Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Количественная метаболомика Saccharomyces Cerevisiae с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

Представлен протокол идентификации и количественного определения основных классов водорастворимых метаболитов в дрожжевых Saccharomyces cerevisiae. Описанный метод является универсальным, надежным и чувствительным. Позволяет отделить структурные изомеры и стереоизомерные формы водорастворимых метаболитов друг от друга.

Abstract

Метаболомика - это методология, используемая для идентификации и количественной оценки многих низкомолекулярных промежуточных продуктов и продуктов метаболизма в клетке, ткани, органе, биологической жидкости или организме. Метаболомика традиционно фокусируется на водорастворимых метаболитах. Водорастворимый метаболом является конечным продуктом сложной клеточной сети, которая объединяет различные геномные, эпигеномные, транскриптомные, протеомные и экологические факторы. Следовательно, метаболомический анализ непосредственно оценивает результат действия для всех этих факторов во множестве биологических процессов в различных организмах. Одним из таких организмов является почкование дрожжей Saccharomyces cerevisiae,одноклеточный эукариот с полностью секвенированным геномом. Поскольку S. cerevisiae поддастся всестороннему молекулярному анализу, он используется в качестве модели для препарирования механизмов, лежащих в основе многих биологических процессов в эукариотической клетке. Универсальный аналитический метод для надежной, чувствительной и точной количественной оценки водорастворимого метаболома обеспечит необходимую методологию для анализа этих механизмов. Здесь представлен протокол оптимизации условий гашения метаболической активности и извлечения водорастворимых метаболитов из клеток S. cerevisiae. Протокол также описывает использование жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа экстрагированных водорастворимых метаболитов. Описанный здесь метод нецелевой метаболомики LC-MS/MS является универсальным и надежным. Это позволяет идентифицировать и количественно оценить более 370 водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами, включая различные структурные изомеры и стереоизомерные формы этих метаболитов. Эти метаболиты включают различные молекулы-носители энергии, нуклеотиды, аминокислоты, моносахариды, промежуточные продукты гликолиза и промежуточные продукты трикарбоксового цикла. Метод нецелевой метаболомики LC-MS/MS чувствителен и позволяет идентифицировать и количественно оценить некоторые водорастворимые метаболиты в концентрациях до 0,05 пмоль/мкл. Метод успешно используется для оценки водорастворимых метаболомов диких и мутантных дрожжевых клеток, культивированных в различных условиях.

Introduction

Водорастворимые метаболиты представляют собой низкомолекулярные промежуточные продукты и продукты метаболизма, которые способствуют необходимым клеточным процессам. Эти эволюционно сохраненные процессы включают преобразование питательных веществ в пригодную для использования энергию, синтез макромолекул, клеточный рост и передачу сигналов, контроль клеточного цикла, регуляцию экспрессии генов, реакцию на стресс, посттрансляционную регуляцию метаболизма, поддержание функциональности митохондрий, везикулярный клеточный транспорт, аутофагию, клеточное старение и регулируемую гибель клеток1,2,3.

Многие из этих важных ролей водорастворимых метаболитов были обнаружены исследованиями в почковых дрожжах S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Этот одноклеточный эукариот является полезным модельным организмом для рассечения механизмов, с помощью которых водорастворимые метаболиты способствуют клеточным процессам благодаря своей податливости передовым биохимическим, генетическим и молекулярно-биологическим анализам23,24,25,26. Хотя методы нецелевой метаболомики LC-MS/MS были использованы для изучения роли водорастворимых метаболитов в почковых дрожжах3,18,22,27,этот тип анализа требует улучшения его универсальности, надежности, чувствительности и способности различать различные структурные изомеры и стереоизомерные формы этих метаболитов.

Последние годы отмечены значительными успехами в применении методов нецелевой метаболомики LC-MS/MS для профилирования водорастворимых метаболитов in vivo. Тем не менее, многие проблемы в использовании этой методологииостаются2,28, 29,30, 31,32,33,34,35,36. Эти проблемы включают в себя следующее. Во-первых, внутриклеточные концентрации многих водорастворимых метаболитов ниже порога чувствительности для применяемых в настоящее время методов. Во-вторых, эффективность гашения метаболической активности слишком низка, а степень связанной с гашением клеточной утечки внутриклеточных метаболитов слишком высока для современных методов; следовательно, используемые в настоящее время методы недооценивают внутриклеточные концентрации водорастворимых метаболитов. В-третьих, существующие методы не могут дифференцировать структурные изомеры (т.е. молекулы с одинаковой химической формулой, но разной атомной связностью) или стереоизомеры (т.е. молекулы с одинаковой химической формулой и атомной связностью, но с разным расположением атомов в пространстве) конкретных метаболитов; это препятствует правильной аннотации некоторых метаболитов используемыми в настоящее время методами. В-четвертых, существующие масс-спектральные онлайн-базы данных родительских ионов (MS1) и вторичных ионов (MS2) являются неполными; это влияет на правильную идентификацию и количественное определение конкретных метаболитов с использованием необработанных данных LC-MS/MS, полученных с помощью современных методов. В-пятых, существующие методы не могут использовать один тип экстракции метаболитов для восстановления всех или большинства классов водорастворимых метаболитов. В-шестых, существующие методы не могут использовать один тип колонки LC для отделения друг от друга всех или большинства классов водорастворимых метаболитов.

