Summary
Dit werk presenteert een protocol om het anti-obesitas effect van twee planten die samen worden gebruikt te onderzoeken, voor een duur van 5 weken. Er was een gecombineerde toediening van het extract en vetrijk dieet (HFD) bij de zwaarlijvige muizen. De methode kan de voordelen van planten bij de behandeling van obesitas bevorderen.
Abstract
Verschillende studies hebben aangetoond dat de fytochemische inhoud van planten potentiële anti-obesitasmiddelen zijn. In deze studie onderzoeken we het effect van het gebruik van een combinatie van droge knoppen van Syzygium aromaticum en zaden van Cuminum cyminum (CC) op C57BL6/J muizen geïnduceerd met obesitas via high-fat-diet (HFD). Het doel van deze studie is om aan te tonen dat de in de studie voorgestelde methode obesitas aanzienlijk verminderde na enkele weken experimenteren. Het extract van beide planten werd geëxtraheerd met behulp van echografie om de extractie van fytochemicaliën te verbeteren. Optimale extractieomstandigheden werden verkregen met ethanol als volgt: 50:50 v/ v water met een ultrageluidvermogen van 300 W en ultrasone tijd van 30 minuten. De gelijktijdige toediening van het CC-extract in HFD gedurende 5 weken leidde tot de regulering van lipidenprofielen (cholesterol en triglyceriden), vermindering van voedselinname, gewichtstoename, vetweefsel en levergewicht. Bevindingen verkregen door dit zwaarlijvige model geven aan dat CC-extract obesitas kan voorkomen. In vergelijking met de traditionele 16 weken methode (8 weken om dik te worden, en 8 weken om gewicht te verliezen), werden vergelijkbare resultaten verkregen in de huidige studie zwaarlijvig model in minder tijd van experimenteren.
Introduction
Overtollige lichaamsvetaccumulatie is een kenmerk van obesitas. Het onevenwicht tussen energie-inname en -consumptie leidt tot de opslag van overtollige energie in adipocyten, wat verband houdt met metabole risicofactoren voor hyperglykemie en insulineresistentie bij diabetes type 2, hypertensie, hypercholesterolemie en hart- en vaatziekten1,2.
Natuurlijke producten met minimale bijwerkingen en lage kosten hebben meer aandacht gekregen sinds eerdere studies bioactieve fytochemicaliën en potentiële anti-obesitasmiddelen hebben gerapporteerd met mechanismen die het metabool syndroom en bijbehorende pathologieën omkeren of vertragen8.
Verschillende medicinale planten zijn bestudeerd om obesitas en gerelateerde ziekten te voorkomen. Onder hen, Syzygium aromaticum is onderzocht voor zijn anti-obesitas potentieel in vitro behandeling op 3T3-L1 cellen en in vivo behandeling op muizen gevoed met een vetrijk dieet11. Bovendien werden significante anti-overgewicht effecten waargenomen in een multi-center open studie van Cuminum cyminum op extreem zwaarlijvige proefpersonen12. In deze studie werden C57BL6/J muizen gebruikt om het experimentele snelle model te onderzoeken om een potentieel anti-obesitas middel te evalueren met behulp van een combinatie van beide eetbare planten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Animal Experiment Committee van Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (IPN; Protocol nr.
1. Bereiding van het extract van de combinatie van kruidnagel en komijn
OPMERKING: De eetbare planten, Syzygium aromaticum (kruidnagel) en Cuminum cyminum (komijn) werden gekocht bij Central de Abastos CDMX, Mexico.
- Maal 500 g zaden van de planten en voer ultrasone extractie uit. Soniceer ze (320 Watt; 24 kHz frequentie, 30 min) met ethanol:water (60:40 v/v) bij een temperatuurbereik van 30 ± 4 °C.13
- Filtreer de vaste stoffen met Whatman nummer 2 filterpapier onder vacuüm en concentreer het extract met een roterende verdamper.
- Meet het UV-vis spectrum van het extract van beide planten (CC).
2. Dieren
- Gebruik mannelijke C57BL6/J muizen van zes weken oud (48 in totaal, lichaamsgewicht 24-29 g) voor het onderzoek.
