Summary
Die Untersuchung der Fettacylierung hat wichtige Auswirkungen auf zelluläre Proteininteraktionen und -krankheiten. Hier wird ein modifiziertes Protokoll zur Verbesserung der Klickchemie von fettacylierten Proteinen vorgestellt, das in verschiedenen Zelltypen angewendet und mit anderen Assays, einschließlich Pulse-Chase und Massenspektrometrie, kombiniert werden kann.
Abstract
Die Fettacylierung, die kovalente Zugabe gesättigter Fettsäuren zu Proteinsubstraten, ist wichtig für die Regulierung einer Vielzahl von zellulären Funktionen zusätzlich zu ihren Auswirkungen auf Krebs und neurodegenerative Erkrankungen. Jüngste Entwicklungen bei Fettacylierungsnachweismethoden haben einen effizienten und ungefährlichen Nachweis von fettacylierten Proteinen ermöglicht, insbesondere durch den Einsatz von Klickchemie mit bioorthogonaler Markierung. Der Nachweis der Klickchemie kann jedoch durch die schlechte Löslichkeit und die potenziellen toxischen Wirkungen der Zugabe von langkettigen Fettsäuren zur Zellkultur eingeschränkt werden. Beschrieben wird hier ein Markierungsansatz mit optimierter Abgabe unter Verwendung von verseiften Fettsäuren in Kombination mit fettsäurefreier BSA sowie entlipidierten Medien, die den Nachweis von schwer nachweisbaren fettacylierten Proteinen verbessern können. Dieser Effekt war am ausgeprägtesten beim Alkynylstearat-Analogon 17-ODYA, das das am häufigsten verwendete Fettsäureanalogon beim Nachweis von akylierten Proteinen in der Klickchemie war. Diese Modifikation verbessert die zelluläre Inkorporation und erhöht die Empfindlichkeit gegenüber dem Nachweis von acylierten Proteinen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz in einer Vielzahl von Zelltypen angewendet und mit anderen Assays wie der Pulse-Chase-Analyse, der stabilen Isotopenmarkierung mit Aminosäuren in Zellkultur und der Massenspektrometrie zur quantitativen Profilierung von fettacylierten Proteinen kombiniert werden.
Introduction
Die Fettacylierung beinhaltet die kovalente Addition von Fettsäuren an Proteine und ist bekannt für ihre Bedeutung bei der Förderung von Protein-Membran-Interaktionen, aber es wurde auch gezeigt, dass sie Protein-Protein-Interaktionen, Konformationsänderungen und katalytische Stellen von Enzymen fördert1,2,3,4,5,6,7 . Die Fettacylierung hat sich als potenzielles Wirkstoffziel bei einer Vielzahl von Krankheiten herausgestellt, darunter Infektionen, Krebs, Entzündungen und Neurodegeneration, bei denen Störungen der Palmitoylation dokumentiert wurden8,9,10,11,12,13. Dies wurde in erster Linie durch die Entwicklung neuer chemischer Nachweismethoden vorangetrieben, die eine großflächige Identifizierung von S-acylierten Proteinzielen ermöglichten.
Die Fettacylierung kann eine Vielzahl von Modifikationen umfassen, die die kovalente Zugabe von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren beinhalten, bezieht sich jedoch typischerweise auf N-Myristoylierung und S-Acylierung. Die N-Myristoylierung bezieht sich auf die Zugabe von Myristinsäure zu N-terminalen Glycinen entweder co-translational auf naszierenden Polypeptiden oder posttranslational auf neu exponierten N-terminalen Glycinen nach proteolytischer Spaltung2,14. Die N-Myristoylierung erfolgt durch eine irreversible Amidbindung. Auf der anderen Seite bezieht sich die S-Acylierung typischerweise auf die reversible Zugabe von langkettigen Fettsäuren zu Cysteinresten über eine Thioesterbindung. Die häufigste Form dieser Modifikation umfasst die Aufnahme von Palmitat und wird daher allgemein als S-Palmitoylation oder einfach Palmitoylation11,15 bezeichnet. In vielerlei Hinsicht ähnelt die S-Palmitoylation der Phosphorylierung. Es ist dynamisch, enzymatisch reguliert und erweist sich als hochgradig handhabbar.
Bis zum letzten Jahrzehnt wurde die Untersuchung der Fettacylierung durch begrenzte Nachweismethoden behindert, die radioaktiv markierte Fettsäuren erforderten. Dies hatte mehrere Nachteile, darunter Kosten, Sicherheitsprobleme und sehr lange Erkennungszeiten. Typischerweise wurde entweder tritiiertes oder jodiertes Palmitat für den Nachweis der S-Acylierung16 verwendet. Tritiiertes Palmitat erforderte lange Nachweiszeiten mit Autoradiographiefilm, die Wochen bis Monate dauern können. Während [125I] Jod-Fettsäure-Analoga die Nachweiszeiten verkürzten, stellten sie ein viel höheres Sicherheitsrisiko dar und erforderten eine engmaschige Schilddrüsenüberwachung der Experimentatoren. Darüber hinaus waren diese Methoden daher nicht quantitativ, was die Fähigkeit zur Messung der dynamischen Palmitoylation einschränkte, und auch zeitaufwändig für die Einrichtung und Reinigung aufgrund der zusätzlichen persönlichen Schutzausrüstung und der radioaktiven Überwachung. Schließlich waren radioaktive Markierungen für proteomische Studien nicht gut geeignet und beschränkten sich typischerweise auf den Nachweis spezifischer Proteine von Interesse mit niedrigem Durchsatz. Da mehr Substrate nachgewiesen wurden und unweigerlich die Enzyme identifiziert wurden, die jede Modifikation vermitteln, war klar, dass neue Nachweismethoden erforderlich waren17,18,19,20,21. Fast gleichzeitig entstanden mehrere neue Methoden zum Nachweis von fettacylierten Proteinen. Die erste nutzt die Reversibilität und Reaktivität der Thioesterbindung der S-Acylierung. Der Acyl-Biotin-Austausch (ABE)-Assay ersetzt Palmitat chemisch durch Biotin für den anschließenden Pulldown von S-acylierten Proteinen unter Verwendung von Avidin-Agarose-Perlen und den direkten Nachweis durch Western Blot22,23,24. Als nächstes wurden die bioorthogonale Markierung von Fettsäuren und die chemoselektive Zugabe zu Tags oder Griffen entwickelt, die die Verwendung der Staudinger-Ligatur und der Klickchemie beinhalteten25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Schließlich ersetzt Acylharz-assistierte Abscheidung (RAC) ähnlich wie die ABE im Wesentlichen S-acylierte Stellen durch Thiol-reaktive Kügelchen zur Erfassung und zum Nachweis von S-acylierten Proteinen34,35. Zusammen haben die auf Austausch und Clickchemie basierenden Assays effizientere und empfindlichere Methoden zur Acylierungsdetektion und Affinitätsreinigung für die nachgelagerte Analyse bereitgestellt und anschließend zur Entdeckung von Tausenden von S-acylierten Proteinen geführt8,36.
