Summary
يفصل هذا البروتوكول التحقيق في التفاعلات المبكرة بين الخلايا الظهارية الأنفية المصابة بالفيروس وتنشيط الخلايا الفطرية. يمكن تمييز المجموعات الفرعية الفردية من الخلايا المناعية بناء على تنشيطها استجابة للعدوى الفيروسية. ويمكن بعد ذلك إجراء مزيد من التحقيقات لتحديد آثارها على الاستجابات المبكرة المضادة للفيروسات.
Abstract
لا تزال التفاعلات المبكرة بين الطبقة الظهارية الأنفية والخلايا المناعية الفطرية أثناء الالتهابات الفيروسية منطقة غير مستكشفة. زادت أهمية إشارات المناعة الفطرية في الالتهابات الفيروسية بشكل كبير حيث أظهر المرضى الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي الذين يظهرون تنشيطا فطريا عاليا للخلايا التائية نتيجة أفضل للمرض. وبالتالي ، فإن تشريح هذه التفاعلات المناعية الفطرية المبكرة يسمح بتوضيح العمليات التي تحكمها وقد يسهل تطوير أهداف واستراتيجيات علاجية محتملة لتثبيط أو حتى منع التقدم المبكر للعدوى الفيروسية. يفصل هذا البروتوكول نموذجا متعدد الاستخدامات يمكن استخدامه لدراسة الأحاديث المتقاطعة المبكرة والتفاعلات وتنشيط الخلايا المناعية الفطرية من العوامل التي تفرزها الخلايا الظهارية المصابة بمجرى الهواء الفيروسي. باستخدام فيروس الأنفلونزا H3N2 (A/Aichi/2/1968) كنموذج فيروسي تمثيلي، تم تحليل التنشيط الفطري للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي المستزرع (PBMCs) باستخدام قياس التدفق الخلوي للتحقيق في المجموعات الفرعية للخلايا التي يتم تنشيطها بواسطة العوامل القابلة للذوبان التي يتم إطلاقها من الظهارة استجابة للعدوى الفيروسية. وتظهر النتائج استراتيجية البوابات للتمييز بين المجموعات الفرعية للخلايا وتكشف عن الاختلافات الواضحة بين المجموعات المنشطة من PBMCs وحديثها المتبادل مع الظهارة الضابطة والمصابة. يمكن بعد ذلك تحليل المجموعات الفرعية المنشطة لتحديد وظائفها وكذلك التغيرات الجزيئية الخاصة بالخلايا. قد تكشف النتائج المستخلصة من مثل هذا التحقيق المتبادل عن عوامل مهمة لتنشيط مجموعات الخلايا الفطرية الحيوية ، والتي تكون مفيدة في السيطرة على تطور العدوى الفيروسية وقمعها. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه العوامل عالميا على الأمراض الفيروسية المختلفة، وخاصة على الفيروسات الناشئة حديثا، لتخفيف تأثير هذه الفيروسات عندما تنتشر لأول مرة في مجموعات بشرية ساذجة.
Introduction
ربما تكون فيروسات الجهاز التنفسي من بين مسببات الأمراض الأكثر انتشارا التي تسبب الرعاية الصحية الشديدة والعبء الاقتصادي. وتشكل الفيروسات، بدءا من الفاشيات العالمية الدورية للسلالات الوبائية الناشئة (مثل H1N1 وH5N1 وH3N2 وMERS وCOVID-19) إلى السلالات الموسمية للإنفلونزا كل عام، تشكل الفيروسات تهديدا مستمرا للصحة العمومية. وعلى الرغم من أن اللقاحات تشكل الجزء الأكبر من الاستجابة لهذه التحديات العالمية في مجال الصحة العامة، فمن الواقعي أن نلاحظ أن هذه التدابير المضادة تستجيب فقطبنسبة 1,2. وعلاوة على ذلك، فإن التأخير بين ظهور سلالة معدية جديدة والتطوير الناجح للقاحها أمر لا مفر منه3، مما يؤدي إلى فترة تكون فيها التدابير المتاحة للحد من انتشار الفيروس محدودة للغاية.
ومما يزيد من تأكيد هذه التأخيرات التكاليف التي تلحق بالمجتمع اقتصاديا واجتماعيا. الإنفلونزا الموسمية وحدها مسؤولة عن ما يقرب من 8 مليارات دولار من التكاليف غير المباشرة ، و 3.2 مليار دولار من التكاليف الطبية ، و 36.3 ألف حالة وفاة في الولايات المتحدة الأمريكية سنويا4. هذا قبل النظر في تكاليف البحث اللازمة لتمويل تطوير اللقاحات. وللفاشيات الوبائية آثار أشد حدة على المجتمع، يضاعفها تزايد معدل العولمة كل عام، كما يتضح من الاضطرابات العالمية الناجمة عن ظهور الفيروس التاجي 2 (SARS-CoV-2) (SARS-CoV-2) وانتشاره السريع.
أظهرت الدراسات الحديثة أن المرضى المصابين الذين لديهم عدد أكبر من الخلايا التائية الفطرية المنشطة يميلون إلى الحصول على نتيجة أفضل للمرض 8,9,10. علاوة على ذلك ، يتم تصنيف مجموعة الخلايا التائية الفطرية إلى مجموعات فرعية متعددة: الخلايا التائية الثابتة المرتبطة بالغشاء المخاطي (MAIT) ، والخلايا التائية Vδ1 γδ ، والخلايا التائية Vδ2 γδ ، والخلايا التائية القاتلة الطبيعية (NKT). تظهر هذه المجموعات الفرعية من الخلايا التائية الفطرية أيضا عدم تجانس داخل سكانها ، مما يزيد من تعقيد التفاعلات بين مجموعات الخلايا المشاركة في الاستجابة المناعية الفطرية11. وبالتالي ، فإن الآلية التي تنشط هذه الخلايا التائية الفطرية ومعرفة المجموعات الفرعية المحددة من الخلايا التائية الفطرية قد توفر وسيلة مختلفة للبحث للحد من الآثار المعدية لهذه الفيروسات على المضيف البشري ، خاصة خلال فترة تطوير اللقاح.
تنتج الخلايا الظهارية المصابة بالإنفلونزا عوامل تنشط الخلايا التائية الفطرية بسرعة12،13،14. وبناء على هذه النتيجة، يهدف نموذج الاستزراع المشترك للواجهة السائلة الهوائية (ALI) الخالي من التلامس إلى محاكاة التفاعلات الكيميائية المبكرة (التي تتوسطها العوامل القابلة للذوبان التي تطلقها الطبقة الظهارية المصابة) بين الطبقة الظهارية الأنفية المصابة و PBMCs أثناء العدوى المبكرة. إن الفصل المادي بين الطبقة الظهارية الأنفية (المستزرعة على إدخالات الغشاء) و PBMCs (في الغرفة الموجودة تحتها) والسلامة الظهارية يمنع العدوى المباشرة ل PBMCs بواسطة الفيروس ، مما يسمح بإجراء دراسة مفصلة لآثار العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الظهارة على PBMCs. وبالتالي يمكن إجراء مزيد من التحقيق في العوامل المحددة لإمكاناتها العلاجية في تحفيز مجموعة الخلايا التائية الفطرية المناسبة التي قد تحمي من عدوى الأنفلونزا. لذلك قامت هذه الورقة بتفصيل طرق إنشاء ثقافة مشتركة لدراسة تنشيط الخلايا التائية الفطرية من العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الظهارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: ارجع إلى الجدول 1 للاطلاع على وصفات الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول.