- Huisvest de dieren in groepen van acht in standaard laboratoriumomstandigheden: temperatuur (20-22 ± 1 °C), relatieve vochtigheid (45-54 ± 2%), verlichting (08:00-20:00 uur) met voedsel en water ad libitum. Acclimatiseren de muizen in deze omstandigheden voor een week voor het experiment.
3. Experimentele procedure
- Bereid het vetrijke dieetvoor 14 zoals in tabel 1.
- Aan het begin van de test elk van de gevormde groepen (n = 8) onderwerpen aan verschillende behandelingen: Voer groep 1 op een normaal dieet; Groep 2, op vetrijk dieet; Groep 3, op vetrijk dieet + 100 mg/kg CC-extract; Groep 4, op vetrijk dieet + 250 mg/kg CC-extract; Groep 5, op vetrijk dieet + 450 mg/kg CC-extract; Groep 6, op vetrijk dieet + fentermine (een antiobesiteitsgeneesmiddel dat als positieve controle wordt gebruikt)15.
- Voer alle groepen muizen gedurende 5 weken en registreer de hoeveelheid voedsel die dagelijks wordt geconsumeerd.
- Homogeniseer in een reageerbuis met stop het extract of het geneesmiddel met de dosis water die overeenkomt met de groep waaraan de behandeling wordt toegediend. Dit gebeurt met vortex shaker.
- Voeg na homogeniteit alle bijbehorende behandeling toe aan de drinker van elke groep.
4. Monsterverzameling
- Meet zowel de voedselinname als het lichaamsgewicht eenmaal per week. Snel de muizen 's nachts voor een periode van 5 weken.
- Offer ze op door cervicale ontwrichting en obductie.
- Nadat de muizen zijn opgeofferd, immobiliseer je ze in een liggende positie.
- Met behulp van schone chirurgische tang en schaar, lokaliseren en opheffen van de centrale huid in de buurt van de genitaliën en maak een kleine 0,2 mm incisie.
- Steek de platte schaar horizontaal in de incisie en scheid de buikhuid voorzichtig van de buikwand.
- Til met de tang de centrale huid op en knip deze met de chirurgische schaar ter hoogte van de ribbenkast. Snijd vervolgens de huid boven beide achterpoten om het verzamelen van vetweefsel te vergemakkelijken.
- Zorg ervoor dat alle vetweefsel uit het lichaam wordt opverzameling door stompe dissectie met een schaar en tang. Eenmaal verzameld, plaatst u het vetweefsel in aluminiumfolie. Vergeet niet om het vet rond de voortplantingsorganen te verzamelen. Vermijd de ophoping van haar en huid om de resultaten niet te veranderen.
- Om toegang te krijgen tot het viscerale vetweefsel, snijdt u de buikspier met een chirurgische schaar van de geslachtsdelen naar de ribbenkast en maakt u een incisie in de buikspieren van de geslachtsdelen naar de rug van de muis.
- Voer een hepatectomie uit om 100% van de lever te verwijderen. Om de lever te externaliseren, verwijder onnodige organen en snijd de leveraders en slagaders om de lever van de rest van het lichaam te scheiden. Als laatste stap, precies extraheren van de galblaas uit de lever16.
- Meet hypercholesterolemie (cholesterol) en hypertriglyceridemie (triglyceriden) met behulp van commerciële testkits volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
5. Statistische analyse
OPMERKING: Alle experimentele resultaten moeten representatief zijn voor drie onafhankelijke testresultaten, uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking.
- Bereken standaardfout met een eenrichtings ANOVA-analyse van variantie gevolgd door de bereiktest van Tukey. Beschouw een P< 0,05 als statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ultrasoon-ondersteunde extractie
De optimale extractieconditie voor de extractie was ethanol: water (50:50, v / v) met een ultrageluidvermogen van 300 W en een ultrasone tijd van 30 minuten. Op deze manier was de extractie sneller dan conventionele extractiemethoden (tabel 2). Het extract vertoonde een intense absorptiepiek bij 320 nm in UV-zichtbare spectra (figuur 1).