Der Begriff Klickchemie umfasst eine Gruppe chemischer Reaktionen, bezieht sich aber am häufigsten auf den Cu(I)-katalysierten Azido-Alkinsäure[3+2]-Cycloadditions-Reaktionsmechanismus zwischen einer Alkynylgruppe und einer Azidogruppe27,28,37. Insbesondere im Falle der Fettacylierung beinhaltet die Klickchemie den Nachweis von S-Palmitoylation oder N-Myristylation durch Einarbeitung von bioorthogonalem 16-Kohlenstoff-Alkynylpalmitat (15-Hexadecynsäure; 15-HDYA) bzw. des 14-Kohlenstoff-Alkynylmyristats (13-Tetradecynsäure; 13-TDYA) in Zellen, um endogen acylierte Proteine zu markieren28 . Nach der Zelllyse und Immunpräzipitation des interessierenden Proteins wird eine Klickchemiereaktion (kovalente Verknüpfung zwischen einem Alkin und einem Azid) durchgeführt, um eine Affinitätssonde, typischerweise Biotin, für den Nachweis durch Western Blot28,37 zu binden. Alternativ kann die Klickchemie an der Gesamtzelllysat durchgeführt werden und fettazylierte Proteine können zur Identifizierung durch Massenspektrometrie affinitätsgereinigt werden. Die anfängliche click-chemistry-Reaktion mit Azido-Biotin erhöhte die Selektivität und Empfindlichkeit des Nachweises im Vergleich zur Radioaktivität um mehr als das Millionenfache2. Ein weiterer Vorteil der Klickchemie besteht darin, dass sie mit anderen klassischen Markierungsmethoden kombiniert werden kann, wie z.B. der Pulse-Chase-Analyse des Proteinumsatzes unter Verwendung von Azido-Homoalanin für die quantitative Analyse38. Darüber hinaus können Fluoreszenzsonden anstelle von Biotin oder anderen biochemischen Sonden wie FLAG- oder Myc-Tags verwendet werden, um die Proteinlokalisation zu untersuchen16,28,39.
Trotz der relativen Benutzerfreundlichkeit der Klickchemie kann der Nachweis durch die geringe Löslichkeit und potenzielle Toxizität der Verwendung langkettiger freier Fettsäuren in Zellkulturen eingeschränkt werden40. Insbesondere haben trotz der Präferenz von Palmitat während der S-Acylierung für die Mehrheit der Proteine viele Studien das 18-Kohlenstoffstearat (17-Octadecynosäure - 17-ODYA) anstelle von Palmitat (15-HDYA) für den Nachweis von S-acylierten Proteinen aufgrund seiner kommerziellen Verfügbarkeit und relativ niedrigen Kosten verwendet. 17-ODYA ist jedoch sehr unlöslich und erfordert besondere Aufmerksamkeit bei der Anwendung. Darüber hinaus kann die Klickchemie eine nuancierte Aufbereitung und Lagerung von Chemikalien erfordern. Hierin beschreibt das Protokoll einen Markierungsansatz, der die Abgabe durch Verseifung von Fettsäuren, Abgabe mit fettsäurefreiem BSA und entfettetem fetalem Rinderserum (FBS) optimiert, um die Löslichkeit zu erhöhen und mögliche toxische Wirkungen der Zugabe von freien Fettsäuren zu Zellen zu umgehen28. Diese Methode funktioniert in einer Vielzahl von Zelltypen und wurde sogar bei lebenden Tieren angewendet28.
Protocol
1. Zellkultur
- Um DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) für die Zellkultur zu ergänzen, fügen Sie 10% fetales Rinderserum (FBS), 1x Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 100 mM Natriumpyruvat (1% vol / vol) hinzu.
- Grob 5 x 105 HEK293T-Zellen/Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturschale plattieren und 18 h in einem 37 °C befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 wachsen lassen, um eine Konfluenz von 75%-80% zu erreichen.
- Fettsäure-Serum-Entzug
- Um Etikettiermedien vorzubereiten, bereiten Sie DMEM wie oben beschrieben (Schritt 1.1) ohne 10% FBS vor. Ersetzen Sie FBS durch 5% dextran-anthrazitbeschichtete FBS (DCC-FBS). Vor Gebrauch auf 37 °C vorwärmen.
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur und ersetzen Sie sie durch Markierungsmedien.
HINWEIS: HEK293T-Zellen lösen sich leicht von Gewebekulturplatten. Seien Sie vorsichtig beim Waschen von Zellen und beim Austausch von Medien. Minimieren Sie die Bewegung während des Transfers zum und vom Inkubator so weit wie möglich. - Bringen Sie die Zellen mit 5% CO2 in den 37 °C-Inkubator zurück und inkubieren Sie etwa 45 min (mindestens 15 min sind wirksam), bis zu 60 min, bevor Sie mit der metabolischen Markierung mit Fettsäuren fortfahren.
