Summary
Dette arbeidet presenterer en protokoll for å utforske anti-fedme effekten av to planter som brukes sammen, for en 5-ukers varighet. Det var en kombinert administrasjon av ekstraktet og høyfett-dietten (HFD) hos overvektige mus. Metoden kan fremme fordelene med planter i behandlingen av fedme.
Abstract
Flere studier har vist at det fytokjemiske innholdet i planter er potensielle anti-fedme midler. I denne studien undersøker vi effekten av å bruke en kombinasjon av tørre knapper fra Syzygium aromaticum og frø fra Cuminum cyminum (CC) på C57BL6 / J mus indusert med fedme via høyfett-diett (HFD). Målet med denne studien er å demonstrere at metoden foreslått i studien reduserte fedme betydelig etter flere uker med eksperimentering. Ekstraktet fra begge plantene ble ekstrahert ved hjelp av ultralyd for å forbedre utvinningen av fytokjemikalier. Optimale ekstraksjonsforhold ble oppnådd med etanol som følger: 50:50 v / v vann med en ultralydkraft på 300 W, og ultralydtid på 30 minutter. Samtidig administrering av CC-ekstraktet i HFD i 5 uker førte til regulering av lipidprofiler (kolesterol og triglyserider), reduksjon av matinntak, vektøkning, fettvev og levervekt. Funn oppnådd av denne overvektige modellen indikerer at CC-ekstrakt kan forhindre fedme. Sammenlignet med den tradisjonelle 16 ukers metoden (8 uker for å få fett, og 8 uker å gå ned i vekt), ble lignende resultater oppnådd i den nåværende studien overvektig modell på kortere tid for eksperimentering.
Introduction
Overflødig kroppsfett akkumulering er en egenskap for fedme. Disequilibrium mellom energiinntak og forbruk fører til lagring av overflødig energi i adipocytter, som er relatert til metabolske risikofaktorer for hyperglykemi og insulinresistens ved type 2 diabetes, hypertensjon, hyperkolesterolemi og kardiovaskulær sykdom1,2.
Naturlige produkter med minimale bivirkninger og lave kostnader har fått økt oppmerksomhet siden tidligere studier har rapportert bioaktive fytokjemikalier og potensielle anti-fedmemidler med mekanismer som reverserer eller forsinker metabolsk syndrom og tilhørende patologier8.
Flere medisinske planter har blitt studert for å forhindre fedme og relaterte sykdommer. Blant dem har Syzygium aromaticum blitt undersøkt for sitt anti-fedme potensial i in vitro behandling på 3T3-L1 celler og in vivo behandling på mus matet med et fettfattig kosthold11. I tillegg ble betydelige anti-overvektige effekter observert i en multi-center åpen studie av Cuminum cyminum på ekstremt overvektige personer12. I denne studien ble C57BL6/J-mus brukt til å undersøke den eksperimentelle raske modellen for å evaluere et potensielt anti-fedmemiddel ved hjelp av en kombinasjon av begge spiselige planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av Animal Experiment Committee of Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (IPN; Protokoll nr. 2732).
1. Fremstilling av ekstraktet av kombinasjonen av nellik og spisskummen
MERK: Spiselige planter, Syzygium aromaticum (clove) og Cuminum cyminum (cumin) ble kjøpt fra Central de Abastos CDMX, Mexico.
- Grind 500 g frø fra plantene og utfør ultralydassistert ekstraksjon. Soniker dem (320 watt; 24 kHz frekvens, 30 min) med etanol:vann (60:40 v/v) ved et temperaturområde på 30 ± 4 °C.13
- Filtrer faste stoffer ved hjelp av Whatman nummer 2 filterpapir under vakuum og konsentrer ekstraktet med en roterende fordamper.
- Mål UV-vis-spekteret av ekstraktet av begge plantene (CC).
2. Dyr
- Bruk mannlige C57BL6/J-mus på seks uker (totalt 48, kroppsvekt 24-29 g) for studien.
- Hus dyrene i grupper på åtte i standard laboratorieforhold: temperatur (20-22 ± 1 °C), relativ luftfuktighet (45-54 ± 2 %), belysning (08:00-20:00 h) med mat og vann ad libitum. Akklimatisere musene under disse forholdene i en uke før eksperimentet.
3. Eksperimentell prosedyre
- Forbered fettfattig diett14 som i tabell 1.
- I begynnelsen av testen, subjekt hver av gruppene dannet (n = 8) til ulike behandlinger: Feed Group 1 på et normalt kosthold; Gruppe 2, på fettfattig diett; Gruppe 3, på fettfattig diett + 100 mg/kg CC-ekstrakt; Gruppe 4, på fettfattig diett + 250 mg/kg CC-ekstrakt; Gruppe 5, på fettfattig diett + 450 mg/kg CC-ekstrakt; Gruppe 6, på fettfattig diett + fentermin (et antiobesitetsmedikament som brukes som positiv kontroll)15.