Voedselinname en lichaamsgewicht
De veranderingen in het lichaamsgewicht van de muizen met verschillende concentraties van het extract (100, 200 en 450 mg/kg) gedurende 5 weken zijn weergegeven in figuur 2A. De percentages gewichtsvermindering in de groepen 3, 4 en 5 bedroegen respectievelijk 12,2%, 30% en 41%. Dit toont aan dat de laagste gewichtstoename werd waargenomen in alle groepen; de HFD-groep had echter een toename van 2,1x in vergelijking met de normale vetdieetgroep. Deze gegevens geven aan dat een dosis van 450 mg/kg CC effectiever is dan 30 mg/kg fentermine (39% vermindering) bij het verminderen van de gewichtstoename.
De gemiddelde voedselinname aan het einde van het experiment in de HFD + CC (450 mg/ml) was 31% lager dan die in de zwaarlijvige groep (HFD), met 1,3 g vermindering van de voedselinname in vergelijking met de zwaarlijvige groep (figuur 2B). De voedselinname bij de HFD-gevoede muizen was 1,5 keer hoger dan bij de normale controle, waardoor deze significant (P<0,05) in alle CC-groepen daalde in een bereik van 7,14% tot 31%. Het dieetefficiëntiepercentage in de HFD-groep was 16%, wat significant anders was (P< 0,05) dan dat van de controlegroep (ND) met 11%. Deze resultaten tonen aan dat CC hfd-geïnduceerde gewichtstoename kan verminderen.
Vetweefsel en levergewicht
Het gewicht van epididymale WAT, onderhuids vet en perirenale WAT vetweefsels was hoger in de HFD-groep, maar niet in de HFD-CC-groepen (Tabel 3). Het levergewicht was significant (P<0,05) verlaagd in de CC-groep (100 tot 450 mg/kg) met een bereik van 15%-28,4% in vergelijking met die van de HFD-groep (Tabel 4).
Leverlipiden en serum
De niveaus van serumtriacylglycerol (TG) en totaal cholesterol (TC) na 5 weken behandeling zijn weergegeven in respectievelijk de figuren 3A en 3B. De triglyceriden en het totale cholesterolgehalte werden significant verhoogd met respectievelijk 1,32-voudig en 1,31-voudig in HFD-groepen in vergelijking met die in de ND-groepen. De verhoogde niveaus van plasma TG en TC in het HFD-dieet werden significant verzwakt door de toediening van 200 en 450 mg/kg/dag CC-extract met respectievelijk 18,18% en 22,7% voor TG en 16,41% en 20,61% voor TC, vergeleken met de controle (ND).
Figuur 1. UV-vis spectrum van kruidnagel en komijn extract (CC) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Effecten van CC op: (A) lichaamsgewicht (g), (B) voedselinname in vetrijke voeding C57BL6/J muizen na 4 weken behandeling. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Voor elke groep n=8. Verschillende brieven vertoonden een significant verschil (p<0,05). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Effecten van CC op: (A) Triglyceriden, (B) Totaal cholesterol. Alle experimentele gegevens waren Gemiddelde ± SD muizen (n = 8). Muizen werden behandeld met 100, 200 en 450 mg/kg CC voor dagelijkse orale toediening met gelijktijdige voeding van HFD gedurende 5 weken. Verschillende letters wijzen op significante verschillen tussen alle groepen (P < 05). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| ingrediënt | Hoeveelheid (g/kg) |
| caseïne | 140 |
| L-Cysteïne | 1.8 |
| reuzel | 120 |
| sojaolie | 40 |
| Maltodextrine 10 | 150 |
| sacharose | 450 |
| cellulose | 50 |
| Vitaminen en mineralen | Tablet equivalent |
| Choline bitartraat | 2.5 |
Tabel 1. Vetrijk dieet voor C57BL6/J muizen.