2. Herstellung und Verseifung von Fettsäureanaloga
- Bereiten Sie die Stammlösungen von Alkynylfettsäuren im Voraus vor, indem Sie in DMSO solubilisieren, um die folgenden Konzentrationen zu erreichen und bei -20 ° C zu lagern. Bei Raumtemperatur nach Bedarf auftauen. Lagern Sie die Präparate für ihre beste Leistung unter N2 oder Ar.
Alkynylmyristat (13-Tetradecynsäure, 13-TDYA): 25 mM
Alkynylpalmitat (15-Hexadecynsäure; 15-HDYA): 100 mM
Alkynylstearat (17-Octadcynsäure; 17-ODYA): 100 mM - Um 20% fettsäurefreies BSA (FAFBSA) herzustellen, wiegen Sie 2 g FAFBSA in einem 50 ml Einwegröhrchen.
- Bringen Sie bis zu 10 ml mit vorgewärmtem (37 °C) DMEM.
- Durch End-over-End-Rotation oder durch Vortexing mischen und in ein 37 °C warmes Wasserbad geben, um FAFBSA vollständig aufzulösen.
- Verwenden Sie einen 0,2-μm-Filter, um das Medium zu sterilisieren.
- Aliquot in ca. 1 ml Volumen und lagern bei -20 °C. Nach Bedarf auftauen und vor Gebrauch in einem Wasserbad auf 37 °C erwärmen.
- Um die Löslichkeit der Fettsäure- und Fettsäureanaloga zu erhöhen, verseifen Sie durch Inkubation mit 20% molarem Überschuss an Kaliumhydroxid (KOH) in konischen 3 ml Glasreaktionsfläschchen.
HINWEIS: Diese Fläschchen ermöglichen es dem Salz, löslich zu bleiben, während sichergestellt wird, dass die FAFBSA nicht durch die hohe Hitze erstarrt. Die Verwendung von Glas verhindert auch, dass Fettsäuren am Kunststoff haften bleiben.- Pipette mindestens 2 μL Alkylfettsäureanalogon direkt auf den Boden einer 3 ml konischen Reaktionsdurchstechflasche. Es werden 2 μL Lipid pro Vertiefung einer verwendeten 6-Well-Platte hergestellt (siehe Tabelle 1).
HINWEIS: Aufgrund der Hydrophobie von Fettsäuren ist es am besten, die Spitze der Pipette zu beschichten, indem Sie das gewünschte Volumen mehrmals aufziehen, bevor Sie es in die Reaktionsdurchstechflasche dosieren. - Verdünnen Sie 1 M KOH auf Konzentrationen, die einem Molüberschuss von 20% der Alkynylfettsäuremarkierung entsprechen (30 mM für 13-TDYA und 120 mM für 15-HDYA und 17-ODYA).
- Eine gleiche Menge verdünnter KOH (1 μL : 1 μL Fettsäure: KOH) nahe dem Boden der Reaktionsdurchstechflasche am Rand des Glases pipettieren, so dass sich das abgegebene Volumen des KOH mit der Fettsäure vermischt.
- Schließen Sie den Deckel der Durchstechflasche und klopfen Sie vorsichtig, um die Lösungen zu mischen.
HINWEIS: Die Mischung kann sich schnell verfestigen, insbesondere bei zunehmender Länge der Kohlenwasserstoffkette der Fettsäure. Achten Sie darauf, den Feststoff nicht zu pipettieren (d.h. nicht durch Pipettieren zu mischen). - Erhitzen Sie die Reaktionsdurchstechflasche bei 65 °C für ca. 5 min oder sobald die Fettsäure eingearbeitet ist (Lösung wird klar).
HINWEIS: Fettsäuren mit einer höheren Anzahl von Kohlenstoffen und verminderter Löslichkeit, wie Stearat (17-ODYA), können längere Inkubationszeiten erfordern, um vollständig in den KOH bei 65 ° C eingebaut zu werden. Erhöhen Sie die Temperatur bei Bedarf auf 70 °C. Ein Wasserbad ist am besten. Achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit nicht zu stark verdunstet. - Sobald die Fettsäuren in Lösung gegangen sind und keine sichtbaren Feststoffe mehr übrig sind, hat die Pipette 20% FAFBSA vorgewärmt, so dass das Volumenverhältnis der Fettsäuren: KOH: FAFBSA 1: 1: 50 beträgt, um eine Endkonzentration von 20x BSA-gebundenen Alkynylfettsäuren zu erreichen.
- Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten. Die Lösung erscheint in der Regel klar und ohne sichtbare Feststoffe.
HINWEIS: Typischerweise werden alle kleinen Feststoffe nach der Inkubation bei 37 °C in Lösung gebracht. - Die Fettsäure und FAFBSA für 15 min bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Das verseifte Etikett an dieser Stelle ist über 15 Minuten stabil.
- Pipette mindestens 2 μL Alkylfettsäureanalogon direkt auf den Boden einer 3 ml konischen Reaktionsdurchstechflasche. Es werden 2 μL Lipid pro Vertiefung einer verwendeten 6-Well-Platte hergestellt (siehe Tabelle 1).
| Gesamtes Medienvolumen (mL) | Vol. Fettsäure oder Fettsäureanalogon (μL) | Band KOH (μL) | Vol. 20% FAFBSA (μL) | Gesamtvolk des BSA-konjugierten verseiften Etiketts (μL) |
| 4 | 4 | 4 | 200 | 208 |
| 2 | 2 | 2 | 100 | 104 |
Tabelle 1: Markierungsverhältnisse für verseifte Fettsäuren Experimentelle Volumina von Fettsäure, KOH und FAFBSA für die Verseifung von Fettsäureetiketten entsprechend der Menge der verwendeten Medien.
