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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62003
Automatic Translation
1, 1, 1, 4, 1, 1, 1, 3, 1,2
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.

Abstract

A neovascularização é geralmente inicializada a partir de uma vasculatura normal existente e o microambiente biomecânico das células endoteliais (CES) no estágio inicial varia drasticamente do processo seguinte de neovascularização. Embora existam muitos modelos para simular diferentes estágios de neovascularização, ainda falta um modelo 3D in vitro que capitula o processo inicial de neovascularização sob as estimulações correspondentes de microambientes normais de vasculatura. Aqui, reconstruímos um modelo 3D in vitro que imita o evento inicial de neovascularização (MIEN). O modelo MIEN contém um chip de brotação microfluido e um sistema de circulação de controle automático e altamente eficiente. Formou-se um microcanal funcional e perfusível revestido de endotélio e o processo de broto foi simulado no chip de brotação microfluídica. O microambiente fisiológico inicialmente da neovascularização foi recapitulado com o sistema de controle microfluido, pelo qual as CEs seriam expostas ao alto estresse da cisalhamento luminal, fluxo transendotelial fisiológico e várias distribuições de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente. O modelo MIEN pode ser facilmente aplicado ao estudo do mecanismo de neovascularização e mantém uma potencial promessa como uma plataforma de baixo custo para aplicações de triagem de medicamentos e toxicologia.

Introduction

A neovascularização acontece em muitos processos normais e patológicos1,2,3,4, que incluem dois processos importantes em adultos, angiogênese e arteriogênese5. Além dos fatores de crescimento mais conhecidos, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)6, estimulações mecânicas, em especial o estresse da cisalhamento induzido pelo fluxo sanguíneo, é importante na regulação da neovascularização7. Como sabemos, a magnitude e as formas de estresse de tesoura variam de forma dramática e dinâmica em diferentes partes da vasculatura, resultando em efeitos importantes sobre as células vasculares8,9,10,11,12. Estudos anteriores mostraram que o estresse da tesoura pode afetar vários aspectos das CE, incluindo alterações fenotípicas celulares, transdução de sinal, expressão genética e a comunicação com células mural13,14,15,16,17,18,19,20; portanto, regular a neovascularização21,22,23,24.

Portanto, para entender melhor a neovascularização, é importante reconstruir o processo no microambiente celular natural in vitro. Recentemente, muitos modelos foram estabelecidos para criar microestinas e fornecer controle preciso do microambiente25,26,27, aproveitando os avanços na microfabagem e tecnologia microfluida. Nesses modelos, os microimpostos podem ser gerados por chips microfluidos de hidrogel28,29, polidimtilsiloxano (PDMS)30,31,32 ou 3D bioimpressora33,34. Alguns aspectos do microambiente, tais como o estresse da cisalhamento luminal22,23,35,36, fluxo transendotelial37,38,39,40, gradiente bioquímico de fatores angiogênicos41,42, tensão/estiramento43,44,45, e co-cultivado com outros tipos de células32,46 foram imitados e controlados. Normalmente, um grande reservatório ou bomba de seringa era usado para fornecer meio perfumado. O fluxo transendotelial nesses modelos foi criado pela queda de pressão entre o reservatório e o micro-tubo22,23,38,40. No entanto, o microambiente mecânico era difícil de manter constantemente desta forma. O fluxo transendotelial aumentaria e, em seguida, excederia o nível fisiológico se uma alta taxa de fluxo com alto estresse de cisalhamento fosse usada para perfusão. Estudo anterior mostrou que, no período inicial de neovascularização, a velocidade do fluxo transendotelial é muito baixa devido às CEs intactas e membrana do porão, geralmente abaixo de 0,05 μm/s8. Enquanto isso, embora o estresse luminal do corte no sistema vascular varie muito, é relativamente alto com valores médios de 5-20 dyn/cm2,11,47. Por enquanto, a velocidade do fluxo transendotelial em trabalhos anteriores tem sido geralmente mantida entre 0,5-15 μm/s22,38,39,40, e o estresse da cisalhamento luminal foi geralmente inferior a 10 dyn/cm223. Continua sendo um assunto difícil de expor constantemente as CEs ao alto estresse luminal da cisalhamento e ao nível fisiológico do fluxo transendotelial simultaneamente. 

No presente estudo, descrevemos um modelo 3D in vitro para imitar o evento inicial de neovascularização (MIEN). Desenvolvemos um chip microfluido e um sistema de circulação automático, altamente eficiente para formar micro-tubos de perfusão e simular o processo de brotaçãode 48. Com o modelo MIEN, o microambiente das CE estimulados no período inicial de neovascularização são, em primeiro lugar, recapitulados. As CE podem ser estimuladas pelo alto estresse luminal da cisalhamento, nível fisiológico de fluxo transendotelial e distribuição de vários VEGF simultaneamente. Descrevemos os passos de estabelecer o modelo MIEN em detalhes e os pontos-chave a serem prestados atenção, na esperança de fornecer uma referência para outros pesquisadores.

