯片。将底层连接到 PDMS 薄膜上，并完成气泡陷阱芯片。
注意：连接时，将底部层上的孔与上层的图案对齐。 - 将芯片放入 80 °C 干烤箱 1 小时，以增强粘合。
- 组装微流体控制系统
注：除电子设备外，系统的所有部件（如气泡陷阱芯片、储层、管子和连接器）均在高压灭菌后使用。将微流体控制系统组装在干净的长凳上。- 组装微流体控制系统，准备两个聚四氟乙烯管、两个短硅胶管、三个长硅管、一个带刺女性 Luer 适配器、一个 Y 型连接器和三个 L 型连接器。
注：聚四氟乙烯管的优点是弹性低，因此，管道中需要的介质较少。相比之下，硅胶管具有很高的弹性，因此，它适用于捏阀和永久泵。 - 将注射器装满 10 mL 预热 （37 °C） ECM 介质。
注意：预热有助于介质释放溶解气体。 - 通过带刺的女性 Luer 适配器将聚特特拉氟乙烯管连接到注射器。然后，将聚四氟乙烯管的另一端连接到 Y 型连接器。
- 接下来，将两根长硅胶管连接到 Y 型连接器的另一端，一根管连接到储层，另一根管连接到气泡陷阱芯片。
- 将另一根长硅胶管连接到储层。
- 接下来，使用两个短硅胶管连接气泡陷阱芯片顶层的所有入口和出口孔。将聚四氟乙烯管连接到芯片的后端。
- 接下来，将注射器固定在微型注射器泵上。
- 将两根长硅胶管夹入电磁夹阀中。
- 接下来，切换电磁夹阀以打开注射器和储层之间的管道。使用微型注射器泵将介质注入储层，以排气管中的空气。
- 然后，再次切换阀门以打开注射器和气泡陷阱芯片之间的管道。注入介质以填充气泡陷阱芯片的液体室和后端管。
- 组装微流体控制系统，准备两个聚四氟乙烯管、两个短硅胶管、三个长硅管、一个带刺女性 Luer 适配器、一个 Y 型连接器和三个 L 型连接器。
7. 内皮发芽检测
注：本研究使用用相位对比显微镜组装的舞台顶孵化器实时观察发芽过程。舞台顶部孵化器可在显微镜阶段保持温度、湿度和 CO2 控制，有利于活细胞成像。但设备是没有必要的检测。此处提供的协议也可以在基本细胞孵化器中工作。
- 从细胞孵化器中取出内皮发芽芯片。
- 然后，删除细胞培养侧的卢尔适配器。将两个管道插头插入微流体发芽芯片的水凝胶喷射端口。
注：插头可以从针头转换，其主要功能是防止介质溢出。 - 将气泡陷阱芯片的后端管连接到细胞培养通道的一个端口。
注意：请确保连接前管中没有气泡。 - 将 T 型连接器插入另一个端口，并将其连接到与储层相连的长硅胶管上。
- 将长硅胶管夹入微渗透泵中。
- 然后，将空气过滤器插入储层。
- 接下来，将微流体发芽芯片组装到舞台顶部孵化器。
- 接下来，将真空泵与带TPU管的气泡陷阱芯片底层的孔连接起来。
- 在自定义程序中设置循环体积和流速，同时控制微注射器泵和电磁夹阀（图2）。
注：通过内皮细胞培养通道的流速是根据经典方程计算的。
τ=6μQ/W h2
其中，τ是剪切应力（dyn/cm2），μ是介质的粘度（8.8 x 10-4 Pa+s），Q 是穿过内皮细胞培养通道的流速（ml/s），h 是通道高度（70 μm），W 是通道宽度（1，000 μm）。使用同轴圆柱体类型旋转粘度计测量介质的粘度。通道的高度和宽度是预先确定的，并使用相位对比显微镜在 4 倍放大时手动确认。根据计算，15 dyn/cm 2 剪切应力的循环量为 5 mL，流速为 85 μL/min（细胞培养通道中的平均0.2 m/s）。 - 其次，设置微渗透泵的流量。
注：微寄生泵的流量略高于微注射器泵，以防止介质溢出。 - 打开微型注射器泵。然后，建立流通控制系统。
8. 数据分析
注：为了量化豆芽，计算了发芽的规范化区域、平均发芽长度和最长的发芽长度。结果表示从三项独立研究中获得的平均± SEM。统计学意义（P < 0.05）由学生 t测试评估。
- 在PBS中对4%的准成形醛进行实验15分钟后，修复微流体发芽芯片中的细胞和芽。污渍核与4+，6-迪亚米迪诺-2-苯丙胺二氢氯化物（DAPI：1：1000：西格玛- 奥尔德里希） 10 分钟， 然后用特里特克 · 法利丁 （P5285， 1： 100） 染色细胞骨骼：西格玛-奥尔德里希）为1小时。每步之间每隔 5 分钟用 PBS 清洗三次电池。
