Summary
Studien av fettacylation har viktiga konsekvenser i cellulära proteininteraktioner och sjukdomar. Här presenteras ett modifierat protokoll för att förbättra klickkemidetektering av fettacylerade proteiner, som kan appliceras i olika celltyper och kombineras med andra analyser, inklusive pulsjakt och masspektrometri.
Abstract
Fettacylation, den kovalenta tillsatsen av mättade fettsyror till proteinsubstrat, är viktig för att reglera en myriad av cellulära funktioner utöver dess konsekvenser vid cancer och neurodegenerativa sjukdomar. Den senaste utvecklingen inom fettacylationsdetekteringsmetoder har möjliggjort effektiv och icke-farlig detektion av fettacylerade proteiner, särskilt genom användning av klickkemi med bioortogonal märkning. Klickkemidetektering kan dock begränsas av den dåliga lösligheten och potentiella toxiska effekterna av att tillsätta långkedjiga fettsyror till cellkulturen. Här beskrivs en märkningsmetod med optimerad leverans med förtvålade fettsyror i kombination med fettsyrafri BSA, samt delipiderade medier, vilket kan förbättra detekteringen av svårupptäckta fettacylerade proteiner. Denna effekt var mest uttalad med alkynyl-stearatanalogen, 17-ODYA, som har varit den vanligaste fettsyraanalogen vid klickkemidetektering av acylerade proteiner. Denna modifiering kommer att förbättra cellulär inkorporering och öka känsligheten för acyleerad proteindetektering. Dessutom kan detta tillvägagångssätt tillämpas i en mängd olika celltyper och kombineras med andra analyser såsom pulsjaktanalys, stabil isotopmärkning med aminosyror i cellodling och masspektrometri för kvantitativ profilering av fettacylaterade proteiner.
Introduction
Fettacylation innebär kovalent tillsats av fettsyror till proteiner och är välkänt för sin betydelse för att främja protein-membraninteraktioner men har också visat sig främja protein-proteininteraktioner, konformationsförändringar och reglera katalytiska platser för enzymer1,2,3,4,5,6,7 . Fettacylation har uppstått som ett potentiellt läkemedelsmål i en myriad av sjukdomar, inklusive infektion, cancer, inflammation och neurodegeneration, där störningar i palmitoylering har dokumenterats8,9,10,11,12,13. Detta har främst drivits på av utvecklingen av nya kemiska detektionsmetoder, vilket möjliggjorde storskalig identifiering av S-acylerade proteinmål.
Fettacylation kan innefatta en mängd olika modifieringar som involverar kovalent tillsats av mättade och omättade fettsyror, men hänvisar vanligtvis till N-myristoylering och S-acylering. N-myristoylering avser tillsats av myristinsyra till N-terminala glyciner antingen samöversättningellt på begynnande polypeptider eller post-translationellt på nyligen exponerade N-terminala glyciner efter proteolytisk klyvning2,14. N-myristoylering sker genom en irreversibel amidbindning. Å andra sidan hänvisar S-acylation typiskt till den reversibla tillsatsen av långkedjiga fettsyror till cysteinrester via en tioesterbindning. Den vanligaste formen av denna modifiering innefattar införlivandet av palmitat och kallas därför vanligen S-palmitoylering, eller helt enkelt palmitoylering11,15. På många sätt liknar S-palmitoylering fosforylering. Det är dynamiskt, enzymatiskt reglerat och visar sig vara mycket lätthanterligt.
Fram till det senaste decenniet hindrades studier av fettacylation av begränsade detektionsmetoder, vilket krävde radioaktivt märkta fettsyror. Detta hade flera nackdelar, inklusive kostnad, säkerhetsproblem och mycket långa detektionstider. Vanligtvis användes antingen tritierad eller joderad palmitat för detektion av S-acylation16. Tritierad palmitat krävde långa detektionsperioder med autoradiografifilm, vilket kan ta veckor till månader. Medan [125I] jodfettsyraanaloger förkortade detektionstiderna, presenterade det en mycket högre säkerhetsrisk och krävde noggrann sköldkörtelövervakning av experimenter. Dessutom var dessa metoder icke-kvantitativa, vilket begränsade förmågan att mäta dynamisk palmitoylering och också tidskrävande att installera och städa upp på grund av extra personlig skyddsutrustning och radioaktiv övervakning. Slutligen var radioaktiva etiketter inte väl lämpade för proteomiska studier och vanligtvis begränsade till detektering av specifika proteiner av intresse. När fler substrat detekterades och oundvikligen enzymerna som förmedlar varje modifiering identifierades, var det klart att nya detektionsmetoder krävdes17,18,19,20,21. Nästan samtidigt uppstod flera nya metoder för detektion av fettacylaterade proteiner. Den första utnyttjar reversibiliteten och reaktiviteten hos tioesterbindningen av S-acylation. Analysen av acyl-biotinutbyte (ABE) ersätter kemiskt palmitat med biotin för efterföljande neddragning av S-acylerade proteiner med användning av avidinagarospärlor och direkt detektion av western blot22,23,24. Därefter utvecklades bio-ortogonal märkning av fettsyror och kemoselektiv tillsats till taggar eller handtag som inkluderade användningen av Staudinger-ligeringen och klickkemi25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Slutligen, i likhet med ABE, ersätter acylhartsassisterad infångning (RAC) i huvudsak S-acylerade platser med tiolreaktiva pärlor för infångning och detektion av S-acylerade proteiner34,35. Tillsammans har utbytes- och klickkemibaserade analyser gett effektivare och känsligare metoder för acylationsdetektion och affinitetsrening för nedströmsanalys och har därefter lett till upptäckten av tusentals S-acylerade proteiner8,36.