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Protocol

1. Preparação de wafer

NOTA: Este protocolo é específico para o fotoresist negativo SU-8 2075 utilizado durante esta pesquisa.

  1. Limpe o wafer de silício 3 a 5 vezes com metanol e isopropanol em um revestimento de giro da seguinte forma: primeiro gire por 15 s a 500 rpm, e depois gire por 60 s a 3.000 rpm.
  2. Transfira o wafer de silício para uma placa de aquecimento, que é pré-aquecido a 180 °C e asse o wafer por 10 minutos.
  3. Remova o wafer de silício da placa quente e esfrie-o à temperatura ambiente. Limpe novamente o wafer com ar comprimido antes de prosseguir com o revestimento de giro. Aplique 4 mL do fotoresist SU-8 2075 no centro do wafer.
  4. Obtenha uma altura de característica de 70 μm no revestimento de giro da seguinte forma: primeiro gire para 12 s a 500 rpm e, em seguida, gire por 50 s a 2.100 rpm.
  5. Asse suavemente o wafer em uma placa de aquecimento da seguinte forma: primeiro asse por 8 min a 65 °C e depois asse por 20 min a 95 °C. Em seguida, remova o wafer de silício da placa quente e esfrie-o à temperatura ambiente antes da litografia.
  6. Coloque uma máscara fotográfica no filme fotoresistista. Exponha o wafer com um equipamento de litografia para alcançar uma exposição total de 200 mJ/cm2.
    NOTA: O fotomask contém nove conjuntos de padrões do chip, para que possa fabricar nove chips de brotação microfluídicas cada vez.
  7. Poste exponha o wafer em uma placa de aquecimento da seguinte forma: primeiro asse por 5 min a 65 °C e depois asse por 20 min a 95 °C. Em seguida, remova o wafer de silício da placa quente e esfrie-o à temperatura ambiente antes de se desenvolver.
  8. Transfira o wafer para uma placa de vidro Petri cheia de desenvolvedor SU-8 (PGMEA) para começar a desenvolver.
    ATENÇÃO: O desenvolvedor é irritante para os olhos e trato respiratório. Executar desenvolvendo-se em um capô de fumaça. Use óculos de respingo, luvas de nitrito e máscara aérea durante a operação.
  9. Agite o prato suavemente ao longo da direção do canal de fluxo e mude o desenvolvedor após 10 minutos.
  10. Repita o passo 1.9 3-5 vezes até que os padrões possam ser claramente observados.
    NOTA: Certifique-se de que não há resíduo fotoresistista no wafer, caso contrário, enxágue novamente o wafer no desenvolvedor.
  11. Transfira o wafer para uma placa de aquecimento pré-aquecido a 120 °C e asse por 30 minutos.
  12. Pipet 35 μL de silano em uma mancha de cobertura, em seguida, coloque o deslizamento de tampa junto com o wafer em um desiccator e puxe o vácuo. Selar o dessecante e deixar o wafer sob vácuo por 4h para silanizar o wafer para evitar a adesão do PDMS durante os processos de litografia macia.
    ATENÇÃO: A silane é tóxica. Para evitar o envenenamento, realize a silanização no capô da fumaça e use luvas de nitrito durante o manuseio.
  13. Solte o vácuo do desiccator. Retire o wafer silanizado em uma placa de aquecimento pré-aquecido e asse a 65 °C por 2h.
  14. Armazene o wafer em uma placa de Petri limpa até que seja necessário.

2. Fabricação de chips de broto microfluido

  1. Combine 20 g de agente base e 2 g de agente de cura (proporção 10:1) em um béquer plástico e misture-os completamente com uma haste de mistura.
  2. Coloque o béquer em um desiccador e puxe o vácuo por 1h para remover bolhas de ar na mistura PDMS.
  3. Despeje a mistura PDMS sobre o wafer na placa de Petri e coloque a placa de Petri de volta no desiccador, desgaseando por mais 30 minutos.
    NOTA: É útil usar fita adesiva de dois lados para colar o wafer na parte inferior da placa de Petri para garantir que o wafer seja mantido horizontal durante a desgaseamento e cura.
  4. Retire a placa de Petri do desiccador e coloque-a em um forno seco de 80 °C por 3h para curar.
  5. Separe cuidadosamente a camada PDMS do wafer e corte a camada para nove chips com um bisturi de acordo com o padrão.
    NOTA: Mantenha o lado do recurso para cima após a separação.
  6. Soque duas portas de injeção de hidrogel e quatro portas de injeção de mídia de cada chip usando um soco de 1 mm e uma biópsia de 3,5 mm, respectivamente.
  7. Limpe os chips perfurados com fita sem resíduos para remover resíduos PDMS. Coloque os chips e nove tampas de vidro em um limpador de plasma e trate-os com plasma de oxigênio por 30 s para formar laços covalentes na superfície.
  8. Tire as fichas e as tampas. Conecte o lado do recurso dos chips nas tampas.
  9. Coloque as lascas fixadas em um forno seco de 80 °C por 1h para intensificar a ligação.
  10. Autoclave os chips antes de usar e mantenha-os estéreis para o resto do procedimento.