| macht | 370 Watt |
| Watertemperatuur | 30 °C |
| Extractietijd | 30 min |
| Oplosmiddelconcentratie | 50% ethanol/50% gedestilleerd water |
| Aantal extracties | 2 extracties |
Tabel 2. Optimale ultrasone omstandigheden voor de bereiding van het kruidnagel- en komijnextract
| groep | Epididymaal WAT (g) | Perirenale WAT (g) | Onderhuids vet (g) | Vet/Lichaamsgewicht (g/100) |
| Nd | 0,32 ± 0,04a | 0,05 ± 0,06a | 0,08 ± 0,01b | 1.22 ± 0.09a |
| HFD | 2,30 ± 0,09b | 0,93 ± 0,07b | 0,15 ± 0,04a | 6,38 ± 1,02b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1,26 ± 0,08b | 0,50 ± 0,05b | 0.12 ± 0.02a,b | 5.12 ± 1.93b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 0,90 ± 0,05b | 0,35 ± 0,04b | 0.11 ± 0.04a,b | 3.21 ± 0.32b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 0,42 ± 0,07a | 0,16 ± 0,02c | 0,09 ± 0,03b | 2,30 ± 0,45c |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 0,49 ± 0,05a | 0,19 ± 0,08c | 0,10 ± 0,01b | 2,41 ± 0,18c |
Tabel 3. Effect van CC bij dieet-geïnduceerde zwaarlijvige muizen op het gewicht van het witte vetweefsel. Elke waarde wordt uitgedrukt als de gemiddelde ± SD (n = 8). Verschillende letters toonden een significant verschil (P<0,05) ten opzichte van wit vetweefsel (WAT)
| groep | Levergewicht (g) |
| Nd | 1.01 ± 0.05a |
| HFD | 1,48 ± 0,08b |
| HFD + CC 100 mg/kg | 1.26 ± 0.09b |
| HFD + CC 200 mg/kg | 1.12 ± 0.03b |
| HFD + CC 400 mg/kg | 1.06 ± 0.06a |
| HFD + PHE 30 mg/kg | 1.08 ± 0.07a |
Tabel 4. Effect van CC bij dieet-geïnduceerde zwaarlijvige muizen op het gewicht van het leverweefsel. Elke waarde wordt uitgedrukt als de gemiddelde ± SD (n = 8). Verschillende letters vertoonden een significant verschil (P<0,05) ten opzichte van wit vetweefsel (WAT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie evalueerden we voor het eerst het effect van orale toediening van een combinatie van kruidnagel en komijn (CC) extract op lipidenprofielen en obesitas bij muizen gevoed met een vetrijk dieet gedurende 5 weken. Bevindingen gaven aan dat de HFD-groepen een significant hogere gewichtstoename vertoonden in vergelijking met de ND-groep, waaruit bleek dat de inductie van obesitas in het zwaarlijvige model succesvol was. De toegediende dosis CC (100, 200 en 450 mg/kg/dag) leidde tot een vermindering van de voedselinname en het lichaamsgewicht. Bijgevolg moet de vermindering van de voedselinname te wijten zijn aan een afname van de eetlust van de dieren.
De vermindering van dyslipidemie is erg belangrijk om obesitasgerelateerde aandoeningen te voorkomen. In onze studie waren de totale cholesterolniveaus en triglyceriden lager in de CC-groep in vergelijking met die in HFD- en fenterminegroepen die als positieve controle werden gebruikt. Bevindingen suggereerden dat CC hyperlipidemie en de complicaties ervan kan remmen.
Onze studie toonde aan dat de HFD-groep had verhoogd lichaamsvet, met inbegrip van buik-en levervet die aanzienlijk werden verminderd door de CC extract suppletie. Dit toont aan dat de CC-extractbehandeling op de HFD-muizen de lipideabsorptie vermindert vanwege de anti-adipogene activiteit.
In deze studie evalueerden we een snel model om het anti-obesitas effect te bepalen van een extract van een combinatie van eetbare planten, Syzygium aromaticum (kruidnagel) en Cuminum cyminum (komijn) op C57BL6/J muizen, die snel obesitas ontwikkelden met een vetrijk dieet. De CC-behandeling voorkwam aanzienlijk de ontwikkeling van obesitas en verbetering van hyperlipidemie veroorzaakt door HFD dat aan de muizen werd gegeven. Al met al leveren de bevindingen in dit onderzoek solide bewijs dat deze snelle methode van 5 weken die in ons laboratorium is ontwikkeld, kan worden gebruikt om te beoordelen of een plant de capaciteit heeft om een potentieel middel te zijn voor de behandeling van obesitas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door Instituto Politécnico Nacional México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled Water | Any vendor | n/a | Available for other vendors as well |
| Ethanol | Fermont | 6063 | 99.8% purity |
| Diet Ingredients | |||
| Casein | Any vendor | n/a | |
| Cellulose | Any vendor | n/a | |
| Centrum balance multivitamin | Pfizer | n/a | |
| Choline Bitartrate | Any vendor | n/a | |
| L- cystein | Sigma Aldrich | 168149 | Available for other vendors as well |
| Lard | Any vendor | n/a | |
| Maltodextrin 10 | Any vendor | n/a | |
| Pellets Nutricubos | Purina | n/a | Available for other vendors as well |
| Soybean Oil | Any vendor | n/a | |
| Sucrose | Any vendor | n/a | |
| Extraction Equipment | |||
| Rotavapor | Buchi | R-300 | |
| Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer | Cole Parmer | T-83400-20 | Available for other vendors as well |
| Ultrasonic Unit | Elma | TI-H-20 | Available for other vendors as well |
| Vacuum pump | Buchi | V-100 |
References
- Singla, P., Bardoloi, A., Parkash, A. A. Metabolic effects of obesity: A review. World Journal of Diabetes. 1 (1), 76-88 (2010).