Здесь мы оптимизировали условия для гашения метаболической активности в клетках S. cerevisiae, поддержания большинства водорастворимых метаболитов в этих клетках перед экстракцией и извлечения большинства классов водорастворимых метаболитов из дрожжевых клеток. Мы разработали универсальный, надежный и чувствительный метод идентификации и количественной оценки более 370 водорастворимых метаболитов, извлеченных из клеток S. cerevisiae на основе LC-MS/MS. Этот метод нецелевой метаболомики позволяет оценить внутриклеточные концентрации различных молекул-энергоносителей, нуклеотидов, аминокислот, моносахаридов, промежуточных продуктов гликолиза и промежуточных продуктов трикарбоксового цикла. Разработанный метод LC-MS/MS позволяет идентифицировать и количественно оценить различные структурные изомеры и стереоизомерные формы водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изготовление и стерилизация среды для выращивания дрожжей

  1. Сделайте 180 мл полного дрожжевого экстракта со средой бактопептона (YP). Полная среда YP содержит 1% (мас./об.) дрожжевого экстракта и 2% (мас./об.) бактопептона.
  2. Распределите 180 мл среды YP поровну на четыре колбы Эрленмейера по 250 мл. Каждая из этих колбы содержит 45 мл среды YP.
  3. Стерилизуйте колбы средой YP путем автоклавирования при 15 psi/121 °C в течение 45 мин.

2. Штамм дрожжей дикого типа

  1. Используйте штамм BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Выращивание дрожжей в среде YP, содержащей 2% глюкозы

  1. Стерилизуют 20% (мас./об.) раствор глюкозы путем автоклавирования при 15 psi/121 °C в течение 45 мин.
  2. Добавьте 5 мл автоклавного 20% (мас./об.) раствора глюкозы в каждую из двух колбы Эрленмейера с 45 мл стерилизованной среды YP. Конечная концентрация глюкозы в среде YP составляет 2% (мас./об.).
  3. Используйте микробиологическую петлю для инокуляции дрожжевых клеток в каждую из двух колб Эрленмейера со средой YP, содержащей 2% глюкозы.
  4. Выращивайте дрожжевые клетки в течение ночи при 30 °C во вращательном шейкере, установленном при 200 оборотах в минуту.
  5. Возьмите аликвот дрожжевой культуры. Определите общее количество дрожжевых клеток на мл культуры. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра.

4. Перенос клеток и клетка растет в среде YP с 2% глюкозы

  1. Добавьте 5 мл стерилизованного 20% (мас./об.) раствора глюкозы в каждую из оставшихся двух колбы Эрленмейера с автоклавной средой YP. Конечная концентрация глюкозы составляет 2% (мас./об.).
  2. Перенесите объем ночной культуры дрожжей в среде YP с 2% глюкозой, содержащей общее количество 5,0 х 107 клеток, в каждую из двух колб Эрленмейера со средой YP, содержащей 2% глюкозы. Используйте стерильную пипетку для переноса клеток.
  3. Выращивайте дрожжевые клетки в течение не менее 24 ч (или более, если требует эксперимент) при 30 °C во вращательном шейкере, установленном при 200 оборотах в минуту.

5. Изготовление реагентов, подготовка лабораторной посуды и установка оборудования для закалки клеток

  1. Приготовить следующее: 1) закалочный раствор (60% полноценный (>99,9%) метанол в буфере бикарбоната аммония (АВС) 155 мМ, рН = 8,0); 2) ледяной раствор ABC (рН = 8,0); 3) цифровой термометр, способный измерять до -20 °C; 4) большие бутылки-центрифуги объемом 500 мл; 5) предварительно охлаждаемая высокоскоростная центрифуга с предварительно охлаждаемым ротором и предварительно охлаждаемыми 500 мл центрифужными баллончиками для этого ротора, все при -5 °C; 6) экстракционные трубки для метаболитов (высокоскоростные стеклянные центрифужные трубки по 15 мл с крышками с полиэтиленовой футерильной подкладкой); и 7) сухой лед.

6. Закалка ячеек

  1. Используйте гемоцитометр для определения количества дрожжевых клеток на мл YP с 2% культурой глюкозы.
  2. Переложите объем культуры в YP-среде с 2% глюкозой, содержащей общее количество 5,0 х 108 клеток, в предварительно охлажденные бутылки центрифуги объемом 500 мл.
  3. Быстро наполните бутылку центрифуги, содержащую ячейки объемом до 200 мл, закалочным раствором, хранящимся при -20 °C.
  4. Центрифугировать флаконы в высокоскоростной центрифуге при 11,325 х г в течение 3 мин при -5 °C.
  5. Быстро и нежно извлеките бутылку из центрифуги; аккуратно открутите крышку и удалите супернатант, не нарушая гранулу.
  6. Быстро повторно суспендировать ячейку гранулы в 10 мл ледяного abc-буфера и перенести суспензию в 15 мл высокоскоростной стеклянной центрифужированной трубки с политетрафторэтиленовым футериленовым колпачком для экстракции метаболитов.
  7. Собирают клетки путем центрифугирования в клинической центрифуге при 3000 х г в течение 3 мин при 0 °C.
  8. Быстро удалите супернатант и поместите трубку на сухой лед, чтобы начать экстракцию метаболита, или храните трубку при -80 °C до экстракции.

7. Подготовка реагентов, лабораторной посуды и оборудования для экстракции метаболитов

  1. Приготовить следующее: 1) хлороформ марки ЛК-МС; 2) метанол марки ЛК-МС; 3) наночистая вода марки LC; 4) класс ЛК-МС (АКН); 5) стеклянные шарики (кислотно-промытые, 425-600 мкм); 6) вихрь с комплектом держателей пенопластовых трубок с фиксатором; 7) высокоскоростные стеклянные центрифужные трубки емкостью 15 мл с крышками с полиэтиленовой футериной; 8) флаконы MS; 9) сухой лед; и 10) пробирки по 1,5 мл промывали один раз этанолом, один раз с ACN и один раз с наночистой водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только наконечники микропипеток и трубки из полипропилена, устойчивого к органическим растворителям.