3. Modificação de superfície e injeção de hidrogel

  1. Para cada chip, pipet 40 μL de 1 mg/mL poli-D-lysine (PDL) e injete-o em canais no chip a partir da porta de injeção de hidrogel.
    NOTA: Certifique-se de que o PDL preencha os canais, especialmente em canais estreitos perto das portas.
  2. Incubar os chips a 37 °C por 4h para modificar a superfície do PDMS .
  3. Pipet 200 μL de água estéril e injetá-la em canais no chip da porta de injeção de hidrogel para lavar PDL.
  4. Remova as lascas em um forno seco de 120 °C por 3h para restaurar a hidroofobidade.
  5. Coloque no gelo um tubo estéril e calcule o volume do colágeno tipo I a ser usado como a seguinte equação.
    Volume final (50 μL) x Concentração final de colágeno (3 mg/mL nesta pesquisa) / Concentração em garrafa = colágeno de volume a ser adicionado
  6. Calcule o volume de NaOH a ser usado como a seguinte equação.
    (colágeno de volume a ser adicionado) x 0,023 = volume 1 N NaOH
  7. Prepare 50 μL de hidrogel no tubo como o seguinte protocolo: adicionar 5 μL de 10x PBS, 0,5 μL de vermelho fenol, volume calculado de 1 N NaOH, 4 μL de 1 mg/mL Fibronectin, volume calculado de colágeno tipo I por sua vez. Adicione a quantidade adequada de dH2O para que o volume total atinja 50 μL. Misture bem todo o conteúdo do tubo.
    NOTA: Realize todas as operações no gelo. Use o vermelho fenol como um indicador à base de ácido para auxiliar na determinação visual do pH do hidrogel. O hidrogel final acaba laranja quando o pH é de cerca de 7,4 e a rigidez é de cerca de 15 kPa49.
  8. Pipet 2-3 μL de hidrogel para cada chip e injetá-lo lentamente no canal central de hidrogel a partir da porta de injeção de hidrogel.
  9. Incubar os chips a 37 °C por 30 min para permitir a gelação.
    NOTA: Sele os chips em uma caixa selada com 1 mL de água estéril se não forem usados imediatamente. Os chips selados podem ser armazenados a 37 °C no máximo 24 h.

4. Semeadura celular

  1. Pipet 20 μL de 125 μg/mL Fibronectin em uma porta de injeção de mídia do canal de cultura celular.
  2. Corte uma ponta de pipeta para caber na porta do canal de cultura celular com uma tesoura.
  3. Insira a ponta da pipeta na outra porta de injeção de mídia do canal de cultura celular. Em seguida, pipet fora ar do canal de cultura celular para preenchê-lo com Fibronectina.
  4. Incubar os chips a 37 °C por 1h.
  5. Antes da semeadura celular, pipet 20 μL de mídia ECM em cada porta de injeção de mídia e incubar os chips a 37 °C por 30 min.
  6. Em seguida, pipet toda a mídia em todas as portas de injeção de mídia.
  7. Em seguida, pipet 5 μL de suspensão celular em uma porta de injeção de mídia do canal de cultura celular. Em seguida, as células endoteliais rapidamente se espalham por todo o canal sob pressão hidrostática diferencial.
    NOTA: Prepare a suspensão celular tentando experimentar células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) a partir do frasco de cultura e centrifificando-as a 400 x g. Em seguida, resuspende as células para 107 células/mL em um tubo.
  8. Adicione cerca de 4-6 μL de mídia ECM à outra porta para ajustar a pressão hidrostática e parar o movimento da célula.
  9. Remova os chips para a incubadora de células. Em seguida, vire os chips a cada 30 minutos até que as células endoteliais se erquem ao redor da superfície interna do canal de cultura celular 2 h depois(Figura 1).
    NOTA: Para fazer o chip de cabeça para baixo, coloque um pouco de água na parte de trás da tampa. Em seguida, o chip pode anexar à tampa da placa de Petri.
  10. Use a ponta da pipeta para remover as células anexadas nas portas de injeção com muito cuidado.
  11. Em seguida, insira quatro adaptadores luer femininos farpados nas portas de injeção de mídia e encha com mídia ECM.
    NOTA: Os adaptadores podem funcionar como reservatórios fluidos para fornecer nutrientes para as células do canal.
  12. Remova os chips para a incubadora de células. Alterar a mídia ECM em adaptadores Luer a cada 12 h.