- 以平铺模式拍摄芯片的共用图像，然后使用图像编辑软件缝合它们。
- 使用编程软件中的自定义代码来量化发芽的规范化区域（见 补充文件），计算 Z 投影图像的荧光像素数。
- 手动识别和标记 Z 投影图像中的每个芽尖，并使用另一个自定义代码来量化平均发芽长度和最长的芽长度（见 补充文件），计算豆芽尖到 ECs 地下室膜之间的距离。
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Representative Results
体外3D模型，以模拟神经血管化（MIEN）的初始事件在这里提出包括一个微流体发芽芯片和一个微流体控制系统。微流体发芽芯片是从以前的出版物22，23，37，40，51，52，53优化。简言之，它包含三个通道和六个端口：一个内皮细胞培养通道和一个有四个介质注入端口的液体通道，以及一个带有两个水凝胶注入端口的中央水凝胶通道（图3）。微流体控制系统包括微型注射器泵、电磁夹阀、气泡陷阱芯片、微垂直泵和文化中储层（图4）。使用定制程序同时控制微注射器泵和电磁夹阀，从而设置流速和循环体积。引入补偿量，以纠正由于系统错误造成的多个周期后体积的轻微变化。为了尽量减少用于输液的介质，引入了用于中等回收的电磁捏阀。电磁夹阀可以在两种状态之间切换，使微流体系统在一个周期的两个阶段。在注射阶段，培养基从微注射器泵缓慢注入微流体发芽芯片。在回收阶段，培养基从储层中迅速提取回微型注射器泵。
通过测量40千达FITC-dextran的扩散渗透系数（Pd），评估了MIEN模型中微容器的阻隔功能。如 图 5所示，带细胞内衬的静态培养芯片的 Pd 为 0.1 ± 0.3 μm/s，无细胞衬里空通道的 Pd 为 5.4 ± 0.7 μm/s。然后，在静态和注水下进行内皮发芽检测，在 MIEN 模型中执行。在静态条件下，内皮发芽发生在播种后约4小时，芽将在大约48小时后穿过中央水凝胶通道迁移到另一侧。豆芽在48小时后逐渐退化。虽然在暴露于 5 或 15 dyn/cm2 剪切应力（细胞培养通道中平均 0.07 或 0.2 m/s）的 24 小时后，EC 在流向中对齐，从多边形、鹅卵石形状变为融合形式，并且随着剪切应力的增加而发芽的程度降低（图 6）。然而，剪切条件下的豆芽比静态培养条件下的豆芽更稳定。他们可以保持超过48小时的注水。定量统计表明，内皮发芽面积、平均发芽长度和发芽长度（图7）显著减少。
图1：细胞培养通道内部表面的内皮细胞涂层。 在细胞播种后2小时，HUVEC均匀地分散在细胞培养通道中。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：用于同时控制微注射器泵和电磁夹阀的定制程序。 可设置流速和流通量的自定义程序的主页（向上）和子页（向下）。引入补偿量，以纠正由于系统错误造成的多个周期后体积的轻微变化。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：微流体发芽芯片的原理图。 该芯片包含三个通道和六个端口：一个内皮细胞培养通道和一个具有四个介质注入端口的液体通道，以及一个带有两个水凝胶注入端口的中央水凝胶通道。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：微流体控制系统的原理图。 微流体控制系统由微注射器泵、电磁夹阀、气泡陷阱芯片、微垂直泵和文化中储层组成。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图 5： 扩散渗透性（Pd） 40 kDa FITC - 德克斯特兰。带细胞内衬的静态培养芯片的Pd为0.1±0.3 μm/s，无细胞衬里的空通道P d为5.4±0.7 μm/s.**，p<0.01。请点击这里查看此数字的较大版本。