8. Извлечение метаболитов

  1. К метаболитам, хранящимся на сухом льду или хранящимся при -80°С в пробирке со ступени 6.7, добавляют следующее: 1) 2 мл хлороформа, хранящегося при -20°С; 2) 1 мл метанола хранят при -20 °C; 3) 1 мл ледяной наночистой воды; и 4) 200 мкл стеклянных шариков 425-600 мкм, промытых кислотой.
  2. Накройте и закройте горловую часть трубки алюминиевой фольгой. Поместите трубки в комплект держателей пенопластовых трубок с ретейнером и вихрьте их в течение 30 мин на средней скорости (т.е. со скоростью, которая установлена на уровне 6, причем 12 является максимальной скоростью вихря) при 4 °C для облегчения экстракции метаболита.
  3. Инкубируйте трубку в течение 15 минут на льду (НЕ сухом льду!), чтобы способствовать осаждению белка и отделению верхней водной от нижней органической фазы.
  4. Центрифугировать трубку в клинической центрифуге при 3000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Эта стадия центрифугирования позволяет отделить верхнюю водную фазу (содержащую водорастворимые метаболиты) от среднего слоя (содержащего клеточный мусор и белки) и от нижней органической фазы (содержащей в основном липиды).
  5. Используйте микропипетку для переноса верхней водной фазы (400 мкл) в промытую и маркированную трубку 1,5 мл, содержащую 800 мкл ACN, которая хранилась при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления верхней водной фазы в ACN будут осаждены белые облака, удерживая при -20 °C.
  6. Центрифугировать трубку с образцом в настольной центрифуге при 13 400 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осадки белого облака исчезнут после центрифугирования.
  7. Переложите 800 мкл из верхней части жидкости в пробирке в меченый флакон MS. Храните образец при 0 °C до тех пор, пока он не будет проанализирован LC-MS/MS.

9. Подготовка реагентов, лабораторной посуды и оборудования для ЛК

  1. Подготовьте следующее: 1) вихрь; 2) ультразвуковой ультразвуковой аппарат; 3) Флаконы из стекла MS; 4) LC-система, оснащенная бинарным насосом, дегассером и автосамплером; 5) цвиттерионно-фазовая хроматографическая колонка (полимер 5 мкм, 150 х 2,1 мм), названная в Таблице материалов; 6) колонный нагреватель; и 7) подвижные фазы, включая фазу А (5:95 ACN:вода (v/v) с 20 мМ ацетата аммония, рН = 8,0) и фазу B (100% ACN).

10. Разделение экстрагированных метаболитов по ЛК

  1. Подвергать содержание флакона MS ультразвуковой ультразвуковой энергии в течение 15 мин.
  2. Вихрь флакона MS 3x в течение 10 секунд при комнатной температуре (RT).
  3. Поместите флакон MS в пластину колодца.
  4. Во время хроматографа поддерживайте колонку при 45 °C и расходе 0,250 мл/мин. Держите образец в пластине скважины при 0 °C. Обратитесь к таблице 1 для градиентов LC, которые необходимо использовать во время хроматографии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативная общая ионная хроматограмма водорастворимых метаболитов, которые были извлечены из клеток штамма дикого типа BY4742, показана на фиг.1. Метаболиты, разделенные LC, были идентифицированы и количественно определены масс-спектрометрическим анализом, который проводили в режиме положительной ионизации [ESI (+)], как описано для этапа 11.

11. Масс-спектрометрический анализ метаболитов, разделенных ЛК

  1. Используйте масс-спектрометр, оснащенный нагретой электрораспрозреванием (HESI) для идентификации и количественного определения водорастворимых метаболитов, которые были разделены LC. Используйте анализатор масс-спектрометра для ионов MS1 и детектор масс-спектрометра для ионов MS2. Используйте параметры, приведенные в Таблицах 2 и 3 для получения ионов MS1 и MS2 в зависимости от данных соответственно.
  2. Используйте объем образца 10 мкл для инъекции в режимах ESI (+) и ESI (-).

12. Идентификация и количественное определение различных метаболитов путем обработки исходных данных из LC-MS/MS

  1. Используйте программное обеспечение, названное в Таблице материалов, для проведения идентификации и количественного определения различных водорастворимых метаболитов из необработанных файлов LC-MS/MS. Это программное обеспечение использует MS1 для количественного определения метаболитов и MS2 для идентификации метаболитов. Программное обеспечение использует наиболее широко курируемую библиотеку масс-спектральной фрагментации для аннотирования метаболитов с использованием необработанных данных LC-MS / MS путем сопоставления спектров MS. Это программное обеспечение также использует точную массу MS1 и соответствие изотопного паттерна для аннотирования метаболитов с использованием онлайн-баз данных. Подробности см. на рисунке 2.
  2. Используйте библиотеку баз данных и спектров, которая находится в свободном доступе онлайн (https://www.mzcloud.org), для поиска MS2 спектров необработанных данных.

13. Анализ целостности мембраны с помощью окрашивания и флуоресцентной микроскопии йодида пропидия (PI)