ملاحظة: تم العثور على hNECS المزروعة على 12 بئرا ترانسويل تنمو لتصبح سماكة أكثر مثالية للعوامل القابلة للذوبان للوصول إلى الغرفة القاعدية بسهولة عند الإصابة بفيروس الأنفلونزا. ومن ثم يوصى باستخدام 12 بئرا من الترانسويل للثقافة المشتركة.
1. إنشاء طبقة التغذية 3T3
- الإنشاء من المخزونات المجمدة
- إذابة بالتبريد من الخلايا الليفية NIH / 3T3 من المخزونات المجمدة. أضف محتويات التجميد إلى 2 مل من الوسائط الأساسية الدنيا الكاملة من Dulbecco (DMEM) وأعد تعليق الخلايا.
- جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم ودرجة حرارة / ضغط الغرفة (rtp) ، وقم بإزالة supernatant. أعد تعليق الخلايا في DMEM كامل.
- عد الخلايا باستخدام تلطيخ أزرق تريبان. أضف 10 ميكرولتر من التربان الأزرق إلى 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المعاد تعليقه. اخلطي جيدا ، وأضيفي 10 ميكرولتر من التعليق إلى مقياس الدم لحساب الخلايا.
- خلايا البذور بكثافة 1 × 104 خلايا / سم2 في طبق استزراع مناسب (على سبيل المثال ، قارورة T75). احتضان قارورة الثقافة الناتجة لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 .
- علاج ميتوميسين سي
- في 3 أيام ، تأكد من أن الالتقاء هو 60٪ -80٪ ، وإزالة الوسط ، وغسل الخلايا مع 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
ملاحظة: من المهم ألا تصل طبقة التغذية 3T3 إلى الالتقاء الكامل ؛ خلاف ذلك ، فإن علاج الميتومايسين C لن يكون فعالا. - أضف DMEM الكامل المكمل ب mitomycin C إلى القارورة ، واحتضنه لمدة 3.5 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 . قم بإزالة الوسط المحتوي على الميتوميسين C ، واغسل الخلايا 2x باستخدام 1x PBS.
- في 3 أيام ، تأكد من أن الالتقاء هو 60٪ -80٪ ، وإزالة الوسط ، وغسل الخلايا مع 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- بذر خلايا 3T3 في لوحات 6 آبار
- أضف 3 مل من 1x trypsin-EDTA إلى القارورة لمدة 3-5 دقائق لفصل الخلايا. اجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب جديد سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي أنبوب 15 مل لمدة 5 دقائق عند 300 × جم ، rtp ؛ تخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا في DMEM كامل.
- عد الخلايا باستخدام تلطيخ أزرق تريبان. زرع الخلايا في صفيحة من 6 آبار في 7.5 × 10 5-2.5 × 106 خلايا / بئر. احتضن اللوحة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2.
ملاحظة: تعتبر طبقة التغذية 3T3 جاهزة إذا كانت الخلايا سليمة. عند هذه النقطة، زرع الخلايا الجذعية/السلفية الظهارية الأنفية البشرية (hNESPCs) في طبقة التغذية للتوسع. - أضف DMEM الكامل إلى القارورة واحتضنه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها لخلايا 3T3 للتعافي من علاج الميتومايسين C.
2. إنشاء مزرعة الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (hNEC)
ملاحظة: يجب الحصول على عينات سريرية من المرضى الذين يخلون من أعراض عدوى الجهاز التنفسي العلوي.
- معالجة أنسجة الأنف في تعليق أحادي الخلية
- اغسل أنسجة الأنف في 1x Dulbecco's PBS (dPBS) (PBS بدون Mg 2+ و Ca2+) التي تحتوي على 100 ميكرولتر / مل من خليط مضاد حيوي مضاد للفطريات. قطع الأنسجة إلى شظايا صغيرة ، وعالج العينة في 10 ملغ / مل من البروتياز المحايد بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع الاهتزاز.
- جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم ، وإزالة السوبرنات بعد الطرد المركزي. احتضن الكريات في 1-2 مل من 1x trypsin-EDTA (37 درجة مئوية ، 15 دقيقة) ، وقم بإخمادها عن طريق إضافة حجم من مصل البقر الجنيني يساوي 10٪ من الحجم في الأنبوب.
- قم بفصل الأنسجة المهضومة ميكانيكيا إلى مجاميع أحادية الخلية عن طريق السحب ، ثم مرر التعليق الناتج من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. أعد تعليق الخلايا في DMEM كامل.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة، يكون تعليق الخلية عبارة عن مزيج من الخلايا المتمايزة نهائيا والخلايا الجذعية التي يشار إليها باسم الخلايا الجذعية/السلفية الظهارية الأنفية البشرية (hNESPCs). الهدف من الخطوات اللاحقة هو اختيار وإثراء سكان hNESPC من خليط من مجموعات الخلايا المختلفة.
- بذر تعليق أحادي الخلية على طبقة التغذية 3T3 لاختيار hNESPCs
- قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية من الخطوة 2.1.3 (300 × جم ، 5 دقائق ، rtp) ، وقم بإزالة السوبرنات. أعد تعليق الخلايا في 3-5 مل من 3 متوسطة.
ملاحظة: تمت صياغة Medium 3 لتعزيز النمو الانتقائي ل hNESPCs. - عد الخلايا عن طريق تلطيخ أزرق تريبان. البذور 1 × 10 6 خلايا في 2 مل متوسطة 3 لكل بئر على لوحة 6 بئر تحتوي على طبقة تغذية 3T3 محضرة بعد إزالة الوسائط في لوحة البئر6 . احتضان الزراعة المشتركة الناتجة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 .
ملاحظة: بعد البذر ، احرص على عدم تحريك اللوحة لأنها ستؤثر على مرفق hNESPCs. - تغيير الوسط 3 (2 مل) كل 2-4 أيام عن طريق إزالة الوسط القديم بالكامل واستبداله بوسط طازج 3.
ملاحظة: يتم تغيير الوسط لتجديد العناصر الغذائية ومنع الظروف الحمضية المفرطة من التأثير سلبا على نمو hNESPCs. يعتمد الفاصل الزمني بين كل تغيير في الوسط على مدى حمضية (صفراء) الوسط. يجب تقصير الفواصل الزمنية إذا تحول الوسط إلى حمضي بسرعة. - بعد 7-10 أيام ، لاحظ أن hNESPCs في التقاء مناسب لنقلها إلى إدخالات الغشاء. انظر الشكل 1 للاطلاع على المورفولوجيا التمثيلية ل hNESPCs في 3 نقاط زمنية مختلفة (2 أيام و 5 أيام و 10 أيام).
- قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية من الخطوة 2.1.3 (300 × جم ، 5 دقائق ، rtp) ، وقم بإزالة السوبرنات. أعد تعليق الخلايا في 3-5 مل من 3 متوسطة.
- نقل hNESPCs إلى إدخالات الغشاء
ملاحظة: بسبب علاج الميتومايسين C ، ستتحلل طبقة التغذية 3T3 ببطء خلال فترة توسع hNESPC. سيؤدي ذلك إلى ضعف الالتصاق بسطح البئر ، مما يسمح بإزاحتها عن طريق التنظيف باستخدام ماصة ، تاركة وراءها فقط hNESPCs الصحية.- قم بإزالة الوسط ، وأضف 500 ميكرولتر من 1x dPBS إلى كل بئر. اغسل الخلايا 3x باستخدام ماصة دقيقة لإزاحة خلايا 3T3 ، وتخلص من 1x dPBS. لاحظ تحت المجهر أن hNESPCs المستديرة تبقى بينما يتم إزاحة طبقة التغذية 3T3 على شكل مغزل.
- أضف 500 ميكرولتر من كاشف فصل الخلايا لكل بئر ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 5-10 دقائق ، أو حتى تنفصل hNESPCs عن سطح البئر.
- اجمع تعليق hNESPC ، جهاز طرد مركزي (300 × جم ، 5 دقائق ، rtp) ، وقم بإزالة السوبرناتان.
- أعد تعليق الكريات في الوسط 3. عد الخلايا عن طريق تلطيخ أزرق تريبان. البذور 3 × 104 خلايا في 150 ميكرولتر من المتوسط 3 لكل غشاء إدراج (لوحة 24 بئر) أو 1 × 105 خلايا في 300 ميكرولتر من المتوسط 3 لكل غشاء إدراج (لوحة 12 بئر) (الشكل 2). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 .
- تغيير الوسط (المتوسط 3) من الغرف القمية والقاعدية كل 2 أيام. تنقل طرف ماصة بين الأذرع الداعمة لإدراج الغشاء للوصول إلى الغرفة القاعدية ، وإزالة الوسط القديم ، ثم إعادة إدخال الوسط الطازج بنفس الطريقة. على الرغم من أن الغرفة القمية يمكن الوصول إليها بسهولة ، احرص على عدم إزعاج طبقة hNESPC المتنامية.
ملاحظة: لا تزعج الوسط في الغرفة القمية لمدة 2 أيام على الأقل بعد البذر لأن الخلايا تحتاج إلى وقت للالتصاق بالغشاء.
- تمايز hNESPCs إلى hNECs
- عندما تصل hNESPCs إلى التقاء بنسبة 100٪ (حوالي 3-7 أيام من البذر على إدراج الغشاء) ، ابدأ ثقافة ALI. قم بتغيير الوسط القاعدي إلى وسط التمايز ، وقم بإزالة الوسط من الغرفة القمي. أضف فقط الوسط إلى الغرفة القاعدية دون إضافته إلى الغرفة القمية عند تغيير الوسط كل 2-3 أيام ، كما هو موضح في الشكل 3 والخطوة 2.3.5 .
ملاحظة: يتم تغيير الوسط إلى وسيط التمايز لتعزيز تمايز hNESPCs إلى hNECs في ALI. تستغرق hNESPCs حوالي 3-4 أسابيع للوصول إلى مرحلة النضج الكامل لتصبح hNECs في ALI ، وعند هذه النقطة تكون الخلايا قد نمت لتصبح متعددة الطبقات مع مجموعات مختلفة من الخلايا في كل طبقة. يجب أيضا ملاحظة الأهداب عند تكبير 400x (يمكن تحديد الأهداب من خلال حركة ضربها ، مما يتسبب في ظهور حقل المجهر وكأنه يهتز). في هذه المرحلة ، تكون الخلايا جاهزة للاستخدام في تجارب الزراعة المشتركة. ارجع إلى الشكل 4 للاطلاع على المقطع العرضي لطبقة hNEC متباينة تماما. - بعد الحصول على hNECs ناضجة ، اغسل الخلايا في الغرفة القمية 3x مع 1x dPBS على فترات 2-3 أيام لمدة أسبوع واحد قبل تجربة الزراعة المشتركة. قم بتآزر خطوة الغسيل مع التغييرات المتوسطة القاعدية ، وقم بإجراء عمليات الغسيل على النحو التالي.
- أضف 50 ميكرولتر (24 بئرا) / 150 ميكرولتر (12 بئرا) من 1x dPBS إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء ، واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة dPBS بعد 10 دقائق من الحضانة لإزالة المخاط المتراكم والخلايا الميتة على مدار التمايز.
ملاحظة: اعتمادا على طبيعة التجربة ، يمكن استخدام محلول بيكربونات الصوديوم لغسل طبقة المخاط بالكامل. ومع ذلك ، بالنسبة للعدوى الفيروسية في تجارب الزراعة المشتركة ، يتم الاحتفاظ بطبقة المخاط ، ويتم إزالة المخاط الزائد فقط باستخدام غسل dPBS. هذا الاحتفاظ هو محاكاة طبقة المخاط الفسيولوجية الموجودة على ظهارة الأنف التي ستتفاعل مع العدوى الفيروسية الواردة.
- أضف 50 ميكرولتر (24 بئرا) / 150 ميكرولتر (12 بئرا) من 1x dPBS إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء ، واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة dPBS بعد 10 دقائق من الحضانة لإزالة المخاط المتراكم والخلايا الميتة على مدار التمايز.
- عندما تصل hNESPCs إلى التقاء بنسبة 100٪ (حوالي 3-7 أيام من البذر على إدراج الغشاء) ، ابدأ ثقافة ALI. قم بتغيير الوسط القاعدي إلى وسط التمايز ، وقم بإزالة الوسط من الغرفة القمي. أضف فقط الوسط إلى الغرفة القاعدية دون إضافته إلى الغرفة القمية عند تغيير الوسط كل 2-3 أيام ، كما هو موضح في الشكل 3 والخطوة 2.3.5 .
3. قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER)
ملاحظة: تأكيد السلامة الظهارية مهم لضمان الحصول على طبقة ظهارية سليمة وصحية. يتم تحديد الطبقة الظهارية السليمة من خلال قياس TEER الذي يتم إجراؤه على 4 آبار عشوائية باستخدام مقياس الفولتوهمتر.
- شطف القطب الكهربائي بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وتعقيمه بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام لضمان العقم. شطف مع 1x dPBS بعد التعقيم.
- أضف 100 ميكرولتر (ل 24 بئرا) أو 300 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من 1x dPBS إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ ثم قم بإزالة dPBS.
- لكل بئر يتم قياسه ، قم بإعداد بئر غير مستخدم مع 1 مل (ل 24 بئرا) أو 3 مل (ل 12 بئرا) من وسط التمايز المسخن مسبقا (إلى 37 درجة مئوية). ضع إدراج الغشاء في البئر المحضر ، وأضف 200 ميكرولتر (ل 24 بئرا) أو 600 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من وسط التمايز المسخن مسبقا إلى الغرفة القمي. التوازن عند 37 درجة مئوية (رهنا بدرجة حرارة حضانة نوع الفيروس المضاف ، على سبيل المثال ، 35 درجة مئوية للإنفلونزا) لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: قم بإعداد فارغ (إدراج غشاء فارغ) بنفس الطريقة لحساب TEER. - قم بموازنة أنبوب سعة 15 مل من وسط التمايز المسخن مسبقا في نفس درجة الحرارة لمدة 15 دقيقة أيضا. ضع الأقطاب الكهربائية في أنبوب 15 مل ، وقم بتشغيل voltohmmeter.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن تكون القراءة مقاومة 0 ، لأن الأقطاب الكهربائية في نفس الوسط. إذا تم الحصول على أي قراءة أخرى ، فقم بموازنة القطب الكهربائي في أنبوب 15 مل حتى تصبح القراءة 0. - بدءا من الفراغ ، ضع الأقطاب الكهربائية في كل بئر بحيث يتم غمر قطب كهربائي واحد في وسط الغرفة القمية والآخر في وسط الغرفة القاعدية. سجل القراءة فقط عند الحصول على قراءة ثابتة لمدة 5 دقائق على الأقل.
- بعد كل قياس ، اغسل القطب باستخدام PBS قبل القياس التالي. لكل بئر تم اختباره ، خذ قياسات لثلاث عينات في مواقع مختلفة من الغشاء. لحساب صافي TEER لكل عينة، اطرح مقاومة الخلفية، التي يعطيها الغشاء الفارغ، من كل قياس.
- احسب إجمالي قراءة TEER لبئر باستخدام المعادلة التالية:
السلامة الظهارية (Ωcm 2) = صافي TEER (أوم) × مساحة الغشاء (سم2)
ملاحظة: يجب أن تكون قيم TEER ل hNECs لتجارب العدوى الفيروسية >1000 Ωcm213,15,16.
4. عزل وحيدات الدم المحيطية وخلايا NK
ملاحظة: يجب الحصول على عينات الدم من المتطوعين الأصحاء واستخدامها في نفس يوم العزل.
- جمع 30-40 مل من الدم الكامل من كل متبرع في أنابيب جمع الدم 10 مل.
- عزل PBMCs باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، والحصول على PBMCs من معطف buffy بعد الخطوات التالية (انظر أيضا جدول المواد).
- امزج جيدا ~ 10 مل من الدم من أنبوب جمع الدم في فراغ قبل تخفيفه بحجم متساو من محلول الملح المتوازن (PBS).
- أضف 15 مل من وسط تدرج الكثافة إلى قاعدة أنبوب 50 مل.
ملاحظة: يجب أن تكون نسبة تدرج الكثافة المتوسطة إلى الدم المخفف 2:3-3.5. - طبقة 35 مل من الدم المخفف على وسط تدرج الكثافة باستخدام مسدس ماصة (مع ضبط إعداد التوزيع على أدنى مستوى ممكن) عن طريق إمالة الأنبوب بمقدار 45 درجة والسماح للدم المخفف بالسقوط قطرة على الجدار الداخلي للأنبوب بحيث لا يتم إزعاج طبقة وسط تدرج الكثافة.
- محلل أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم ، 18-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الفرامل: إيقاف). قم بإزالة طبقة البلازما العليا بعناية والتخلص منها دون إزعاج الطبقة السفلية.
- انقل المعطف الرقيق إلى أنبوب جديد دون خلط طبقة خلايا الدم الحمراء أو الطبقة المتوسطة ذات الكثافة المتدرجة أو المعطف الناعم. بمجرد جمع المعطف الرقيق في أنبوب جديد سعة 50 مل ، قم بزيادة الحجم إلى 50 مل باستخدام 1x PBS.
- محلل أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم ، 18-20 درجة مئوية ، 8 دقائق (الفرامل: إيقاف) ، وإزالة supernatant باستخدام مسدس ماصة. أعد تعليق بيليه الخلية مع 50 مل من 1x PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 120 × جم ، 18-20 درجة مئوية ، 10 دقائق لإزالة الصفائح الدموية.
- تخلص من السوبرناتانت عن طريق السحب ، دون إزعاج بيليه الخلية.
ملاحظة: نظرا لأن حبيبات الخلايا قد تكون فضفاضة ، فمن غير المستحسن التخلص من السوبرناتانت عن طريق الصب. - أعد تعليق بيليه الخلية باستخدام وسيط RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري) الكامل. قم بإجراء عدد الخلايا عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من حمض الخليك بنسبة 3٪ مع أزرق الميثيلين إلى 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المعاد تعليقه. اخلطي جيدا ، وأضيفي 10 ميكرولتر من الخليط إلى مقياس الدم لحساب الخلايا.
- تمييع PBMCs مع RPMI كاملة متوسطة إلى كثافة 2 × 10 6 / مل (ل 24 بئر) أو 4 × 106 / مل (ل 12 بئر).
5. العدوى الفيروسية hNEC والانتقال إلى hNEC: PBMC الثقافة المشتركة
ملاحظة: يستخدم الفيروس H3N2 (A/Aichi/2/1968) كسلالة تمثيلية للعدوى في هذا البروتوكول. يستخدم تعدد العدوى (MOI) من 0.1 كممثل لوزارة الداخلية في هذا البروتوكول.
- اليوم 0 (عدوى hNECs)
ملاحظة: يتم استخدام بئر واحد من hNECs المزروعة من نفس المتبرع للحصول على عدد خلايا تمثيلي لكل بئر يستخدم في التجربة.- في البئر التمثيلية ، أضف 150 ميكرولتر من 1x trypsin-EDTA إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء و 350 ميكرولتر من 1x trypsin-EDTA إلى الغرفة القاعدية ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، أو حتى تنفصل الخلايا عن الغشاء.
- اغسل الخلايا على الغشاء عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، وجمع التعليق في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل. أضف 200 ميكرولتر من DMEM الكامل لإخماد نشاط التربسين. عد الخلايا عن طريق تلطيخ التربان الأزرق للحصول على عدد الخلايا لكل بئر.
- احسب MOI المطلوب للفيروس بناء على عدد الخلايا لكل بئر ، وقم بتخفيف مخزون الفيروس وفقا لذلك مع RPMI الكامل على الجليد.
ملاحظة: MOI 0.1 من 1.26 × 106 hNECs لكل بئر = 1.26 × 105 جسيمات فيروسية H3N2 لكل بئر في 30 ميكرولتر (ل 24 بئر) / 100 ميكرولتر (ل 12 بئر) - بالنسبة للآبار المتبقية لتجربة العدوى ، أضف 50 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 150 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من 1x dPBS إلى الغرف القمية لإدراج الغشاء ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وإزالة 1x dPBS.
- قم بتغيير الوسط القاعدي في إدراج الغشاء لإكمال وسط RPMI عن طريق نقل الإدخالات إلى لوحة جديدة مع إضافة RPMI كاملة إلى الآبار (350 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 700 ميكرولتر (ل 12 بئرا)).
ملاحظة: عندما تكون hNESPCs قد تميزت تماما عن hNECs ، فإنها تكون متسامحة / متساهلة مع وسائط مختلفة لمدة تصل إلى 72 ساعة ، دون أي تغييرات في المورفولوجيا أو التنظيم عند تبديل الوسيط إلى RPMI12. يستخدم RPMI لدعم نمو وصيانة سكان PBMC. - أضف 30 ميكرولتر المحضر (ل 24 بئرا) / 100 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من لقاح الفيروس إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء ، واحتضان عند 35 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة ، وإزالة التلقيح الفيروسي من الغرفة القمي.
- قم بتغيير الوسط القاعدي لإدراج الغشاء إلى وسط RPMI كامل طازج واحتضنه عند 35 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
- اليوم 1 (إنشاء مراكز وطنية للكهرباء والنباتات ومراكز بناء القدرات في مجال الثقافة المشتركة)
- زرع العدد المطلوب من PBMCs في 150 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 300 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من وسط RPMI الكامل عن طريق إضافة تعليق PBMC مباشرة إلى الغرفة القاعدية لكل بئر من hNECs غير المصابة أو المصابة من اليوم 0 (1.5 × 10 6 للوحات 24 بئرا و 3 × 106 للوحات 12 بئرا). تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24/48 ساعة.
ملاحظة: الحجم النهائي في الغرفة القاعدية بعد إنشاء الاستزراع المشترك هو 500 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 1000 ميكرولتر (ل 12 بئرا).
- زرع العدد المطلوب من PBMCs في 150 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 300 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من وسط RPMI الكامل عن طريق إضافة تعليق PBMC مباشرة إلى الغرفة القاعدية لكل بئر من hNECs غير المصابة أو المصابة من اليوم 0 (1.5 × 10 6 للوحات 24 بئرا و 3 × 106 للوحات 12 بئرا). تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24/48 ساعة.
- الأيام 2-3 (حصاد PBMCs 48/72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)
- جمع المواد الخارقة القمية (48/72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)
- أضف 50 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 150 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من 1x dPBS إلى كل غرفة قمية ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اجمع 1x dPBS في أنابيب 1.5 مل. Aliquot 25 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 50 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من supernatant لفحص البلاك في أنبوب جديد 1.5 مل ، وتجميد كل من المخزون و aliquots على الفور عند -80 درجة مئوية.
- جمع الحمض النووي الريبي الخلوي من hNECs (48/72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)
- انقل إدراج الغشاء إلى بئر نظيف ، وأضف 300 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 600 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي إلى الغرفة القمية ، واحتضنه في rtp لمدة 5 دقائق. جمع supernatant في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي للتحليل الجزيئي.
- حصاد PBMCs (48/72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)
- باستخدام القاعدة العريضة لطرف ماصة معقم ، قم بكشط سطح البئر بلطف لإزاحة PBMCs المنشطة التي قد تكون ملتصقة بسطح البئر. جمع الوسط القاعدي الذي يحتوي على PBMCs في أنبوب طرد مركزي 2 مل.
- اغسل الآبار 2x ب 300 ميكرولتر من 1x dPBS ، واجمع الغسيل في نفس الأنبوب 2 مل. الطرد المركزي أنبوب 2 مل (500 × غرام، 5 دقائق، rtp)، وجمع supernatant في أنبوب جديد 2 مل دون إزعاج بيليه الخلية. تخزين supernatant في -80 درجة مئوية لتحليل السيتوكين والكيموكين ؛ إعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من 1x dPBS.
- جمع المواد الخارقة القمية (48/72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)
6. قياس التدفق الخلوي
ملاحظة: يستمر هذا القسم من البروتوكول مباشرة من القسم السابق باستخدام تعليق خلية PBMC من الخطوة 5.3.3.2. تأكد من الحد الأدنى من التعرض للضوء خلال الخطوات التالية في هذا القسم. يمكن العثور على لوحة عينة من علامات تلطيخ السطح في الجدول 2.
- تلطيخ السطح
- انقل حبيبة خلية PBMC المعاد تعليقها إلى صفيحة بئر سفلية 96-V. تحلل أجهزة الطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 3 دقائق ، وإزالة supernatant.
- احتضان جميع PBMCs (باستثناء "غير ملطخة") مع 100 ميكرولتر من بقعة قابلة للحياة لمدة 15 دقيقة في rtp. قم بتعبئة ما يصل إلى 200 ميكرولتر باستخدام 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). تحلل أجهزة الطرد المركزي عند 800 × غرام لمدة 3 دقائق ، وتخلص من السوبرناتانت.
- قم بإعداد لوحة من الأجسام المضادة الملطخة السطحية ذات الأهمية مع نسب تخفيف مناسبة وحجم نهائي قدره 50 ميكرولتر لكل تفاعل (قم بتعبئة المخزن المؤقت MACS للحصول على الحجم النهائي). قم بإجراء تلطيخ السطح عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة المحضر إلى الخلايا باستخدام ماصة متعددة القنوات. تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
- اغسل بإضافة 150 ميكرولتر من مخزن MACS المؤقت. محلل جهاز الطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 3 دقائق ، والتخلص من supernatant. إذا لم تكن هناك حاجة إلى تلطيخ داخل الخلايا ، فانتقل مباشرة إلى حضانة 15 دقيقة في الخطوة 6.3.
- تلطيخ داخل الخلايا (إذا لزم الأمر)
- أضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت والنفاذية لكل بئر. تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام. قم بتعبئة الآبار ب 100 ميكرولتر من 1x MACS العازل.
- جهاز طرد مركزي (800 × جم ، 3 دقائق ، 25 درجة مئوية) ، وإزالة supernatant. كرر الغسيل بإضافة 200 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت لغسيل النفاذية. جهاز طرد مركزي (500 × جم ، 3 دقائق ، 25 درجة مئوية) ، وإزالة supernatant.
- قم بإعداد التخفيفات للوحة الأجسام المضادة ذات الأهمية لتحقيق حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر باستخدام 1x Permeabilization Wash buffer. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل النفاذية 1x.
- الطرد المركزي للخلايا (800 × جم ، 3 دقائق ، 4 درجات مئوية) ، وإزالة supernatant. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلور.
- ماصة 200 ميكرولتر من محلول التحلل في كل بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة في rtp. محلل جهاز الطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 3 دقائق والتخلص من supernatant.
- أعد تعليق كريات الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS. قم بإجراء قياس التدفق الخلوي وفقا للإعدادات الموضحة سابقا13 ، أو قم بتخزينها عند 4 درجات مئوية في الظلام.
7. تحديد مستويات السيتوكين والكيموكين
- معالجة 25 ميكرولتر من supernatant الغرفة القاعدية باستخدام فحص متعدد الإرسال المناعي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة18.
- احسب تركيز كل تحليل باستخدام برنامج مدير متعدد الإرسال باستخدام خوارزمية ملائمة للمنحنى (5 معلمات) للمنحنى القياسي.
8. تقييم التلوث الفيروسي
- استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام مجموعة استخراج على 4 مجموعات من الحلول: محلول H3N2 المخزون، وتخفيف MOI 0.1 للعدوى، والتخفيفات التسلسلية 10x من MOI 0.1، والوسط القاعدي من العينات (كل من 48 و 72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)12.
- حدد الجين غير الهيكلي (NS1) والمصفوفة (M1) كأهداف لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (انظر جدول المواد للاشعال المستخدمة في التجربة التمثيلية).
- قم بإجراء النسخ العكسي-PCR (RT-PCR) (42 درجة مئوية ، 60 دقيقة) لتحويل الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى cDNA قبل إجراء PCR الكمي (QPCR) لقياس مستويات NS1 و M1 كوكيل للوجود الفيروسي ، وربط المستويات بالمنحنى القياسي الذي تم الحصول عليه من RT-qPCR الذي تم إجراؤه على التخفيف التسلسلي 10x ل MOI 0.1 aliquot. ارجع إلى الجدول 3 لمعرفة تكوين خلطات التفاعل ، واستخدم الشروط التالية: ما قبل الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، يليها تضخيم من 3 خطوات لمدة 40 دورة: 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 60 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ منحنى الذوبان: 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 65 درجة مئوية ل 60 ثانية ، و 97 درجة مئوية لمدة 1 ثانية.
9. فحص البلاك
- اليوم 0: البذر MDCK (كلية الكلاب في مدين داربي) في 24 بئرا
- قم بإزالة الوسط من قارورة T75 من خلايا MDCK المتقاربة. اغسل 2x مع 1x PBS لإزالة جميع آثار المصل. التربسين خلايا MDCK عن طريق إضافة 10 مل من التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 20-30 دقيقة حتى تنفصل الخلايا.
ملاحظة: لا تنقر على القارورة لأن ذلك قد يؤدي إلى التكتل. - ماصة تعليق الخلية في أنبوب 15 مل يحتوي على 2 مل من الوسط الأساسي الأدنى الكامل من النسر (EMEM). جهاز طرد مركزي (300 × جم ، 5 دقائق ، rtp) ، وإزالة supernatant.
- أعد تعليق الخلايا في 6 مل من EMEM الكامل. عد الخلايا عن طريق تلطيخ التربان الأزرق.
- قم بتخفيف تعليق خلية MDCK إلى تركيز 1 × 105 خلايا / مل ، وبذور 1 مل من التعليق المخفف في كل بئر من صفيحة معقمة من 24 بئرا. احتضان في 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة للحصول على طبقة أحادية التقاء من خلايا MDCK في كل بئر.
- قم بإزالة الوسط من قارورة T75 من خلايا MDCK المتقاربة. اغسل 2x مع 1x PBS لإزالة جميع آثار المصل. التربسين خلايا MDCK عن طريق إضافة 10 مل من التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 20-30 دقيقة حتى تنفصل الخلايا.
- اليوم 1: عدوى خلايا MDCK
- تحضير وسط العدوى. قم بإزالة الوسط من الطبقة الأحادية MDCK في اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واغسل 2x باستخدام 1x dPBS. بالنسبة للغسيل الثاني ، اترك PBS في الآبار أثناء إعداد التخفيفات التسلسلية للفيروس.
- قم بإذابة عينات الفيروس على الجليد ، وتخفيفها بشكل متسلسل في صفيحة من 24 بئرا لتحقيق تخفيفات تسلسلية من 10-1 إلى 10-6.
ملاحظة: على سبيل المثال ، املأ كل بئر في صفيحة من 24 بئرا ب 270 ميكرولتر من وسط العدوى. - أضف 30 ميكرولتر من عينة الفيروس إلى البئر الأول في الصف. باستخدام طرف ماصة جديد ، اخلطه جيدا وانقله إلى البئر التالي في الصف لتخفيف العينة بمقدار 10 أضعاف. المضي قدما حتى يتم تحقيق تخفيف 10-6 ؛ تنفيذ الخطوات 9.2.1-9.2.3 لكافة عينات الفيروسات.
- قم بإزالة PBS من لوحة MDCK ، وأصاب في نسختين مع 100 ميكرولتر من التخفيفات الفيروسية المحضرة. لآبار التحكم ، أضف 100 ميكرولتر من وسط العدوى (بدون العينة الفيروسية). احتضان في 35 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة ، وهز اللوحة للقضاء على البقع الجافة كل 15 دقيقة.
- إزالة التلقيح الفيروسي ، وإضافة 1 مل من تراكب السائل لكل بئر. احتضان في 35 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة.
- اليوم 4 (72 ساعة بعد الإصابة): تصور البلاك
- قم بإزالة تراكب السائل ، وقم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ من الفورمالديهايد في 1x PBS لمدة 1 ساعة. قم بإزالة محلول الفورمالديهايد ، واغسله مرة واحدة باستخدام 1x PBS أو الماء المقطر.
- قم بتلطيخ الخلايا الثابتة بإضافة محلول بنفسجي كريستالي بنسبة 1٪ لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة صبغة البنفسج الكريستالية ، واغسل الخلايا بالماء الجاري. جفف اللوحة في rtp.
- بمجرد أن تجف ، عد اللويحات ، واحسب العيار الفيروسي وفقا للصيغة التالية:
عدد اللويحات × عامل التخفيف = عدد اللويحات - وحدات التشكيل في 100 ميكرولتر
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
على الرغم من أن الخلايا التائية التقليدية تشكل الذخيرة الرئيسية للاستجابة المناعية التكيفية ضد العدوى الفيروسية لتسهيل التطهير الفيروسي ، إلا أن مجموعة الخلايا التائية الفطرية تعمل عبر طيف أوسع لقمع الحمل الفيروسي من أجل إزالة فعالة في مرحلة لاحقة. لذلك ، يخلق هذا البروتوكول على وجه التحديد حالة قوية لدراسة الخلايا التائية الفطرية وتنشيطها وسكانها الوظيفيين بعد الإصابة بالأنفلونزا ، دون الحاجة إلى عينات الخلايا الظهارية والمناعية من نفس المتبرع. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على فيروسات أخرى ، على الرغم من أنه قد يقتصر على الفيروسات ذات الإطلاق القمي ، أي أنه لا ينبغي لأي فيروس أن يدخل الطبقة القاعدية للتلامس مع حجرة PBMC.
استنادا إلى النتائج التمثيلية في الشكل 1 ، يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الحصول على مجموعات hNESPC المزروعة من تعليق خلية أولي في طبقة تغذية 3T3. يقدم الشكل 1 عينة من التقدم المتوقع ل hNESPCs أثناء نموها على طبقة التغذية 3T3. سيتم استخدام هذه الخلايا للتمايز في ثقافة ALI للحصول على hNECs متعددة الطبقات ، كاملة مع الخلايا الهدبية الوظيفية والكأس (الشكل 4). باستخدام hNECs ، يمكن التحقيق في تنشيط الخلايا التائية الفطرية باستخدام قياس التدفق الخلوي. وتبين النتائج المبينة في الشكل 5 الكشف عن مجموعات خلايا MAIT و γδ-T و NK ، والتي زادت بشكل كبير في الزراعة المشتركة التي تنطوي على hNECs المصابة بفيروس الأنفلونزا. يمكن بعد ذلك تطبيق هذا الإعداد على سلالات أخرى من فيروس الأنفلونزا لإغاظة السكان العالميين عبر السلالات ، وكذلك الفيروسات الأخرى وقدرتها على تنشيط مجموعات الخلايا التائية الفطرية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تخصيص لوحة الكشف وفقا لمجموعة الخلايا المناعية الفطرية ذات الأهمية لمراقبة تنشيط كل منها في ظل ظروف الزراعة المشتركة مع الخلايا الظهارية المصابة.
الشكل 1: hNESPCs نمت على طبقة تغذية 3T3 2/5/10 أيام من البذر. اليوم 2: لاحظ جزر hNESPCs (مثال محدد بسهم أبيض) يجب ملاحظته بعد يومين من البذر على طبقة التغذية 3T3. اليوم 5: يجب أن تكون الجزر التي لوحظت في اليوم 2 أكبر الآن (يتم ترسيم أمثلة جزر hNESPCs بواسطة دوائر خضراء) ، ويجب ملاحظة أن طبقة 3T3 تتدهور. اليوم 10: يجب أن تهيمن hNECPS على اللوحة بأكملها مع ظهور خلايا 3T3 قليلة أو معدومة. أشرطة المقياس لليوم 2 واليوم 5 = 50 ميكرومتر استنادا إلى تكبير 200x، شريط المقياس لليوم 10 = 100 ميكرومتر استنادا إلى تكبير 100x. اختصار: hNESPCs = خلايا جذعية / سلفية ظهارة الأنف البشرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخططات الآبار لإدراج الأغشية في لوحات 24 بئر و 12 بئرا. لاحظ الحجم المتوسط الذي سيتم استخدامه لكل حجرة. يتم زرع hNESPCs في الغرف القمية لإدراج الغشاء. اختصار: hNESPCs = خلايا جذعية / سلفية ظهارة الأنف البشرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مخططات الآبار لإدراج الأغشية في لوحات 24 بئر و 12 بئرا لإنشاء الزراعة المشتركة ALI. لاحظ الحجم المتوسط الذي سيتم استخدامه لكل حجرة. لاحظ الاختلافات في الحجم المتوسط الذي سيتم استخدامه للفترات الزمنية المختلفة (2 أيام / 3 أيام) بين التغييرات المتوسطة. اختصار: ALI = واجهة الهواء والسائل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: β4-Tubulin و MUC5AC ملطخان بطبقة hNEC. β4-Tubulin ملطخ باللون الأخضر ، بينما MUC5AC ملطخ باللون الأحمر. النوى ملطخة باللون الأزرق مع DAPI. يشير MUC5AC إلى وجود خلايا كأسية منتجة للمخاط ، بينما يشير β4-tubulin إلى وجود أهداب على الخلايا الهدبية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر استنادا إلى التكبير 600x. الاختصارات: hNEC = خلية ظهارية أنفية بشرية. MUC5AC = mucin 5AC ؛ DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية لمركبات PBMCs المحتضنة مع أو بدون ظهارة أنفية أو ظهارة مصابة بالأنفلونزا لمدة 24 ساعة. تم تحديد تنشيط خلايا MAIT و Vδ1 T وخلايا Vδ2 T و NK بواسطة علامات خاصة بنوع الخلية بما في ذلك Vα 7.2 TCR و Vδ1 TCR و Vδ2 TCR و CD56 و CD69. تشير القيم الموجودة أعلى البوابات إلى النسبة المئوية للخلايا الموجبة CD69. الاختصارات: PBMCs = خلايا الدم أحادية النواة الطرفية. Epith = ظهارة الأنف; FLU-Epith = ظهارة مصابة بالأنفلونزا. MAIT = الخلايا التائية الثابتة المرتبطة بالمخاط ؛ NK = القاتل الطبيعي; TCR = مستقبلات الخلايا التائية; CD = مجموعة من التمايز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| متوسط | وصفة | تكوين | التعليقات |
| متوسط 3 | DMEM / خليط المغذيات F-12 | 500 مل | |
| عامل النمو الظهاري البشري | 5 نانوغرام/مل | ||
| إنسولين | 2.5 ميكروغرام/مل | ||
| سموم الكوليرا | 0.1 نانومتر | ||
| الهيدروكورتيزون | 0.5 ميكروغرام/مل | ||
| 3،3'،5-تريودو-ل-ثيرونين | 2 نانومتر | ||
| N-2 الملحق | 5 مل | 10 ميكرولتر/مل | |
| مضاد حيوي مضاد للفطريات | 5 مل | ||
| وسائط التمايز | PneumaCult-ALI القاعدية المتوسطة | 441 مل | |
| PneumaCult-ALI 10x الملحق | 50 مل | ||
| محلول الهيدروكورتيزون (200x) | 2.5 مل | ||
| 0.2٪ (2 ملغ / مل ؛ 1000 وحدة دولية / مل) ملح الصوديوم الهيبارين في محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات | 1 مل | ||
| مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) | 5 مل | ||
| ملحق صيانة PneumaCult-ALI (100x) | 500 ميكرولتر | فقط ليتم إضافته مباشرة قبل الاستخدام | |
| أكمل الحد الأدنى من الوسط الأساسي من دولبيكو (DMEM) | DMEM / ارتفاع الجلوكوز | 450 مل | |
| مصل بقري جنيني معطل حراريا | 50 مل | ||
| مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) | 5 مل | ||
| معهد روزويل بارك التذكاري الكامل (RPMI) متوسط | RPMI 1640 (مع L-الجلوتامين) | 445 مل | |
| مصل بقري جنيني معطل حراريا | 50 مل | ||
| مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) | 5 مل | ||
| متوسط النسر الأساسي الأدنى الكامل (EMEM) | EMEM (ث L-الجلوتامين) | 450 مل | |
| مصل بقري جنيني معطل حراريا | 50 مل | ||
| وسط العدوى | EMEM (ث L-الجلوتامين) | 4 مل | |
| TPCK التربسين (500 ميكروغرام / مل) | 8 ميكرولتر | تركيز التربسين TPCK النهائي من 1 ميكروغرام / مل | |
| المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا | 1x PBS | 498 مل | |
| 0.5 م EDTA | 2 مل | ||
| BSA (درجة زراعة الأنسجة) | 2.5 غ | ||
| ميتوميسين C - تكملة كاملة DMEM | أكمل DMEM | 10 مل | |
| ميتوميسين سي | 500 ميكرولتر | ميتوميسين C (10 ميكروغرام / مل) |
الجدول 1: وصفة للوسائط المستخدمة.
| علامة سطح الخلية | الفلوروفور |
| مستقبلات الخلايا التائية Vδ1 (TCR) | فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC) |
| Vδ2 TCR | بيريدينين-كولورفيل-بروتين (PerCP) |
| CD3 | V500 |
| CD8 | صبغة ألوفيكوسيانين - سيانين 7 (APC-Cy7) |
| CD14 | فيكويريثرين (PE)-CF594 |
| CD56 | فيكويريثرين (PE)-سيانين 7 (Cy7) |
| CD69 | بنفسجي لامع 421 (BV421) |
| CD83 | ألوفيكوسيانين (APC) |
| CD161 | بنفسجي لامع 605 (BV605) |
| Vα 7.2 | فيكويريثرين (PE) |
| CD38 | الأشعة فوق البنفسجية الرائعة ٣٩٥ (BUV395) |
الجدول 2: عينة من علامات تلطيخ السطح.
| qPCR مزيج التفاعل | كيو بي سي آر ماستر ميكس | 5 ميكرولتر |
| مياه خالية من النوكليز | 3 ميكرولتر | |
| التمهيدي الأمامي (1 ملليمتر) | 0.5 ميكرولتر | |
| التمهيدي العكسي (1 ملليمتر) | 0.5 ميكرولتر | |
| cDNA (12.5 نانوغرام/ميكرولتر) | 1 ميكرولتر | |
| إجمالي حجم التفاعل | 10 ميكرولتر | |
| مزيج تفاعل RT-PCR | RT-PCR 5x المخزن المؤقت | 2.5 ميكرولتر |
| الاشعال العشوائية (500 نانوغرام / ميكرولتر) | 0.2 ميكرولتر | |
| مثبط RNase | 0.625 ميكرولتر | |
| دي إن تي بي ميكس | 2.5 ميكرولتر | |
| النسخ العكسي | 0.5 ميكرولتر | |
| الحمض النووي الريبي (200 نانوغرام/ميكرولتر) | 1 ميكرولتر | |
| مياه خالية من النوكليز | 12.675 ميكرولتر | |
| إجمالي حجم التفاعل | 20 ميكرولتر |
الجدول 3: وصفة لخلطات التفاعل من تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الاستجابات المناعية الفطرية ضد الفيروسات هي مجال دراسة غير مدروس في الإدارة المضادة للفيروسات. تعمل الخلايا الظهارية في مجرى الهواء والخلايا المناعية الفطرية بشكل متضافر لقمع التكاثر الفيروسي أثناء العدوى ، إلى جانب العمل كمحدد للاستجابة التكيفية المفرطة النشاط إذا لم يتم الاحتفاظ بالحمل الفيروسي تحت السيطرة12،13،17. ومع ذلك ، فإن تطوير نموذج بشري ذي صلة لدراسة المناعة الفطرية الظهارية الفطرية المتقاطعة للتحقيق في تنشيط الخلايا المناعية الفطرية لمنح استجابة مناسبة مضادة للفيروسات لا يزال يمثل تحديا. وبالتالي ، يمثل نموذج الزراعة المشتركة ALI هذا تقنية متعددة الاستخدامات يمكن استخدامها لتقييم مجموعة كاملة من التفاعلات بين الطبقة الظهارية الأنفية والخلايا المناعية. وبما أن هذا النموذج يجمع بين hNECs المتمايزة في المختبر ، وتحليل تنشيط PBMC عبر قياس التدفق الخلوي ، والعدوى الفيروسية ، فقد تم تحديد العديد من الخطوات الحاسمة بوضوح لضمان نجاح هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا إجراء مزيد من التعديلات على جزء مجرى الهواء المعني حيث يمكن استخدام الخلايا المتمايزة في المختبر من كل من الشعب الهوائية العلوية والسفلية ، مما يضيف طبقة أخرى من التنوع إلى البروتوكول.
ومع ذلك ، عند العمل مع الخلايا الظهارية المناعية المتقاطعة في العدوى الفيروسية ، من الأهمية بمكان ألا تتفاعل الفيروسات مباشرة مع PBMCs لتحديد العوامل القابلة للذوبان المحلية المشتقة من الظهارة المبكرة التي تطلقها hNECs. لذلك ، فإن هذا النموذج أكثر ملاءمة لفحص الفيروسات ذات الإطلاق الفيروسي المستقطب ، حيث لا تخرج الفيروسات إلا من السطح القمي إلى الغرفة القمية ، على سبيل المثال ، فيروسات الأنفلونزا12 وفيروس SARS-CoV-219. بالإضافة إلى ذلك ، لمنع تسرب الفيروسات القمية إلى الغرفة القاعدية التي تعرض التجربة للخطر ، فإن وجود طبقة ظهارية سليمة بسماكة كافية أمر حيوي. لذلك ، من المهم إجراء قياس TEER وتحديد كمية الحمض النووي الريبي الفيروسي لضمان خلو النتائج من التسرب الفيروسي إلى الغرفة القاعدية13،16،20. تتضمن قراءة TEER >1000 طبقة متعددة سليمة من الخلايا المناسبة للفيروسات ذات الإطلاق المستقطب. يجب أن تكون الوسائط القاعدية خالية من أي تلوث فيروسي بالحمض النووي الريبي13،15،16. ومع ذلك ، لا يزال يتعين استكشاف فائدة نموذج فيروسات الإطلاق ثنائية الاتجاه ، مثل فيروسات الأنف ،16. ولا تقتصر هذه الفيروسات على إطلاق ذريتها بطريقة مستقطبة، بل قد تطلق فيروسات جديدة ثنائية الاتجاه في كل من المناطق القمية والقاعدية من الظهارة. هناك حاجة إلى مزيد من التحسين قبل أن يمكن تطبيق هذا النموذج على الفيروسات ذات الإطلاق غير المستقطب.
نظرا لأن هذا البروتوكول يتضمن العمل مع عينات بشرية من أفراد مختلفين ، فلن تظهر عينتان من hNECs نفس الخصائص والاستجابات12,16. على سبيل المثال ، يمكن أن تختلف لزوجة المخاط الناتج عن طبقة hNEC المتمايزة نهائيا اختلافا كبيرا. قد تكون سرعة تطور الأهداب مختلفة أيضا. ولذلك، من المهم ممارسة مستوى معين من المرونة عند الالتزام بالمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في هذا البروتوكول. في حين أنه من الممكن بالتأكيد استخدام خطوط الخلايا الظهارية ، فإن هذا من شأنه أن يزيل التعقيد (المخاط ، التفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة) للتفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة للطبقة الظهارية ، والتي ستكون مثالية للتحقيق في كيفية تأثير الحديث المتبادل الظهاري على استجابات PBMCs. خط الخلية الأساسي ضروري لمحاكاة فسيولوجيا أنسجة الأنف ، حيث تكون الخلايا متعددة الطبقات ، ويتم توطين أنواع الخلايا المختلفة إلى مكانتها الفردية الخاصة بها ، على الرغم من أن التباين قد يكون مشكلة. يمكن التغلب على التباين في هذا الصدد باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية للتمييز والفصل بين السكان غير المتجانسين للخلايا.
والواقع أن أنواع التفاعلات التي يمكن تقييمها محدودة بمنشأ هذه البلدان والبلدان الصغيرة والمتوسطة الحجم. وعندما يتم الحصول على هذه المراكز والمساهمات الوطنية من جهات مانحة مختلفة، فإن ضمان السلامة الظهارية والفصل بينهما أمر بالغ الأهمية. عندما تتلامس PBMCs مع hNECs ، يمكن أن تحدث تفاعلات مناعية ألوجينية. وبالتالي ، فإن التفاعلات الوحيدة ذات الصلة هي التفاعلات التي تتوسط فيها العوامل القابلة للذوبان التي يمكن أن تمر عبر إدراج الغشاء ، كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. ومع ذلك ، عندما تنشأ كلتا المجموعتين من الخلايا من نفس الفرد ، فإن هذا النموذج له طبقة إضافية من الفائدة حيث يمكن الآن تقييم تفاعلات الخلايا المناعية التقليدية بين hNECs و PBMC ، بما في ذلك السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية والاستجابات بوساطة الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا إجراء دراسات فوق جينية لدراسة كيفية تأثير التعديلات على الجينوم على جين / تعبير / إفراز السيتوكين الجيني.
علاوة على ذلك ، يمكن إضافة مجموعات خلايا مختلفة إلى الغرفة القاعدية لمزيد من التحقيق في مجموعة سكانية محددة. يمكن القيام بذلك عن طريق عزل مجموعات الخلايا ذات الأهمية (الخلايا التائية ، خلايا NK ، الخلايا الوحيدة) وإدخالها إلى الغرفة القاعدية بدلا من PBMCs. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في التفاعلات الخلوية التي تتطلب اتصالا مباشرا بسبب فصل الخليتين بواسطة الغشاء. على هذا النحو ، قد يكون التحقيق في الاستجابات المناعية التكيفية محدودا بهذه التفاصيل. في الختام ، يوفر نموذج ALI للزراعة المشتركة نقطة انطلاق متعددة الاستخدامات للتحقيق في المختبر للحديث المتبادل بين أنسجة الأنف والخلايا المناعية. يحاول البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة توفير مبدأ توجيهي سيكون مفيدا حتى لو تم تغيير السكان / الظروف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر موظفي الأبحاث في قسم NUS لطب الأنف والأذن والحنجرة وقسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة على مساعدتهم في العمل المتعلق بثقافة hNEC والثقافة الفيروسية. كما نود أن نشكر الجراحين والفريق الجراحي في مستشفى الجامعة الوطنية ، قسم طب الأنف والأذن والحنجرة ، على مساعدتهم في توفير عينات الخلايا والدم المطلوبة للدراسة.
تم تمويل هذه الدراسة من قبل المجلس الوطني للبحوث الطبية ، سنغافورة رقم. NMRC/CIRG/1458/2016 (إلى دي يون وانغ) ووزارة الصحة-OFYIRG19may-0007 (إلى كاي سين تان). كاي سين تان هو حاصل على دعم الزمالة من الزمالة الأوروبية للحساسية والمناعة السريرية (EAACI) 2019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |
References
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L.
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M.
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