图6：不同剪切条件下内皮发芽的代表性图像。 经过24小时的静态栽培，HUVECs通过微柱和水凝胶中的大量芽从细胞培养通道侵入相邻的水凝胶通道。虽然在暴露在 5 或 15 dyn/cm 2 剪切应力的 24 小时后，发芽的程度明显降低。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图7：发芽面积、平均发芽长度和发芽长度最长。 静态培养 （S0） 或接触 5 （S5） 或 15 （S15） dyn/cm2 剪切应力后，随着剪切应力的增加，发芽程度会降低。*，p<0.05：*，p<0.01。 请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
长期以来，对神经血管化的实时观测一直是个问题。最近已开发出几种方法，以制造与ECs衬砌的香水容器，并毗邻细胞外矩阵，以发芽22，32，40，46，54，但机械微环境仍然难以持续。模仿ECs的初始生物力学微环境仍然是一个困难的课题，这些环境受到高光泽剪切应力和低速度的转皮流的影响。在这里，我们提出了一个MIEN模型，首先模拟模拟生理微环境下的神经血管化的初始事件。通过 MIEN 模型，实现了自动、高效和无气泡的长期注入。在进行保持生理水平的跨内皮流实验期间，IC 上的光敏剪切应力可随时随地更改。
MIEN 模型的关键是将光流对 EC 的影响与跨内皮流脱钩。为此，T 型连接器被创造性地插入到 EC 文化通道的出口端口。连接器的一端通过微渗透泵连接到储层。连接器的另一端暴露在孵化器的空气中。它使内皮细胞培养通道内的压力与大气压力相同，因为既没有多余的媒体聚集来增加压力，也没有多余的介质被抽走，在通道中形成负压力。这样，微流体发芽芯片后的流量阻力非常小，即使在高光泽剪切应力下也能保持在生理范围内。
协议中的一个关键步骤是在中央水凝胶通道成功注入水凝胶。黄等人提出，凝胶的成功填充取决于微流体凝胶通道55内毛细的力和表面张力的平衡。他们发现了三种不同的变量来控制平衡：微孔之间的间距、设备的表面特性和水凝胶前体解决方案的粘度。在目前的模型中，微流体发芽芯片的设计从以前的22，23，37，40，51，52，53优化。微柱分离三个通道的几何形状和间距是根据以前的计算和许多实验确定的。此外，还执行 PDL 涂层和高温烘烤来修改 PDMS 表面：因此，在水凝胶注入之前，调整亲水性和疏水性的平衡。
协议的另一个关键步骤是清除气泡。由于T型连接器和微渗透泵，大量的空气会在实验过程中溶解成循环介质，导致循环中的气泡，并极大地影响内皮细胞的功能。为了去除气泡，在微流体发芽芯片之前引入气泡陷阱芯片。它的工作原理基于 PDMS 膜的高气体渗透性。当气泡进入陷阱时，它们被小而密集的网格结构分散，由于真空泵产生的负压而被困住，因此它们无法进入微流体发芽芯片。此外，气泡通过 PDMS 膜输送到连接到真空泵的负压孔中，最终消失。即便如此，在实验过程中，也应高度重视气泡的形成。一旦在管道中的微流体发芽芯片前发现气泡，立即停止微注射器泵。用手指轻轻挡住管道，让气泡移动到气泡陷阱芯片并移除。
虽然神经血管化的初始微环境被部分重述，但这种MIEN模型存在一些局限性。内皮细胞的机械微环境，如血液诱发的剪切应力和细胞外基质僵硬，在血管化过程中正在发生变化。在神经血管化之前，内皮底膜仍然完好无损，具有完整的屏障功能，导致高亮度剪切应力与低速度的转皮流和间质流8，9。在血管生成和动脉发生开始时，一个标志性事件是基质金属蛋白酶 （MMP） 调解地下室退化，这将增加 IC 渗透性和重塑矩阵，导致机械微环境的变化，如血液诱发的剪切应力和细胞外基质刚度。在目前的工作中，我们专注于神经血管化的启动，因此微流体发芽芯片中的机械环境旨在保持稳定，以模拟生理条件。然而，机械微环境的变化将发生与ECs发芽，就像在体内。此外，与以往许多研究34、53、56类似，目前的模型以胶原蛋白水凝胶为细胞外基质。当我们专注于流量诱导剪切应力的影响时，只使用了一个刚度水凝胶。然而，考虑到基质刚度对细胞行为和血管化的重要影响，应研究胶原蛋白的不同刚度，通过调节胶原蛋白的pH.来达到，因为胶原蛋白的机械特性取决于胶原蛋白的pH49。但重要的是要注意，水凝胶需要彻底冲洗与PBS去除残留的酸或碱基之前，细胞播种，以防止损害细胞。此外，为了模拟体内ECM的复杂成分，今后应使用各种水凝胶，如马特里格尔、透明质酸（HA）和纤维蛋白原等来改进目前的模型。血压诱发的循环菌株是调节血管细胞形态和功能的另一种重要的造血力。