  1. После закалки клеток, выполненной, как описано на этапе 6, тщательно промыть закаленные клетки 15 мл буфера ABC для удаления закалочного раствора. Собирают клетки центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин при 0 °С.
  2. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл АВС-буфера и добавляют 0,5 мл раствора PI (0,5 мг/мл).
  3. Вихрь пробирку с образцом 3х в течение 10 с и высиживая ее в течение 10 мин в темноте и на льду.
  4. Центрифугировать трубку с образцом в настольной центрифуге при 13 400 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  5. Удалите супернатант и повторно суспендируют гранулу в 1 мл буфера ABC.
  6. Центрифугируют трубку при 13 400 х г в течение 10 мин при 4 °C и удаляют супернатант. Повторите этот шаг еще 2 раза, чтобы удалить PI, привязанный к поверхности ячейки.
  7. Повторно суспендируют гранулу в 300 мкл АВС-буфера. Поместите 10 мкл суспензии на поверхность слайда микроскопа.
  8. Захват изображений дифференциального интерференционного контраста (DIC) и флуоресцентной микроскопии с помощью флуоресцентного микроскопа. Используйте фильтр, настроенный на длинах волн возбуждения и излучения 593 нм и 636 нм (соответственно).
  9. Используйте программное обеспечение для подсчета общего числа клеток (в режиме DIC) и количества флуоресцентно окрашенных клеток. Кроме того, используйте это программное обеспечение для определения интенсивности окрашивания для отдельных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы улучшить количественную оценку водорастворимых метаболитов в дрожжевой клетке, мы оптимизировали условия закалки клеток для обнаружения метаболитов. Закалка клеток для этой цели включает в себя быструю остановку всех ферментативных реакций внутри клетки31,33,37,38. Такое остановку клеточной метаболической активности является существенным этапом любого метода количественного определения водорастворимых метаболитов in vivo, поскольку предотвращает недооценить их внутриклеточные концентрации31,33,37,38. Закалка клеток для оценки метаболитов всегда ухудшает целостность плазматической мембраны (ПМ) (и клеточной стенки (ХО), если она присутствует); это вызывает утечку метаболитов из клеток31,33,37,38. Метод использует условия закалки клеток, которые минимизируют такое нарушение, тем самым значительно уменьшая связанную с закалку клеточную утечку внутриклеточных метаболитов. Действительно, большинство современных методов закалки клеток включают использование определенной концентрации метанола (т.е. 40% (v/v), 60% (v/v), 80% (v/v) или 100% (v/v)) при удельной температуре (т.е. -20 °C, -40 °C или -60 °C), с буфером31,33,37,38или без него. Мы сравнили эффективность нарушения ТЧ и ХО для одного из используемых в настоящее время методов закалки клеток (т.е. путем клеточной обработки 80% (v/v) метанола при -40 °C в отсутствие буфера38)с эффективностью для модифицированного метода закалки клеток (т.е. путем клеточной обработки 60% (v/v) метанола при -20 °C в присутствии изотонического буферного раствора ABC при рН = 8,0). PI представляет собой флуоресцентный краситель, который непроницаем для интактных клеток; он может попасть в ячейку только в том случае, если целостность ТЧ (и ХО, если она присутствует) нарушена39. Более того, интенсивность флуоресцентного излучения ПИ возрастает в 30 раз, когда оно связано с ДНК или РНК39. Таким образом, анализ окрашивания ПИ может быть использован для оценки эффективности утечек внутриклеточных метаболитов, связанных с гашением, поскольку эти метаболиты могут просачиваться во внеклеточное пространство только в том случае, если ТЧ и ХО дрожжевой клетки повреждены39. Мы обнаружили, что модифицированный метод закалки клеток вызывает значительно меньший ущерб ТЧ и ХО, чем метод закалки путем обработки клеток небуферным 80% (v/v) метанолом при -40 °C(рисунок 3). Действительно, почти все клетки, подвергавшиеся закалке с использованием метода, демонстрировали красную флуоресцентную эмиссию, которая характерна для дрожжевых клеток, у которых ТЧ и ХО не повреждены(рисунок 3). Напротив, почти все клетки, подвергаемые закалке с использованием другого метода, отображали зеленый флуоресцентный выброс, характерный для дрожжевых клеток, у которых ТЧ и ХО значительно повреждены(рисунок 3). Наиболее интенсивная красная флуоресценция была преобразована в зеленую флуоресценцию с помощью программного обеспечения для дифференциации между сильной красной флуоресценцией и мягкими красными флуоресцентными излучениями.

Модифицированный метод закалки клеток вызвал значительно меньшую утечку водорастворимых метаболитов из дрожжевых клеток, чем метод закалки клеток небуферизованным 80% (v/v) метанолом при -40 °C. Мы подвергли закалке равное количество дрожжевых клеток либо способом (т.е. клеточной обработкой 60% (v/v) метанолом при -20 °C в присутствии изотонического буферного раствора ABC при рН = 8,0; Рисунок 4) или другой способ (т.е. клеточной обработкой небуферизованным 80% (v/v) метанолом при -40°C; Рисунок 5). Степень утечек клеток, связанных с гашением, во внеклеточный раствор оценивали для специфических водорастворимых метаболитов с помощью LC-MS/MS. Концентрации различных классов аминокислот (т.е. больших и малых кислых, основных, нейтрально-неполярных и нейтральных полярных аминокислот) во внеклеточном растворе измеряли до и после закалки клеток. Мы обнаружили, что метод закалки клеток вызывает значительно меньшую утечку всех этих классов аминокислот во внеклеточный раствор(рисунок 4),чем другой метод(рисунок 5).

Метод LC-MS/MS для количественной оценки водорастворимых метаболитов в дрожжевой клетке использует один тип колонки для хроматографического разделения всех водорастворимых классов метаболитов. Этот столбец является столбцом цвиттерионной фазы, названным в Таблице материалов. Мы обнаружили, что эта колонка обеспечивает гораздо более эффективное разделение различных классов водорастворимых метаболитов, чем колонка обратной фазы, названная в Таблице материалов(Дополнительная таблица 1). Действительно, значения сдвига времени удержания (RT) водорастворимых стандартов метаболитов (т.е. NAD+, AMP, GMP, аргинина и глутаминовой кислоты) были значительно ниже, а пиковые формы были значительно более резкими для столбца цвиттерионной фазы по сравнению с колонкой обратной фазы(Дополнительная таблица 1). Условия ЛК, используемые для хроматографического разделения всех метаболитов (т.е. водорастворимых и нерастворимых в воде) для столба обратной фазы, приведены в дополнительной таблице 2.

Еще одно преимущество метода LC-MS/MS заключается в способности хроматографического разделения на приведенной выше цвиттерионной фазовой колонке эффективно отделять друг от друга различные водорастворимые метаболиты с различными структурными, физическими и химическими свойствами. Эти водорастворимые метаболиты включают следующие классы метаболитов: 1) кислые, основные, нейтральные полярные и ненейтральные полярные аминокислоты, включая их различные структурные изомеры(рисунок 6); 2) стабильные и нестабильные нуклеотиды и их производные, выполняющие жизненно важные функции внутри клетки(рисунок 7); и 3) различные моносахариды, включая их различные стереоизомерные формы(рисунок 8).

