Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kvantitativ metabolomikk av saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

Vi presenterer en protokoll for identifisering og kvantifisering av store klasser av vannløselige metabolitter i gjæren Saccharomyces cerevisiae. Den beskrevne metoden er allsidig, robust og sensitiv. Det tillater separasjon av strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vannløselige metabolitter fra hverandre.

Abstract

Metabolomics er en metodikk som brukes for identifisering og kvantifisering av mange lavmolekylære mellomprodukter og produkter av metabolisme i en celle, vev, organ, biologisk væske eller organisme. Metabolomics fokuserer tradisjonelt på vannløselige metabolitter. Den vannløselige metabolome er det endelige produktet av et komplekst mobilnettverk som integrerer ulike genomiske, epigenomiske, transkripsjons-, proteomiske og miljømessige faktorer. Derfor vurderer den metabolomiske analysen direkte utfallet av handlingen for alle disse faktorene i en mengde biologiske prosesser innenfor ulike organismer. En av disse organismene er den spirende gjæren Saccharomyces cerevisiae, en encellulær eukaryote med det fullt sekvenserte genomet. Fordi S. cerevisiae er egnet til omfattende molekylære analyser, brukes den som modell for dissekeringsmekanismer som ligger til grunn for mange biologiske prosesser i den eukaryote cellen. En allsidig analytisk metode for den robuste, sensitive og nøyaktige kvantitative vurderingen av det vannløselige metabolomet vil gi den essensielle metodikken for dissekering av disse mekanismene. Her presenterer vi en protokoll for optimaliserte forhold for metabolsk aktivitet slukking i og vannløselig metabolittutvinning fra S. cerevisiae celler. Protokollen beskriver også bruk av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri (LC-MS/MS) for kvantitativ analyse av de ekstraherte vannløselige metabolittene. LC-MS/MS-metoden for ikke-målrettet metabolomikk som er beskrevet her, er allsidig og robust. Det muliggjør identifisering og kvantifisering av mer enn 370 vannløselige metabolitter med forskjellige strukturelle, fysiske og kjemiske egenskaper, inkludert forskjellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for disse metabolittene. Disse metabolittene inkluderer ulike energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosakkarider, mellomprodukter av glykolyse og trikarboksylsyklus mellomprodukter. LC-MS/MS-metoden for ikke-målrettet metabolomikk er følsom og tillater identifisering og kvantifisering av noen vannløselige metabolitter ved konsentrasjoner så lave som 0,05 pmol/μL. Metoden har blitt vellykket brukt til å vurdere vannløselige metabolomer av villtype og mutant gjærceller dyrket under forskjellige forhold.

Introduction

Vannløselige metabolitter er lavmolekylære mellomprodukter og produkter av metabolisme som bidrar til essensielle cellulære prosesser. Disse evolusjonært bevarte prosessene inkluderer konvertering av næringsstoffer til brukbar energi, syntese av makromolekyler, cellulær vekst og signalering, cellesykluskontroll, regulering av genuttrykk, stressrespons, postoversettelsesregulering av metabolisme, vedlikehold av mitokondriefunksjonalitet, bilikulær smugling, autofagi, cellulær aldring og regulert celledød1,2,3.

Mange av disse viktige rollene til vannløselige metabolitter har blitt oppdaget av studier i den spirende gjæren S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Denne encellede eukaryotten er en nyttig modellorganisme for dissekeringsmekanismer der vannløselige metabolitter bidrar til cellulære prosesser på grunn av dens egnethet til avanserte biokjemiske, genetiske og molekylære biologiske analyser23,24,25,26. Selv om LC-MS / MS-metodene for ikke-målrettet metabolomics har blitt brukt til å studere rollene til vannløselige metabolitter i spirende gjær3,18,22,27, krever denne typen analyse forbedring av allsidigheten, robustheten, følsomheten og evnen til å skille mellom forskjellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for disse metabolittene.

De siste årene er preget av betydelige fremskritt i å anvende LC-MS / MS metoder for ikke-målrettet metabolomics til profilering av vannløselige metabolitter in vivo. Mange utfordringer ved bruk av denne metodikken er imidlertidfortsatt 2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Disse utfordringene inkluderer følgende. For det første er de intracellulære konsentrasjonene av mange vannløselige metabolitter under en terskel for følsomhet for de for tiden brukte metodene. For det andre er effektiviteten av metabolsk aktivitetsslukking for lav, og omfanget av slukke-assosiert cellelekkasje av intracellulære metabolitter er for høy for dagens metoder; Derfor undervurderer de for tiden brukte metodene de intracellulære konsentrasjonene av vannløselige metabolitter. For det tredje kan de eksisterende metodene ikke skille de strukturelle isomerene (dvs. molekyler med samme kjemiske formel, men forskjellige atomforbindelser) eller stereoisomerer (dvs. molekyler med samme kjemiske formel og atomforbindelse, men med det forskjellige atomarrangementet i rommet) av spesifikke metabolitter; Dette forhindrer riktig merknad av visse metabolitter ved dagens brukte metoder. For det fjerde er de eksisterende elektroniske massespektraldatabasene for overordnede ioner (MS1) og sekundære ioner (MS2) ufullstendige. Dette påvirker riktig identifisering og kvantifisering av spesifikke metabolitter ved hjelp av rå LC-MS / MS-data produsert ved hjelp av de nåværende metodene. For det femte kan de eksisterende metodene ikke bruke en enkelt type metabolittutvinning for å gjenopprette alle eller de fleste klasser av vannløselige metabolitter. For det sjette kan de eksisterende metodene ikke bruke en enkelt type LC-kolonne for å skille seg fra hverandre alle eller de fleste klasser av vannløselige metabolitter.