Termen klickkemi omfattar en grupp kemiska reaktioner, men hänvisar oftast till Cu (I) -katalyserad azido-alkyn [3 + 2] cykloadditionsreaktionsmekanism mellan en alkynylgrupp och en azidogrupp27,28,37. I synnerhet vid fettacylation innebär klickkemi detektion av S-palmitoylering eller N-myristylering genom att införliva bioortogonal 16-kolalkynylpalmitat (15-hexadecynosyra; 15-HDYA) respektive 14-kolalkynyl-myristat (13-tetradecynosyra; 13-TDYA) i celler för att märka endogent acylaterade proteiner28 . Efter celllys och immunutfällning av proteinet av intresse utförs en klickkemireaktion (kovalent koppling mellan en alkyn och en azid) för att binda en affinitetssond, typiskt biotin, för detektion av western blot28,37. Alternativt kan klickkemi utföras på det totala celllysatet och fettacylaterade proteiner kan affinitet renas för identifiering genom masspektrometri. Den initiala klickkemireaktionen med azido-biotin ökade selektiviteten och känsligheten för detektion över en miljon gånger jämfört med radioaktivitet2. En annan fördel med klickkemi är att den kan kombineras med andra klassiska märkningsmetoder, såsom pulsjaktanalys av proteinomsättning med azido-homoalanin för kvantitativ analys38. Dessutom kan fluorescerande sonder användas istället för biotin eller andra biokemiska sonder, såsom FLAG- eller Myc-taggar, för att undersöka proteinlokalisering16,28,39.
Trots den relativa användarvänligheten hos klickkemi kan detektionen begränsas av den låga lösligheten och den potentiella toxiciteten vid användning av långkedjiga fria fettsyror i cellodling40. I synnerhet, trots att palmitat föredras under S-acylation för majoriteten av proteinerna, har många studier använt 18-kolstearat (17-oktadecynosyra - 17-ODYA) snarare än palmitat (15-HDYA) för att detektera S-acylerade proteiner på grund av dess kommersiella tillgänglighet och relativt låga kostnad. 17-ODYA är dock mycket olöslig och kräver särskild uppmärksamhet när den används. Dessutom kan klickkemi kräva viss nyanserad beredning och lagring av kemikalier. Här beskriver protokollet en märkningsmetod som optimerar leveransen med hjälp av förtvålning av fettsyror, leverans med fettsyrafri BSA och delipiderat fetalt bovint serum (FBS) för att öka lösligheten och kringgå potentiella toxiska effekter av att tillsätta fria fettsyror till celler28. Denna metod fungerar i en mängd olika celltyper och har även använts i levande djur28.
Protocol
1. Cellodling
- För att komplettera DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) för cellodling, tillsätt 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-glutamin och 100 mM natriumpyruvat (1% vol / vol).
- Platta cirka 5 x 105 HEK293T-celler / brunn i en 6-brunns vävnadsodlingsskål och växa i 18 timmar i en 37 ° C fuktad inkubator med 5% CO2 för att nå 75% -80% sammanflöde.
- Fettsyra serum deprivation
- För att förbereda etiketteringsmedia, förbered DMEM enligt ovan (steg 1.1) utan 10% FBS. Byt ut FBS mot 5% dextran-kolbelagd FBS (DCC-FBS). Förvärm till 37 °C före användning.
- Tvätta försiktigt cellerna med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid rumstemperatur och ersätt med märkningsmedia.
OBS: HEK293T-celler lossnar lätt från vävnadsodlingsplattor. Var försiktig när du tvättar celler och byter ut media. Minimera agitation under överföring till och från inkubatorn så mycket som möjligt. - Återför cellerna till 37 ° C-inkubatorn med 5% CO2 och inkubera cirka 45 min (minst 15 min är effektiv), upp till 60 min, innan du fortsätter med metabolisk märkning med fettsyror.
2. Beredning och förtvålning av fettsyraanaloger
- Förbered stamlösningarna av alkynylfettsyror i förväg genom att solubilisera i DMSO för att uppnå följande koncentrationer och lagra vid -20 °C. Tina vid rumstemperatur efter behov. Förvara förberedelserna för deras bästa prestanda under N2 eller Ar.
Alkynyl-myristat (13-tetradecynosyra, 13-TDYA): 25 mM
Alkynylpalmitat (15-hexadecynosyra; 15-HDYA): 100 mM
Alkynylstearat (17-oktadecynosyra; 17-ODYA): 100 mM - För att bereda 20% fettsyrafri BSA (FAFBSA), väg 2 g FAFBSA i ett 50 ml engångsrör.
- Ta upp till 10 ml med förvärmd (37 ° C) DMEM.
- Blanda genom rotation i slutet eller genom virvel och lägg i ett 37 °C vattenbad för att lösa upp FAFBSA helt.
- Använd 0,2 μm filter för att filtrera sterilisera mediet.
- Alikvot i cirka 1 ml volymer och lagras vid -20 °C. Tina efter behov och värm till 37 °C i ett vattenbad före användning.
- För att förbättra lösligheten hos fettsyra- och fettsyraanalogerna, förtvål genom att inkubera med 20% molärt överskott av kaliumhydroxid (KOH) i 3 ml glas koniska reaktionsflaskor.
OBS: Dessa injektionsflaskor gör att saltet kan förbli lösligt samtidigt som FAFBSA inte kongeal från den höga värmen. Användningen av glas förhindrar också fettsyror från att fastna på plasten.- Pipettera ut minst 2 μL alkynylfettsyraanalog direkt till botten av en 3 ml konisk reaktionsflaska. Förbered 2 μL lipid per brunn av en 6-brunnsplatta som används (se tabell 1).