5. Medição da permeabilidade difusa do FITC-dextran

NOTA: Para avaliar a função da barreira do micro-vaso, a permeabilidade difusa do canal de cultura CE com ou sem forro celular é avaliada.

  1. Tire um chip de brotação microfluido com hidrogel injetado.
  2. Repita as etapas 4.1-4.6.
  3. Remova todos os adaptadores Luer e descobre todas as mídias em quatro portas de injeção de mídia.
  4. Coloque o chip no microscópio de varredura a laser confocal.
  5. Pipet 5 μL de mídia de cultura contendo 500 μg/mL 40 kDa FITC-dextran para uma porta de canal de cultura celular.
    NOTA: 40 kDa FITC-dextran tem tamanho molecular semelhante ao VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Capture imagens a cada 3 s por 30 s. Assim, a permeabilidade difusa sem forro celular é medida.
  7. Tire o chip de brotação microfluido depois que os HUVECs forem confluentes no canal de cultura celular.
  8. Repita as etapas 5.3-5.5.
  9. Capture imagens a cada 3 s por 30 s. Assim, a permeabilidade difusa com forro celular é medida.
  10. Calcule a permeabilidade difusa ao quantificar alterações de intensidade fluorescente ao longo do tempo usando a seguinte equação modificada50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)· Δt) · S/d
    onde, Pd é o coeficiente de permeabilidade difusivo, I1 é a intensidade média em um ponto de tempo inicial, I2 é a intensidade média após o tempo delta(Δt), Ib é a intensidade de fundo, S é a área do canal em imagens de fluorescência, e d é o intervalo total de micro-postes em imagens de fluorescência. No presente trabalho, Δt é definido como 9 s.
    NOTA: A equação atual é ligeiramente diferente da50original, devido à direção de difusão da fluorescência no chip é apenas do canal CE ao canal de hidrogel, o que não é como o tubo circular difundindo em toda a direção radial.

6. Configuração do sistema de controle microfluido

NOTA: O sistema de controle microfluido no presente estudo é composto por uma bomba de micro-seringa, uma válvula de pinça eletromagnética, um chip de armadilha de bolhas, um chip microfluido, uma bomba micro-peristáltica e um reservatório. Cada parte do sistema pode ser substituída por alternativas capazes de executar a mesma função.

  1. Fabricação de chip de armadilha de bolhas
    NOTA: O chip de armadilha de bolhas é usado para remover bolhas de ar em circulação. O chip consiste em três camadas PDMS. A camada superior é construída usando litografia macia para formar estrutura de grade como a câmara líquida. Cada canal da estrutura da grade tem 100 μm de largura. A camada inferior é um pedaço PDMS com um buraco. Entre as duas camadas, um filme PDMS fino de 100 μm é colocado.
    1. Repita o passo 1 para preparar o wafer para o chip de armadilha de bolhas.
    2. Repita as etapas 2.1-2.5 para fabricar a camada superior e a camada inferior do chip de armadilha de bolhas.
      NOTA: A máscara fotográfica da camada superior contém três conjuntos de padrões, então corte a camada PDMS para três chips de acordo com o padrão.
    3. Faça seis furos na extremidade dos canais de entrada e saída da camada superior usando um soco de biópsia de 3,5 mm.
    4. Faça dois furos na posição correspondente da camada inferior usando um soco de biópsia de 6 mm de acordo com o padrão na camada superior.
    5. Repita as etapas 2.1-2.2 para preparar 10 g de mistura PDMS e despeje-a no centro de um wafer de silício limpo.
    6. Fabricar um filme PDMS de 100 μm aplicando o seguinte protocolo de giro: girar para 15 s a 500 rpm, aumentar a velocidade de giro para 1.300 rpm e manter aqui por 45 s.
    7. Transfira o wafer para uma placa de aquecimento pré-aquecido a 180 °C e asse por 30 minutos.
    8. Limpe as camadas perfuradas com fita sem resíduos para remover resíduos PDMS. Coloque as camadas superiores e o wafer em um limpador de plasma e trate-as com plasma de oxigênio por 30 s para formar laços covalentes na superfície.
    9. Tire as camadas superiores e o wafer. Conecte o lado do recurso das camadas superiores ao filme PDMS.
    10. Corte o filme cuidadosamente ao longo da borda das camadas superiores com uma agulha.
    11. Lentamente separe o filme do wafer e vire os chips para fazer o filme ficar lado a lado após a separação.
    12. Coloque as camadas inferiores e os chips conectados em um limpador de plasma e trate-as com plasma de oxigênio para 30 s novamente.
    13. Tire camadas inferiores e chips conectados. Conecte as camadas inferiores ao filme PDMS e os chips de armadilha de bolhas são feitos.
      NOTA: Alinhe os orifícios na camada inferior com os padrões na camada superior ao anexar.
    14. Coloque as lascas em um forno seco de 80 °C por 1h para intensificar a ligação.
  2. Monte o sistema de controle microfluido
    NOTA: Todas as partes do sistema, como chip de armadilha de bolhas, reservatório, tubos e conectores são usadas após a esterilização automática, exceto equipamentos eletrônicos. Monte o sistema de controle microfluido em um banco limpo.
    1. Para montar o sistema de controle microfluido, prepare dois tubos de politetrafluoroetileno, dois tubos curtos de silicone, três tubos de silicone longos, um adaptador luer feminino farpado, um conector tipo Y e três conectores tipo L.
      NOTA: A vantagem do tubo de politetrafluoroetileno é a baixa elasticidade, portanto, menos mídia é necessária no pipeline. O tubo de silicone, em contraste, tem alta elasticidade, portanto, é adequado para a válvula de beliscão e a bomba peristáltica.
    2. Encha a seringa com 10 mL de meio ECM pré-aquecido (37 °C).
      NOTA: O pré-aquecimento ajuda o gás dissolvido de liberação média.
    3. Conecte um tubo de politetrafluoroetileno à seringa por um adaptador luer fêmea farpado. Em seguida, conecte a outra extremidade do tubo de politetrafluoroetileno a um conector do tipo Y.
    4. Em seguida, conecte dois tubos de silicone longos às outras duas extremidades do conector tipo Y com um tubo que se conecta ao reservatório e o outro tubo que se conecta ao chip de armadilha de bolhas.
    5. Conecte outro tubo de silicone longo ao reservatório.
    6. Em seguida, use dois tubos curtos de silicone para conectar todos os orifícios de entrada e saída na camada superior do chip de armadilha de bolhas. Conecte um tubo de politetrafluoroetileno ao backend do chip.
    7. Em seguida, fixe a seringa na bomba de micro-seringa.
    8. Corte dois tubos de silicone longos na válvula de beliscão eletromagnética.
    9. Em seguida, troque a válvula de beliscão eletromagnética para abrir o gasoduto entre a seringa e o reservatório. Injete a mídia no reservatório usando uma bomba de micro-seringa para esgotar o ar no tubo.
    10. Em seguida, troque a válvula novamente para abrir o gasoduto entre a seringa e o chip de armadilha de bolhas. Injete a mídia para encher a câmara líquida e o tubo de encosto do chip de armadilha de bolhas.

7. Ensaio de broto endotelial

NOTA: Uma incubadora de topo de estágio montada com microscópio de contraste de fase é utilizada no presente estudo para observar o processo de brotação em tempo real. A incubadora superior do estágio pode manter a temperatura, a umidade e o controle de CO2 em estágios de microscópio, sendo bom para imagens de células vivas. Mas o equipamento não é necessário para o ensaio. Os protocolos aqui fornecidos também podem ser trabalhados em uma incubadora celular básica.

  1. Retire chips endoteleliais da incubadora celular.
  2. Em seguida, remova os adaptadores Luer no lado da cultura celular. Insira dois plugues de tubo nas portas de injeção de hidrogel do chip de brotação microfluida.
    NOTA: Os plugues podem se transformar a partir de agulhas e sua principal função é evitar que a mídia derrame.
  3. Conecte o tubo backend do chip de armadilha de bolhas a uma porta de canal de cultura celular.
    NOTA: Certifique-se de que não há bolhas no tubo antes da conexão.
  4. Insira um conector tipo T na outra porta e conecte-o a um tubo de silicone longo conectado com o reservatório.
  5. Corte o tubo de silicone longo na bomba micro-peristáltica.
  6. Em seguida, insira um filtro de ar no reservatório.
  7. Em seguida, monte o chip de brotação microfluidic para a incubadora de topo do palco.
  8. Em seguida, conecte a bomba de vácuo aos orifícios na camada inferior do chip de armadilha de bolhas com um tubo TPU.
  9. Configure o volume de circulação e a taxa de fluxo no programa personalizado, que controla a bomba de micro-seringa e a válvula de beliscão eletromagnética simultaneamente(Figura 2).
    NOTA: A taxa de fluxo através do canal de cultura celular endotelial é calculada de acordo com a equação clássica.
    τ = 6μQ / Wh2
    onde, τ é o estresse de cisalhamento (dyn/cm2), μ é viscosidade do meio (8,8 x 10-4 Pa•s), Q é a taxa de fluxo através do canal de cultura celular endotelial (ml/s), h é altura do canal (70 μm), e W é largura de canal (1.000 μm). A viscosidade do meio é medida usando um viscometro rotacional tipo cilindro coaxial. A altura e largura do canal são predeterminadas e confirmam manualmente usando um microscópio de contraste de fase na ampliação de 4x. O volume de circulação é de 5 mL e a vazão é de 85 μL/min (média de 0,2 m/s no canal de cultura celular) para 15 dyn/cm2 cisalhamento de acordo com o cálculo.
  10. Em seguida, configure a taxa de fluxo da bomba micro-peristáltica.
    NOTA: A taxa de fluxo da bomba micro-peristáltica é ligeiramente maior do que a bomba de micro-seringa, a fim de evitar que a mídia derrame.
  11. Ligue a bomba de micro-seringa. Em seguida, o sistema de controle de circulação é estabelecido.