Her optimaliserte vi forhold for slukking av metabolsk aktivitet i S. cerevisiae celler, opprettholde de fleste vannløselige metabolitter i disse cellene før utvinning, og trekke ut de fleste klasser av vannløselige metabolitter fra gjærceller. Vi utviklet en allsidig, robust og sensitiv metode for LC-MS/MS-basert identifisering og kvantifisering av mer enn 370 vannløselige metabolitter ekstrahert fra S. cerevisiae celler. Denne metoden for ikke-målrettede metabolomics gjør det mulig å vurdere intracellulære konsentrasjoner av ulike energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosakkarider, mellomprodukter av glykolyse og trikarboksylsyklus mellomprodukter. Den utviklede LC-MS/MS-metoden tillater identifisering og kvantifisering av forskjellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vannløselige metabolitter med forskjellige strukturelle, fysiske og kjemiske egenskaper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Å lage og sterilisere et medium for dyrking av gjær

  1. Lag 180 ml av et komplett gjærekstrakt med bactopeptone (YP) medium. Det komplette YP-mediet inneholder 1% (w / v) gjærekstrakt og 2% (w / v) bactopeptone.
  2. Fordel 180 ml av YP-mediet likt i fire 250 ml Erlenmeyer-kolber. Hver av disse kolbeene inneholder 45 ml av YP-mediet.
  3. Steriliser kolbeene med YP-medium ved autoklavering ved 15 psi/121 °C i 45 minutter.

2. Gjærstamme av vill type

  1. Bruk BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) stammen.

3. Voksende gjær i YP-mediet som inneholder 2% glukose

  1. Steriliser en 20% (w / v) lagerløsning av glukose ved autoklavering ved 15 psi / 121 ° C i 45 minutter.
  2. Tilsett 5 ml av den autoklavede 20% (w / v) lagerløsningen av glukose til hver av de to Erlenmeyer-kolbeene med 45 ml av det steriliserte YP-mediet. Den endelige konsentrasjonen glukose i YP-mediet er 2% (m / v).
  3. Bruk en mikrobiologisk løkke for å inokulere gjærceller i hver av de to Erlenmeyer-kolbeene med YP-mediet som inneholder 2% glukose.
  4. Dyrg gjærcellene over natten ved 30 °C i et rotasjons shakersett ved 200 o/min.
  5. Ta en aliquot av gjærkultur. Bestem totalt antall gjærceller per ml kultur. Telle celler ved hjelp av et hemocytometer.

4. Celleoverføring til og celle vokser i YP-mediet med 2% glukose

  1. Tilsett 5 ml av den steriliserte 20% (w / v) lagerløsningen av glukose til hver av de resterende to Erlenmeyer-kolbeene med det autoklavede YP-mediet. Den endelige konsentrasjonen av glukose er 2% (m / v).
  2. Overfør et volum av gjærkulturen over natten i YP-medium med 2% glukose som inneholder det totale antallet 5,0 x 107 celler i hver av de to Erlenmeyer-kolbeene med YP-mediet som inneholder 2% glukose. Bruk en steril pipette til celleoverføringen.
  3. Dyrk gjærcellene i minst 24 timer (eller mer, hvis eksperimentet krever det) ved 30 °C i en rotasjons shaker satt til 200 rpm.

5. Lage reagenser, forberede labware og sette opp utstyr for celleslukking

  1. Forbered følgende: 1) en slukkeløsning (60% høyverdig (>99,9%) metanol i 155 mM ammoniumbikarbonat (ABC) buffer, pH = 8,0); 2) en iskald ABC-løsning (pH = 8,0); 3) et digitalt termometer som er i stand til å måle opp til -20 °C; 4) 500 ml store sentrifugeflasker; 5) en forhåndskjølt høyhastighets sentrifuge med en forhåndskjølt rotor og forhåndskjølte 500 ml sentrifugeflasker til denne rotoren, alt ved -5 °C; 6) metabolitt ekstraksjon rør (15 ml høyhastighets glass sentrifuge rør med polytetrafluoretylen fôret caps); og 7) tørris.

6. Celleslukking

  1. Bruk et hemocytometer for å bestemme antall gjærceller per ml YP med 2% glukosekultur.
  2. Overfør et volum av kulturen i YP-medium med 2% glukose som inneholder totalt antall 5,0 x 108 celler til forhåndskjølte 500 ml sentrifugerflasker.
  3. Fyll sentrifugeflasken som inneholder cellene opp til volumet på 200 ml med en slukkeløsning lagret ved -20 °C.
  4. Sentrifuger flaskene i en høyhastighets sentrifuge ved 11,325 x g i 3 min ved -5 °C.
  5. Raskt og ømt gjenopprette flasken fra sentrifugen; Skru forsiktig av lokket og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
  6. Resuspend cellepellet raskt i 10 ml iskald ABC buffer og overføre suspensjonen til en 15 ml høyhastighets glass sentrifuge rør med en polytetrafluoretylenforet hette for metabolitt ekstraksjon.
  7. Samle celler ved sentrifugering i en klinisk sentrifuge ved 3000 x g i 3 min ved 0 °C.
  8. Fjern raskt supernatanten og legg røret på tørris for å begynne metabolittutvinning eller lagre røret ved -80 °C til ekstraksjon.

7. Fremstilling av reagenser, labware og utstyr for metabolittutvinning

  1. Forbered følgende: 1) LC-MS grade kloroform; 2) LC-MS klasse metanol; 3) LC-klasse nano-rent vann; 4) LC-MS-grad (ACN); 5) glassperler (syrevasket, 425-600 μm); 6) en virvel med et skumrørholdersett med holder; 7) 15 ml høyhastighets glass sentrifuge rør med polytetrafluoretylenforede caps; 8) MS hetteglass; 9) tørris; og 10) 1,5 ml rør vasket en gang med etanol, en gang med ACN og en gang med nano-rent vann.
    MERK: Bruk kun mikropipettespisser og rør laget av polypropylen som er motstandsdyktige mot organiske løsemidler.