- Wiederholen Sie als Kontrolle Schritt 2.3. mit Fettsäuren ohne Alkin-Label.
- Beschriften Sie die Zellen mit 1/20 Volumen des 20-fachen Fettsäure-BSA-Konjugats direkt auf dem Hungermedium (typischerweise 100 μL in 2 ml Medien/Zellen), um eine Endkonzentration von 1% BSA und 25 μM für Alkynylmyristat oder 100 μM für Alkynylpalmitat und Alkynyl-Stearat zu erreichen.
HINWEIS: Um die Menge an physischen Störungen der angeschlossenen Zellen zu minimieren, bilden Sie ein Tröpfchen an der Spitze der Pipette nahe der Oberfläche des Mediums, anstatt direkt in das Medium zu pipettieren. Wenn Sie Acylierungsinhibitoren verwenden, fügen Sie mindestens 15 Minuten vor den markierten Fettsäuren hinzu. Die Zeiten können je nach verwendeter Zelle oder Inhibitor variieren. Es wurde empfohlen, die Verseifung auch für diesen Schritt zu verwenden28.- Zum Vergleich fügen Sie nicht verseifte Lipide hinzu, indem Sie 2 μL (oder das äquivalent zum verseiften Volumen) unmarkierter Fettsäuren direkt in das Hungermedium pipettieren.
- Legen Sie die Zellen zurück in den Inkubator und inkubieren Sie für 3-6 h.
HINWEIS: Für jeden Zelltyp oder experimentellen Zustand muss möglicherweise ein optimaler Markierungszeitpunkt bestimmt werden. Längere Inkubationszeiten können potentiell zum Abbau der Fettsäuren durch β-Oxidation und/oder Einbau in andere Lipidgruppen, wie z.B. Phospholipide28, führen.
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1x PBS bei Raumtemperatur.
- Die Zellen werden mit einem 500 μL Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-freien modifizierten Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Puffer (0,1% SDS, 50 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N-ethansulfonsäure (HEPES) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% nicht denaturierendes Reinigungsmittel, 0,5% Natriumdesoxycholat, 2 mM MgCl2 mit frisch zugesetztem 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 10 μg/μL Pepstatin A (oder EDTA-freier vollständiger Proteasehemmer-Cocktail)) geerntet und gelysert, indem die Lysate für 15 min bei 4 °C geschaukelt werden.
- Zentrifugieren Sie die Lysate bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C.
- Sammeln Sie den Überstand in 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie ihn bei -20 °C, bis er mit der Klickreaktion fortfahren kann.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Lysate sind bis zu 1 Monat bei -20 °C stabil. Es wird jedoch empfohlen, mit der Klickreaktion rechtzeitig fortzufahren.
- Quantifizieren Sie die Proteinkonzentrationen mit einem geeigneten Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers, z. B. einem waschmittelkompatiblen (DC) Assay.
3. Klickreaktion auf Zelllysate
- Bereiten Sie die Reagenzien für die Klickchemie vor.
- Tris-(Benzyltriazolylmethyl)amin (TBTA) in DMSO auf 2 mM auflösen. In kleinen Aliquots mit Trockenmittel bei -20 °C bis zu 2-3 Monate lagern. Am besten unter N2 oder Ar gespeichert.
- CuSO4 in ddH2O-Wasser auflösen, um 50 mM zu erreichen. Bei Raumtemperatur bis zu 2 Monate lagern.
- Tris-Carboxyethylphosphin (TCEP) in ddH2O-Wasser auf 250 mM auflösen. Bei Dunkelheit bei 4 °C lagern und kurz vor der Klickreaktion frische 50 mM Verdünnungen herstellen.
- Bereiten Sie 2 mM Azid in DMSO vor. In kleinen Aliquots mit Trockenmittel bei -20 °C bis zu 6 Monate lagern. Am besten unter N2 oder Ar gespeichert.
HINWEIS: Es wurde beobachtet, dass die Produkte mit drei oder mehr Polyethylenglykolgruppen am besten mit Biotin funktionierten.
- Bringen Sie 50-100 μg Proteinlysate in 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit dem gleichen Lysepuffer wie oben auf das gleiche Volumen.
HINWEIS: Halten Sie das Reaktionsvolumen so klein wie möglich (20-100 μL).- Geben Sie Natriumdodecylsulfat (SDS) zu jeder Probe, um eine endgültige Konzentration von 1% zu erreichen.
- Bereiten Sie eine Mastermischung aus Click-Reagenzien vor, so dass die endgültigen Konzentrationen nach Zugabe zu den Lysaten betragen: 100 μM TBTA (2 mM Stamm), 1 mM CuSO4 (50 mM Stamm), 1 mM TCEP (50 mM Stamm) und 100 μM Azidsonde (2 mM Stamm). Kombinieren Sie die Lagerlösungen entsprechend (siehe Tabelle 2).
HINWEIS: Die Bestellung ist wichtig. Nach dem Hinzufügen jeder Komponente vollständig mischen. - Fügen Sie geeignete Volumina des Master-Mixes in die Lysate ein. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.
- 30 min im Dunkeln in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubieren. Gelegentlich rühren/mischen.
| Gesamtreaktionsvol (μL) | Vol.-Protein (μL) | Band TBTA (2 mM) (μL) | Band CuSO4 (50 mM) (μL) | Band TCEP (50 mM) (μL) | Vol. Azidosonde (2 mM) (μL) |
| 50 | 43 | 2.5 | 1 | 1 | 2.5 |
| 100 | 86 | 5 | 2 | 2 | 5 |
Tabelle 2: Verhältnis von Klickreagenz und Proteinvolumen Experimentelle Volumina der Click-Chemistry-Reagenzien und entsprechende Stammkonzentrationen, zusätzlich zu den Volumina von Proteinproben.