Важно отметить, что метод LC-MS/MS для количественной оценки водорастворимых метаболитов в дрожжевой клетке был универсальным и надежным. Это позволило нам идентифицировать и количественно оценить 374 водорастворимых метаболита с различными структурными, физическими и химическими свойствами в клетках S. cerevisiae, которые культивировались в полной среде YP, первоначально содержащей 2% глюкозы(Дополнительная таблица 3). 240 метаболитов были обнаружены в режиме положительной ионизации и 134 метаболита были обнаружены в режиме отрицательной ионизации. Идентичность всех этих водорастворимых метаболитов была подтверждена путем сопоставления их фрагментов MS2, полученных как в положительном, так и в отрицательном режимах ионизации, со спектральной библиотекой MS2 mzCloud. Эта онлайн-библиотека включает спектры стандартов метаболитов, которые отличаются своими параметрами MS1 и DDA MS2. Чтобы максимально увеличить степень соответствия спектров MS2 образца с онлайн-спектральной библиотекой, мы использовали различные параметры DDA MS2. Эти параметры приведены в дополнительной таблице 4. Почти 6000 признаков (мнимых метаболитов) для одного и того же образца были получены с помощью метода фрагментации диссоциации с высокой энергией, вызванной столкновением (HCD) или диссоциации, вызванной столкновением (CID), с использованием топ-5 событий MS2, 35 значений энергии столкновения и времени активации 10 мс. После фильтрации полученных файлов с > 95% соответствия MS2 и > критериям соответствия изотопному паттерну MS1 было идентифицировано только 162 метаболита в фрагментированном состоянии HCD и 142 метаболита в фрагментированном состоянии CID. 81 из 162 метаболитов были уникальными для метода фрагментации HCD, тогда как 42 из 142 были уникальными для метода фрагментации CID (см. лист под названием «T5_35E__10 ms_HCD vs CID» в дополнительной таблице 4). Поэтому мы пришли к выводу, что правильная аннотация водорастворимых метаболитов с помощью метода LC-MS/MS требует использования множества различных параметров DDA MS2.

Метод LC-MS/MS также очень чувствителен. Это позволяет идентифицировать и количественно оценить некоторые водорастворимые метаболиты в концентрациях до 0,05 пмоль/мкл (см. данные по фенилаланину в таблице 4). Этот предел количественного определения варьируется в широком диапазоне концентраций для различных классов метаболитов(таблица 4).

Используемая здесь система MS имеет широкий (не менее двух порядков) линейный динамический диапазон для измерения концентраций различных метаболитов(Дополнительная таблица 5).

Figure 1
Рисунок 1:Общая ионная хроматограмма (ТИЦ) из данных жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC-MS) водорастворимых метаболитов, которые были извлечены из клеток штамма дикого типа BY4742. Метаболиты были разделены ЛК на цвиттерионно-фазовой хроматографической колонке, названной в Таблице материалов. Метаболиты были обнаружены МС родительских ионов (MS1), которые были созданы с использованием положительного режима электрораспролива области ионизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Рабочий процесс, используемый для анализа водорастворимых метаболитов с помощью программного обеспечения, названного в Таблице материалов. Все параметры были автозаменены программным обеспечением на основе необработанных данных MS, за исключением следующих: 1) вкладка «Обнаружение соединений»: установленная минимальная, пиковая интенсивность 10 000; и 2) вкладка «Поиск ChemSpider»: для идентификации метаболитов были выбраны 4 онлайн-базы данных, включая BioCyc, Human Metabolome Database, KEGG и Дрожжевые метаболомные базы данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Дифференциальный интерференционный контраст (ДВС-чв; верхний ряд) и флуоресцентный (нижний ряд) микроскопические изображения дрожжевых клеток, закаленного либо буфером бикарбоната аммония (ABC) (pH = 8,0; контроль), либо другим раствором для закалки. После закалки клеток равное количество клеток инкубировали с раствором ПИ в течение 10 мин в темноте и на льду. Наиболее интенсивная красная флуоресценция была преобразована в зеленую флуоресценцию программным обеспечением, чтобы различать сильную красную флуоресценцию и мягкие красные флуоресцентные выбросы. Эффективность повреждения ТЧ и ХО сравнивали для способа закалки клеток (т.е. клеточной обработки 60% (v/v) метанола при -20°C в присутствии изотонического буферного раствора ABC при рН = 8,0) и одного из используемых в настоящее время методов (т.е. клеточной обработкой 80% (v/v) метанола при -40 °C при отсутствии буфера). Отображается шкала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Процент утечки различных классов аминокислот для способа закалки клеток. 5,0 х 108 дрожжевых клеток подвергали закалке обработкой 60% (v/v) метанолом при -20 °C в присутствии изотонического буферного раствора ABC при рН = 8,0. Процент утечки различных классов аминокислот оценивали с использованием LC-MS/MS для измерения их концентраций во внеклеточном растворе до и после закалки. Показаны средние значения ± SD и отдельных точках данных (n = 3). * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Процент утечки различных классов аминокислот для одного из используемых в настоящее время методов закалки клеток. 5,0х 10 8 дрожжевых клеток подвергали закалке обработкой 80% (v/v) метанола при -40 °C при отсутствии буфера. Процент утечки различных классов аминокислот оценивали с использованием LC-MS/MS для измерения их концентраций во внеклеточном растворе до и после закалки. Показаны средние значения ± SD и отдельных точках данных (n = 3). * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6:Эффективное хроматографическое разделение кислотных, основных, нейтральных полярных и ненейтрального полярных классов аминокислот, включая два структурных изомеров (т.е. лейцин и изолейцин), на столбике цвиттерионной фазы, названной в Таблице материалов. Все эти аминокислоты были обнаружены MS/MS в режиме положительной ионизации [ESI (+)]. Условия для ЛК на цвиттерионно-фазовой хроматографической колонке описаны в таблице 1. Условия для MS/MS описаны в Таблице 2 и Таблице 3. Все аминокислотные стандарты покупаются на коммерческой купе (например, Sigma). Время удержания сдвигов между 3 независимыми прогоном хроматографии составляет менее ± 10 секунд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7:Эффективное хроматографическое разделение различных классов нуклеотидов, включая энергетически нестабильные нуклеотиды (нуклеозидмонофосфаты, нуклеозиддифосфаты и нуклеозидтрифосфаты) и молекул-носителей электронов (NADH и NAD+), на колонке цвиттерионной фазы,названной в Таблице материалов. Все эти нуклеотиды были обнаружены MS/MS в режиме положительной ионизации [ESI (+)]. Условия для ЛК на цвиттерионно-фазовой хроматографической колонке описаны в таблице 1. Условия для MS/MS описаны в Таблице 2 и Таблице 3. Все нуклеотидные стандарты покупаются коммерчески (например, Sigma). Время удержания сдвигов между 3 независимыми прогоном хроматографии составляет менее ± 10 секунд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8:Эффективное хроматографическое разделение различных классов моносахаридов, включая структурные изомеры и стереоизомерные формы альдо- и кетогексоз (фруктоза, манноза и галактоза), и альдопентоз (рибоза и арабиноза), на цвиттерионической фазовой колонке,названной в Таблице материалов. Все эти моносахариды были обнаружены MS/MS в режиме положительной ионизации [ESI (+)]. Условия для ЛК на цвиттерионно-фазовой хроматографической колонке описаны в таблице 1. Условия для MS/MS описаны в Таблице 2 и Таблице 3. Все моносахаридные стандарты покупаются на коммерческой купе (например, Sigma). Время удержания сдвигов между 3 независимыми прогоном хроматографии составляет менее ± 10 секунд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Тип столбца SeQuant ZIC-pHILIC 5 мкм полимер 150 x 2,1 мм
Растворитель А LC-MS марка H2O: ACN (95:5, об/об) 20 мМ ацетат аммония
Растворитель B Ацетонитрил LC-MS класса (ACN)
Предел давления Максимум = 300 бар Минимум = 0
Программа градиента ВЭЖХ
Время (минуты) Расход (0,25 мл/мин) Композиции
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Таблица 1: Условие ЛК, используемое для разделения водорастворимых метаболитов с помощью цвиттерионическо-фазовой колонки,названной в Таблице материалов. Эти условия использовались во всех экспериментах, описанных здесь.