- Ojulari, O. V., Lee, S. G., Nam, J. O. Beneficial Effects of Natural Bioactive Compounds from Hibiscus sabdariffa L. on Obesity. Molecules. 24 (1), 210 (2019).
- Bahmani, M., et al. Obesity phytotherapy: review of native herbs used in traditional medicine for obesity. Journal of Evidence-Based Integrative Medicine. 21 (3), 228-234 (2016).
- Ríos-Hoyo, A., Gutiérrez-Salmeán, G. New Dietary Supplements for Obesity: What We Currently Know. Current Obesity Reports. 5 (2), 262-270 (2016).
- Hasani-Ranjbar, S., Nayebi, N., Larijani, B., Abdollahi, M. A systematic review of the efficacy and safety of herbal medicines used in the treatment of obesity. World Journal Gastroenterology. 15 (25), 3073-3085 (2009).
- Hardeman, W., Griffin, S., Johnston, M., Kinmonth, A. L., Wareham, N. J. Interventions to prevent weight gain: a systematic review of psychological models and behaviour change methods. Nternational Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 24 (1), 131-143 (2000).
- Dinda, B., Dinda, M., Roy, A., Dinda, S. Dietary plant flavonoids in prevention of obesity and diabetes. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 120, 159-235 (2020).
- Mayer, M. A., Hocht, C., Puyo, A., Taira, C. A.
- Rafie, A. Z. M., Syahir, A., Ahmad, W. A. N. W., Mustafa, M. Z., Mariatulqabtiah, A. R. 2018 supplementation of stingless bee honey from heterotrigona itama improves antiobesity parameters in high-fat diet induced obese rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 6371582 (2018).
- Song, J., et al. Anti-obesity effects of the flower of prunus persica in high-fat diet-induced obese mice. Nutrients. 11, 2176 (2019).
- Jung, C. H., Ahn, J., Jeon, T. -I., Kim, T. W., Ha, T. Y. Syzygium aromaticum ethanol extract reduces high-fat diet-induced obesity in mice through downregulation of adipogenic and lipogenic gene expression. Experimental and Therapeutic Medicine. 4 (3), 409-414 (2012).
- Said, O., Saad, B., Fulder, S., Khalil, K., Kassis, E. Weight Loss in Animals and Humans Treated with "Weigh level", a Combination of Four Medicinal Plants Used in Traditional Arabic and Islamic Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 874538 (2011).
- Anaya-Esparza, L. M., Ramos-Aguirre, D., Zamora-Gasga, V. M., Yahia, E., Montalvo-Gonzalez, E. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of phenolic compounds from Justicia spicigera leaves. Food Science and Biotechnology. 27 (4), 1093-1102 (2018).
- Ayoub, R. M., et al. The effect of anthocyanin-rich purple vegetable diets on metabolic syndrome in obese Zucker. Journal of Medical Food. , (2017).
- Go, R., et al. Effects of anti-obesity drugs, phentermine and mahuang, on the behavioral patterns in Sprague-Dawley rat model. Laboratory of Animals Research. 30 (2), 73-78 (2014).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA analysis. Journal of Visualized Experiments. (13), e57026 (2018).
- Bjorndal, B., Burri, L., Staalesen, V., Skorve, J., Berge, R. K. Different adipose depots: Their role in the development of metabolic syndrome and mitochondrial response to hypolipidemic agents. Journal of Obesity. 2011, 490650 (2011).