- Fôr alle gruppene av mus i 5 uker og registrer mengden mat som forbrukes daglig.
- I et reagensrør med stopper, homogeniser ekstraktet eller legemidlet med dosen av vann som tilsvarer gruppen som behandlingen administreres til. Dette gjøres med virvel shaker.
- Når homogenisert, legg til all tilsvarende behandling i drinker av hver gruppe.
4. Eksempelsamling
- Mål både matinntak og kroppsvekt en gang i uken. Rask musene over natten i en 5-ukers periode.
- Ofre dem ved cervical dislokasjon og nekropsi.
- Etter at musene har blitt ofret, immobiliserer dem i en liggende stilling.
- Bruk rene kirurgiske tang og saks, finn og løft den sentrale huden nær kjønnsorganene og gjør et lite 0,2 mm snitt.
- Sett den flate saksen horisontalt inn i snittet og separer forsiktig bukhuden fra bukveggen.
- Med tangene løfter du den sentrale huden og med den kirurgiske saksen kutter den på nivået av ribbeburet. Klipp deretter huden over begge bakre lemmer for å lette samlingen av fettvev.
- Sørg for innsamling av alt fettvev fra kroppen ved stump disseksjon med saks og tang. Når det er samlet inn, plasser fettvevet i aluminiumsfolie. Husk å samle fettet rundt reproduktive organer. Unngå opphopning av hår og hud for ikke å endre resultatene.
- For å få tilgang til det viscerale fettvevet, kutt magemuskelen med kirurgisk saks fra kjønnsorganene til ribbeburet, og gjør et snitt i magemusklene fra kjønnsorganene mot musens rygg.
- Utfør en hepatektomi for å fjerne 100% av leveren. For å eksternisere leveren, fjern unødvendige organer og kutt leverårene og arteriene for å skille leveren fra resten av kroppen. Som det siste trinnet, trekk ut galleblæren nøyaktig fra leveren16.
- Mål hyperkolesterolemi (kolesterol) og hypertriglyseridemi (triglyserider) ved hjelp av kommersielle analysesett i henhold til produsentens indikasjoner.
5. Statistisk analyse
MERK: Alle eksperimentelle resultater skal være representative fra tre uavhengige analyser, uttrykt som gjennomsnittlig ± standardavvik.
- Beregn standardfeil med en enveis ANOVA-analyse av varians etterfulgt av Tukeys områdetest. Se på en P< 0,05 som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ultralydassistert ekstraksjon
Den optimale ekstraksjonsbetingelsen for utvinningen var etanol: vann (50:50, v / v) med en ultralydkraft på 300 W og en ultralydtid på 30 min. På denne måten var utvinningen raskere enn konvensjonelle utvinningsmetoder (Tabell 2). Ekstraktet viste en intens absorpsjonstopp på 320 nm i UV-synlig spektra (figur 1).
Matinntak og kroppsvekt
Endringene i kroppsvekten til musene gitt forskjellige konsentrasjoner av ekstraktet (100, 200 og 450 mg / kg) i 5 uker er vist i figur 2A. Andelen vektreduksjon i gruppe 3, 4 og 5 var henholdsvis 12,2 %, 30 % og 41 %. Dette viser den laveste kroppsvektøkningen ble observert i alle gruppene; HFD-gruppen hadde imidlertid en økning på 2,1x sammenlignet med den normale fettdiettgruppen. Disse dataene indikerer at en 450 mg/kg dose CC er mer effektiv enn 30 mg/kg fentermin (39% reduksjon) i å redusere kroppsvektøkning.
Gjennomsnittlig matinntak på slutten av eksperimentet i HFD + CC (450 mg/ml) var 31 % lavere enn i den overvektige gruppen (HFD), med 1,3 g reduksjon i matinntak sammenlignet med den overvektige gruppen (Figur 2B). Matinntaket i de HFD-matede musene var høyere med 1,5 ganger enn i normal kontroll, og dermed gikk det betydelig (P<0,05) ned i alle CC-grupper i et område på 7,14% til 31%. Kostholdseffektivitetsraten i HFD-gruppen var 16%, noe som var betydelig forskjellig (P< 0,05) fra kontrollgruppen (ND) på 11%. Disse resultatene viser at CC kan redusere HFD-indusert kroppsvektøkning.
Fettvev og levervekt
Vekten av epididymal WAT, subkutant fett og perirenalt WAT fettvev var høyere i HFD-gruppen, men ikke i HFD-CC-gruppene (Tabell 3). Levervekten var signifikant (P<0,05) redusert i CC-gruppen (100 til 450 mg/kg) med et område på 15%-28,4% sammenlignet med HFD-gruppen(tabell 4).