8. Metabolitt ekstraksjon

  1. Til metabolittene som oppbevares på tørris eller oppbevares ved -80 °C rør fra trinn 6.7, tilsett følgende: 1) 2 ml kloroform lagret ved -20 °C; 2) 1 ml metanol lagret ved -20 °C; 3) 1 ml iskaldt nano-rent vann; og 4) 200 μL 425-600 μm syrevaskede glassperler.
  2. Dekk og lukk munnen på et rør med aluminiumsfolie. Plasser rørene i et skumrørholdersett med holder og virvel dem i 30 minutter ved middels hastighet (dvs. med en hastighet som er satt til 6, med 12 som maksimal hastighet på en virvel) ved 4 °C for å lette metabolittutvinningen.
  3. Inkuber røret i 15 min på is (IKKE tørris!) for å fremme proteinnedbør og separasjon av øvre vandig fra den nedre organiske fasen.
  4. Sentrifuger røret i en klinisk sentrifuge ved 3000 x g i 10 min ved 4 °C. Dette sentrifugeringstrinnet gjør det mulig å skille den øvre vandige fasen (som inneholder vannløselige metabolitter) fra mellomlaget (som inneholder cellerester og proteiner) og fra den nedre organiske fasen (som for det meste inneholder lipider).
  5. Bruk en mikropipette til å overføre den øvre vandige fasen (400 μL) til et vasket og merket 1,5 ml rør som inneholder 800 μL ACN som ble lagret ved -20 °C.
    MERK: Det vil være hvit sky nedbør etter å ha lagt den øvre vandige fasen til ACN holdt ved -20 °C.
  6. Sentrifuger røret med prøven i en bordplate sentrifuge ved 13 400 x g i 10 min ved 4 °C.
    MERK: Den hvite skynedbør vil forsvinne etter sentrifugering.
  7. Overfør 800 μL fra den øvre delen av en væske i røret til et merket MS-hetteglass. Oppbevar prøven ved 0 °C til den analyseres av LC-MS/MS.

9. Tilberedning av reagenser, labware og utstyr for LC

  1. Forbered følgende: 1) en virvel; 2) en ultralyd soniker; 3) HETTEGLASS MED MS-glass; 4) et LC-system utstyrt med en binær pumpe, avgasser og autosampler; 5) en zwitterionic-fase kromatografi kolonne (5 μm polymer, 150 x 2,1 mm) navngitt i Tabell over materialer; 6) en kolonnevarmer; og 7) mobile faser, inkludert fase A (5:95 ACN:vann (v/v) med 20 mM ammoniumacetat, pH = 8,0) og fase B (100 % ACN).

10. Separasjon av ekstraherte metabolitter ved LC

  1. Underkast innholdet i MS-hetteglasset til ultralyd sonikering i 15 min.
  2. Virvel MS hetteglasset 3x i 10 sek ved romtemperatur (RT).
  3. Plasser MS-hetteglasset i brønnplaten.
  4. Under kromatografien, opprettholde kolonnen ved 45 °C og en strømningshastighet på 0,250 ml/min. Oppbevar prøven i brønnplaten ved 0 °C. Se tabell 1 for LC-gradientene som må brukes under kromatografi.
    MERK: Et representativt total ionkromatogram av vannløselige metabolitter som ble ekstrahert fra celler av villtypestammen BY4742, er vist i figur 1. Metabolittene separert av LC ble identifisert og kvantifisert ved massespektrometrisk analyse som ble utført i positiv ioniseringsmodus [ESI (+)], som beskrevet for trinn 11.

11. Massespektrometrisk analyse av metabolitter separert av LC

  1. Bruk et massespektrometer utstyrt med oppvarmet elektrosprayionisering (HESI) for identifisering og kvantifisering av vannløselige metabolitter som ble skilt av LC. Bruk massespektrometerets analysator for MS1-ioner og massespektrometerets detektor for MS2-ioner. Bruk innstillingene i tabell 2 og tabell 3 for den dataavhengige innsamlingen av henholdsvis MS1- og MS2-ioner.
  2. Bruk et prøvevolum på 10 μL for injeksjonen i både ESI- (+) og ESI-modus (-).

12. Identifisering og kvantifisering av ulike metabolitter ved behandling av rådata fra LC-MS/MS

  1. Bruk programvaren som er navngitt i Table of Materials for å utføre identifisering og kvantifisering av forskjellige vannløselige metabolitter fra rå LC-MS / MS-filer. Denne programvaren bruker MS1 for metabolitt kvantifisering og MS2 for metabolitt identifikasjon. Programvaren utnytter det mest omfattende kuraterte massespektral fragmenteringsbiblioteket for å kommentere metabolittene ved hjelp av LC-MS / MS-rådata ved å matche MS-spektra. Denne programvaren bruker også den eksakte massen av MS1 og isotop mønster samsvar for å kommentere metabolitter ved hjelp av online databaser. Se figur 2 hvis du vil ha mer informasjon.
  2. Bruk biblioteket med databaser og spektra, som er fritt tilgjengelig online (https://www.mzcloud.org), for å søke etter MS2-spektra av rådataene.