Полный диапазон масс сканирования (Dalton) 70-900
Полное разрешение сканирования FTMS (анализатор Orbitrap) 6,0 х 104
Разрешение FTMS (анализатор Orbitrap) HCD 7500
FtMS цель полного сканирования AGC 1,0 х 106
Цель МТС МСН 5,0 х 104
Ионный улавливание (LTQ) MSn AGC мишень 1,0 х 104
Тип источника ионов Нагретая электрорасправная ионизация
Капиллярная температура (°C) 275
Температура нагревателя источника (°C) 250
Поток газа в оболочке 10
Aux Расход газа 5

Таблица 2: Настройки масс-спектрометра, используемые для анализа метаболитов, которые были разделены LC. Эти условия использовались для анализа метаболитов во всех экспериментах, описанных здесь. Сокращения: FTMS = преобразование Фурье (FTMS); HCD = высокоэнергетическая диссоциация, вызванная столкновением; LTQ = линейный квадруполь ловушки; AGC = автоматическая регулировка усиления, значение популяции ионов для MS и MS/MS.

Полярность прибора Положительный/Отрицательный
Тип активации CID/HCD
Требуется минимальный сигнал 5000
Ширина изоляции 2
Нормализованные энергии столкновения для CID 35, 60
Нормализованные энергии столкновения для HCD 35, 45, 55
Состояние заряда по умолчанию 1
Время активации для CID (мс) 10, 30
Время активации для HCD (мс) 10
Количество событий MS/MS в CID Топ 3, Топ 5, Топ 10
Количество событий MS/MS в HCD Топ 5
Количество микросканирований, используемых как в HCD, так и в CID 1

Таблица 3: Настройки масс-спектрометра, используемые для обнаружения вторичных ионов (MS2). Сокращения: HCD = высокоэнергетическая-индуцированная-столкновение-диссоциация; CID = диссоциация, вызванная столкновением; ms = миллисекунды.

Метаболиты Std М.В. (г/моль) [М+Ч]+1 [М-Н]-1 Режим обнаружения Самая низкая обнаруженная концентрация (пмоль/мкл)
глицин 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
триптофан 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56Е-02
Фенилаланин 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14Е-02
аргинин 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14Е-02
треонин* 119.05824 120.06552 118.05096 P
серин 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66Е+00
глутамат 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20Е-01
метионин 149.05105 150.05833 148.04377 P 1.96Е+00
Аспартат 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75Е+00
Валин 117.07898 118.08626 116.0717 P 1.49E+00
Изолейцин 131.09463 132.10191 130.08735 P 1.84E+00
лейцин 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26Е+00
Гистидин 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53Е+00
тирозин 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72Е-02
лизин 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43Е-01
Аланин 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12Е+00
Пролин 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05Е+00
цистеин 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22Е-01
аспарагин 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08Е+00
глутамин 146.06914 147.07642 145.06186 P 1.92E+00
гуанин 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47Е+00
гуанозин 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67Е-01
GMP 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17Е-01
ВВП 443.02434 444.03162 442.01706 P 2.57Е+00
ГТП 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27Е+00
АМПЕР 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25Е-01
АДП 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32Е+00
СПС 506.99575 508.00303 505.98847 P 1.77Е+00
НАДН 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47Е+00
НАД+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03Е+00
глюкоза** 180.06339 181.07067 179.05611
фруктоза*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67Е-01
манноза*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05Е+00
галактоза*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00Е-01
рибоза*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10Е+00
арабиноза*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23Е+00
фруктоза-6-фосфат*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60Е+00
глюкозо-6-фосфат*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27Е+00
лимонная кислота 192.12 г 193.034279 191.019726 N 9.33Е-01
яблочная кислота 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23Е+00
пировиноградная кислота 88.06 89.02332 87.008768 N 2.77Е+00