Leverlipider og serum
Nivåene av serumtriacylglyserol (TG) og totalt kolesterol (TC) etter 5 ukers behandling er vist i henholdsvis figur 3A og 3B. Triglyserider og totalt kolesterolnivå ble betydelig forhøyet med henholdsvis 1,32 ganger og 1,31 ganger i HFD-grupper sammenlignet med de i ND-gruppene. De økte nivåene av plasma TG og TC i HFD-dietten ble betydelig svekket av administrering av 200 og 450 mg /kg/dag CC-ekstrakt med henholdsvis 18,18% og 22,7% for TG og 16,41% og 20,61% for TC sammenlignet med kontrollen (ND).
Figur 1. UV-vis spektrum av nellik og spisskummen ekstrakt (CC) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Effekter av CC på: (A) kroppsvekt (g), (B) matinntak i fettfattig diett C57BL6/J mus ved 4 ukers behandling. Data representeres som gjennomsnittlig ± SD. For hver gruppe, n=8. Ulike bokstaver viste signifikant forskjell (p<0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Effekter av CC på: (A) Triglyserider, (B) Totalt kolesterol. Alle eksperimentelle data var gjennomsnittlige ± SD-mus (n = 8). Mus ble behandlet med 100, 200 og 450 mg/kg CC for daglig oral administrering med samtidig fôring av HFD i 5 uker. Ulike bokstaver indikerer signifikante forskjeller mellom alle gruppene (P < 05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| ingrediens | Antall (g/kg) |
| kasein | 140 |
| L-Cysteine | 1.8 |
| smult | 120 |
| Soyaolje | 40 |
| Maltodextrin 10 | 150 |
| sukrose | 450 |
| cellulose | 50 |
| Vitaminer og mineraler | Tilsvarende nettbrett |
| Kolin-bitartrate | 2.5 |
Tabell 1. Høyt fett diett for C57BL6 / J mus.
| kraft | 370 watt |
| Vanntemperatur | 30 °C (86 °F) |
| Ekstraksjonstid | 30 min |
| Konsentrasjon av løsemiddel | 50% etanol / 50% destillert vann |
| Antall uttrekk | 2 ekstraksjoner |
Tabell 2. Optimale ultralydforhold for fremstilling av nellik og spisskummen ekstrakt
| gruppe | Epididymal WAT (g) | Perirenal WAT (g) | Subkutant fett (g) | Fett/kroppsvekt (g/100) |
| Nd | 0,32 ± 0,04a | 0,05 ± 0,06a | 0,08 ± 0,01b | 1,22 ± 0,09a |
| HFD | 2,30 ± 0,09b | 0,93 ± 0,07b | 0,15 ± 0,04a | 6.38 ± 1.02b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,08b | 0,50 ± 0,05b | 0,12 ± 0,02a,b | 5.12 ± 1,93b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 0,90 ± 0,05b | 0,35 ± 0,04b | 0,11 ± 0,04a,b | 3.21 ± 0.32b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 0,42 ± 0,07a | 0,16 ± 0,02c | 0,09 ± 0,03b | 2,30 ± 0,45c |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 0,49 ± 0,05a | 0,19 ± 0,08c | 0,10 ± 0,01b | 2.41 ± 0.18c |
Tabell 3. Effekt av CC i diettinduserte overvektige mus på hvit fettvevsvekt. Hver verdi uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD (n = 8). Ulike bokstaver viste signifikant forskjell (P<0,05) vs hvitt fettvev (WAT)
| gruppe | Levervekt (g) |
| Nd | 1,01 ± 0,05a |
| HFD | 1,48 ± 0,08b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,09b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 1.12 ± 0,03b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 1,06 ± 0,06a |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 1,08 ± 0,07a |
Tabell 4. Effekt av CC i diettinduserte overvektige mus på levervevsvekt. Hver verdi uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD (n = 8). Ulike bokstaver viste signifikant forskjell (P<0,05) vs hvitt fettvev (WAT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien evaluerte vi for første gang effekten av oral administrering av en kombinasjon av nelliker og spisskummen (CC) ekstrakt på lipidprofiler og fedme hos mus matet med et fettfattig kosthold i 5 uker. Funn indikerte at HFD-gruppene viste en betydelig høyere kroppsvektøkning sammenlignet med ND-gruppen, som viste at induksjonen av fedme i den overvektige modellen var vellykket. Den administrerte dosen av CC (100, 200 og 450 mg/kg/dag) ga en reduksjon i matinntak og kroppsvekt. Reduksjonen i matinntaket må derfor skyldes en nedgang i dyrenes appetitt.
Reduksjonen av dyslipidemi er svært viktig for å forhindre fedmerelaterte lidelser. I vår studie var de totale kolesterolnivåene og triglyseridene lavere i CC-gruppen sammenlignet med de i HFD- og fentermingrupper som ble brukt som positiv kontroll. Funn antydet at CC kan hemme hyperlipidemi og dens komplikasjoner.
Vår studie viste at HFD-gruppen hadde økt kroppsfett, inkludert mage- og leverfett som ble betydelig redusert av CC-ekstrakttilskuddet. Dette viser at CC-ekstraktbehandlingen på HFD-musene reduserer lipidabsorpsjon på grunn av sin anti-adipogene aktivitet.
I denne studien evaluerte vi en rask modell for å bestemme anti-fedme effekten av et ekstrakt fra en kombinasjon av spiselige planter, Syzygium aromaticum (clove) og Cuminum cyminum (cumin) på C57BL6 / J mus, som raskt utviklet fedme med et fettfattig kosthold. CC-behandlingen forhindret signifikant utvikling av fedme og ameliorated hyperlipidemi indusert av HFD gitt til musene. Til sammen gir funn i denne forskningen solide bevis på at denne raske metoden på 5 ukers varighet utviklet i vårt laboratorium kan brukes til å vurdere om en plante har kapasitet til å være et potensielt middel for behandling av fedme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Instituto Politécnico Nacional México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
- Singla, P., Bardoloi, A., Parkash, A. A. Metabolic effects of obesity: A review. World Journal of Diabetes. 1 (1), 76-88 (2010).
- Ojulari, O. V., Lee, S. G., Nam, J. O. Beneficial Effects of Natural Bioactive Compounds from Hibiscus sabdariffa L. on Obesity. Molecules. 24 (1), 210 (2019).
- Bahmani, M., et al. Obesity phytotherapy: review of native herbs used in traditional medicine for obesity. Journal of Evidence-Based Integrative Medicine. 21 (3), 228-234 (2016).
- Ríos-Hoyo, A., Gutiérrez-Salmeán, G. New Dietary Supplements for Obesity: What We Currently Know. Current Obesity Reports. 5 (2), 262-270 (2016).
- Hasani-Ranjbar, S., Nayebi, N., Larijani, B., Abdollahi, M. A systematic review of the efficacy and safety of herbal medicines used in the treatment of obesity. World Journal Gastroenterology. 15 (25), 3073-3085 (2009).
- Hardeman, W., Griffin, S., Johnston, M., Kinmonth, A. L., Wareham, N. J. Interventions to prevent weight gain: a systematic review of psychological models and behaviour change methods. Nternational Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 24 (1), 131-143 (2000).
- Dinda, B., Dinda, M., Roy, A., Dinda, S. Dietary plant flavonoids in prevention of obesity and diabetes. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 120, 159-235 (2020).
- Mayer, M. A., Hocht, C., Puyo, A., Taira, C. A.
- Rafie, A. Z. M., Syahir, A., Ahmad, W. A. N. W., Mustafa, M. Z., Mariatulqabtiah, A. R. 2018 supplementation of stingless bee honey from heterotrigona itama improves antiobesity parameters in high-fat diet induced obese rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 6371582 (2018).
- Song, J., et al. Anti-obesity effects of the flower of prunus persica in high-fat diet-induced obese mice. Nutrients. 11, 2176 (2019).
- Jung, C. H., Ahn, J., Jeon, T. -I., Kim, T. W., Ha, T. Y. Syzygium aromaticum ethanol extract reduces high-fat diet-induced obesity in mice through downregulation of adipogenic and lipogenic gene expression. Experimental and Therapeutic Medicine. 4 (3), 409-414 (2012).
- Said, O., Saad, B., Fulder, S., Khalil, K., Kassis, E. Weight Loss in Animals and Humans Treated with "Weigh level", a Combination of Four Medicinal Plants Used in Traditional Arabic and Islamic Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 874538 (2011).
- Anaya-Esparza, L. M., Ramos-Aguirre, D., Zamora-Gasga, V. M., Yahia, E., Montalvo-Gonzalez, E. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of phenolic compounds from Justicia spicigera leaves. Food Science and Biotechnology. 27 (4), 1093-1102 (2018).
- Ayoub, R. M., et al. The effect of anthocyanin-rich purple vegetable diets on metabolic syndrome in obese Zucker. Journal of Medical Food. , (2017).
- Go, R., et al. Effects of anti-obesity drugs, phentermine and mahuang, on the behavioral patterns in Sprague-Dawley rat model. Laboratory of Animals Research. 30 (2), 73-78 (2014).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA analysis. Journal of Visualized Experiments. (13), e57026 (2018).
- Bjorndal, B., Burri, L., Staalesen, V., Skorve, J., Berge, R. K. Different adipose depots: Their role in the development of metabolic syndrome and mitochondrial response to hypolipidemic agents. Journal of Obesity. 2011, 490650 (2011).