4. Klickreaktion auf immunpräzipitierte Proteine
- Alternativ ist es möglich, die Klickreaktion auf immunpräzipitierte (IP) Proteine auf oder von den Perlen durchzuführen.
HINWEIS: In der Regel führt das Klicken auf die Perlen zu dem geringsten Hintergrund und ist am besten, wenn neue Proteine von Interesse getestet werden.- Transfekte Zellen für das interessierende Protein, in diesem Fall Wildtyp-Myristoyliertes C-terminales Huntingtin (HTT), verschmolzen mit GFP (Myr-ctHTT-GFP) und ctHTT-GFP mit einer G2A-Substitution unter Verwendung von Calciumphosphat-DNA-Kopräzipitation, wie zuvor beschrieben41.
- Platte 2,5 x 105 Zellen / Well in 6-Well-Gewebekulturplatten und wachsen über Nacht auf ~ 70-80% Konfluenz.
- Bereiten Sie die DNA-Mischung vor, indem Sie 2,5 μg DNA in 10 μL mit 99,75 μL molekularem H2O zu einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. Dann 15,25 μL CaCl2 tropfenweise in die DNA-Mischung geben.
- DNA/CaCl2-Gemisch in ein separates Röhrchen, das 125 μL 2x HEPES gepufferte Kochsalzlösung (HBS, pH 7,0) enthält, tropfenweise mit Mischen hinzufügen.
- Fügen Sie langsam die DNA / CaCl2 / HBS-Mischung zu den Zellen hinzu. Nach 2-4 h das Medium ersetzen und über Nacht inkubieren. Fahren Sie mit der Beschriftung aus den Schritten 1.3-2.8 fort.
- Bereiten Sie gleiche Volumina von 500 μg Protein im Lysepuffer vor.
- Führen Sie IP durch, indem Sie mit Kaninchen-Anti-GFP für ctHTT-GFP inkubieren, das über Nacht bei 4 ° C rotiert.
- Fügen Sie 15-20 μL Protein-G-Perlen, die mit Lysepuffer voräquivalent sind, zu jeder Röhrchen hinzu und lassen Sie sie 3 h lang Ende über Ende bei 4 ° C reagieren.
- Waschen Sie die Perlen mit Lysepuffer und resuspendieren Sie in 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES-Puffer.
- Erhitzen Sie die Perlen bei 80 °C für 15 min und drehen Sie die Rohre um oder rühren Sie sie etwa alle 5 min. Drehen Sie die Röhrchen kurz und kehren Sie zu 80 °C zurück.
- Sammeln Sie den Überstand, der die Proteine enthält, während die Proben noch warm sind.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden und die immunpräzipitierten Proben können bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort für die Klickchemie verwendet werden. - Lassen Sie 43 μL des Überstands mit einer 7-μL-Mastermischung aus Klickreagenzien reagieren.
- Fahren Sie mit der Reaktion fort, wie in Schritt 3.2.3 angegeben.
- Transfekte Zellen für das interessierende Protein, in diesem Fall Wildtyp-Myristoyliertes C-terminales Huntingtin (HTT), verschmolzen mit GFP (Myr-ctHTT-GFP) und ctHTT-GFP mit einer G2A-Substitution unter Verwendung von Calciumphosphat-DNA-Kopräzipitation, wie zuvor beschrieben41.
5. SDS-PAGE und Western Blotting
- Stoppen Sie die Reaktion und Denaturierung durch Zugabe von 1x Probenladepuffer mit 25 mM Dithiothreitol (DTT) und Hitze bei 95 °C für 5 min.
HINWEIS: Es können bis zu 100 mM DVB-T verwendet werden28. Verwenden Sie β-Mercaptoethanol nicht mit S-acylierten Proteinen, da es die Thioesterbindungen hydrolysieren und das angeklickte Fettsäureanalogon entfernen kann. - Drehen Sie die Proben kurz herunter.
- Trennen Sie die Proteine mit SDS-PAGE auf einem Polyacrylamid-Gel in Duplikaten.
HINWEIS: Für die alkalische Behandlung mit KOH sind zwei Gele erforderlich, um das Vorhandensein von Thioesterbindungen zu bestätigen. Bei Verwendung einer fluoreszierenden Azidsonde kann die Acylierung in Gel oder nach dem Transfer mit dem angegebenen Anregungskanal nachgewiesen werden. - Transfer auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen (aktiviert in Methanol und gespült in ddH2O - jeweils 5 min) mit halbtrockener Transferapparatur bei 25 V, 1,0 A (konstant) für 30 min.
- Nach kurzem Spülen der Membranen mit ddH2O eine Replikatmembran in 0,1 M KOH in Methanol/Wasser (9:1 v/v) und die andere in 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 in Methanol/Wasser (9:1 v/v) als nicht-alkalische Kontrolle für 60 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schaukeln einweichen.
- Spülen Sie die Membranen kurz in ddH2O-Wasser, gefolgt von 6 x 5-minütigen Waschungen in PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20).
HINWEIS: Waschen Sie gründlich. - Blockieren Sie die Membranen über Nacht in 5% Magermilch-Blockierpuffer (1x PBS, 0,1% Tween20).
6. Führen Sie Western Blot durch
- Wo angegeben, Sonde mit fluoreszierend markiertem Streptavidin (1:5000) und Ladekontrolle, Anti-GAPDH-Rhodamin (1:5000) in 5% BSA-Sperrpuffer (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) bei Raumtemperatur für 45-60 min mit sanftem Schaukeln, in der Dunkelheit.
- Untersuchen Sie den immunpräzipitierten Proteinblot zuerst mit primären Anti-GFP-Antikörpern in 5% Magermilch-Blocking-Puffer, dann mit geeigneten sekundären Antikörpern in 5% BSA wie in Schritt 6.1.
- Waschen Sie die Membranen für 5 min in PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) insgesamt vier Wiederholungen und spülen Sie sie vor der Bildgebung mit ddH2O-Wasser ab.
Representative Results
Der Unterschied in der Markierungseffizienz zwischen verseiften und nicht verseiften (nicht safthaltigen) Alkynylfettsäuren für den Nachweis der Klickchemie kann durch die Signalintensität von fettacylierten Proteinen durch Western Blot visualisiert und verglichen werden (Abbildung 1). Ein spürbarer Effekt wurde mit zunehmender Länge der Acylketten beobachtet. In Zellen, die mit Alkynylstearat (Alk-Stear) markiert waren, erhöhten die Verseifung der Fettsäure und die Abgabe mit BSA zur metabolischen Markierung den Nachweis des S-acylierten Proteinsignals durch Klickchemie und den Nachweis durch eine fluoreszierende Azidosonde drastisch (Abbildung 1, rechts), was auf eine allgemeine Zunahme der zellulären Inkorporation der Alkynylfettsäuremarkierung hindeutet. Umgekehrt wurde kein spürbarer Unterschied in Zellen beobachtet, die mit der kürzesten und löslichsten Fettsäure, Alkynylmyristat (Alk-Myr; 13-Tetradecynsäure oder 13-TDYA), behandelt wurden. Zellen, die mit Alkynylpalmitat markiert waren (Abbildung 1, Mitte), zeigten einen mittleren Anstieg der Markierung im Vergleich zu Alkynylmyristat (13-TDYA), aber weniger als Alkynylstearat.
Wichtig ist, dass die Behandlung von PVDF-Membranen mit 0,1 M KOH die Fettsäuremarkierungen von Zellen, die mit Alkynylpalmitat und Alkynylstearat inkubiert wurden, weitgehend entfernt hat, was bestätigt, dass der Großteil des Signals durch eine Ester- oder Thioesterbindung erfolgte (Abbildung 1, Mitte und rechts, untere Tafeln). Wie erwartet, war der Einbau von Alkynylmyristat aufgrund der Bindung von Myristat an Proteine durch eine Amidbindung weitgehend alkaliresistent (Abbildung 1, links, untere Tafeln).
Abbildung 2 zeigt die Vielseitigkeit und Empfindlichkeit der Klickchemie zum Nachweis der Fettacylierung von immunpräzipitierten Proteinen. HEK293T-Zellen wurden mit myristoyliertem C-terminalem Huntingtin (HTT) transfiziert, das mit GFP (myr-ctHTT-GFP) fusioniert und mit Alkynylmyristat markiert wurde, wie zuvor beschrieben18. Nach der Immunpräzipitation wurde ctHTT-GFP aus den Perlen freigesetzt und neben den Lysaten einer Klickchemie unterzogen. Die Myristoylierung von Wildtyp (WT) Myr-ctHTT-GFP wurde nicht nur in den Immunpräzipitaten nachgewiesen, sondern auch stark in den Lysaten, während die G2A-Mutation die Myristoylierung des ctHTT-GFP vollständig blockierte (Abbildung 2).
Abbildung 1: Nachweis von fettacylierten Proteinen mittels Klickchemie. HEK293T-Zellen wurden mit den angegebenen Fettsäuren direkt (ohne Saft) oder nach Verseifung (Saft) und Inkubation mit dem Trägerprotein BSA inkubiert, wie in Protokoll 2.1-2.7 beschrieben. Alkynyl-Fettsäuren wurden mit fluoreszierendem Azid verknüpft, indem 100 μg Proteinlysate der Klickchemie unterzogen, durch SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membranen übertragen wurden. Nach der Behandlung mit 0,1 M Tris pH 7,0 oder 0,1 M KOH wurde zur Umkehrung von Thioesterbindungen eine Fettacylierung mit einem fluoreszierenden Azid nachgewiesen. GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet; Anti-GAPDH-Rhodamin (1:5.000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Nachweis von N-myristoyliertem ctHTT-GFP mittels Klickchemie. HEK293T-Zellen wurden mit C-terminally truncated (ct) und myristoylatable Form von HTT (myr-ctHTT-GFP) transfiziert und mit Alkynylmyristat markiert. Eine nicht myristoylatierbare Form, bei der das essentielle Glycin durch ein Alanin ersetzt wurde, wurde aufgenommen (G2A). Nach der Ernte und Lyse wurde ctHTT-GFP mit Ziegen-Anti-GFP immunpräzipitiert. Lysate wurden nach der Freisetzung aus den Perlen einer Click-Chemistry-Reaktion (links) sowie Immunpräzipitaten unterzogen. Myristoylierung wurde mit Streptavidin Alexa 680 (SA680) nachgewiesen. GFP wurde mit Kaninchen-Anti-GFP in Kombination mit Anti-Kaninchen-Alexa 488 nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Workflow-Schema des experimentellen Protokolls. Workflow-Überblick über die wichtigsten experimentellen Schritte im Protokoll. Es werden mehrere Punkte notiert, an denen das Protokoll angehalten werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Die direkte Zugabe von Fettsäuren zu Zellen in Kultur kann zu Unlöslichkeit, Ausfällung von Lipiden und Lipotoxizität führen40. Folglich kann die direkte Zugabe von Fettsäuren zu Zellen nicht nur zu einer schlechten Zellaufnahme und einer geringen Verfügbarkeit der Fettsäuremarkierung führen, sondern auch zu einer verringerten Anzahl lebensfähiger Zellen für die nachgelagerte Analyse sowie zur Aktivierung von Off-Target-Signalwegen. Viele metabolische Markierungsprotokolle für den Nachweis der Klickchemie beinhalten jedoch die direkte Zugabe von Fettsäuren und eine große Anzahl von Palmitoyl-Proteom-Studien unter Verwendung des Click-Chemistry-Nachweises verseift die Fettsäuremarkierungen bisher selten oder inkubiert sie mit BSA8,36. Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass die Effizienz und Empfindlichkeit des clickchemischen Nachweises von fettazylatierten Proteinen von einer ausreichenden zellulären Aufnahme der Fettsäureanaloga abhängt. Daher ist es vernünftig zu spekulieren, dass viele S-acylierte Proteine aufgrund einer geringen Verfügbarkeit der Fettsäuremarkierungen durch schlechten Einbau in die Zellen in proteomischen Studien dem Nachweis entgangen sein könnten, insbesondere wenn die längerkettige Fettsäure 17-ODYA verwendet wurde. 17-ODYA, oder Alkynylstearat, war aufgrund seiner kommerziellen Verfügbarkeit und seiner frühen Verwendung das weit verbreitete Etikett der Wahl für mehrere Studien8,36. Die Ergebnisse dieses Protokolls zeigen jedoch, dass die Verseifung von 17-ODYA im Vergleich zu kürzerkettigen Fettsäuren wie Palmitat oder Myristat zu dem größten Anstieg des Nachweises von S-acylierten Proteinen führt. Daher kann die Wiederholung dieser Experimente mit verseiften Etiketten zusätzliche Substrate der S-Acylierung ergeben, die zuvor möglicherweise übersehen wurden. Während die meisten Palmitoylacyltransferasen Palmitat für die S-Acylierung bevorzugen, haben einige Präferenzen für andere Längen von Fettsäuren wie Stearat15,38,44. Darüber hinaus bevorzugen einige Proteine oder sogar bestimmte Stellen innerhalb von Proteinen eine Fettsäure gegenüber einer anderen15,45. Daher können Studien mit 17-ODYA eine Tendenz zu Proteinen haben, die mit Stearat und nicht mit Palmitat acylatiert sind, während sie diese Proteine aufgrund einer geringeren Erkennung auch unterrepräsentieren.
Die verbesserte metabolische Markierungseffizienz für die Klickchemie beruht auf der Verseifung von Lipiden und der Inkubation mit FAFBSA-Schritten sowie dem entlipidierten FBS. Alle Fettsäuren müssen vollständig in KOH verseift werden, ohne sichtbare Feststoffe, bevor mit der Inkubation mit FAFBSA fortgefahren wird. Dies kann ein schwieriger Schritt sein und das Timing ist entscheidend. Nachdem die verseiften Fettsäuren bei 65 °C in Lösung gegangen sind, fügen Sie sofort warmes BSA hinzu, da eine weitere Erwärmung zu einer Verdunstung des DMSO aus den Fettsäuren führt. Darüber hinaus beginnt sich das verseifte Etikett wieder zu verfestigen, sobald es zu kühlen beginnt. Daher muss die FAFBSA warm sein und schnell hinzugefügt werden, nachdem das Salz löslich geworden ist. Die Glasreaktionsfläschchen und ihre Form sind für diesen Schritt wichtig. Sie lassen das verseifte Lipid warm genug sein, um löslich zu bleiben, während es kühl genug ist, um sicherzustellen, dass das FAFBSA nicht erstarrt. Auch eine ausreichende Durchmischung durch Pipettieren ist bei diesem Schritt wichtig, um eine homogene Lösung für die Etikettierung zu gewährleisten.
Die Reagenzien für die Klickchemie müssen ordnungsgemäß gelagert werden, typischerweise mit Trockenmitteln oder unter N2 - oder Ar-Gas bei -20 °C bis -80 °C. Das Fehlen eines Acylierungssignals oder ein schwaches Signal kann auf instabile Reagenzien zurückzuführen sein, insbesondere auf ältere TBTA- und Azidlagerlösungen. Darüber hinaus ist bei fluoreszierenden Azid-Stammlösungen, die so gut wie möglich vor Licht geschützt werden müssen, Vorsicht geboten. Darüber hinaus müssen möglicherweise Variablen wie die Methode des Lipidentzugs und die Markierungszeit getestet werden, um die optimalen Bedingungen in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Zelle zu bestimmen. Zum Beispiel können neuronale Zellen längere Markierungszeiten benötigen, da Medienveränderungen und Lipidentzug schwierig sind (unveröffentlicht).
Der Vorteil dieses Protokolls ist am dramatischsten, wenn es für längerkettige Fettsäuren verwendet wird. Bei kürzeren Ketten wird der Anstieg der Signalintensität weniger dramatisch, schützt aber wahrscheinlich immer noch die Zellen. Während die vorgeschlagenen Modifikationen die Proteinacylierungsdetektion im Allgemeinen verbessern werden, wird die Klickchemie immer noch als lipidzentrierte Methode1 angesehen, die sich auf den Nachweis von dynamischen, nicht stabilen S-acylierten Proteinen beschränkt1. Weitere zu berücksichtigende Einschränkungen sind die Anforderung des Fettsäureentzugs zur Förderung der Markierung und die relativ begrenzte Bandbreite kompatibler Zelltypen im Vergleich zum Acyl-Biotin-Austausch (ABE)-Nachweis der S-Acylierung16. Trotz dieser Einschränkungen ist der Nachweis der Klickchemie schneller als die meisten Acylaustausch-Assays und eignet sich besser für den Nachweis von Proteinen, die die wiederholten Proteinausscheidungsschritte, die für Acylaustausch-Assays erforderlich sind, nicht tolerieren. Darüber hinaus kann dieser Ansatz mit der gleichzeitigen Markierung unter Verwendung anderer Klickassays wie der Pulse-Chase-Analyse38 kombiniert werden.
Die Verwendung dieser Modifikation für die metabolische Markierung für die Klickchemie erhöhte den Gesamtnachweis von acylierten Proteinen, insbesondere S-acyliert, mit einer Vielzahl von proteomischen Techniken, die in Verbindung mit der Klickchemie verwendet werden. Wie gezeigt, kann der fluorogene Nachweis als Alternative zu Biotin eingesetzt werden (Abbildung 1)28. Dies ist besonders nützlich, da sich in den Zelllysaten keine endogen fluoreszierenden Proteine befinden. Zusätzlich können Fluorophore verwendet werden, die erst nach Klickchemie aktiviert werden46. Die verseifte und FAFBSA-gebundene Fettsäure für die Click-Chemistry-Markierung kann bei Schwierigkeiten beim Nachweis von Proteinen von Interesse helfen, da die in der Zelle verfügbare Menge an Markierung insgesamt erhöht wird und die toxischen Wirkungen der Zugabe von Fettsäuren direkt in die Medien begrenzt werden. Es kann auch in Verbindung mit der Massenspektrometrie27 verwendet werden, um die Erkennung von Proteinen mit geringer Häufigkeit zu erhöhen, insbesondere wenn es zusammen mit der jüngsten Weiterentwicklung unter Verwendung von Algorithmen des maschinellen Lernens verwendet wird, die redundante Messungen verhindern, um die Empfindlichkeit gegenüber Proteinen mit geringer Häufigkeit zu erhöhen, im Gegensatz zu bestehenden datenabhängigen Aufzeichnungen, die den Nachweis der am häufigsten vorkommenden Proteine begünstigen47 . Darüber hinaus kann die Klickchemie mit stabiler Isotopenmarkierung mit Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) und Pulse-Chase-Methoden kombiniert werden, um quantifizierbare Daten zur dynamischen Protein-S-Acylierung zu erhalten27. Schließlich hat die Hannoush-Gruppe die Klickchemie mit dem Proximity-Ligationsassay (PLA) kombiniert, um die Einzelzellvisualisierung und -untersuchung der subzellulären Verteilung von palmitoylierten Proteinen zu ermöglichen43,48.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Science and Engineering Research Council (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao wurde durch das Ram and Lekha Tumkur Memorial Scholarship durch das Department of Biology an der University of Waterloo und das Lucy Morrison Memorial Bursary durch IODE Ontario finanziert, zusätzlich zu der Graduiertenforschungsfinanzierung der University of Waterloo, bestehend aus dem Graduate Research Studentship (50503-11072), dem Science Graduate Award und dem Graduate Teaching Assistantship. Die Autoren danken allen Mitgliedern des Martin-Labors für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung dieses Manuskripts, insbesondere Stephanie Ryall, Harleen Gill und Sadia Khan, die bei der ersten Einrichtung des Martin-Labors in Vorbereitung auf diese Studien geholfen haben. Die Autoren danken auch Dr. Luc Berthiaume für das freundliche Geschenk der ctHTT-GFP-Konstrukte und Dr. Shaun Sanders für den kritischen Beitrag zur Vorbereitung des Manuskripts. Abbildung 3 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) | Click Chemistry Tools | 1164 | |
| 15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) | Click Chemistry Tools | 1165 | |
| 17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) | Cayman Chemical Company | 90270 | |
| 30% acrylamide/bis solution 29:1 | Biorad | 1610156 | |
| 96-well plate reader | Biorad | N/A | |
| AFDye 647 azide plus | Click Chemistry Tools | 1482 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 1610700 | |
| Anti-GAPDH hFAB Rhodamine | Biorad | 12004167 | |
| Anti-rabbit Alexa 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-Tubulin hFAB Rhodamine | Biorad | 12004166 | |
| Biotin Azide | Click Chemistry Tools | 1265 | |
| Bis-tris, ultrapure | VWR | 715 | |
| Calcium chloride | J.T. Baker | 1332-1 | |
| Centrifuge 16,000xg, 4°C | Thermo Scientific | N/A | |
| Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) | Life Technologies | A3382101 | |
| ChemiDoc Imager | Biorad | N/A | |
| Copper sulfate (1 mM) | VWR | BDH9312 | |
| Deoxycholic acid sodium salt monohydrate | MP Biomedicals | 102906 | |
| Detergent compatible (DC) assay | Biorad | N/A | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR | 0231-500 mL | |
| DMEM, 1x | Wisent Inc | 319015CL | |
| Ethanol, anhydrous | N/A | N/A | |
| Fatty Acid Free BSA | MP Biomedicals | 219989950 | |
| Fast Blot Turbo Semi-dry transfer | Biorad | N/A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483-020 | |
| FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane | Pall Life Sciences | BSP0161 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid | VWR | 5011 | |
| Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 | VWR | N/A | |
| Igepal CA-630 | Alfa Aesar | J61055 | |
| Image Lab Software | Biorad | N/A | |
| L-glutamine supplement solution | Wisent Inc | 609-065-EL | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Methanol | VWR | BDH1135 | |
| Myristic Acid (25 mM) | VWR | M0476-25G | |
| Palmitic acid (100 mM) | VWR | P0002-25G | |
| Penicillin-Streptomycin, 10x | Wisent Inc | 450201EL | |
| Pepstatin A (synthetic) | Enzo Life Sciences | ALX-260-085-M005 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Enzo Life Sciences | ALX-270-184-G005 | |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | VWR | 75801-000 | |
| Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) | Eusera | EU4 | |
| FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane | Pall Life Sciences | BSP0161 | |
| Potassium hydroxide | Ward's Science | 470302-100 | |
| Rabbit polyclonal antibody to GFP | Eusera | EU1 | |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Sodium pyruvate | Wisent Inc | 600-110-EL | |
| Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate | Thermo Fisher Scientific | S21378 | |
| Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) | Soltec Ventures | M115 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypsin/EDTA | Wisent Inc | 325-043-CL | |
| Tween 20 Reagent Grade 1L | VWR | 97062-332 | |
| WHEATON NextGen V Vials 3 mL | VWR | 89085-424 |
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