Таблица 4:Самые низкие концентрации различных водорастворимых стандартов метаболитов, которые метод LC-MS/MS может идентифицировать и количественно определить. Пиковая область MS1 каждого стандарта метаболитов использовалась для оценки самой низкой количественной концентрации для этого метаболита. Показаны средние значения двух независимых экспериментов. Три технические реплики были выполнены для каждого из двух независимых экспериментов. ПРИМЕЧАНИЕ: Треонин* может быть обнаружен, но не может быть количественно определен из-за его совместного элюдения с гомосерином, химическим изомером треонина. Глюкоза ** не может быть идентифицирована, потому что она создает несколько пиков хроматографии. Стандарты метаболитов*** могут быть идентифицированы и количественно оценены только в отдельных образцах, но не в смеси стандартов метаболитов или биологической смеси метаболитов.

Дополнительная таблица 1: Значения сдвига времени удержания (RT) одного и того же набора метаболитов для столбцов цвиттерионической фазы и обратной фазы (см. Таблицу материалов) после уравновешивания столбцов. В таблице сравнивается ретенционная воспроизводимость столбцов цвиттерионной фазы и обратной фазы для отдельного набора метаболитов, отличающихся друг от друга своей гидрофильностью и гидрофобностью. Эти метаболиты были идентифицированы с помощью LC-MS/MS. Обратите внимание, что значения сдвига RT гидрофильных метаболитов (т.е. NAD+, AMP, GMP, аргинина и глутаминовой кислоты) значительно ниже, а пиковые формы значительно острее для столбца цвиттерионной фазы по сравнению с колонкой обратной фазы. Напротив, значения сдвига RT гидрофобных метаболитов (т.е. стеариновой кислоты, лауриновой кислоты и декановой кислоты) значительно ниже, а пиковые формы значительно острее для столба обратной фазы по сравнению с цвиттерионной фазовой колонкой. Условия хроматографического разделения метаболитов с помощью цвиттерионическо-фазовой и обратнофазной колонок подробно описаны в таблице 1 и дополнительной таблице 2соответственно. Представленные здесь значения сдвига RT основаны на измерении 20 различных образцов, взятых из разных флаконов. Образцы анализировались после уравновешивания колонн. Метаболиты в каждом образце извлекали из 5,0 × 108 дрожжевых клеток. Значения сдвига RT являются средствами 20 различных выборок (n = 20). Значения p, полученные из непарного теста t, использовались для сравнения двух столбцов с равной дисперсией между обоими типами выборки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Условия LC для столбца обратной фазы 8, названного в Таблице материалов и используемого для разделения различных метаболитов в этом исследовании. Свойства колонны были следующими: 150 х 2,1 мм, полимер 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 3: Список всех 374 водорастворимых метаболитов, восстановленных и аннотированных с использованием метода LC-MS/MS. Все метаболиты были извлечены из одного и того же градиентного пробега LC, подвергнуты алгоритму фрагментации данных-зависимого сбора (DDA), описанному в дополнительной таблице 4,и аннотированы с использованием программного обеспечения, названного в Таблице материалов. Пиковые формы MS1 211 метаболитов (статус которых в таблице указан как пустой) были подходящими для использования для количественной оценки, и их соответствующие спектры MS2 полностью соответствовали спектральной библиотеке mzCloud. Спектры MS2 из 38 метаболитов (статус которых в таблице обозначен как d) имели полное соответствие с онлайн-спектральной библиотекой. Тем не менее, их пиковые формы MS1 не подходят для использования для количественной оценки. Спектры MS2 из 125 метаболитов (статус которых в таблице обозначен как n) не имели полного соответствия с онлайн-спектральной библиотекой. Эти метаболиты были аннотированы следующим образом: 1) с использованием «узла прогноза состава» (который аннотирует метаболиты на основе точного соответствия значений MS1, количества совпадающих и пропущенных изотопов и интенсивности изотопов % соответствия теоретическим эталонным стандартам); 2) использование «узла ChemSpider» (который аннотирует метаболиты на основе точного совпадения значений MS1 и оценки соответствия сходства спектров MS2 с онлайн-спектральной библиотекой); и 3) использование значений сдвига времени удержания (RT) метаболитов (эти значения зависят от физической структуры и химических свойств метаболитов). Метаболиты, перечисленные в таблице, были обнаружены во всех 3 выполненных биологических репликатах со значениями сдвига RT < 0,2 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 4: Алгоритм фрагментации сбора данных (DDA), который использовался здесь для аннотации водорастворимых метаболитов с помощью программного обеспечения, названного в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 5: Типичный линейный динамический диапазон, который мы наблюдали, когда измеряли концентрации различных аминокислот с помощью системы MS, названной в Таблице материалов. Используемая здесь система MS имеет широкий (не менее двух порядков) линейный динамический диапазон для измерения концентраций различных метаболитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Чтобы успешно использовать описанный здесь протокол, следуйте профилактическим мерам, описанным ниже. Хлороформ и метанол извлекают различные вещества из лабораторной пластичной посуды. Поэтому относитесь к ним с осторожностью. Избегайте использования пластмасс на этапах, которые включают контакт с любым из этих двух органических растворителей. Используйте боросиликатные стеклянные пипетки для этих шагов. Поднимите эти пипетки с хлороформом и метанолом перед использованием. Используйте только микропипетные наконечники и трубки из полипропилена, устойчивого к органическим растворителям. Во время подготовки образца для LC-MS/MS удалите все пузырьки воздуха в стеклянных флаконах, прежде чем вставлять их в пластину скважины.