13. Membranintegritetsanalyse ved propidiumjodid (PI) farging og fluorescensmikroskopi

  1. Etter at celleslukking utført som beskrevet for trinn 6, vask de slukkede cellene grundig med 15 ml ABC-buffer for å fjerne slukkeløsningen. Samle celler ved sentrifugering ved 3000 x g i 5 min ved 0 °C.
  2. Resuspend cellepellet i 1 ml ABC buffer og tilsett 0,5 ml PI-oppløsning (0,5 mg/ml).
  3. Virvel et rør med prøven 3x i 10 s og inkuber den i 10 min i mørket og på is.
  4. Sentrifuger røret med prøven i en bordplate sentrifuge ved 13 400 x g i 10 min ved 4 °C.
  5. Fjern supernatanten og resuspender pelletsen i 1 ml ABC-buffer.
  6. Sentrifuger røret ved 13 400 x g i 10 min ved 4 °C og fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet 2 ganger til for å fjerne PI bundet til celleoverflaten.
  7. Resuspend pellet i 300 μL ABC buffer. Plasser 10 μL av suspensjonen på overflaten av et mikroskopskred.
  8. Fang opp differensialinterferenskontrasten (DIC) og fluorescensmikroskopibildene med et fluorescensmikroskop. Bruk et filter satt opp ved eksitasjons- og utslippsbølgelengdene på henholdsvis 593 nm og 636 nm ().
  9. Bruk en programvare til å telle det totale cellenummeret (i DIC-modus) og antall fluorescerende fargede celler. Bruk også denne programvaren til å bestemme intensiteten av farging for individuelle celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å forbedre en kvantitativ vurdering av vannløselige metabolitter i en gjærcelle, optimaliserte vi betingelsene for celleslukking for metabolittdeteksjon. Celleslukking for dette formålet innebærer en rask arrestasjon av alle enzymatiske reaksjoner i en celle31,33,37,38. En slik arrestasjon av cellulær metabolsk aktivitet er et viktig trinn i enhver metode for kvantisering av vannløselige metabolitter in vivo fordi det forhindrer underestimering av deres intracellulære konsentrasjoner31,33,37,38. Celleslukking for metabolittvurdering forringer alltid integriteten til plasmamembranen (PM) (og av celleveggen (CW), hvis den er til stede); Dette forårsaker metabolittlekkasje fra celle31,33,37,38. Metoden benytter celleslukkingsbetingelser som minimerer slik svekkelse, og reduserer dermed den slukkerelaterte cellelekkasjen av intracellulære metabolitter betydelig. Faktisk innebærer de fleste nåværende metoder for celleslukking bruk av en viss konsentrasjon av metanol (dvs. 40 % (v/v), 60 % (v/v), 80 % (v/v) eller 100 % (v/v)) ved spesifikk temperatur (dvs. -20 °C, -40 °C eller -60 °C), med eller uten buffer31,33,37,38. Vi sammenlignet effektiviteten til PM- og CW-svekkelsen for en av de brukte celleslukkingsmetodene (dvs. ved cellebehandling med 80 % (v/v) metanol ved -40 °C i fravær av buffer38) til den for den modifiserte celleslukkingsmetoden (dvs. ved cellebehandling med 60 % (v/v) metanol ved -20 °C i nærvær av en isotonisk bufret løsning av ABC ved pH = 8,0). PI er et fluorescerende fargestoff som er ugjennomtrengelig for intakte celler; Den kan bare gå inn i cellen hvis integriteten til PM (og for faktisk vekt, hvis den finnes) er svekket39. Videre stiger intensiteten av fluorescensutslipp av PI med 30 ganger når den er bundet til DNA eller RNA39. Dermed kan en PI-fargingsanalyse brukes til å vurdere effektiviteten av slukke-assosiert cellelekkasje av intracellulære metabolitter fordi disse metabolittene bare kan lekke inn i det ekstracellulære rommet hvis PM og CW i en gjærcelle er skadet39. Vi fant at den modifiserte celleslukkingsmetoden forårsaker betydelig lavere skade på PM og CW enn slukkemetoden ved cellebehandling med ikke-bufret 80% (v / v) metanol ved -40 °C (figur 3). Faktisk viste nesten alle celler utsatt for slukking ved hjelp av metoden rødt fluorescensutslipp, som er karakteristisk for gjærcellene hvis PM og CW ikke er skadet (Figur 3). I motsetning til dette viste nesten alle celler som ble utsatt for slukking ved hjelp av den andre metoden, grønt fluorescensutslipp som er karakteristisk for gjærcellene hvis PM og CW er betydelig skadet (Figur 3). Den mest intense røde fluorescensen ble konvertert til grønn fluorescens av en programvare for å skille mellom den sterke røde fluorescensen og milde røde fluorescensutslipp.

Den modifiserte celleslukkingsmetoden forårsaket betydelig lavere lekkasje av vannløselige metabolitter fra gjærceller enn - slukkemetode ved cellebehandling med ikke-bufret 80% (v / v) metanol ved -40 ° C. Vi utsatte like mange gjærceller for slukking ved hjelp av enten metoden (dvs. ved cellebehandling med 60% (v / v) metanol ved -20 °C i nærvær av en isotonisk bufret løsning av ABC ved pH = 8,0; Figur 4) eller den andre metoden (dvs. ved cellebehandling med ikke-bufret 80% (v / v) metanol ved -40 °C; Figur 5). Omfanget av slukke-assosiert cellelekkasje i den ekstracellulære løsningen ble vurdert for spesifikke vannløselige metabolitter ved hjelp av LC-MS / MS. Konsentrasjonene av forskjellige aminosyreklasser (dvs. store og små sure, grunnleggende, nøytrale og nøytrale polare aminosyrer) i den ekstracellulære løsningen ble målt før og etter celleslukking. Vi fant at celleslukkingsmetoden forårsaker betydelig lavere lekkasje av alle disse aminosyreklassene i den ekstracellulære løsningen (figur 4) enn den andre metoden (figur 5).

LC-MS/MS-metoden for en kvantitativ vurdering av vannløselige metabolitter i en gjærcelle bruker en enkelt type kolonne for kromatografisk separasjon av alle vannløselige metabolittklasser. Denne kolonnen er zwitterionic-phase-kolonnen med navnet i Tabell over materialer. Vi fant at denne kolonnen gir en mye mer effektiv separasjon av forskjellige klasser av vannløselige metabolitter enn den omvendte fasekolonnen som er navngitt i Tabell over materialer (Supplerende tabell 1). Faktisk var oppbevaringstiden (RT) skiftverdiene for vannløselige metabolittstandarder (dvs. NAD +, AMP, GMP, arginin og glutaminsyre) betydelig lavere og toppformene betydelig skarpere for zwitterionic-fasekolonnen, sammenlignet med omvendt fasekolonne (Supplemental Table 1). LC-forhold som brukes til kromatografisk separasjon av alle metabolitter (dvs. vannløselig og vannløselig) for omvendt fasekolonne er gitt i supplerende tabell 2.

En annen fordel med LC-MS/MS-metoden består i evnen til kromatografisk separasjon på den ovennevnte zwitterionic-fasekolonnen for effektivt å skille seg fra hverandre forskjellige vannløselige metabolitter med forskjellige strukturelle, fysiske og kjemiske egenskaper. Disse vannløselige metabolittene inkluderer følgende metabolittklasser: 1) sure, grunnleggende, nøytrale polare og ikke-nøytrale polare aminosyrer, inkludert deres forskjellige strukturelle isomerer (Figur 6); 2) stabile og ustabile nukleotider og deres derivater som utfører vitale funksjoner i en celle (Figur 7); og 3) ulike monosakkarider, inkludert deres forskjellige stereoisomeriske former (figur 8).