OBS: På grund av fettsyrornas hydrofobicitet är det bäst att belägga pipettens spets genom att rita upp önskad volym flera gånger innan den släpps ut i reaktionsflaskan. - Späd 1 M KOH till koncentrationer lika med 20% molärt överskott av alkynylfettsyraetiketten (30 mM för 13-TDYA och 120 mM för 15-HDYA och 17-ODYA).
- Pipettera ut en lika stor mängd utspädd KOH (1 μL: 1 μL fettsyra: KOH) nära botten av reaktionsflaskan på kanten av glaset, så att den dispenserade volymen av KOH blandas med fettsyran.
- Stäng locket på flaskan och knacka försiktigt för att blanda lösningarna.
OBS: Blandningen kan stelna snabbt, särskilt med ökande längder av fettsyrans kolvätekedja. Var försiktig så att du inte pipetterar det fasta ämnet (dvs blanda inte genom pipettering). - Värm reaktionsflaskan vid 65 °C i cirka 5 minuter, eller så snart fettsyran har införlivats (lösningen blir klar).
OBS: Fettsyror med ett högre antal kol och minskad löslighet, såsom stearat (17-ODYA), kan kräva längre inkubationstider för att helt införlivas i KOH vid 65 ° C. Höj temperaturen till 70 °C om det behövs. Ett vattenbad är bäst. Se till att vätskan inte avdunstar för mycket. - När fettsyrorna har gått i lösning och inga synliga fasta ämnen kvarstår, förvarnade pipetten 20% FAFBSA så att volymförhållandet mellan fettsyror: KOH: FAFBSA är 1: 1: 50 för att uppnå en slutlig koncentration av 20x BSA-bundna alkynylfettsyror.
- Blanda genom att pipettera upp och ner. Lösningen verkar vanligtvis klar utan synliga fasta ämnen.
OBS: Vanligtvis kommer alla små fasta ämnen att gå i lösning efter inkubation vid 37 ° C. - Inkubera fettsyran och FAFBSA i 15 min vid 37 °C.
OBS: Den förtvålade etiketten vid denna tidpunkt är stabil över 15 minuter.
- Pipettera ut minst 2 μL alkynylfettsyraanalog direkt till botten av en 3 ml konisk reaktionsflaska. Förbered 2 μL lipid per brunn av en 6-brunnsplatta som används (se tabell 1).
| Total medievolym (ml) | Vol. fettsyra eller fettsyraanalog (μL) | Vol. KOH (μL) | Vol. 20% FAFBSA (μL) | Total volym volym av BSA-konjugerad förtvålad etikett (μL) |
| 4 | 4 | 4 | 200 | 208 |
| 2 | 2 | 2 | 100 | 104 |
Tabell 1: Märkningsförhållanden för förtvålad fettsyra. Experimentella volymer av fettsyra, KOH och FAFBSA för förtvålning av fettsyraetikett enligt volymen av media som används.
- Upprepa steg 2.3 som en kontroll. med fettsyror utan alkynetikett.
- Märk cellerna med 1/20 volym av 20x fettsyra-BSA-konjugatet direkt på svältmediet (vanligtvis 100 μL i 2 ml media / celler) för att uppnå en slutlig koncentration av 1% BSA och 25 μM för alkynyl-myristat, eller 100 μM för alkynylpalmitat och alkynylstearat.
OBS: För att minimera mängden fysisk störning av de bifogade cellerna, bilda en droppe vid pipettens spets nära medieytan istället för att pipettera direkt i mediet. Om du använder acylationshämmare, tillsätt minst 15 minuter före de märkta fettsyrorna. Tiderna kan variera beroende på vilka celler eller hämmare som används. Det har rekommenderats att använda förtvålningen även för detta steg28.- Som jämförelse, tillsätt icke-förtvålade lipider genom pipettering av 2 μL (eller motsvarande volym förtvålad) av omärkt fettsyra direkt i svältmediet.
- Placera cellerna tillbaka i inkubatorn och inkubera i 3-6 timmar.
OBS: Optimal märkningstid kan behöva bestämmas för varje celltyp eller experimentellt tillstånd. Längre inkubationstider kan potentiellt leda till nedbrytning av fettsyrorna genom β oxidation och/eller införlivande i andra lipidgrupper, såsom fosfolipider28.
- Tvätta försiktigt cellerna med 1x PBS vid rumstemperatur.
- Skörda och lysera cellerna med 500 μL etylendiamintetraättiksyra (EDTA)-fri modifierad radioimmunoprecipitationsanalys (RIPA) buffert (0,1% SDS, 50 mM N-2-hydroxietylpiperazin-N-etansulfonsyra (HEPES) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% icke-denaturerande tvättmedel, 0,5% natriumdeoxikolat, 2 mM MgCl2 med nyligen tillsatt 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) och 10 μg/μL Pepstatin A (eller EDTA-fri komplett proteashämmarcocktail)) genom att gunga lysaterna i 15 minuter vid 4 °C.
- Centrifugera lysaterna vid 16 000 x g i 10 min vid 4 °C.
- Samla supernatanten i 1,7 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 °C tills den är redo att fortsätta med klickreaktionen.
OBS: Protokollet kan pausas här. Lysater är stabila vid -20 °C i upp till 1 månad. Det rekommenderas dock att fortsätta med klickreaktionen i tid.
- Kvantifiera proteinkoncentrationerna med hjälp av en lämplig analys enligt tillverkarens protokoll, såsom en tvättmedelskompatibel (DC) analys.
3. Klicka på reaktion på celllysat
- Förbered reagenserna för klickkemi.
- Lös upp tris-(bensyltriazolylmetyl)amin (TBTA) i DMSO till 2 mM. Förvara i små alikvoter med torkmedel vid -20 °C i upp till 2-3 månader. Lagras bäst under N2 eller Ar.
- Lös upp CuSO4 i ddH2O-vatten för att uppnå 50 mM. Förvara vid rumstemperatur i upp till 2 månader.