Используемая здесь цвиттерионная фазовая колонна требует обширного переподготовки после каждого прогона, чтобы свести к минимуму сдвиг RT. Для повторного кондиционирования колонны мы рекомендуем использовать объем раствора для повторного кондиционирования, который составляет около 20 объемов колонны. Колонну необходимо переобозначить с начальной подвижной фазой в течение 15 мин при повышенном расходе 0,4 мл/мин. Чтобы избежать повреждения колонны во время ее повторного кондиционирования, держите давление в колонне ниже верхнего предела давления, рекомендованного производителем.

Следует отметить, что некоторые колонки хроматографии со смешанным разделением, которые работают в режиме обратной фазы, позволяют разрешать заряженные метаболиты40,41. Эти колонны со смешанным разделением основаны на колонне обратной фазы, используемойздесь (см. Таблицу материалов), и содержат полярные встроенные группы, которые могут разделять метаболиты на основезаряда40,41.

Здесь мы описали метод нецелевой метаболомики на основе LC-MS / MS для количественного анализа многих водорастворимых метаболитов, извлеченных из дрожжевых клеток. Метод обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с методами LC-MS/MS нецелевой метаболомики, используемыми в настоящее время для этой цели. К таким преимуществам можно отнести следующее. Во-первых, метод чувствителен и позволяет идентифицировать и количественно оценить некоторые водорастворимые метаболиты в концентрациях до 0,05 пмоль/мкл. Сообщаемая чувствительность существующих методов LC-MS/MS ниже3,22,27,42. Во-вторых, в способе используется процедура закалки клеток, которая вызывает значительно меньшую утечку внутриклеточных метаболитов из клетки, чем та, о чем сообщалось для используемых в настоящее время процедур31,33,38. Таким образом, процедура, которую мы разработали для закалки клеток, снижает степень, в которой используемые в настоящее время процедуры недооценивают внутриклеточные концентрации водорастворимых метаболитов. В-третьих, в отличие от существующих LC-MS/MS методов2,31,33,способ различает различные структурные изомеры и стереоизомерные формы многих метаболитов. Эти метаболиты включают различные молекулы-носители энергии, нуклеотиды, аминокислоты, моносахариды, промежуточные продукты гликолиза и промежуточные продукты трикарбоксового цикла. В-четвертых, мы использовали метод для создания обширной масс-спектральной базы данных MS1 и MS2 для правильной идентификации и количественного определения широкого спектра специфических метаболитов с использованием необработанных данных LC-MS/MS. Напротив, существующие масс-спектральные онлайн-базы данных MS1 и MS2 являются неполными43,44,45. В-пятых, метод использует один тип экстракции метаболитов для извлечения водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами. Разнообразие этих метаболитов значительно превышает разнообразие альтернативных методов одностадной экстракции водорастворимых метаболитов из дрожжевых клеток3,22,27,46. Шесть, в отличие от существующих LC-MS/MS способов3,22,47,48,способ использует один тип колонки LC для отделения друг от друга различных структурных и функциональных классов водорастворимых метаболитов. В-седьмых, метод позволяет идентифицировать и количественно оценить более 370 водорастворимых метаболитов, извлеченных из дрожжевых клеток. Это число идентифицируемых и поддающихся количественной оценке метаболитов превышает количество метаболитов, зарегистрированных для других методов нецелевой метаболомики в дрожжах3,22,27,49,50.

Метод имеет несколько ограничений. Эти ограничения заключаются в следующем. Цвиттерионная фазовая колонна, используемая для разделения метаболитов ЛК, требует обширного переободионения после каждого прогона. Кроме того, способ эффективен только для нецелевой метаболомики водорастворимых, гидрофильных метаболитов. Более того, различные изомерные формы углеводов (включая изомеры фруктозы, глюкозы и галактозы) не могут быть количественно определены с помощью метода. Это связано с тем, что столбец цвиттерионной фазы, используемый в способе, не может отделить эти изомеры углеводов друг от друга, когда они присутствуют в смеси с другими метаболитами. Кроме того, метод не может быть использован для идентификации глюкозы, поскольку этот углевод создает множественные пики во время хроматографии на цвиттерионической фазовой колонке, используемой в методе. Наконец, треонин не может быть количественно определен с помощью метода из-за совместного элюирования этой аминокислоты с ее изомером гомосерина при разделении метаболитов методом хроматографии.

Мы используем этот метод LC-MS / MS для изучения связанных со старением изменений в водорастворимом метаболоме почковых дрожжей S. cerevisiae. Мы также используем этот метод для изучения того, сколько генетических, диетических и фармакологических вмешательств, задерживающих старение, влияют на водорастворимый метаболом дрожжевых клеток во время их хронологического старения. Благодаря своей универсальности, надежности и чувствительности метод LC-MS/MS может быть успешно использован для количественной оценки водорастворимых метаболомов в эволюционно отдаленных эукариотических организмах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарны нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Титоренко за дискуссии. Мы выражаем признательность Центру биологических применений масс-спектрометрии, Центру структурной и функциональной геномики и Центру микроскопии и клеточной визуализации (все в Университете Конкордия) за выдающиеся услуги. Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады (RGPIN 2014-04482 и CRDPJ 515900 - 17). K.M. был поддержан стипендией Арманда К. Аршамбо Университета Конкордия и премией декана университета Конкордия за выдающиеся достижения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

Биохимия выпуск 167 водорастворимые метаболиты профилирование метаболомики гашение метаболической активности окрашивание йодида пропидия флуоресцентная микроскопия экстракция метаболитов молекул энергоносителей нуклеотидов аминокислот моносахаридов жидкостная хроматография масс-спектрометрия
Количественная метаболомика <em>Saccharomyces Cerevisiae</em> с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter