Summary
אנחנו מציגים פרוטוקול לבדיקת האכלה של שתי אפשרויות לזבובים. מבחני האכלה אלה מהירים וקלים להפעלה ומתאימים לא רק למחקר מעבדה בקנה מידה קטן, אלא גם למסכים התנהגותיים בעלי תפוקה גבוהה בזבובים.
Abstract
כדי לבחור מזון בעל ערך תזונתי תוך הימנעות מצריכת חומרים מזיקים, בעלי חיים זקוקים למערכת טעם מתוחכמת וחזקה כדי להעריך את סביבת המזון שלהם. זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, הוא אורגניזם מודל המתוח גנטית המשמש באופן נרחב לפענוח היסודות המולקולריים, התאיים והנוירונים של העדפת מזון. כדי לנתח העדפת מזון זבוב, יש צורך בשיטת האכלה חזקה. המתואר כאן הוא שתי אפשרויות האכלה, שהוא קפדני, חסכוני, ומהיר. ההסתעפות מבוססת פטרי-צלחת וכוללת תוספת של שני מזונות שונים בתוספת צבע כחול או אדום לשני חצאי המנה. לאחר מכן, ~ 70 prestarved, זבובים 2-4 יום מונחים בצלחת מותר לבחור בין מאכלים כחולים ואדומים בחושך במשך כ 90 דקות. בחינת הבטן של כל זבוב מלווה בחישוב מדד ההעדפות. בניגוד לצלחות multiwell, כל צלחת פטרי לוקח רק ~ 20 s כדי למלא וחוסך זמן ומאמץ. זה מבחני האכלה ניתן להעסיק כדי לקבוע במהירות אם זבובים כמו או לא אוהב מזון מסוים.
Introduction
למרות הבדלים דרמטיים במבנה האנטומי של איברי הטעם בין זבובים ליונקים, התגובות ההתנהגותיות של הזבובים לחומרים טעימים רבים דומות להפליא לאלה של היונקים. לדוגמה, זבובים מעדיפים סוכר1,2,3,4,5,6,7,8, חומצות אמינו9,10, ומלח נמוך11, אשר מצביעים על חומרים מזינים, אבל לדחות מזונות מרים12,13,14,15 כי הם unpalatable או רעיל. במהלך שני העשורים האחרונים, זבובים הוכיחו להיות אורגניזם מודל בעל ערך רב לקידום ההבנה של שאלות בסיסיות רבות הקשורות תחושת טעם וצריכת מזון, כולל גילוי טעים, התמרת טעם, פלסטיות טעם, תקנת האכלה16,17,18,19,20. למרבה הפלא, מספר מחקרים הראו כי מנגנוני התמרת הטעם והמעגל העצבי שבבסיס תפיסת הטעם מקבילים בין זבובי פירות ליונקים. לכן, זבוב הפירות משמש כאורגניזם ניסיוני אידיאלי, המאפשר לחוקרים לחשוף מושגים ועקרונות שמורים מבחינה אבולוציונית השולטים בזיהוי וצריכת מזון בממלכת החי.
כדי לחקור את תחושת הטעם בזבובים, חיוני להקים מבחנה מהירה וקפדנית למדידת העדפת מזון באופן אובייקטיבי. במהלך השנים, שיטות האכלה שונות, כגון מבחנים מבוססי צבע11,12,13,21,22,23, תגובת הארכת פרובוסיס זבוב24, מאכיל נימי (CAFE) assay25,26, מונה האינטראקציה של Fly Liquid-Food (FLIC) assay27, ושיטות קומבינטוריות אחרות פותחו כדי למדוד כמותית העדפת מזון ו / או צריכת מזון עבור זבובי פירות28,29,30,31. אחת מפרדיגמות ההאכלה הפופולריות היא מבחני האכלה דו-ברירה המבוססים על צבע באמצעות צלחת מיקרוטיטר רב-ערוצית12,21,32 או, כמתואר כאן, צלחת פטרי קטנה11,22 כתא האכלה. בדיקה זו מתוכננת על בסיס שקיפות הבטן של הזבוב. במהלך חקירה זו, זבובים ממוקמים לתוך תא ההאכלה ומוצגים עם שתי אפשרויות מזון מעורבב עם צבע אדום או צבע כחול. לאחר השלמת ההסמכה, הבטן לעוף מופיעים אדום או כחול תלוי איזה מזון הם צורכים.
הן צלחת פטרי והן מבחני האכלה מבוססי צבע רב-תכליתי הם חזקים מאוד ומניבים בערך את אותן תוצאות. באמצעות שתי מבחנים אלה, תגליות חשובות רבות פריצות דרך נעשו לקראת פענוח קולטנים מגוונים מאוד תאים האחראים על חישת טעמי מזון ומרקם מזון11,12,21,22,32,33. במהלך ההסמכה המבוססת על צבע, צעד ניסיוני אחד הדורש זמן ומאמץ ניכרים הוא הכנה והעמסה של מזון לתא ההזנה. כדי להפחית את זמן הכנת המזון והטעינה, מבחנה זו שונתה על ידי החלפת צלחת microtiter multiwell עם צלחת פטרי קטנה, אשר מחולק לשני תאים שווים. ב בדיקה המבוססת על צלחת פטרי, שני מזונות שונים בתוספת צבע כחול או אדום מתווספים שני חצאים של המנה. לאחר מכן, ~ 70 prestarved, זבובים 2-4 יום מונחים בצלחת מותר לבחור בין מאכלים כחולים ואדומים בחושך במשך כ 90 דקות. הבטן של כל זבוב נבדקת לאחר מכן, ומדד ההעדפות (PI) מחושב.
מבחני האכלה דו-ברירה המבוססים על פטרי הם זולים, פשוטים ומהירים. צלחת אחת multiwell דורש כ 110 s כדי למלא, ואילו כל צלחת פטרי לוקח רק ~ 20 s. בנוסף, צלחת multiwell דורש צינור כמויות קטנות של מזון לתוך מספר גדול של בארות קטנות (למשל, 60 או יותר בארות לכל צלחת), אשר דורש דיוק ניכר ותשומת לב. לעומת זאת, ההסתעפות המבוססת על צלחת פטרי דורשת רק שתי פעולות לכל צלחת. כמו מבחני האכלה יכול לכלול מספר רב של עותקים משוכפלים, Assay מבוסס צלחת פטרי חוסך כמות לא טריוויאלית של זמן ומאמץ. בדיקה זו נותנת תוצאות שוות ערך לאלה של הבדיקה מבוססת multiwell והוכיחה מוצלחת בהתמודדות עם שאלות בסיסיות רבות בתחושת הטעם, כולל קידוד טעם מלח11, פלסטיות טעם שונה על ידי ניסיון מזון22, ואת הבסיס המולקולרי של תחושת מרקם מזון33. לסיכום, זה פטרי-צלחת מבוסס שתי אפשרויות assay הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור כיצד זבובים לתפוס milieus מים מזינים חיצוניים ופנימיים כדי לעורר התנהגות האכלה מתאימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הרכבת תאי ההסתעפות
הערה: בעוד שפרוטוקול זה מתאר את השימוש בצלחת פטרי 35 מ"מ(איור 1A),ניתן להשיג את האפקט הרצוי באמצעות כל כלי אטום למים עם תחתית חלקה שניתן לחצות ולכסות.
- ראשית, חוצה צלחת פטרי 35 מ"מ מרופדת על ידי תיקון אורך פלסטיק (5 מ"מ רוחב ו 3 מ"מ גובה) לאורך קו האמצע עם דבק עמיד למים, ויוצרים שני תאים אטומים למים. אשר כי החותם הושלם כדי למנוע דליפה שיכולה להוביל לערבוב של שני מצעי מזון להיות assayed.
הערה: לאחר ההרכבה, יש לעשות שימוש חוזר במנגנון זה כל עוד החותם מחזיק מעמד.
2. הכנת בקבוקוני רעב
- הכן מספר מספיק של בקבוקוני זבוב פלסטיק ריקים; לאחר מכן, לדחוס באופן רופף פיסת נייר טישו בתחתית. לדחוס את נייר הרקמה מספיק שהוא ממלא את החלל, אבל לא כל כך הרבה שהוא יוצר מסה צפופה.
הערה: ודא כי אין סדקים עמוקים או קפלים ברקמה, כמו זה יכול להוביל זבובים להילכד. - מוסיפים ~ 3 מ"ל מים טהורים לבקבוקון כך שהרקמה רוויה לחלוטין, אך אין מים עומדים. ודא כי אין טיפות גדולות של מים עודפים על הקיר של הבקבוקון. לחלופין, תחליף agarose עבור נייר ספוג על ידי הכנת 1% w / v פתרון אגר (ללא סוכרוז) על ידי הוספת 5 מ"ל של 1% agarose לכל בקבוקון ריק ומאפשר agarose להתמצק בטמפרטורת החדר.
3. רעב רטוב של זבובים לפני הניסוי
- ליזום רעב 24 שעות לפני הזמן של הניסוי. תחת CO2 הרדמה, מיין קבוצות של ~ 70, 2-4 יום בן זבובים לתוך בקבוקוני רעב מוכן, תיוג כל בקבוקון עם הגנוטיפ וזמן של רעב.
4. הגדרת ריאגנט
- הכנת צבעים
הערה: לפני ביצוע כל הניסויים, חשוב לבצע בדיקה ראשונית כדי לקבוע את הריכוזים הנכונים של צבעים אדומים וכחולים לשימוש.- לבדיקת הבקרה, הכינו מגוון של דילולים לכל צבע, ובצעו את מבחני ההאכלה עם אותו מזון עם צבע צבע שונה. השתמש בתוצאות כדי לזהות ריכוזים של שני צבעים (אחד אדום, אחד כחול) המניבים PI של ~ 0 כאשר לא נוסף תרכובת ניסיונית (ראה סעיף 7).
הערה: לדוגמה, ריכוז הצבע הכחול הסופי תוקן ב 50 μM ונבדק נגד סדרה של ריכוזי צבע אדום. בהתבסס על עקומת מינון הצבע האדום, ריכוז הצבע האדום האופטימלי היה 210 מיקרומטר, מה שנתן הטיית צבע מינימלית (איור 1B). ריכוז צבע אדום גבוה יותר מניע זבובים להעדיף מזון אדום, ואילו ריכוז נמוך יותר מניע זבובים להעדיף מזון כחול. בזהירות לחדד ריכוזי צבע כחול או אדום במרווחים של μM 1, כמו הבדלים בסדר גודל זה גדול יותר יכול להשפיע על תוצאות ניסיוניות.
- לבדיקת הבקרה, הכינו מגוון של דילולים לכל צבע, ובצעו את מבחני ההאכלה עם אותו מזון עם צבע צבע שונה. השתמש בתוצאות כדי לזהות ריכוזים של שני צבעים (אחד אדום, אחד כחול) המניבים PI של ~ 0 כאשר לא נוסף תרכובת ניסיונית (ראה סעיף 7).
- הכנה של 1% agarose
- לשלב 0.5 גרם agarose ו 50 מ"ל של מים טהורים (או כמה רבים מהם) בכלי בטוח למיקרוגל. יש לחמם במיקרוגל את תמיסת האגרוז עד להמסה, תוך ערבובה לפי הצורך.
- הכנת רכיבי מזון אחרים
- ממיסים כל רכיב מזון, כולל סוכרוז ותרכובות ניסיוניות, במים בריכוז של פי 100 ומעלה של הריכוז הסופי שנבדק.
הערה: הנפח הכולל של כל מרכיב מזון הוסיף 1% אגר לא יעלה על 1 מ"ל לכל 10 מ"ל אגר מותך. אחרת, agarose עשוי להיות מדולל מדי ולא להתמצק כראוי.
- ממיסים כל רכיב מזון, כולל סוכרוז ותרכובות ניסיוניות, במים בריכוז של פי 100 ומעלה של הריכוז הסופי שנבדק.
- הכנת מדיית מזון
- מערבבים אגר, צבע, ואת התרכובת הניסיונית הרצויה בצינורות צנטריפוגה פוליפרופילן חרוט (15 או 50 מ"ל); להשתמש במים במקום טעים ניסיוני במזון הבקרה. לעשות זאת בזמן אגר הוא עדיין נוזלי לחלוטין ומערבבים ביסודיות באמצעות מערבל מערבולת. שמור את הצינורות באמבט מים 60 מעלות צלזיוס בזמן לא בשימוש כדי למנוע את agarose התקשות לפני להיות מופץ לכלים.
- הכנת מנות לניסוי
הערה: יש לוודא שכל המנות יבשות לחלוטין לפני שמתחילים.- פיפטה 1 מ"ל של מדיום מזון ניסיוני אדום לצד אחד של צלחת ההסתערות (איור 1A); חוזרים על הפעולה לקבלת מספר הכלים הרצוי. אפשרו לאגורוז להתקרר עד המשרד (3-5 דקות), ולאחר מכן פיפטה 1 מ"ל של מזון שליטה כחול לצד השני של הכלים(איור 1A). חזור על תהליך זה עם זוג כחול אדום /ניסיוני שליטה.
הערה: ודאו שכל המנות מוגדרות במלואן לפני תחילת הניסוי. השתמש בכלים בתוך 30 דקות.
- פיפטה 1 מ"ל של מדיום מזון ניסיוני אדום לצד אחד של צלחת ההסתערות (איור 1A); חוזרים על הפעולה לקבלת מספר הכלים הרצוי. אפשרו לאגורוז להתקרר עד המשרד (3-5 דקות), ולאחר מכן פיפטה 1 מ"ל של מזון שליטה כחול לצד השני של הכלים(איור 1A). חזור על תהליך זה עם זוג כחול אדום /ניסיוני שליטה.
5. ייזום מבחני ההאכלה הדו-כיווניים
- לשתק זמנית קווי זבוב ניסיוניים על קרח עד שלא נצפו פעילויות מוטוריות ברורות כגון טיסה וטיפוס. לאחר הזבובים משותקים, בעדינות להפוך את הבקבוקון, ולהקיש כדי להעביר את כל הזבובים לתוך תא ההסתערות.
הערה: הלם קר לוקח ~ 3 - 5 דקות. חשיפה ממושכת לקור עלולה להשפיע על הפיזיולוגיה והבריאות של הזבוב ולכן יש להימנע ממנה. - מניחים במהירות את הכיסוי על התא ומניחים אותו בצד. לאחר שכל הזבובים הועברו, העבר את כל התאים לחלל חשוך וסגור. אפשר לבדיקה לפעול במשך 90 דקות.
הערה: סביבה חשוכה ממזערת את השפעת המסלול החזותי של הזבוב על התנהגות ההזנה ומסירה רמזים סביבתיים מחוץ למנה.
6. סיום מבחני ההזנה הדו-כיווניים
- לאחר 90 דקות חלפו, להעביר את התאים למקפיא -20 מעלות צלזיוס להקריב את הזבובים. לאחר ~ 1 שעות, לספור את הזבובים.
הערה: הפוך כל צלחת פטרי לפני הנחת המנה במקפיא כדי להבטיח כי אין זבובים יוקפאו על האוכל.
7. הקצאת אינדקס העדפות (PI) לקביעת העדפת מזון
- תחת מיקרוסקופ ניתוח סטנדרטי, בדקו את צבע הבטן של הזבובים בכל מנה בנפרד. ספרו את הזבובים כאדום, כחול או סגול לפי צבע הבטן שלהם (איור 2A). ספור את הזבוב אם הבטן שלו צבעונית יותר מ-50%, מה שמצביע על הזנה חזקה(איור 2B). אל תכלול את הזבוב אם הבטן שלו מכילה רק נקודת מזון זעירה, המציינת אכילה לקויה (איור 2C).
- לאחר ספירת מספר הזבובים שאוכלים מאכלים כחולים, אדומים או כחולים ואדומים כאחד, השתמש במשוואה הבאה כדי להקצות לכל צלחת פטרי מדד העדפה (PI):
PI = (מספר זבובים שאוכלים מזון ניסיוני) - (מספר זבובים שאוכלים מזון בקרה) / (מספר זבובים שאוכלים מזון ניסיוני) + (מספר זבובים שאוכלים מזון בקרה) + (מספר זבובים שאוכלים את שניהם)
PI > 0 מציין העדפה עבור התרכובת הניסיונית, PI < 0 מציין סלידה לתרכובת הניסיונית, ו PI = 0 מציין שום השפעה של המתחם על התנהגות האכלה.
8. ניקוי תאי ההסתעפות
- מיד לנקות את מנות פטרי על ידי גירוד מצע המזון ולשטוף אותם עם מים וסבון מבושם. משרים את מנות הפטרי למשך הלילה במים מזוקקים. בדוק כי חותם החלוקה בכל מנה הוא עדיין אטום למים, ואז לתת את האוויר צלחת יבש.