- Lös triskarboxyetylfosfin (TCEP) i ddH2O-vatten till 250 mM. Förvara i mörker vid 4 °C och gör färska 50 mM utspädningar strax före klickreaktionen.
- Förbered 2 mM azid i DMSO. Förvara i små alikvoter med torkmedel vid -20 °C i upp till 6 månader. Lagras bäst under N2 eller Ar.
OBS: Det observerades att produkterna med tre eller flera polyetylenglykolgrupper fungerade bäst med biotin.
- Ta 50-100 μg proteinlysat i 1,7 ml mikrocentrifugrör till samma volym med samma lysbuffert som ovan.
OBS: Håll reaktionsvolymen så liten som möjligt (20-100 μL).- Tillsätt natriumdodecylsulfat (SDS) till varje prov för att uppnå en slutlig koncentration på 1%.
- Förbered en huvudblandning av klickreagens så att de slutliga koncentrationerna efter tillsats till lysaterna är: 100 μM TBTA (2 mM lager), 1 mM CuSO4, (50 mM lager) 1 mM TCEP (50 mM lager) och 100 μM azidsond (2 mM lager). Kombinera lagerlösningar i enlighet med detta (se tabell 2).
OBS: Beställningen är viktig. Blanda helt efter tillsats av varje komponent. - Tillsätt lämpliga volymer av masterblandningen i lysaterna. Blanda genom att pipettera upp och ner.
- Inkubera i 30 min i mörkret i ett 37 ° C vattenbad. Agitera/blanda ibland.
| Total reaktion vol (μL) | Vol. protein (μL) | Volym TBTA (2 mM) (μL) | Vol. CuSO4 (50 mM) (μL) | Vol. TCEP (50 mM) (μL) | Vol. azido sond (2 mM) (μL) |
| 50 | 43 | 2.5 | 1 | 1 | 2.5 |
| 100 | 86 | 5 | 2 | 2 | 5 |
Tabell 2: Klicka på reagens- och proteinvolymförhållanden. Experimentella volymer av klickkemireagenserna och motsvarande lagerkoncentrationer, förutom volymerna av proteinprover.
4. Klicka på reaktion på immunutfällda proteiner
- Alternativt är det möjligt att utföra klickreaktionen på immunutfällda (IP) proteiner på eller utanför pärlorna.
OBS: Vanligtvis leder klick av pärlorna till minst bakgrund och är bäst när man testar nya proteiner av intresse.- Transfektceller för det protein som är av intresse, i detta fall vildtyp myristoylerat C-terminalt huntingtin (HTT) smält till GFP (myr-ctHTT-GFP) och ctHTT-GFP med en G2A-substitution, med användning av kalciumfosfat-DNA-samfällning, som tidigare beskrivits41.
- Platta 2,5 x 105 celler/brunn i 6-brunns vävnadsodlingsplattor och växa över natten till ~70-80% sammanflöde.
- Förbered DNA-blandningen genom att tillsätta 2,5 μg DNA i 10 μL med 99,75 μL molekylär kvalitet H2O till ett 1,7 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt sedan 15,25 μL CaCl2 droppvis till DNA-blandningen.
- Tillsätt DNA/CaCl2-blandningen i ett separat rör innehållande 125 μL 2x HEPES-buffrad saltlösning (HBS, pH 7.0) på ett droppvis sätt vid blandning.
- Tillsätt långsamt DNA / CaCl2 / HBS-blandningen till cellerna. Efter 2-4 timmar, byt ut media och inkubera över natten. Fortsätt med märkningen från steg 1.3–2.8.
- Förbered lika stora volymer 500 μg protein i lysbuffert.
- Utför IP genom att inkubera med kanin anti-GFP för ctHTT-GFP som roterar över natten vid 4 ° C.
- Tillsätt 15-20 μL protein G-pärlor före jämvikt med lysbuffert till varje rör och låt det reagera end-over-end vid 4 ° C i 3 timmar.
- Tvätta pärlorna med lysbuffert och återsuspendera i 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES-buffert.
- Värm pärlorna vid 80 ° C i 15 minuter och invertera rören eller agitera ungefär var 5: e minut. Snurra rören en kort stund och återgå till 80 °C.
- Samla supernatanten som innehåller proteinerna medan proverna fortfarande är varma.
OBS: Protokollet kan pausas här och de immunutfällda proverna kan lagras vid -20 ° C eller -80 ° C, om de inte används för klickkemi direkt. - Låt 43 μL av supernatanten reagera med 7 μL masterblandning av klickreagens.
- Fortsätt med reaktionen enligt steg 3.2.3.
- Transfektceller för det protein som är av intresse, i detta fall vildtyp myristoylerat C-terminalt huntingtin (HTT) smält till GFP (myr-ctHTT-GFP) och ctHTT-GFP med en G2A-substitution, med användning av kalciumfosfat-DNA-samfällning, som tidigare beskrivits41.
5. SDS-PAGE och western blotting
- Stoppa reaktionen och denaturen genom att tillsätta 1x provladdningsbuffert innehållande 25 mM ditiotreitol (DTT) och värm vid 95 °C i 5 minuter.
OBS: Upp till 100 mM DTT kan användas28. Använd inte β-merkaptoetanol med S-acylerade proteiner eftersom det kan hydrolysera tioesterbindningarna och ta bort den klickade fettsyraanalogen. - Snurra kort ner proverna.
- Separera proteinerna med SDS-PAGE på en polyakrylamidgel, i dubbletter.
OBS: Två geler krävs för alkalisk behandling med KOH för att bekräfta närvaron av tioesterbindningar. Vid användning av en fluorescerandeazidsond kan acylation detekteras i gel eller efter överföring med användning av den angivna excitationskanalen. - Överför till polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) (aktiverad i metanol och sköljd i ddH2O - 5 min vardera) med halvtorr överföringsapparat vid 25 V, 1,0 A (konstant) i 30 min.