先前的研究表明，拉伸菌株通过血管内皮地下室膜59的IV型胶原蛋白降解，增强了人体间质干细胞中血管原因子的表达，并诱导血管生成。这些结果表明，血压诱发的菌株也可能影响血管化。目前的模型侧重于流量诱导剪减应力的影响，因此不适用于引入应变，因为水凝胶粘附在通道上不够紧密，在拉伸时会脱落。我们将在今后的工程中注意克服这一困难。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学研究基金会的资助（赠款号11827803，31971244，31570947，11772036， 61533016、U20A20390、32071311）、中国国家重点研究开发计划（2016年YFC1101101和2016YFC1102202）、111项目（B13003）和北京自然科学基金（4194079）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Electromagnetic pinch valve | Wokun Technology | WK02-308-1/3 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Every Green | NA | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| FITC-dextran | Miragen | 60842-46-8 | |
| Graphical programming environment | Lab VIEW | NA | |
| Image editing software | PhotoShop | NA | |
| Image processing program | ImageJ | NA | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 91237 | |
| Lithography equipment | Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences | URE-2000/35 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 82762 | |
| Micro-peristaltic pump | Lead Fluid | BT101L | |
| Micro-syringe pump | Lead Fluid | TYD01 | |
| Oxygen plasma | MING HENG | PDC-MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS (10x) | Beyotime | ST448 | |
| Permanent epoxy negative photoresist | Microchem | SU-8 2075 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P5530 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Polytetrafluoroethylene | Teflon | NA | |
| Program software | MATLAB | NA | |
| Recombinant Human VEGF-165 | StemImmune LLC | HVG-VF5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1.06498 | |
| Stage top incubator | Tokai Hit | NA | |
| SU-8 developer | Microchem | NA | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P5285 |
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