הערה: לאחר הבטחה כי אין שאריות agarose או כתמי צבע, מנות פטרי מוכנים לשימוש שוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בחשבון זה חולקה מנה של 35 מ"מ לשני תאי האכלה שווים, כאשר כל מחצית מהתבשיל הכילה מזון אגרוז בשילוב צבע כחול או אדום(איור 1A). כדי לא לכלול הטיית צבע, ריכוזי הצבע הכחול והאדום שוכללו בקפידה כדי להניב PI "0" משוער כאשר רק שני צבעים אלה נוספו (איור 1B). לאחר שצלחת הפטרי הייתה עמוסה במזון שנבדק, הועברו למנה כ-70 זבובים בוגרים רטובים, בני יומיים-ארבעה ימים, המאפשרים להם לבחור בין שתי אפשרויות המזון בחושך. לאחר 90 דקות, צבע הבטן של הזבובים נבדק במיקרוסקופ ניתוק. בדרך כלל, הבטן הזבובית נראית כחולה או אדומה אם החיה צורכת בעיקר מזון כחול או אדום (איור 2A), בהתאמה. אם הזבוב צורך הן כחול והן אדום, הבטן שלו הופכת לסגולה (איור 2A).
הזבובים שבלעו כמויות ניכרות של מזון קיבלו ציון (איור 2B),תוך דילוג על הזבובים עם צריכת מזון לא מספקת (איור 2C). מבחנה זו המבוססת על צלחת פטרי הושוותה לתסע המבוסס על צלחת רב-תכליתית. התוצאות מראות ששתי שיטות האכלה אלה נותנות למעשה את אותן תוצאות בהזנת תגובות למזון מתוק, מריר או מלוח בזבובים מסוג בר (איור 3A-C). יש לציין כי הרבה יותר מהר להכין ולהפיץ מזון בצלחת פטרי מאשר בצלחת המולטיוול המכילה 60 בארות(איור 3D). בסך הכל, ההסתעפות המבוססת על צלחת פטרי היא שיטת הזנה חזקה ומהירה שניתן להשתמש בה כדי לקבוע במהירות את העדפת המזון לזבובים.
איור 1: שני מכשירים נבחרים ועקומת מינון צבע. (A) שני חצאים של צלחת פטרי משמשים להצגת שתי אפשרויות מזון שונות. מחצית מהתבשיל מכילה מזון צבוע בכחול, והחצי השני מכיל מזון צבוע באדום. זבובים prestarved ממוקמים לתוך המנה כדי לאפשר להם לצרוך את המזון שהם מעדיפים. (B) העדפת מזון עבור זבובים מסוג בר בחירה בין 1% agarose בתוספת 2 סוכרוז mM המכיל גם 50 μM צבע כחול או ריכוזים שונים של צבע אדום. ריכוז הצבע האדום האופטימלי הוא 210 מיקרומטר ±. עבור כל נקודת נתונים, n = 6 גירסאות ניסיון. כ-70 זבובים נבדקו בכל ניסוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: טוס בצבע בטן לאחר אכילת מאכלים כחולים, אדומים או כחולים ואדומים כאחד. (A) תמונות מייצגות של זבובים לאחר שבלעו מזון כחול (מימין למעלה), מזון אדום (משמאל למעלה), או שניהם, מה שהופך את הבטן לסגולה (למטה). (B)זבוב המציג צריכה מספקת של מזון כחול. (ג)זבוב לאחר בליעת כמות קטנה של מזון כחול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תגובות האכלה לטעימות שונות בזבובים מסוג בר, וזמן טעינת המזון עבור מכשיר האכלה מבוסס צלחת 60-well לעומת פטרי- צלחת. (A) העדפת מזון עבור זבובים מסוג בר בחירה בין 2 mM סוכרוז ו 10 mM סוכרוז. n = 12 ניסויים, מבחני tשל סטודנט לא משויכים. (B)העדפת מזון בזבובים מסוג בר למזון המכיל 2 מ"מ סוכרוז עם או בלי 10 מ"מ קפאין. n = 10 ניסויים, מבחני tשל סטודנט לא משויכים. (C)העדפת מזון זבובים מסוג בר עבור מזון המכיל 2 סוכרוז מ"מ עם או בלי 20 mM NaCl. n = 10 ניסויים, מבחני tשל סטודנט לא משויכים. (ד)הזמן בילה במילוי מזון לצלחת של 60 באר ותבשיל פטרי. n = 12 צלחות או כלים, *p < 0.0001, לא משויכים של סטודנט t-בדיקות. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. קיצורים: n.s. = לא מובהק סטטיסטית; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; NaCl = נתרן כלורי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו כוללת מספר שלבים מכריעים שבהם עלולות להתרחש בעיות. ראשית, ודאו שזבובים בולעים כמות מספקת של מזון כדי לספק נתונים יציבים. אם זבובים אוכלים בצורה גרועה, ודאו שהזבובים מורעבים במשך 24 שעות לפחות, ושהמדיה הניסיונית מכילה לפחות ריכוז סוכרוז מינימלי (2 מ"מ). כדי להמריץ עוד יותר את צריכת המזון, להאריך את תקופת הרעב הרטוב מעבר ל-24 שעות, בהתאם למצבם הפיזיולוגי של הזבובים. אם זבובים רבים מדי אינם מצליחים לשרוד את הרעב הממושך, ודא כי מספיק מים מתווספים לנייר הרקמה בעת ביצוע רעב רטוב בבקבוקונים. הימנע מים מוגזמים שעלולים להטביע את הזבובים. שנית, זבובים נוטים להראות הטיית האכלה כלפי צבע כחול או אדום אם הריכוזים שלהם אינם מאוזנים בקפידה. לשינויים קטנים בריכוז הצבעים יכולות להיות השפעות הזנה עמוקות (איור 1B). לכן, כדי למנוע הטיית צבע, ריכוז צבע צריך להיות מדויק. אם זבובים מושפעים הצבע, בזהירות לחדד את ריכוז הצבע במרווח של 1 מיקרומטר, ולאחר מכן לבדוק שילובי צבע שונים כדי לזהות את זוג ריכוז צבע אדום / כחול המניב PI = 0 כאשר אין תרכובת ניסיונית למעט ריכוז נמוך של סוכרוז (למשל, 2 מ"מ) מתווסף. קונצרט צבע אדום או כחול אופטימלי צריך להיות מחדש בעת בדיקת קווי זבוב חדשים או לאחר ביצוע מלאי צבע חדש. שלישית, ודא שההגבלה מוגבלת ל- 90 דקות. על פי מחקר קודם22, האכלה ממושכת יכולה להוביל להסתגלות טעם או רגישות.
בהשוואה לטכניקות האכלה אחרות, כגון FLIC27 או CAFE25 assays, זה פטרי-צלחת מבוסס שתי אפשרויות assay יש את התכונות והיתרונות הבאים: (1) פשטות: מכשיר זה כולל רק צלחת פטרי קטנה חצויה עם מחלק פלסטיק. מכיוון שהכלים ומפרידי הפלסטיק הם זולים וקלים להרכבה, ניסוי שלם דורש השקעה מינימלית בלבד. (2) תועלת: המכשיר המבוסס על צלחת פטרי מאיץ במידה ניכרת את מבחני ההזנה(איור 3D). תהליך ניקוד הצבע הוא גם מהיר וישיר באמצעות מיקרוסקופ ניתוח רגיל. בשיטה זו, ניתן לבדוק במהירות את העדפת הטעם של הזבובים כלפי מרכיב מזון מסוים. לכן, הוא מתאים הן למחקר בקנה מידה קטן והן למסכים גנטיים בקנה מידה גדול. (3) יציבות: בניגוד לשיטות הזנה אחרות המנתחות רק זבובים בודדים בכל מכשיר, שיטה זו מאפשרת כימות של תגובות האכלה למספר רב של זבובים בוגרים בבת אחת, מה שמצמצם באופן משמעותי את ההשפעות של וריאציות האכלה בין זבובים בודדים. זה מבוסס צבע שתי אפשרויות האכלה assay הוכיחה להיות קפדנית לשחזור שימש כדי לבודד מוטציות זבוב חשוב עם פגמים בתביעת טעמי מזון ומרקמים11,22,33.
כפי שהוכח בתוצאות אלה, הבדיקה המבוססת על צלחת פטרי מייצרת למעשה את אותן תוצאות כמו מבחני ההזנה הרב-פעמיים לתגובות טעם מתוקות, מרירות ומלוחות, אם כי הבדיקה המבוססת על צלחת פטרי נוטה להיות בעלת וריאציות קטנות יותר (איור 3A-C). צעד אחד גוזל זמן של מבחני האכלה מבוססי צבע הוא פריקת מזון לתוך תא ההאכלה. הצלחת multiwell, אשר מכיל 60 או יותר בארות, יכול להיות מייגע להגדיר בשל הדרישה של טעינה מדויקת מזון agarose מומס לתוך 60 או יותר בארות לכל צלחת. הרבה יותר מהר להכין ולהעמיס מזון בצלחת הפטרי מאשר בצלחת המולטיוול, שכן צלחת הפטרי מכילה רק שני תאים נפרדים(איור 3D). לפיכך, שיטה זו המבוססת על צלחת פטרי לא רק שומרת על החוסן של מבחני הצבע, אלא גם מפחיתה באופן משמעותי את הזמן והמאמץ שהושקעו בהכנת מבחנים, ובכך מגדילה באופן משמעותי את הקיבולת והמהירות של מבחני ההזנה. כתוצאה מכך, ניתן להעסיק אותו בקלות כדי לנתח מספר רב של קווי זבוב, כגון בפרויקט מסך גנטי.
בעוד מבחנים מבוססי צבע לספק שדרת תפוקה גבוהה של מחקר בשל הפשטות והמהירות שלהם, הם לא יכולים ללכוד מידע על היבטים כמותיים מפורטים יותר של האכלה כגון משך או נפח. כדי להתגבר על בעיה זו, מצלמה במהירות גבוהה יכולה להיות מותקנת מעל המנה, אשר חושף מידע מפורט יותר של תהליך ההאכלה, כגון משך האכלה ותדירות בכל תא. יתר על כן, מספר פרדיגמות האכלה אחרות ניתן להשתמש כדי להשלים נתונים שנאספו מניסויים מבוססי צבע. התקני הזנה אוטומטיים, כגון FLIC27 ו proboscis לטוס גלאי פעילות (FlyPAD)34, יכול להקליט את הדינמיקה הזמנית של האכלה. CAFE assay25 או מבחני האכלה ידניים35 יכולים למדוד את נפח המזון הנצרך. עם זאת, לגישות אלה יש אזהרות משלהן. לדוגמה, בהשוואה לצלחת פטרי או לצלחת המולטיוול, מכשירי האכלה אוטומטיים יקרים מאוד להתקנה במעבדה. בנוסף, כל מכשיר מבצע רק זבובים בודדים בכל פעם, מה שהופך אותו לפגיע יותר לשונות בבעלי חיים בודדים. מכיוון ש-CAFE assay מסתמך על היכולת של הזבובים לתמרן את גופם עד לקצה הצינור הנימי התלוי בתוך תא ההאכלה, התוצאות יכולות להיות מבולבלות על ידי ליקויים מוטוריים שאינם קשורים לתחושת הטעם.
למרות שגישות אחרות הן בעלות עוצמה בזכות עצמן, מבחנים מבוססי צבע יכולים להיות כלי יעיל יותר לגלות ולנתח במהירות העדפות מזון בזבובים. יתר על כן, ההתקנה שתי ברירה ניתן לשלב עם טכניקות חדשניות כגון אופטוגנטיקה36 כדי לתפעל באופן סלקטיבי בחריפות את התנהגות האכלה של הזבוב. ניתן לעשות זאת באמצעות מחצית אחת של המנה להפעלת אור ואת החצי השני כפקד לא פעיל אור. הפעלה ישירה או חוסר פעילות של נוירונים ספציפיים מסייע לקבוע אם יש להם תפקיד בוויסות התנהגויות האכלה. לסיכום, תוצאות אלה מראות כי הבדיקה של האכלה דו-ברירה המבוססת על צלחת פטרי היא שיטת הזנה מהירה וחזקה שיכולה לעזור לחוקרים לנתח את התנהגות ההזנה במצבים פיזיולוגיים ומטבוליים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים או אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד"ר טינגווי מי שעזר להם לייעל את מבחני ההאכלה של שתי הנבחרות. הם גם רוצים להודות לסמואל צ'אן וויאט קולמס על הערותיהם על כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R03 DC014787 (Y.V.Z.) ו R01 DC018592 (Y.V.Z.) ועל ידי קרן אמברוז מונל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K.
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H.
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Scott, K.
- Freeman, E. G., Dahanukar, A.
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).