- Efter att ha sköljt membranen en kort stund med ddH2O, blötlägg det ena replikatmembranet i 0,1 M KOH i metanol/vatten (9:1 v/v) och det andra i 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 i metanol/vatten (9:1 v/v) som en icke-alkalisk kontroll i 60 min vid rumstemperatur med mild gungning.
- Skölj membranen kort i ddH2O-vatten, följt av 6 gånger 5 minuters tvättar i PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20).
OBS: Tvätta noggrant. - Blockera membranen över natten i 5% skummjölksblockerande buffert (1x PBS, 0,1% Tween20).
6. Utför western blot
- Där det anges, sond med fluorescerande märkt Streptavidin (1: 5000) och laddningskontroll, anti-GAPDH rodamin (1: 5000) i 5% BSA-blockerande buffert (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) vid rumstemperatur i 45-60 min med mild gungning, i mörker.
- Undersök det immunutfällda proteinet först med primär anti-GFP-antikropp i 5% skummjölksblockerande buffert, sedan med lämpliga sekundära antikroppar i 5% BSA som i steg 6.1.
- Tvätta membranen i 5 min i PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) totalt fyra repetitioner och skölj med ddH2O-vatten före avbildning.
Representative Results
Skillnaden i märkningseffektivitet mellan förtvålade och icke-förtvålade (icke-sap) alkynylfettsyror för klickkemidetektering kan visualiseras och jämföras med signalintensiteten hos fettacylerade proteiner genom western blot (Figur 1). En märkbar effekt observerades med ökande längd av acylkedjorna. I celler märkta med alkynylstearat (alk-stear) ökade förtvålning av fettsyran och leverans med BSA för metabolisk märkning drastiskt detekteringen av S-acylerad proteinsignal genom klickkemi och detektion av en fluorescerande azidosond (Figur 1, höger), vilket tyder på en övergripande ökning av cellulär införlivande av alkynylfettsyraetiketten. Omvänt observerades ingen märkbar skillnad i celler behandlade med den kortaste och mest lösliga fettsyran, alkynyl-myristat (alk-myr; 13-tetradecynosyra eller 13-TDYA). Celler märkta med alkynylpalmitat (figur 1, mitten) visade en mellanliggande ökning av etiketten jämfört med alkynyl-myristat (13-TDYA), men mindre än alkynylstearat.
Viktigt är att behandling av PVDF-membran med 0,1 M KOH i stor utsträckning avlägsnade fettsyraetiketterna från celler inkuberade med alkynylpalmitat och alkynylstearat, vilket bekräftade att majoriteten av signalen var genom en ester- eller tioesterbindning (Figur 1, mitten och höger, bottenpaneler). Som förväntat var införlivandet av alkynyl-myristat mestadels alkalibeständigt (figur 1, vänster, bottenpaneler) på grund av bindningen av myristat till proteiner genom en amidbindning.
Figur 2 visar mångsidigheten och känsligheten hos klickkemi för att detektera fettacylation av immunutfällda proteiner. HEK293T-celler transfekterades med myristoylerat C-terminalt huntingtin (HTT) smält till GFP (myr-ctHTT-GFP) och märktes med alkynyl-myristat, som tidigare beskrivits18. Efter immunutfällning frigjordes ctHTT-GFP från pärlorna och utsattes för klickkemi tillsammans med lysaterna. Inte bara detekterades myristoylering av vildtyp (WT) myr-ctHTT-GFP i immunutfällarna, men det detekterades starkt i lysaterna, medan G2A-mutationen helt blockerade myristoylering av ctHTT-GFP (Figur 2).
Figur 1: Detektion av fettacylerade proteiner med hjälp av klickkemi. HEK293T-celler inkuberades med de angivna fettsyrorna direkt (icke-sap) eller efter förtvålning (sap) och inkubation med bärarproteinet BSA, enligt beskrivningen i protokoll 2.1-2.7. Alkynylfettsyror kopplades till fluorescerande azid genom att utsätta 100 μg proteinlysater för klickkemi, åtskilda av SDS-PAGE och överförda till PVDF-membran. Efter behandling med 0,1 M Tris pH 7,0 eller 0,1 M KOH, för att vända tioesterbindningar, detekterades fettacylation med användning av en fluorescerande azid. GAPDH användes som lastkontroll; anti-GAPDH rhodamine (1:5,000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Detektion av N-myristoylerad ctHTT-GFP med klickkemi. HEK293T-celler transfekterades med C-terminalt trunkerad (ct) och myristoylatabel form av HTT (myr-ctHTT-GFP) och märktes med alkynyl-myristat. En icke-myristoylatabel form med det essentiella glycinet ersatt med en alanin inkluderades (G2A). Efter skörd och lys immunutfälldes ctHTT-GFP med användning av getanti-GFP. Lysater utsattes för klickkemireaktion (vänster) samt immunutfällningar efter frisättning från pärlorna. Myristoylering detekterades med Streptavidin Alexa 680 (SA680). GFP detekterades med användning av kanin anti-GFP i kombination med anti-kanin Alexa 488. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Arbetsflödesschema för experimentellt protokoll. Arbetsflödesöversikt över de viktigaste experimentella stegen i protokollet. Flera punkter noteras där protokollet kan pausas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Direkt tillsats av fettsyror till celler i odling kan resultera i olöslighet, utfällning av lipider och licotoxicitet40. Följaktligen kan tillsats av fettsyror direkt till celler inte bara resultera i dåligt cellulärt upptag och låg tillgänglighet av fettsyraetiketten, utan också ett minskat antal livskraftiga celler för nedströms analys, liksom aktivering av off-target-vägar. Många metaboliska märkningsprotokoll för klickkemidetektering involverar emellertid direkt tillsats av fettsyror och ett stort antal palmitoylproteomstudier med klickkemidetektering hittills förtvålning av fettsyrorna eller inkuberar dem med BSA8,36. Det är viktigt att överväga det faktum att effektiviteten och känsligheten hos klickkemidetektering av fettacylerade proteiner är beroende av tillräckligt cellulärt upptag av fettsyraanalogerna. Därför är det rimligt att spekulera i att många S-acylerade proteiner kan ha undgått detektion i proteomiska studier på grund av en låg tillgänglighet av fettsyraetiketterna från dålig inkorporering i cellerna, särskilt när den längre kedjefettsyran 17-ODYA användes. 17-ODYA, eller alkynylstearat, har varit den allmänt använda etiketten för flera studier på grund av dess kommersiella tillgänglighet och dess tidiga användning8,36. Resultaten av detta protokoll visar emellertid att förtvålning av 17-ODYA resulterar i den största ökningen av detektionen av S-acylerade proteiner, jämfört med kortkedjiga fettsyror såsom palmitat eller myristat. Därför kan upprepning av dessa experiment med förtvålade etiketter ge ytterligare substrat för S-acylation som tidigare kan ha förbisetts. Vidare, medan de flesta palmitoylacyltransferaser föredrar palmitat för S-acylering, har vissa preferenser för andra längder av fettsyror såsom stearat15,38,44. Dessutom föredrar vissa proteiner eller till och med specifika platser inom proteiner en fettsyra framför en annan15,45. Därför kan studier som använder 17-ODYA ha en bias mot proteiner S-acylerade med stearat, inte palmitat, samtidigt som de underrepre representerar dessa proteiner på grund av lägre detektion.
Den förbättrade metaboliska märkningseffektiviteten för klickkemi är beroende av förtvålning av lipider och inkubation med FAFBSA-steg, liksom den avgränsade FBS. Alla fettsyror måste vara fullständigt förtvålade i KOH utan synliga fasta ämnen kvar innan inkubation med FAFBSA fortsätter. Detta kan vara ett svårt steg och tidpunkten är avgörande. Efter att de förtvålade fettsyrorna har gått i lösning vid 65 ° C, tillsätt varmt BSA omedelbart eftersom ytterligare uppvärmning kommer att orsaka avdunstning av DMSO från fettsyrorna. Dessutom börjar den förtvålade etiketten stelna igen så snart den börjar svalna. Därför måste FAFBSA vara varm och tillsättas snabbt efter att saltet har blivit lösligt. Glasreaktionsflaskorna och deras form är viktiga för detta steg. De tillåter den förtvålade lipiden att vara tillräckligt varm för att förbli löslig, medan den är tillräckligt sval för att säkerställa att FAFBSA inte kongeal. Tillräcklig blandning via pipettering är också viktigt i detta steg för att säkerställa en homogen lösning för märkning.
Reagenserna för klickkemi måste förvaras på rätt sätt, vanligtvis med torkmedel eller under N2 - eller Ar-gas vid -20 °C till -80 °C. Brist på acylationssignal eller svag signal kan bero på instabila reagenser, särskilt äldre TBTA- och azidlagerlösningar. Dessutom måste man vara försiktig med fluorescerande azidlagerlösningar, som måste skyddas från ljus så mycket som möjligt. Dessutom kan variabler som metod för lipidbrist och märkningstid behöva testas för att bestämma de optimala förhållandena beroende på vilken typ av cell som används. Till exempel kan neuronala celler behöva längre märkningstider eftersom medieförändringar och lipidbrist är svåra (opublicerade).
Fördelen med detta protokoll är mest dramatisk när den används för långkedjiga fettsyror. För kortare kedjor blir ökningen av signalintensiteten mindre dramatisk, men är fortfarande sannolikt skyddande för cellerna. Medan de föreslagna modifieringarna kommer att förbättra proteinacylationsdetekteringen i allmänhet, anses klickkemi fortfarande vara en lipidcentrerad metod1 som är begränsad till detektion av dynamiskt, inte stabilt S-acylerade proteiner1. Andra begränsningar att beakta är kravet på fettsyrabrist för att främja märkning och dess relativt begränsade antal kompatibla celltyper jämfört med detektionen av acyl-biotinutbyte (ABE) av S-acylation16. Trots dessa begränsningar är klickkemidetektering snabbare än de flesta acylutbytesanalyser och är bättre lämpad för detektion av proteiner som inte tolererar de upprepade proteinutfällningsstegen som krävs för acylutbytesanalyser. Dessutom kan denna metod kombineras med samtidig märkning med hjälp av andra klickanalyser som pulsjaktanalys38.
Användningen av denna modifiering för metabolisk märkning för klickkemi ökade den totala detekteringen av acylerade proteiner, särskilt S-acylerade, med en mängd proteomiska tekniker som används i samband med klickkemi. Som framgår kan fluorogen detektion användas som ett alternativ till biotin (figur 1)28. Detta är särskilt användbart eftersom det inte finns några endogent fluorescerande proteiner i celllysaterna. Dessutom kan fluoroforer som endast aktiveras efter klickkemi användas46. Den förtvålade och FAFBSA-bundna fettsyran för klickkemimärkning kan hjälpa till med svårigheter att upptäcka proteiner av intresse på grund av en övergripande ökning av mängden etikett som finns tillgänglig i cellen och genom att begränsa toxiska effekter av att tillsätta fettsyror direkt till media. Det kan också användas tillsammans med masspektrometri27 för att öka detektionen av proteiner med låg förekomst, särskilt tillsammans med den senaste tidens framsteg med hjälp av maskininlärningsalgoritmer som förhindrar redundanta mätningar för att öka känsligheten för proteiner med låg överflöd, i motsats till befintligt databeroende förvärv som gynnar detektion av de vanligaste proteinerna47 . Dessutom kan klickkemi kombineras med stabil isotopmärkning med aminosyror i cellodling (SILAC) och pulsjaktmetoder för att producera kvantifierbara data om dynamiskt protein S-acylation27. Slutligen har Hannoush-gruppen kombinerat klickkemi med närhetsligeringsanalys (PLA) för att möjliggöra encellsvisualisering och undersökningar av subcellulär fördelning av palmitoylerade proteiner43,48.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Science and Engineering Research Council (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao finansierades av The Ram and Lekha Tumkur Memorial Scholarship genom Biologiska institutionen vid University of Waterloo och Lucy Morrison Memorial Bursary genom IODE Ontario, förutom forskarforskningsfinansieringen från University of Waterloo som omfattar Graduate Research Studentship (50503-11072), Science Graduate Award och Graduate Teaching Assistantship. Författarna vill tacka alla medlemmar i Martin-laboratoriet för deras stöd i att förbereda detta manuskript, särskilt Stephanie Ryall, Harleen Gill och Sadia Khan som hjälpte till att initialt inrätta Martin Lab som förberedelse för dessa studier. Författarna vill också tacka Dr. Luc Berthiaume för den vänliga gåvan av ctHTT-GFP-konstruktionerna och Dr Shaun Sanders för kritisk input i utarbetandet av manuskriptet. Figur 3 skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) | Click Chemistry Tools | 1164 | |
| 15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) | Click Chemistry Tools | 1165 | |
| 17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) | Cayman Chemical Company | 90270 | |
| 30% acrylamide/bis solution 29:1 | Biorad | 1610156 | |
| 96-well plate reader | Biorad | N/A | |
| AFDye 647 azide plus | Click Chemistry Tools | 1482 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 1610700 | |
| Anti-GAPDH hFAB Rhodamine | Biorad | 12004167 | |
| Anti-rabbit Alexa 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-Tubulin hFAB Rhodamine | Biorad | 12004166 | |
| Biotin Azide | Click Chemistry Tools | 1265 | |
| Bis-tris, ultrapure | VWR | 715 | |
| Calcium chloride | J.T. Baker | 1332-1 | |
| Centrifuge 16,000xg, 4°C | Thermo Scientific | N/A | |
| Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) | Life Technologies | A3382101 | |
| ChemiDoc Imager | Biorad | N/A | |
| Copper sulfate (1 mM) | VWR | BDH9312 | |
| Deoxycholic acid sodium salt monohydrate | MP Biomedicals | 102906 | |
| Detergent compatible (DC) assay | Biorad | N/A | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR | 0231-500 mL | |
| DMEM, 1x | Wisent Inc | 319015CL | |
| Ethanol, anhydrous | N/A | N/A | |
| Fatty Acid Free BSA | MP Biomedicals | 219989950 | |
| Fast Blot Turbo Semi-dry transfer | Biorad | N/A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483-020 | |
| FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane | Pall Life Sciences | BSP0161 | |
| HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid | VWR | 5011 | |
| Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 | VWR | N/A | |
| Igepal CA-630 | Alfa Aesar | J61055 | |
| Image Lab Software | Biorad | N/A | |
| L-glutamine supplement solution | Wisent Inc | 609-065-EL | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Methanol | VWR | BDH1135 | |
| Myristic Acid (25 mM) | VWR | M0476-25G | |
| Palmitic acid (100 mM) | VWR | P0002-25G | |
| Penicillin-Streptomycin, 10x | Wisent Inc | 450201EL | |
| Pepstatin A (synthetic) | Enzo Life Sciences | ALX-260-085-M005 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Enzo Life Sciences | ALX-270-184-G005 | |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | VWR | 75801-000 | |
| Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) | Eusera | EU4 | |
| FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane | Pall Life Sciences | BSP0161 | |
| Potassium hydroxide | Ward's Science | 470302-100 | |
| Rabbit polyclonal antibody to GFP | Eusera | EU1 | |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Sodium pyruvate | Wisent Inc | 600-110-EL | |
| Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate | Thermo Fisher Scientific | S21378 | |
| Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) | Soltec Ventures | M115 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypsin/EDTA | Wisent Inc | 325-043-CL | |
| Tween 20 Reagent Grade 1L | VWR | 97062-332 | |
| WHEATON NextGen V Vials 3 mL | VWR | 89085-424 |
References
- Zaballa, M. E., vander Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 1-31 (2018).
- Martin, D. D. O., Beauchamp, E., Berthiaume, L. G. Post-translational myristoylation: Fat matters in cellular life and death. Biochimie. 93 (1), 18-31 (2011).
- Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
- O'Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. The Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
- Liang, X., et al. Heterogeneous fatty acylation of Src family kinases with polyunsaturated fatty acids regulates raft localization and signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 276 (33), 30987-30994 (2001).
- Thinon, E., Percher, A., Hang, H. C. Bioorthogonal chemical reporters for monitoring unsaturated fatty-acylated proteins. ChemBioChem. 17 (19), 1800-1803 (2016).
- Veit, M., Reverey, H., Schmidt, M. F. G. Cytoplasmic tail length influences fatty acid selection for acylation of viral glycoproteins. Biochemical Journal. 318 (1), 163-172 (1996).
- Sanders, S. S., et al. Curation of the mammalian palmitoylome indicates a pivotal role for palmitoylation in diseases and disorders of the nervous system and cancers. PLOS Computational Biology. 11 (8), 1004405 (2015).
- Hannoush, R. N.
- Martin, D. D. O., Hayden, M. R. Post-translational myristoylation at the cross roads of cell death, autophagy and neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 43 (2), 229-234 (2015).
- Young, F. B., Butland, S. L., Sanders, S. S., Sutton, L. M., Hayden, M. R. Putting proteins in their place: Palmitoylation in Huntington disease and other neuropsychiatric diseases. Progress in Neurobiology. 97 (2), 220-238 (2012).
- Hansen, A. L., Mukai, K., Schopfer, F. J., Taguchi, T., Holm, C. K. Sting palmitoylation as a therapeutic target. Cellular & Molecular Immunology. 16 (3), 236-241 (2019).
- Veit, M.
- Jiang, H., et al. Protein lipidation: Occurrence, mechanisms, biological functions, and enabling technologies. Chemical Reviews. 118 (3), 919-988 (2018).
- Greaves, J., et al. Molecular basis of fatty acid selectivity in the zDHHC family of S-acyltransferases revealed by click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (8), 1365-1374 (2017).
- Gao, X., Hannoush, R. N. A decade of click chemistry in protein palmitoylation: Impact on discovery and new biology. Cell Chemical Biology. 25 (3), 236-246 (2018).
- Tsutsumi, R., Fukata, Y., Fukata, M.
- Roth, A. F., Feng, Y., Chen, L., Davis, N. G. The yeast DHHC cysteine-rich domain protein Akr1p is a palmitoyl transferase. The Journal of Cell Biology. 159 (1), 23-28 (2002).
- Lobo, S., Greentree, W. K., Linder, M. E., Deschenes, R. J. Identification of a Ras Palmitoyltransferase in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41268-41273 (2002).
- Ohno, Y., Kihara, A., Sano, T., Igarashi, Y. Intracellular localization and tissue-specific distribution of human and yeast DHHC cysteine-rich domain-containing proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1761 (4), 474-483 (2006).
- Huang, K., et al. Huntingtin-interacting protein HIP14 Is a palmitoyl transferase involved in palmitoylation and trafficking of multiple neuronal proteins. Neuron. 44 (6), 977-986 (2004).
- Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. BioTechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
- Roth, A. F., Wan, J., Green, W. N., Yates, J. R., Davis, N. G.
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2 (7), 1573-1584 (2007).
- Martin, D. D. O., et al. Rapid detection, discovery, and identification of post-translationally myristoylated proteins during apoptosis using a bio-orthogonal azidomyristate analog. The FASEB Journal. 22 (3), 797-806 (2007).
- Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. The FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
- Martin, B. R., Wang, C., Adibekian, A., Tully, S. E., Cravatt, B. F.
- Yap, M. C., et al. Rapid and selective detection of fatty acylated proteins using ω-alkynyl-fatty acids and click chemistry. Journal of Lipid Research. 51 (6), 1566-1580 (2010).
- Hang, H. C., Wilson, J. P., Charron, G. Bioorthogonal chemical reporters for analyzing protein lipidation and lipid trafficking. Accounts of Chemical Research. 44 (9), 699-708 (2011).
- Thinon, E., et al. Global profiling of co- and post-translationally N-myristoylated proteomes in human cells. Nature Communications. 5 (1), 4919 (2014).
- Charron, G., Wilson, J., Hang, H. C. Chemical tools for understanding protein lipidation in eukaryotes. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (4), 382-391 (2009).
- Hang, H. C., et al. Chemical probes for the rapid detection of fatty-acylated proteins in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 129 (10), 2744-2745 (2007).
- Heal, W. P., et al. Site-specific N-terminal labelling of proteins in vitro and in vivo using N-myristoyl transferase and bioorthogonal ligation chemistry. Chemical Communications. 0 (4), 480-482 (2007).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (ABE). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e50031 (2013).
- Blanc, M., et al.
- Heal, W. P., Wickramasinghe, S. R., Leatherbarrow, R. J., Tate, E. W. N -Myristoyl transferase-mediated protein labelling in vivo. Organic & Biomolecular Chemistry. 6 (13), 2308-2315 (2008).
- Lin, D. T. S., Conibear, E. ABHD17 proteins are novel protein depalmitoylases that regulate N-Ras palmitate turnover and subcellular localization. eLife. 4, 11306 (2015).
- Charron, G., et al. Robust fluorescent detection of protein fatty-acylation with chemical reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
- Alsabeeh, N., Chausse, B., Kakimoto, P. A., Kowaltowski, A. J., Shirihai, O. Cell culture models of fatty acid overload: Problems and solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (2), 143-151 (2018).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
- Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6 (2), 135-138 (2009).
- Gao, X., Hannoush, R. N. Single-cell in situ imaging of palmitoylation in fatty-acylated proteins. Nature Protocols. 9 (11), 2607-2623 (2014).
- Muszbek, L., Haramura, G., Cluette-Brown, J. E., Cott, E. M. V., Laposata, M. The pool of fatty acids covalently bound to platelet proteins by thioester linkages can be altered by exogenously supplied fatty acids. Lipids. 34, 331-337 (1999).
- Brett, K., et al. Site-specific S-Acylation of influenza virus hemagglutinin. The location of the acylation site relative to the membrane border is the decisive factor for attachment of stearate. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34978-34989 (2014).
- Shieh, P., et al. CalFluors: A universal motif for fluorogenic azide probes across the visible spectrum. Journal of the American Chemical Society. 137 (22), 7145-7151 (2015).
- Pelletier, A. R., et al. MealTime-MS: A machine learning-guided real-time mass spectrometry analysis for protein identification and efficient dynamic exclusion. bioRxiv. , 110726 (2020).
- Gao, X., Hannoush, R. N. Method for cellular imaging of palmitoylated proteins with clickable probes and proximity ligation applied to Hedgehog, tubulin, and Ras. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4544-4550 (2014).