8. Análise de dados

NOTA: Para quantificar os brotos, calculou-se a área normalizada de broto, comprimento médio do broto e maior comprimento do broto. Os resultados representam ± SEM obtidos em três estudos independentes. A significância estatística (P < 0,05) é avaliada pelo teste t-do-aluno.

  1. Fixar células e brotos no chip de brotação microfluido após experimentos com 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos. Núcleos de manchas com 4′,6-diamidino-2-fenilídeos (DAPI; 1: 1000; Sigma-Aldrich) por 10 min e depois mancha citoesqueleto com fálica TRITC (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) por 1h. Lave as células com PBS três vezes em intervalos de 5 minutos entre cada passo.
  2. Pegue imagens confocal dos chips em um modo de revestimento e costure-os usando software de edição de imagem.
  3. Conte o número de pixels fluorescentes de imagens de projeção Z usando um código personalizado em software de programação para quantificar a área normalizada de broto (Ver Arquivo Suplementar).
  4. Identifique e rotule manualmente cada ponta de brotos em imagens de projeção Z e calcule distâncias entre as pontas dos brotos até a membrana do porão dos CES usando outro código personalizado para quantificar o comprimento médio do broto e o maior comprimento do broto (Ver Arquivo Suplementar).

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Representative Results

O modelo 3D in vitro para imitar o evento inicial de neovascularização (MIEN) apresentado aqui consistia em um chip de broto microfluido e um sistema de controle microfluido. O chip de broto microfluido foi otimizado a partir das publicações anteriores22,23,37,40,51,52,53. Resumidamente, continha três canais e seis portas: um canal de cultura celular endotelial e um canal líquido com quatro portas de injeção de mídia, e um canal central de hidrogel com duas portas de injeção de hidrogel(Figura 3). O sistema de controle microfluido consistia em uma bomba de micro-seringa, uma válvula de beliscão eletromagnética, um chip de armadilha de bolhas, uma bomba micro-peristáltica e um reservatório médio de cultura(Figura 4). Um programa personalizado foi utilizado para controlar a bomba de micro-seringa e a válvula de beliscão eletromagnética simultaneamente, com a qual a taxa de fluxo e o volume de circulação podem ser configurados. Um volume de compensação foi introduzido para corrigir a ligeira mudança de volume após vários ciclos devido a erro sistêmico. Para minimizar o meio utilizado para a perfusão, foi introduzida uma válvula de beliscão eletromagnética para reciclagem média. A válvula de beliscão eletromagnética poderia alternar entre dois estados para fazer o sistema microfluido em duas fases em um ciclo. Na fase de injeção, o meio de cultura foi lentamente injetado da bomba de micro-seringa para o chip de broto microfluido. Enquanto na fase de reciclagem, o meio de cultura foi muito rapidamente extraído do reservatório de volta para a bomba de micro-seringa.

A função de barreira do microimposto em nosso modelo MIEN foi avaliada medindo o coeficiente de permeabilidade difusional(Pd)de 40 kDa FITC-dextran. Como é mostrado na Figura 5, o Pd do chip estático cultivado com revestimento celular é de 0,1 ± 0,3 μm/s, e o Pd do canal vazio sem forro de célula é de 5,4 ± 0,7 μm/s. Em seguida, o ensaio de broto endotelial sob estática e perfusão foi realizado no modelo MIEN. Em condições estáticas, o broto endotelial ocorreu cerca de 4h após a semeadura e os brotos migrariam através do canal hidrogel central para o outro lado em cerca de 48 h. Os brotos se degradaram gradualmente após 48 h. Enquanto após 24h de exposição a 5 ou 15 dyn/cm2 cisalhamento (média 0,07 ou 0,2 m/s no canal de cultura celular), os CEs alinhados na direção de fluxo mudando de forma poligonal, paralepípedos em fusiforme, e o grau de broto diminuiu com o aumento do estresse da cisalhamento(Figura 6). No entanto, os brotos em condições de tesoura foram mais estáveis do que em condições estáticas de cultura. Eles poderiam manter mais de 48 h sob perfusão. Estatísticas quantitativas mostraram que o broto endotelial diminuiu significativamente em termos de área de broto, comprimento médio do broto e maior comprimento de broto(Figura 7).

Figure 1
Figura 1: As células endoteliais se vestem ao redor da superfície interna do canal de cultura celular. Os HUVECs são uniformemente dispersos no canal de cultura celular 2 h após a semeadura celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: O programa personalizado utilizado para controlar a bomba de micro-seringa e a válvula de beliscão eletromagnética simultaneamente. Página principal (para cima) e sub-página (para baixo) do programa personalizado com o qual a taxa de fluxo e o volume de circulação podem ser configurado. Um volume de compensação foi introduzido para corrigir a ligeira mudança de volume após vários ciclos devido a erro sistêmico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: O esquema do chip de broto microfluido. O chip contém três canais e seis portas: um canal de cultura celular endotelial e um canal líquido com quatro portas de injeção de mídia, e um canal central de hidrogel com duas portas de injeção de hidrogel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: O esquema do sistema de controle microfluido. O sistema de controle microfluido consiste em uma bomba de micro-seringa, uma válvula de beliscão eletromagnética, um chip de armadilha de bolhas, uma bomba micro-peristáltica e um reservatório médio de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Permeabilidade difusa(Pd)de 40 kDa FITC-dextran. O Pd de chip estático cultivado com revestimento celular é de 0,1 ± 0,3 μm/s, e o Pd do canal vazio sem forro de célula é de 5,4 ± 0,7 μm/s. **, p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Imagens representativas do endotelial brotando em diferentes condições de tesoura. Após 24 horas de cultivo estático, huvecs invadem do canal de cultura celular para o canal de hidrogel adjacente através de micro-postes e um grande número de brotos no hidrogel. Enquanto depois de 24 horas de exposição a 5 ou 15 dyn/cm2 estresse de tesoura, o grau de brotação diminui, obviamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Área quantificada de broto, comprimento médio do broto e maior comprimento de broto. Após 24h de cultura estática (S0) ou exposição a 5 (S5) ou 15 (S15) dyn/cm2 estresse de tesoura, o grau de brotação diminui com o aumento do estresse da tesoura. *, p < 0,05; **, p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Por muito tempo, a observação em tempo real da neovascularização tem sido um problema. Várias abordagens foram desenvolvidas recentemente para criar forro de vasos perfumados com CEs e adjacentes à matriz extracelular para brotar22,32,40,46,54, mas o microambiente mecânico ainda é difícil de manter constantemente. Continua sendo um sujeito difícil de imitar o microambiente biomecânico inicial das CE, que são submetidos a alto estresse de cisalhamento luminal e baixa velocidade de fluxo transendotelial. Aqui, apresentamos um modelo MIEN que simula primeiro o evento inicial de neovascularização no microambiente fisiológico imitador. Com o modelo MIEN, a perfusão automática, eficiente e sem bolhas a longo prazo é alcançada. O estresse da cisalhamento luminal em CEs pode ser alterado opcionalmente a qualquer momento durante experimentos com fluxo transendotelial permanecendo em nível fisiológico.

A chave do modelo MIEN é desacoplar o efeito do fluxo luminal em CEs do fluxo transendotelial. Para isso, um conector do tipo T é inserido criativamente na porta de saída do canal de cultura CE. Uma extremidade do conector está conectada ao reservatório através da bomba micro-peristáltica. A outra extremidade do conector está exposta ao ar da incubadora. Mantém a pressão dentro do canal de cultura celular endotelial da mesma forma que a pressão atmosférica, uma vez que não há nenhuma coleta de mídia excedente para aumentar a pressão nem o excesso de mídia sendo retirado para formar pressão negativa no canal. Desta forma, a resistência ao fluxo após o chip de brotação microfluida é muito pequena para que o fluxo transendotelial possa ser mantido na faixa fisiológica mesmo sob alto estresse de cisalhamento luminal.

Um passo crítico dentro do protocolo é a injeção bem sucedida de hidrogel no canal de hidrogel central. Huang et al. propuseram que o preenchimento bem sucedido dos géis depende do equilíbrio das forças capilares e da tensão superficial dentro do canal de gel microfluidic55. Encontraram três variáveis diferentes para controlar o equilíbrio: o espaçamento entre microatos, as propriedades superficiais do dispositivo e a viscosidade das soluções precursoras do hidrogel. No modelo atual, o design do chip de broto microfluido é otimizado a partir de trabalhos anteriores22,23,37,40,51,52,53. A geometria e o espaçamento de micro-postagens para separar três canais são determinados com base em cálculos anteriores e numerosos experimentos. Além disso, o revestimento PDL e o cozimento de alta temperatura são realizados para modificar a superfície PDMS; portanto, ajuste o equilíbrio entre hidrofilicidade e hidroofobidade antes da injeção de hidrogel.

O outro passo crítico do protocolo é a remoção de bolhas. Uma grande quantidade de ar se dissolverá em meio de circulação durante o experimento devido ao conector tipo T e bomba micro-peristáltica, resultando em bolhas em circulação e afetando muito a função das células endoteliais. Para remover bolhas, um chip de armadilha de bolhas é introduzido antes do chip de broto microfluido. Funciona com base na alta permeabilidade do gás da membrana PDMS. Quando as bolhas entram na armadilha, elas são dispersas pela pequena e densa estrutura da grade e presas devido à pressão negativa gerada pela bomba de vácuo para que elas não se movam para a frente no chip de brotação microfluida. Além disso, as bolhas transportam através da membrana PDMS para o orifício de pressão negativo conectado à bomba de vácuo e desaparecem eventualmente. Mesmo assim, deve-se prestar muita atenção à formação de bolhas durante o experimento. Assim que as bolhas forem encontradas antes do chip de brotação microfluido no oleoduto, pare a bomba de micro-seringa imediatamente. Vire suavemente o oleoduto com o dedo para deixar as bolhas se moverem para o chip de armadilha de bolhas e ser removido.

Embora o microambiente inicial da neovascularização seja parcialmente recapitulado, existem algumas limitações para este modelo MIEN. Os microambientes mecânicos das células endoteliais, como o estresse da tesoura induzida pelo sangue e a rigidez da matriz extracelular estão mudando durante os processos de neovascularização. Antes da neovascularização, a membrana do porão endotelial ainda está intacta com função de barreira completa, resultando em alto estresse luminal de cisalhamento com baixa velocidade de fluxo transendotelial e fluxo intersticial8,9. No início da angiogênese e arteriogênese, um evento marcante é a mediação de metaloproteases matricial (MMPs) da degradação do porão, o que aumentará a permeabilidade e a matriz de remodelação das CES, levando a mudanças nos microambientes mecânicos, como o estresse da tesoura induzida pelo sangue e a rigidez da matriz extracelular. No presente trabalho, focamos no início da neovascularização para que os ambientes mecânicos dentro do chip de brotação microfluidic sejam projetados para se manterem estáveis para simular as condições fisiológicas. No entanto, mudanças de microambientes mecânicos ocorrerão com os CEs brotando, assim como in vivo. Além disso, semelhante a muitos estudos anteriores34,53,56, o modelo atual toma o hidrogel de colágeno como uma matriz extracelular. À medida que nos concentramos no efeito do estresse de cisalhamento induzido pelo fluxo, apenas um hidrogel de rigidez é usado. No entanto, considerando o importante efeito da rigidez matricial no comportamento celular e na neovascularização, diferentes rigidezs de colágeno devem ser estudadas e podem ser alcançadas regulando o pH do colágeno, uma vez que as propriedades mecânicas do colágeno dependem de seu pH49. Mas é importante notar que o hidrogel precisa ser completamente enxaguado com PBS para remover ácidos ou bases residuais antes da semeadura celular para evitar danos às células. Além disso, para imitar os componentes complexos do ECM in vivo,vários hidrogéis como Matrigel, ácido hialurônico (HA) e fibrinogen etc. devem ser usados no futuro para melhorar o modelo atual. A tensão cíclica induzida pela pressão arterial é outra importante força hemodinâmica que modula a morfologia e as funções das células vasculares57. Estudos anteriores mostraram que a tensão da tensão aumentou a expressão de fatores angiogênicos nas células-tronco mesenquimais humanas58 e induziu angiogênese por degradação do colágeno tipo IV na membrana do porão endotelial vascular59. Esses resultados indicaram que a tensão induzida pela pressão arterial pode afetar também a neovascularização. O modelo atual se concentra no efeito do estresse de cisalhamento induzido pelo fluxo, por isso não é aplicável introduzir tensão, pois o hidrogel não gruda firmemente o suficiente no canal e cairá quando esticado. Vamos prestar atenção para superar essa dificuldade em obras futuras.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (grant nº 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 e 32071311), programa nacional de pesquisa e desenvolvimento da China (grant nº 2016YFC110101 e 2016YFC1102202), o Projeto 111 (B13003) e a Fundação de Ciências Naturais de Pequim (4194079).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285

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Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização
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Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).

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