Det er viktig at LC-MS/MS-metoden for en kvantitativ vurdering av vannløselige metabolitter i en gjærcelle var allsidig og robust. Det tillot oss å identifisere og kvantifisere 374 vannløselige metabolitter med forskjellige strukturelle, fysiske og kjemiske egenskaper i S. cerevisiae-celler som ble dyrket i det komplette YP-mediet som opprinnelig inneholdt 2% glukose (Supplerende tabell 3). 240 metabolitter ble påvist i positiv iioniseringsmodus og 134 metabolitter ble påvist i negativ ioniseringsmodus. Identiteten til alle disse vannløselige metabolittene ble bekreftet ved å matche deres dataavhengige innsamlings(DDA) MS2-fragmenter anskaffet både i de positive og negative ioniseringsmodusene til MS2 mzCloud spectral-biblioteket. Dette elektroniske biblioteket inneholder spektra av metabolittstandarder som varierer i MS1- og DDA MS2-parameterne. For å maksimere omfanget av å matche MS2-spektraet i eksemplet med det elektroniske spektralbiblioteket, brukte vi forskjellige DDA MS2-parametere. Disse parameterne finnes i Supplerende tabell 4. Nesten 6000 funksjoner (putative metabolitter) for samme prøve ble anskaffet ved hjelp av høyenergiindusert kollisjon-dissosiasjon (HCD) eller kollisjonsindusert dissosiasjon (CID) fragmenteringsmetode, ved hjelp av topp 5 MS2-hendelser, 35 kollisjonsenergiverdier og 10 ms aktiveringstider. Etter filtrering av de resulterende filene med > 95% MS2 samsvarende og > 90% MS1 isotopisk mønster samsvarende kriterier, bare 162 metabolitter under HCD fragmentert tilstand og 142 metabolitter under CID fragmentert tilstand ble identifisert. 81 av 162 metabolitter var unike for HCD-fragmenteringsmetoden, mens 42 av 142 var unike for CID-fragmenteringsmetoden (se et ark kalt "T5_35E__10 ms_HCD vs CID" i Supplerende tabell 4). Derfor konkluderte vi med at riktig merknad av vannløselige metabolitter ved hjelp av LC-MS / MS-metoden krever bruk av mange forskjellige DDA MS2-parametere.

LC-MS/MS-metoden er også svært følsom. Det gjør det mulig å identifisere og kvantifisere noen vannløselige metabolitter ved konsentrasjoner så lave som 0,05 pmol/μL (se data for fenylalanin i tabell 4). Denne grensen for kvantasjon varierer innenfor et bredt spekter av konsentrasjoner for ulike metabolittklasser (tabell 4).

MS-systemet som brukes her har et bredt (minst to størrelsesordener) lineært dynamisk område for måling av konsentrasjonene av ulike metabolitter (Supplerende tabell 5).

Figure 1
Figur 1: Total ionkromatogram (TIC) fra væskekromatografi/massespektrometridata (LC-MS) av vannløselige metabolitter som ble ekstrahert fra celler av villtypestammen BY4742. Metabolittene ble skilt av LC på den zwitterionic-fase kromatografi kolonnen navngitt i Tabell over materialer. Metabolittene ble oppdaget av MS av foreldreioner (MS1) som ble opprettet ved hjelp av den positive elektrosprayioniseringsmodusen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: En arbeidsflyt som brukes til analyse av vannløselige metabolitter ved hjelp av programvaren som er navngitt i Materialfortegnelse. Alle parametrene ble autokorrigert av programvaren basert på MS-rådata, unntatt følgende: 1) "Detect Compounds" -fanen: set min, peak intensity 10,000; og 2) "Search ChemSpider" fane: 4 online databaser ble valgt for identifisering av metabolitter, inkludert BioCyc, Human Metabolome Database, KEGG, og Yeast Metabolome Database. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Differensial interferenskontrast (DIC, øverste rad) og fluorescens (nederste rad) mikroskopiske bilder av gjærceller slukket enten med ammoniumbikarbonatbuffer (ABC) buffer (pH = 8,0; kontroll) eller med en annen slukkeløsning. Etter celleslukking ble like mange celler inkubert med PI-løsningen i 10 min i mørket og på is. Den mest intense røde fluorescensen ble konvertert til grønn fluorescens av programvare for å skille mellom sterk rød fluorescens og milde røde fluorescensutslipp. Effektiviteten av skade på PM og CW ble sammenlignet for metoden for celleslukking (dvs. ved cellebehandling med 60 % (v/v) metanol ved -20 °C i nærvær av en isotonisk bufret løsning av ABC ved pH = 8,0) og en av de brukte metodene (dvs. ved cellebehandling med 80 % (v/v) metanol ved -40 °C i fravær av buffer). En skalalinje vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Lekkasjeprosenten av ulike aminosyreklasser for metoden for celleslukking. 5,0 x 108 av gjærcellene ble utsatt for slukking ved behandling med 60% (v/ v) metanol ved -20 °C i nærvær av en isotonisk bufret løsning av ABC ved pH = 8,0. Lekkasjeprosenten av forskjellige aminosyreklasser ble vurdert ved hjelp av LC-MS/MS for å måle konsentrasjonene i den ekstracellulære løsningen før og etter slukking. Gjennomsnittsverdiene ± SD og individuelle datapunkt vises (n = 3). * p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Lekkasjeprosenten av forskjellige aminosyreklasser for en av de brukte celleslukkingsmetodene. 5,0 x 108 av gjærcellene ble utsatt for slukking ved behandling med 80% (v/ v) metanol ved -40 °C i fravær av buffer. Lekkasjeprosenten av forskjellige aminosyreklasser ble vurdert ved hjelp av LC-MS/MS for å måle konsentrasjonene i den ekstracellulære løsningen før og etter slukking. Gjennomsnittsverdiene ± SD og individuelle datapunkt vises (n = 3). * p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Effektiv kromatografisk separasjon av sure, grunnleggende, nøytrale polare og ikke-nøytrale polare aminosyreklasser, inkludert to strukturelle isomerer (dvs. leucin og isoleucin), på zwitterionic-fase kolonnen navngitt i Materialfortegnelse. Alle disse aminosyrene ble påvist av MS/MS i positiv ioniseringsmodus [ESI (+)]. Betingelser for LC på kolonnen zwitterionic-phase chromatography er beskrevet i tabell 1. Betingelser for MS/MS er beskrevet i tabell 2 og tabell 3. Alle aminosyrestandarder kjøpes kommersielt (f.eks. Oppbevaringstiden skifter mellom 3 uavhengige kromatografikjøringer er mindre enn ± 10 sekunder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Effektiv kromatografisk separasjon av ulike klasser av nukleotider, inkludert energisk ustabile nukleotider (nukleosidemonofer, nukleosiddifosfater og nukleosider) og elektronbærermolekyler (NADH og NAD+), på zwitterionic-fasekolonnensom er navngitt iMaterialtabellen. Alle disse nukleotidene ble oppdaget av MS/MS i modusen for positiv ionisering [ESI (+)]. Betingelser for LC på kolonnen zwitterionic-phase chromatography er beskrevet i tabell 1. Betingelser for MS/MS er beskrevet i tabell 2 og tabell 3. Alle nukleotidstandarder kjøpes kommersielt (f.eks. Oppbevaringstiden skifter mellom 3 uavhengige kromatografikjøringer er mindre enn ± 10 sekunder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Effektiv kromatografisk separasjon av ulike klasser av monosakkarider, inkludert strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for aldo- og ketohexoser (fruktose, mannose og galaktose), og aldopentoser (ribose og arabinose), på den zwitterioniske fasekolonnensom er navngitt iMaterialtabellen. Alle disse monosakkaridene ble oppdaget av MS/MS i modusen for positiv ionisering [ESI (+)]. Betingelser for LC på kolonnen zwitterionic-phase chromatography er beskrevet i tabell 1. Betingelser for MS/MS er beskrevet i tabell 2 og tabell 3. Alle monosakkaridstandarder kjøpes kommersielt (f.eks. Oppbevaringstiden skifter mellom 3 uavhengige kromatografikjøringer er mindre enn ± 10 sekunder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Kolonnetype SeKant ZIC-pHILIC 5μm polymer 150 x 2,1 mm
Løsningsmiddel A LC-MS klasse H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM Ammoniumacetat
Løsningsmiddel B Acetonitril av LC-MS-grad (ACN)
Trykkgrense Maksimum = 300 bar Minimum = 0
HPLC graderingsprogram
Klokkeslett (minutter) Strømningshastighet (0,25 ml/min) Komposisjoner
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Tabell 1: LC-tilstand som brukes til separasjon av vannløselige metabolitter ved hjelp av den zwitterionic-fase kolonnennavngitt i Tabell overmaterialer. Disse forholdene ble brukt i alle eksperimenter beskrevet her.

Full skanning masseområde (Dalton) 70-900
FTMS (Orbitrap-analysator) full skanneoppløsning 6,0 x 104
FTMS (Orbitrap-analysator) HCD-oppløsning 7500
FTMS AGC-mål for full skanning 1,0 x 106
FTMS MSn AGC-mål 5,0 x 104
Ionfelle (LTQ) MSn AGC-mål 1,0 x 104
Ion Kildetype Oppvarmet elektrosprayionisering
Kapillær temperatur (°C) 275
Kildevarmer Temperatur (°C) 250
Hylse gassstrøm 10
Aux Gass strømning 5

Tabell 2: Massespektrometerinnstillingene som brukes til å analysere metabolitter som ble skilt av LC. Disse forholdene ble brukt til analyse av metabolitter i alle eksperimenter beskrevet her. Forkortelser: FTMS = Fourier transform (FTMS); HCD = høyenergiindusert kollisjon-dissosiasjon; LTQ = lineær felle quadrupole; AGC = automatisk forsterkningskontroll, en ionpopulasjonsverdi for MS og MS/MS.

Instrument polaritet Positiv/negativ
Aktiveringstype CID/HCD
Min. signal kreves 5000
Bredde på isolasjon 2
Normaliserte kollisjonsenergier for CID 35, 60
Normaliserte kollisjonsenergier for HCD 35, 45, 55
Standard ladetilstand 1
Aktiveringstid for CID (ms) 10, 30
Aktiveringstid for HCD (ms) 10
Antall MS/MS-hendelser i CID Topp 3, Topp 5, Topp 10
Antall MS/MS-hendelser i HCD Topp 5
Antall mikroskanninger som brukes i både HCD og CID 1

Tabell 3: Massespektrometerinnstillingene som brukes til å oppdage sekundære ioner (MS2). Forkortelser: HCD = høyenergiindusert kollisjon-dissosiasjon; CID = kollisjon indusert dissosiasjon; ms = millisekunder.

Std Metabolitter M.W. (g/mole) [M+H]+1 [M-H]-1 Søkemodus Laveste konsentrasjon påvist (pmol/μL)
Glysin 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
Tryptofan 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56E-02
Fenylalanin 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
Arginine 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
threonine* 119.05824 120.06552 118.05096 P
serin 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66E+00
Glutamat 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
metionin 149.05105 150.05833 148.04377 P 1.96E+00
aspartat 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75E+00
valine 117.07898 118.08626 116.0717 P 1.49E+00
isoleucin 131.09463 132.10191 130.08735 P 1.84E+00
Leucine 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26E+00
histidin 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53E+00
Tyrosin 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
Lysin 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43E-01
alanin 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12E+00
Proline 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05E+00
cystein 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
aspargin 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08E+00
Glutamin 146.06914 147.07642 145.06186 P 1.92E+00
guanin 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47E+00
guanosin 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
GMP 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
BRUTTONASJONALPRODUKT 443.02434 444.03162 442.01706 P 2.57E+00
GTP 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
AMP 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32E+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1.77E+00
NADH 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47E+00
NAD+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E+00
glukose** 180.06339 181.07067 179.05611
fruktose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
mannose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05E+00
galaktose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
ribose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10E+00
arabinose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23E+00
fruktose-6-fosfat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60E+00
glukose-6-fosfat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27E+00
sitronsyre 192,12 g 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
malinsyre 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23E+00
pyruvinsyre 88.06 89.02332 87.008768 N 2.77E+00

Tabell 4:De laveste konsentrasjonene av ulike vannløselige metabolittstandarder som LC-MS/MS-metoden kan identifisere og kvantifisere. MS1-toppområdet i hver metabolittstandard ble brukt til å estimere den laveste kvantifiserbare konsentrasjonen for denne metabolitten. Gjennomsnittsverdier for to uavhengige eksperimenter vises. Tre tekniske replikeringer ble utført for hvert av de to uavhengige eksperimentene. MERK: Threonine* kan påvises, men kan ikke kvantifiseres på grunn av sin ko-elution med homoserin, en kjemisk isomer av trone. Glukose** kan ikke identifiseres fordi det skaper flere kromatografitopper. Metabolittstandarder*** kan bare identifiseres og kvantiseres i individuelle prøver, men ikke i en blanding av metabolittstandarder eller en biologisk blanding av metabolitter.

Supplerende tabell 1: Oppbevaringstid (RT) skifter verdier for samme sett med metabolitterittere for zwitterionic-fase- og omvendt fasekolonner (se Tabell over materialer) etter kolonnelikevekt. Tabellen sammenligner retensjonsreroduserbarheten av zwitterionic-fase og omvendt fase kolonner for et tydelig sett med metabolitter forskjellig fra hverandre i deres hydrofilisitet og hydrofobiskhet. Disse metabolittene ble identifisert ved hjelp av LC-MS/MS. Merk at RT-skiftverdiene til hydrofile metabolittere (dvs. NAD+, AMP, GMP, arginin og glutaminsyre) er betydelig lavere og toppformene er vesentlig skarpere for zwitterionic-fasekolonnen, sammenlignet med omvendt fasekolonne. Derimot er RT-skiftverdiene til hydrofobe metabolitter (dvs. stearinsyre, laurinsyre og deanosyre) betydelig lavere og toppformene er vesentlig skarpere for omvendt fasekolonne, sammenlignet med den zwitterionic-fase kolonnen. Betingelser for kromatografisk separasjon av metabolitter ved hjelp av zwitterionic-fase og omvendt fase kolonner er beskrevet i henholdsvis tabell 1 og supplerende tabell 2. De rapporterte RT-skiftverdiene er basert på måling av 20 forskjellige prøver tatt fra forskjellige hetteglass. Prøvene ble analysert etter kolonnelikevekt. Metabolittene i hver prøve ble ekstrahert fra 5,0 × 108 gjærceller. Rt shift-verdier er middelet til 20 forskjellige prøver (n = 20). P-verdiene som er avledet fra den ikke-de ubetalte t-testen, ble brukt til å sammenligne de to kolonnene med samme varians mellom begge utvalgstypene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: LC-betingelser for omvendt fase 8-kolonnen navngitt i Materialfortegnelse og brukes til å skille forskjellige metabolitter i denne studien. Kolonneegenskaper var som følger: 150 x 2,1 mm, 5 μm polymer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 3: En liste over alle de 374 vannløselige metabolittene som er gjenvunnet og kommentert ved hjelp av LC-MS/MS-metoden. Alle metabolitter ble gjenopprettet fra samme LC-graderingskjøring, utsatt for en dataavhengig anskaffelsesalgoritme (DDA) beskrevet i Supplemental Table 4, og kommentert ved hjelp av programvaren som er navngitt i Tabell over materialer. MS1-toppformene til 211 metabolitter (hvis status i tabellen er angitt som en tom) var passende å bli brukt til kvantifisering, og deres respektive MS2-spektra hadde fulle kamper med mzCloud spectral-biblioteket. MS2 spektra av 38 metabolitter (hvis status i tabellen er angitt som en d) hadde fulle treff med online spektralbiblioteket. Likevel var ikke MS1-toppfigurene deres passende å bruke til kvantifisering. MS2-spektra av 125 metabolitter (hvis status i tabellen er angitt som en n) hadde ikke fullstendige treff med det elektroniske spektralbiblioteket. Disse metabolittene ble kommentert som følger: 1) ved hjelp av "Predict composition node" (som kommenterer metabolitter basert på nøyaktig samsvar med MS1-verdier, antall matchede og tapte isotoper og isotop % intensitet samsvart med de teoretiske referansestandardene); 2) ved hjelp av "ChemSpider node" (som kommenterer metabolitter basert på nøyaktig samsvar av MS1 verdier og likhet match score av MS2 spektra med online spektral bibliotek); og 3) ved hjelp av oppbevaringstid (RT) skifte verdier av metabolitter (disse verdiene avhenger av den fysiske strukturen og kjemiske egenskapene til metabolitter). Metabolittene som er oppført i tabellen ble funnet i alle de 3 biologiske replikeringene som ble utført, med RT-skiftverdiene på < 0,2 min. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 4: En dataavhengig anskaffelsesalgoritme (DDA) som ble brukt her til merknad av vannløselige metabolitter ved hjelp av programvaren som er navngitt i Materialfortegnelse.

Supplerende tabell 5: Et typisk lineært dynamisk område som vi observerte da vi målte konsentrasjonene av forskjellige aminosyrer ved hjelp av MS-systemet som er navngitt i Materialfortegnelse. MS-systemet som brukes her har et bredt (minst to størrelsesordener) lineært dynamisk område for måling av ulike metabolitters konsentrasjoner. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Følg de forebyggende tiltakene som er beskrevet nedenfor for å kunne bruke protokollen som er beskrevet nedenfor. Kloroform og metanolekstrakt ulike stoffer fra laboratorieplastikk. Vær derfor forsiktig når du håndterer dem. Unngå bruk av plast i trinn som innebærer kontakt med noen av disse to organiske løsningsmidlene. Bruk borosilikatglasspipetter for disse trinnene. Øk disse pipettene med kloroform og metanol før bruk. Bruk kun mikropipettespisser og rør laget av polypropylen som er motstandsdyktige mot organiske løsningsmidler. Under prøvepreparering for LC-MS/MS eliminerer du alle luftbobler i hetteglassene i glasset før du setter dem inn i en brønnplate.

Zwitterionic-fasekolonnen som brukes her, krever omfattende rekondisjonering etter hver kjøring for å minimere RT-skiftet. For rekondisjonering av kolonner anbefaler vi at du bruker et volum av rekondisjoneringsløsningen som er omtrent 20 volumer av kolonnen. Kolonnen må rekondisjoneres med den første mobile fasen i 15 min med en økt strømningshastighet på 0,4 ml / min. For å unngå skade på søylen under rekondisjoneringen, hold kolonnetrykket under den øvre trykkgrensen som anbefales av produsenten.

Vær oppmerksom på at noen kolonner med blandet separasjonskromatografi som opererer i omvendt fasemodus, tillater oppløsning av ladede metabolitter40,41. Disse kolonnene for blandet separasjon er basert på omvendt fase-kolonnen som brukes her (se Materialfortegnelse) og inneholder polare innebygde grupper som kan skille metabolitter basert på kostnad40,41.

Her beskrev vi en LC-MS/MS-basert metode for ikke-målrettet metabolomikk for kvantitativ analyse av mange vannløselige metabolitter ekstrahert fra gjærceller. Metoden gir flere fordeler i forhold til LC-MS/ MS-metodene til ikke-målrettede metabolomics som for tiden brukes til dette formålet. Disse fordelene inkluderer følgende. For det første er metoden følsom og tillater identifisering og kvantifisering av noen vannløselige metabolitter i konsentrasjoner så lave som 0,05 pmol / μL. Den rapporterte følsomheten til de eksisterende LC-MS/MS-metodene er lavere3,22,27,42. For det andre bruker metoden en celleslukkingsprosedyre som fremkaller en betydelig lavere lekkasje av intracellulære metabolitter fra cellen enn det som er rapportert for de for tiden brukte prosedyrene31,33,38. Dermed reduserer prosedyren som vi utviklet for celleslukking i hvilken grad de for tiden brukte prosedyrene undervurderer de intracellulære konsentrasjonene av vannløselige metabolitter. For det tredje, i motsetning til de eksisterende LC-MS / MS-metodene2,31,33, skiller metoden mellom forskjellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for mange metabolitter. Disse metabolittene inkluderer ulike energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosakkarider, mellomprodukter av glykolyse og trikarboksylsyklus mellomprodukter. For det fjerde brukte vi metoden til å lage en omfattende massespektral database med MS1 og MS2 for riktig identifisering og kvantifisering av et bredt spekter av spesifikke metabolitter ved hjelp av rå LC-MS / MS-data. I motsetning til dette er de eksisterende elektroniske massespektraldatabasene for MS1 og MS2 ufullstendige43,44,45. For det femte bruker metoden en enkelt type metabolittutvinning for å gjenopprette vannløselige metabolitter med forskjellige strukturelle, fysiske og kjemiske egenskaper. Disse metabolittenes mangfold overstiger betydelig de alternative metodene for et enkelt trinns utvinning av vannløselige metabolitter fra gjærceller3,22,27,46. Seks, i motsetning til de eksisterende LC-MS /MS-metodene3,22,47,48, bruker metoden en enkelt type LC-kolonne for å skille seg fra hverandre forskjellige strukturelle og funksjonelle klasser av vannløselige metabolitter. Syv, metoden muliggjør identifisering og kvantifisering av mer enn 370 vannløselige metabolitter ekstrahert fra gjærceller. Dette antallet identifiserbare og kvantifiserbare metabolitter overstiger antall metabolitter rapportert for andre metoder for ikke-målrettet metabolomics i gjær3,22,27,49,50.

Metoden har flere begrensninger. Disse begrensningene er som følger. Zwitterionic-fase kolonnen som brukes til metabolitt separasjon av LC krever omfattende re-conditioning etter hver kjøring. Videre er metoden effektiv bare for ikke-målrettet metabolomics av vannløselige, hydrofile metabolitter. Videre kan forskjellige isomeriske former for karbohydrater (inkludert isomerer av fruktose, glukose og galaktose) ikke kvantifiseres ved hjelp av metoden. Dette skyldes at zwitterionic-fase kolonnen som brukes i metoden ikke kan skille disse karbohydrat isomers fra hverandre når de er tilstede i en blanding med andre metabolittere. Dessuten kan metoden ikke utnyttes for å identifisere glukose fordi dette karbohydratet skaper flere topper under kromatografi på den zwitterionic-fase kolonnen som brukes i metoden. Til slutt, treonin kan ikke kvantifiseres ved hjelp av metoden på grunn av co-elution av denne aminosyren med isomer homoserin under metabolitt separasjon ved kromatografi.

Vi bruker denne LC-MS / MS-metoden for å studere aldringsrelaterte endringer i vannløselig metabolome av den spirende gjæren S. cerevisiae. Vi bruker også denne metoden for å undersøke hvor mange aldringsforsinkende genetiske, kostholdsmessige og farmakologiske intervensjoner påvirker vannløselig metabolom av gjærceller under deres kronologiske aldring. På grunn av sin allsidighet, robusthet og følsomhet kan LC-MS/MS-metoden med hell brukes til kvantitativ vurdering av de vannløselige metabolomene i evolusjonært fjerne eukaryote organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi er takknemlige overfor nåværende og tidligere medlemmer av Titorenko-laboratoriet for diskusjoner. Vi anerkjenner Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Centre for Structural and Functional Genomics, og Centre for Microscopy and Cellular Imaging (alle ved Concordia University) for fremragende tjenester. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482 og CRDPJ 515900 - 17). K.M. ble støttet av Concordia University Armand C. Archambault Fellowship og Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

Biokjemi Utgave 167 vannløselige metabolitter metabolomikkprofilering slukking av metabolsk aktivitet propidiumjodfarging fluorescensmikroskopi utvinning av metabolitter energibærermolekyler nukleotider aminosyrer monosakkarider flytende kromatografi massespektrometri
Kvantitativ metabolomikk av <em>saccharomyces cerevisiae</em> ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter