Summary
该协议详细研究了病毒感染的鼻上皮细胞与先天细胞活化之间的早期相互作用。免疫细胞的单个亚群可以根据其对病毒感染的反应而激活来区分。然后可以进一步研究它们以确定它们对早期抗病毒反应的影响。
Abstract
在病毒感染期间，鼻上皮层和先天免疫细胞之间的早期相互作用仍然是一个探索不足的领域。先天免疫信号传导在病毒感染中的重要性已大大增加，因为表现出高先天性T细胞活化的呼吸道感染患者显示出更好的疾病结果。因此，剖析这些早期先天免疫相互作用可以阐明控制它们的过程，并可能促进潜在的治疗靶点和策略的发展，以抑制甚至预防病毒感染的早期进展。该协议详细介绍了一种多功能模型，可用于研究病毒感染的气道上皮细胞分泌的因子中先天免疫细胞的早期串扰，相互作用和激活。使用H3N2流感病毒（A/ Aichi / 2 / 1968）作为代表性病毒模型，使用流式细胞术分析了共培养外周血单核细胞（PBMC）的先天细胞活化，以研究由上皮释放的可溶性因子激活的细胞亚群以响应病毒感染。结果验证了分化细胞亚群的门控策略，揭示了PBMCs活化群体及其与对照和感染上皮的串扰之间的明显差异。然后可以进一步分析激活的亚群以确定其功能以及细胞特异性的分子变化。这种串扰研究的结果可能会发现对激活重要先天细胞群很重要的因素，这些因素有利于控制和抑制病毒感染的进展。此外，这些因素可以普遍适用于不同的病毒性疾病，特别是新出现的病毒，以减轻这些病毒首次在幼稚人群中传播时的影响。
Introduction
呼吸道病毒可能是最普遍的病原体之一，造成严重的医疗保健和经济负担。从每年定期爆发的新流行毒株（如H1N1、H5N1、H3N2、MERS、COVID-19）到季节性流感毒株，病毒对公共卫生构成持续威胁。虽然疫苗构成了应对这些全球公共卫生挑战的主要部分，但令人清醒的是，这些对策只是响应1，2。此外，在新的传染性菌株的出现与其疫苗的成功开发之间出现延迟是不可避免的3，导致遏制病毒传播的现有措施非常有限。
这些拖延因给社会造成的经济和社会代价而进一步凸显。仅季节性流感每年就造成约80亿美元的间接成本、32亿美元的医疗费用和3.63万人死亡4。这是在考虑资助疫苗开发所需的研究成本之前。流行病的暴发对社会的影响甚至更加严重，而全球化的速度每年都在加快，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的出现和迅速传播造成的全球破坏就证明了这一点， 5，6，7。
最近的研究表明，具有更多活化先天性T细胞群的感染患者往往具有更好的疾病结果8，9，10。此外，先天性T细胞群被分类为多个亚组：粘膜相关不变T（MAIT）细胞，Vδ1 γδ T细胞，Vδ2 γδ T细胞和自然杀伤T（NKT）细胞。这些先天性T细胞亚群在其群体内也表现出异质性，增加了参与先天免疫应答的细胞群11之间相互作用的复杂性。因此，激活这些先天性T细胞的机制和先天性T细胞特定亚群的知识可能提供不同的研究途径，以减少这些病毒对人类宿主的感染作用，特别是在疫苗开发期间。
受流感感染的上皮细胞产生迅速激活先天性T细胞的因子12，13，14。基于这一发现，这种非接触式空气 - 液体界面（ALI）共培养模型旨在模拟感染的鼻上皮层和PBMCs在早期感染期间的早期化学相互作用（由受感染的上皮层释放的可溶性因子介导）。鼻上皮层（在膜插入物上培养）和PBMC（在下面的腔室中）之间的物理分离以及上皮完整性可防止PBMCs被病毒直接感染，从而可以详细研究上皮衍生的可溶性因子对PBMCs的影响。因此，可以进一步研究所确定的因素在诱导适当的先天性T细胞群方面的治疗潜力，从而可以预防流感感染。因此，本文详细介绍了建立共培养的方法，用于研究上皮衍生的可溶性因子的先天性T细胞活化。
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Protocol
注：有关此协议中使用的介质配方，请参阅 表 1 。
注意：已发现在12孔透孔上生长的hNECS可生长成更优化的厚度，使可溶性因子在感染流感病毒时容易到达基底室。因此，建议使用12孔大小的转孔进行共培养。
1. 建立3T3供料层
- 从冻结的库存中建立
- 从冷冻储液中解冻NIH / 3T3成纤维细胞的冷冻管。将冷冻管的内容物加入2 mL完全Dulbecco的最小必需培养基（DMEM）中，并重悬细胞。
- 在300× g 和室温/压力（rtp）下离心5分钟，并除去上清液。在完整的DMEM中重悬细胞。
- 使用台盼蓝染色计数细胞。将10μL台盼蓝加入10μL重悬的细胞悬浮液中。充分混合，并将10μL悬浮液加入血细胞计数器以计数细胞。
- 密度为1×10个4 个细胞/ cm2 的种子细胞在适当的培养皿（例如，T75烧瓶）中。将所得培养瓶在37°C下在5%CO2 气氛中孵育3天。
- 丝裂霉素C治疗
- 在3天时，确保汇合度为60%-80%，除去培养基，并用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。
注意：重要的是3T3进料层不能达到完全汇合;否则，丝裂霉素C治疗将无效。 - 将丝裂霉素C补充的完全DMEM加入烧瓶中，并在37°C下在5%CO2 气氛中孵育3.5小时。除去含丝裂霉素C培养基，并用1x PBS洗涤细胞2次。
- 在3天时，确保汇合度为60%-80%，除去培养基，并用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。
- 在6孔板中接种3T3细胞
- 向烧瓶中加入3mL的1x胰蛋白酶- EDTA，持续3-5分钟以解离细胞。将解离的细胞收集在新鲜的15 mL管中。将15mL管在300× g，rtp下离心5分钟;丢弃上清液。在完整的DMEM中重悬细胞。
- 使用台盼蓝染色计数细胞。将细胞以7.5×10 5-2.5×10 6个细胞/孔接种在6孔板中。将板在37°C下在5%CO2气氛中孵育过夜。
注意：如果细胞健康，则3T3饲养层被视为就绪。此时，将人鼻上皮干/祖细胞（hNESPC）接种到饲养层上进行扩增。 - 将完整的DMEM加入烧瓶中，并在37°C，5%CO2 下孵育过夜，以3T3细胞从丝裂霉素C治疗中恢复。
2. 建立人鼻上皮细胞（hNEC）培养物
注意：临床样本应从无上呼吸道感染症状的患者处获得。
- 将鼻组织加工成单细胞悬浮液
- 在含有100μL / mL抗生素 - 抗真菌剂混合物的1x Dulbecco的PBS（dPBS）（不含Mg2 + 和Ca2 +的PBS）中洗涤鼻组织。将组织切成小片段，并在4°C振荡下用10mg / mL中性蛋白酶处理样品过夜。
- 在200× g下离心5分钟，离心后除去上清液。将沉淀在1-2mL的1x胰蛋白酶-EDTA（37°C，15分钟）中孵育，并通过在管中加入相当于体积10%的胎牛血清体积来淬灭。
- 通过移液将消化的组织机械地解离成单细胞聚集体，然后将所得的悬浮液通过70μm细胞过滤器。在完整的DMEM中重悬细胞。
注意：在此步骤之后，细胞悬浮液是终末分化细胞和干细胞的混合物，称为人鼻上皮干细胞/祖细胞（hNESPC）。后续步骤的目标是从不同细胞群的混合物中选择并富集hNESPC群体。
- 将单细胞悬浮液接种到3T3饲养层上，以选择hNESPC
- 离心步骤2.1.3（300× g，5分钟，rtp）的细胞悬浮液，并除去上清液。将细胞重悬于3-5mL培养基3中。
注：培养基3的配制是为了促进hNESPCs的选择性生长。 - 通过台盼蓝染色计数细胞。在6孔板中除去培养基后，将1×106 个细胞在2mL培养基3中每孔3个孔中接种到含有制备的3T3的6孔板上。将所得共培养物在37°C的5%CO2 气氛中孵育。
注意：播种后，请注意不要搅拌板，因为它会影响hNESPC的附着。 - 每2-4天更换一次培养基3（2毫升），方法是完全取出旧培养基并用新鲜培养基3代替。
注意：更换培养基以补充营养物质并防止过度酸性条件对hNESPC的生长产生负面影响。每种培养基变化之间的间隔取决于培养基的酸性（黄色）程度。如果培养基迅速变酸，应缩短间隔。 - 7-10天后，观察hNESPCs处于适合将它们转移到膜插入物上的汇合处。参见 图1 ，了解hNESPC在3个不同时间点（2天，5天和10天）的代表性形态。
- 离心步骤2.1.3（300× g，5分钟，rtp）的细胞悬浮液，并除去上清液。将细胞重悬于3-5mL培养基3中。
- 将 hNESPC 转移到膜插入件上
注意：由于丝裂霉素C处理，3T3馈线层将在hnESPC膨胀期内缓慢降解。这将导致对孔表面的粘附力减弱，通过用移液管冲洗它们来使其脱落，仅留下健康的hnESPC。- 取出培养基，并向每个孔中加入500μL 1x dPBS。用微量移液管冲洗细胞3x以除去3T3细胞，并丢弃1x dPBS。在显微镜下观察圆形hNESPC保留，而纺锤形3T3进料层被移开。
- 每孔加入500μL细胞解离试剂，并在37°C下在5%CO2 气氛中孵育5-10分钟，或直到hNESPC从孔表面分离。
- 收集hnesPC悬浮液，离心机（300× g，5分钟，rtp），并除去上清液。
- 将沉淀重悬于培养基3中。通过台盼蓝染色计数细胞。将3×10个4 个细胞放入每个膜插入物（24孔板）的150μL培养基3中或1×10个5 细胞放入每个膜插入物（12孔板）的300μL培养基3中（图2）。将细胞在37°C下在5%CO2 气氛中孵育。
- 每2天更换一次顶端和基底腔的培养基（培养基3）。在膜插入物的支撑臂之间导航移液器尖端以进入基底室，取出旧培养基，然后通过相同的方法重新引入新鲜培养基。虽然顶端室很容易接近，但请注意不要干扰不断增长的hNESPC层。
注意：接种后至少2天不要干扰顶端室中的培养基，因为细胞需要时间附着在膜上。
- hNESPC的分化为hNEC
- 当hNESPCs达到100%汇合度（从在膜插入物上播种后约3-7天），开始ALI培养。将基底培养基更换为分化培养基，并将培养基从顶室中取出。每2-3天更换培养基时，仅向基底室添加培养基而不将其添加到顶室，如图3和步骤 2.3.5 所示。
注：将培养基改为分化培养基，以促进HNESPC在ALI中分化为hNEC。hNESPCs大约需要3-4周才能达到完全成熟才能成为ALI中的hNEC，此时细胞将生长成多层，每层具有不同的细胞群。纤毛也应该在400x的放大倍率下观察（纤毛可以通过它们的跳动运动来识别，这导致显微镜场看起来像在振动）。此时，细胞已准备好用于共培养实验。请参阅 图4 ，了解完全分化的hNEC层的横截面。 - 获得成熟的hNECs后，在共培养实验之前，以2-3天的间隔在顶端室中用1x dPBS洗涤细胞3次，持续1周。将洗涤步骤与基础介质变化协同，并按如下方式进行洗涤。
- 将50μL（24孔）/ 150μL（12孔）1x dPBS加入膜插入物的顶室中，并将细胞在37°C下孵育10分钟。孵育10分钟后除去dPBS，以除去分化过程中积聚的粘液和死细胞。
注意：根据实验的性质，碳酸氢钠溶液可用于完全洗掉粘液层。然而，对于共培养实验中的病毒感染，粘液层被保留，并且仅用dPBS洗涤除去多余的粘液。这种保留是为了模仿存在于鼻上皮上的生理粘液层，该粘液层将与传入的病毒感染相互作用。
- 将50μL（24孔）/ 150μL（12孔）1x dPBS加入膜插入物的顶室中，并将细胞在37°C下孵育10分钟。孵育10分钟后除去dPBS，以除去分化过程中积聚的粘液和死细胞。
- 当hNESPCs达到100%汇合度（从在膜插入物上播种后约3-7天），开始ALI培养。将基底培养基更换为分化培养基，并将培养基从顶室中取出。每2-3天更换培养基时，仅向基底室添加培养基而不将其添加到顶室，如图3和步骤 2.3.5 所示。
3. 跨上皮电阻 （TEER） 测量
注意：确认上皮完整性对于确保获得完整和健康的上皮层非常重要。通过使用体积测量仪对4个随机孔进行TEER测量来确定完整的上皮层。
- 用70%乙醇冲洗电极，并在使用前用紫外线灭菌15分钟，以确保无菌。灭菌后用1x dPBS冲洗。
- 向膜插入物的顶腔室中加入100μL（对于24孔）或300μL（对于12孔）1x dPBS。将板在37°C下孵育10分钟;然后，删除 dPBS。
- 对于要测量的每个孔，用1 mL（对于24孔）或3mL（对于12孔）预热（至37°C）分化培养基制备未使用的孔。将膜插入物置于制备的孔中，并向顶端室中加入200μL（对于24孔）或600μL（对于12孔）预热分化培养基。在37°C下平衡（受制于加入的病毒类型的孵育温度，例如，流感为35°C）15分钟。
注意：以相同的方式准备空白（空膜插入物）以计算TEER。 - 在相同温度下平衡15 mL预热分化培养基管15分钟。将电极放入 15 mL 离心管中，然后打开体积测量仪。
注意：此时，读数应为0电阻，因为电极位于同一介质中。如果获得任何其他读数，请在15 mL管中平衡电极，直到读数为0。 - 从空白开始，将电极放置在每个孔中，使得一个电极浸没在顶室介质中，另一个浸没在基底室介质中。仅当获得恒定读数至少5分钟时，才记录读数。
- 每次测量后，在下一次测量之前用PBS清洗电极。对于每个经过测试的孔，在膜的不同位置对三个样品进行测量。要计算每个样品的净TEER，请从每次测量中减去由空白膜插入物给出的背景电阻。
- 使用以下等式计算油井的总 TEER 读数：
上皮完整性 （Ωcm2） = 净 TEER（欧姆） × 膜面积 （cm2）
注意：用于病毒感染实验的hNEC的TEER值应为>1000 Ωcm2 13，15，16。
4. 外周血单核细胞和NK细胞的分离
注意：血液样本应从健康志愿者处获取，并在隔离当天使用。
- 在10 mL血液收集管中从每个供体收集30-40 mL全血。
- 使用密度梯度离心分离PBMC，并在以下步骤后从buffy涂层中获得PBMCs（另见 材料表）。
- 在真空吸尘器中彻底混合来自血液收集管的约10 mL血液，然后用等体积的平衡盐溶液（PBS）稀释。
- 将15 mL密度梯度培养基加入50 mL管的基底。
注意：密度梯度培养基与稀释血液的比例应为2：3-3.5。 - 用移液枪（分配设置设置为尽可能低）在密度梯度培养基上涂上35mL稀释的血液层，方法是将管倾斜45°，并允许稀释的血液滴落到管的内壁上，以使密度梯度介质层不受干扰。
- 离心裂解物在500× g，18-20°C下30分钟（制动器：关闭）。小心地去除并丢弃上层等离子体层，而不干扰下层。
- 将白细胞层转移到新管中，而不混合红细胞层，梯度密度介质层或白细胞层。一旦将浅黄色外套收集到新的50 mL试管中，用1x PBS将体积加满至50 mL。
- 离心机在800× g，18-20°C，8分钟（制动器：关闭）下裂解物，并用移液枪除去上清液。用50mL 1x PBS重悬细胞沉淀，并在120× g，18-20°C下离心10分钟以除去血小板。
- 通过移液丢弃上清液，而不干扰细胞沉淀。
注意：由于细胞沉淀可能松动，因此不建议通过倒入来丢弃上清液。 - 用完整的RPMI（罗斯威尔公园纪念研究所）培养基重悬细胞沉淀。通过将10μL3%乙酸与亚甲基蓝加入10μL重悬的细胞悬浮液来进行细胞计数。充分混合，并将10μL混合物加入血细胞计数器以计数细胞。
- 用完整的RPMI培养基稀释PBMC至2×106 / mL（对于24孔）或4×106 / mL（对于12孔）的密度。
5. hNEC病毒感染和向hNEC的过渡：PBMC共培养
注意：H3N2（A/Aichi/2/1968）在本方案中被用作感染的代表性菌株。感染多重性 （MOI） 为 0.1 用作该协议中的代表性 MOI。
- 第0天（hNECs感染）
注意：来自同一供体生长的hNEC的一个孔用于获得实验中使用的每个孔的代表性细胞计数。- 在代表性孔中，向膜插入物的顶端室中加入150μL1x胰蛋白酶-EDTA，向基础室中加入350μL1x胰蛋白酶EDTA，并在37°C下孵育10分钟，或直到细胞从膜中分离。
- 通过上下移液冲洗膜上的细胞，并将悬浮液收集在1.5 mL离心管中。加入200μL完全DMEM以淬灭胰蛋白酶活性。通过台盼蓝染色对细胞进行计数，以获得每孔的细胞计数。
- 根据每孔细胞计数计算病毒所需的MOI，并在冰上用完整的RPMI相应地稀释病毒储备。
注意：MOI 0.1/1.26 × 106 hNEC/孔 = 1.26 × 105 H3N2 病毒颗粒，每孔 30 μL（24 孔）/100 μL（12 孔） - 对于用于感染实验的其余孔，将50μL（对于24孔）/ 150μL（对于12孔）的1x dPBS加入膜插入物的顶端室中，在37°C下孵育10分钟，并除去1x dPBS。
- 通过将插入物转移到新板上，将膜插入物转移到新板上，将完整的RPMI添加到孔中，从而将膜插入物中的基础培养基（350μL（对于24孔）/ 700μL（对于12孔））来改变膜插入物中的基础培养基以完成RPMI介质。
注意：当 hNESPC 完全分化为 hNEC 时，它们对不同培养基的耐受性/容许性长达 72 小时，当培养基切换到 RPMI12 时，形态或组织没有变化。RPMI用于支持PBMC种群的增长和维持。 - 将制备的30μL（用于24孔）/ 100μL（对于12孔）病毒接种物加入膜插入物的顶端室中，在35°C下在5%CO2 气氛中孵育1小时，并从顶端室中除去病毒接种物。
- 将膜插入物的基础介质更换为新鲜的完全RPMI培养基，并在35°C下在5%CO2 气氛中孵育24小时。
- 第1天（建立hNECs+PBMC共培养）
- 从第0天开始，将所需数量的PBMC接种在150μL（对于24孔）/ 300μL（对于12孔）的完整RPMI培养基中，方法是将PBMC悬浮液直接加入每个未感染或受感染的hNEC孔的基础室中（1.5×106 用于24孔板，3×106 用于12孔板）。在37°C下孵育24/48小时。
注意：共培养物建立后基底室中的最终体积为500μL（对于24孔）/ 1000μL（对于12孔）。
- 从第0天开始，将所需数量的PBMC接种在150μL（对于24孔）/ 300μL（对于12孔）的完整RPMI培养基中，方法是将PBMC悬浮液直接加入每个未感染或受感染的hNEC孔的基础室中（1.5×106 用于24孔板，3×106 用于12孔板）。在37°C下孵育24/48小时。
- 第2-3天（病毒感染后48/72小时收获多溴联苯）
- 收集顶端上清液（病毒感染后48/72小时）
- 向每个顶端室中加入50μL（用于24孔）/ 150μL（对于12孔）1x dPBS，并在37°C下孵育10分钟。将 1x dPBS 收集在 1.5 mL 离心管中。等分试样25μL（用于24孔）/ 50μL（用于12孔）的上清液，用于在新的1.5mL管中进行斑块测定，并立即在-80°C下冷冻储备液和等分试样。
- 从hNECs收集细胞RNA（病毒感染后48/72小时）
- 将膜插入物转移到干净的孔中，加入300μL（对于24孔）/ 600μL（对于12孔）的RNA裂解缓冲液到顶点室，并在rtp下孵育5分钟。将上清液收集在1.5mL离心管中，并将其储存在-80°C直至RNA提取以进行分子分析。
- 收获多溴联苯（病毒感染后48/72小时）
- 使用无菌移液器尖端的宽基部，轻轻刮擦孔表面以移出可能粘附在孔表面的活化PBMCs。将含有PBMC的基础培养基收集在2 mL离心管中。
- 用300μL 1x dPBS冲洗孔2x，并将洗涤物收集在同一个2mL管中。离心2mL管（500× g，5分钟，rtp），并将上清液收集在新鲜的2mL管中而不会干扰细胞沉淀。将上清液储存在-80°C用于细胞因子和趋化因子分析;将细胞沉淀重悬于200μL的1x dPBS中。
- 收集顶端上清液（病毒感染后48/72小时）
6. 流式细胞术
注：本部分方案直接从上一节继续，使用步骤5.3.3.2中的PBMC细胞悬浮液。在本节的以下步骤中，确保最小的光照。表面染色标记物的样品面板可以在 表2中找到。
- 表面染色
- 将重悬的PBMC细胞沉淀转移到96-V底孔板中。离心机以800× g 裂解物3分钟，并除去上清液。
- 将所有PBMC（“未染色”除外）与100μL活性染色剂在rtp下孵育15分钟。用 150 μL 磁性活化细胞分选 （MACS） 缓冲液补充至 200 μL。在800× g 下离心裂解物3分钟，并弃去上清液。
- 制备一组具有适当稀释比和每次反应最终体积为50μL的靶向表面染色抗体（用MACS缓冲液补充以获得最终体积）。通过使用多通道移液器向细胞中加入50μL制备的抗体混合物来进行表面染色。在黑暗中在4°C下孵育15分钟。
- 通过加入150μLMACS缓冲液进行洗涤。将裂解物以800× g 离心3分钟，并弃去上清液。如果不需要细胞内染色，请在步骤6.3中直接进行15分钟的孵育。
- 细胞内染色（如果需要）
- 向每个孔中加入100μL固定和透化溶液。在4°C下在黑暗中孵育20分钟。用100μL1x MACS缓冲液加注孔。
- 离心（800× g，3分钟，25°C），并除去上清液。通过加入200μL1x渗透性洗涤缓冲液重复洗涤。离心（500× g，3分钟，25°C），并除去上清液。
- 为感兴趣的抗体组合制备稀释液，以使用1x透化洗涤缓冲液实现50μL的最终体积。在黑暗中在冰上孵育30分钟。加入200μL1x透化洗涤缓冲液。
- 离心细胞（800× g，3分钟，4°C），并除去上清液。将细胞重悬于100μL荧光活化的细胞分选缓冲液中。
- 将200μL裂解溶液移液到每个孔中。在rtp孵育15分钟。将裂解物以800× g 离心3分钟，弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于200μLMACS缓冲液中。按照前面概述的设置13进行流式细胞术，或在黑暗中储存在4°C。
7. 细胞因子和趋化因子水平的测定
- 根据制造商的方案18，使用免疫学多重测定法处理25μL基础室上清液。
- 使用多重管理器软件计算每种分析物的浓度，该软件利用标准曲线的曲线拟合算法（5个参数）。
8. 病毒污染的评估
- 使用提取试剂盒在4组溶液上提取病毒RNA：储备H3N2溶液，用于感染的MOI 0.1稀释液，MOI 0.1的10倍连续稀释度以及样品的基础培养基（病毒感染后48和72小时）12。
- 选择非结构基因（NS1）和基质（M1）作为聚合酶链反应（PCR）的靶标（参见代表性实验中使用的引物 的材料表 ）。
- 在进行定量PCR（qPCR）以测量NS1和M1水平作为病毒存在的代理之前，进行逆转录PCR（RT-PCR）（42°C，60分钟）将病毒RNA转化为cDNA，并将水平与从MOI 0.1等分试样的10倍连续稀释进行的RT-qPCR获得的标准曲线相关联。反应混合物的组成见 表3 ，并使用以下条件：在95°C下预臺育10分钟，然后进行3步扩增40次循环：95°C为10 s，60°C为10 s，72°C为30 s ;熔化曲线：95 °C 持续 10 s，65°C 持续 60 s，97°C 持续 1 s。
9. 斑块测定
- 第0天：在24孔平板中播种MDCK（Madin Darby犬肾）
- 从汇合MDCK细胞的T75烧瓶中取出培养基。用1x PBS洗涤2次，以去除所有血清痕迹。胰蛋白酶消化MDCK细胞，方法是加入10mL胰蛋白酶，并在37°C下在5%CO2 气氛中孵育20-30分钟，直到细胞分离。
注：请勿点击烧瓶，因为这可能会导致结块。 - 将细胞悬浮液移液到含有2 mL完整Eagle's Minimal Essential Medium （EMEM）的15 mL管中。离心机（300× g，5分钟，rtp），并除去上清液。
- 将细胞重悬于6 mL完全EMEM中。通过台盼蓝染色计数细胞。
- 将MDCK细胞悬浮液稀释至1×105 个细胞/ mL的浓度，并将稀释的悬浮液接种在无菌24孔板的每个孔中1mL。在37°C下在5%CO2 气氛中孵育24小时，以获得每个孔中MDCK细胞的汇合单层。
- 从汇合MDCK细胞的T75烧瓶中取出培养基。用1x PBS洗涤2次，以去除所有血清痕迹。胰蛋白酶消化MDCK细胞，方法是加入10mL胰蛋白酶，并在37°C下在5%CO2 气氛中孵育20-30分钟，直到细胞分离。
- 第1天：MDCK细胞感染
- 准备感染培养基。从24孔板中的MDCK单层中取出培养基，并用1x dPBS洗涤2x。对于第二次洗涤，将PBS留在孔中，同时准备病毒的连续稀释液。
- 在冰上解冻病毒样品，并在24孔板中连续稀释，以实现从10-1到10-6的连续稀释。
注意：例如，用270μL感染培养基填充24孔板中的每个孔。 - 将30μL病毒样品加入行中的第一个孔中。使用新的移液器吸头，充分混合并转移到行中的下一个孔中，将样品稀释10倍。继续进行，直到达到10-6 稀释;对所有病毒样本执行步骤9.2.1-9.2.3。
- 从MDCK板中取出PBS，并用100μL制备的病毒稀释液一式两次感染。对于对照孔，加入100μL感染培养基（不含病毒样品）。在35°C的5%CO2 气氛中孵育1小时，每15分钟摇动板以消除干斑。
- 除去病毒接种物，并为每个孔添加1 mL液体覆盖层。在35°C的5%CO2 气氛中孵育72小时。
- 第4天（感染后72小时）：斑块可视化
- 除去液体覆盖层，并用4%甲醛在1x PBS中固定细胞1小时。除去甲醛溶液，用1x PBS或蒸馏水洗涤一次。
- 通过加入1%结晶紫溶液染色固定细胞15分钟。除去结晶紫染料，用自来水清洗细胞。在 rtp 处干燥板。
- 干燥后，计数斑块，并根据以下公式计算病毒滴度：
×稀释因子的斑块数 = 100 μL 中的斑块数 - 形成单位
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Representative Results
虽然传统的T细胞构成了针对病毒感染的适应性免疫反应的主要库，以促进病毒清除，但先天性T细胞群在更广泛的谱系中起作用，以抑制病毒载量，以便在后期有效清除。因此，该方案专门创造了一种强大的条件来研究流感感染后的先天性T细胞，它们的活化及其功能群体，而不需要来自同一供体的上皮和免疫细胞样本。该协议也可以应用于其他病毒，尽管它可能仅限于具有顶端释放的病毒，即，没有病毒应该进入基底层与PBMC隔室接触。
基于 图1中的代表性结果，该方案可以帮助获得从3T3饲养层中的原代细胞悬浮液生长的hNESPC群体。 图1 提供了hNESPC在3T3馈线层上生长时预期进展的样本。这些细胞将用于ALI培养物中的分化，以获得多层hNEC，并具有功能性纤毛细胞和高脚杯细胞（图4）。使用hNECs，可以使用流式细胞术研究先天性T细胞活化。 图5 所示结果显示MAIT细胞，γδ-T细胞和NK细胞群的检测，在涉及感染流感病毒的hNECs的共培养物中显着增加。然后，这种设置可以应用于流感病毒的其他菌株，以梳理出跨菌株的普遍群体，以及其他病毒及其激活先天T细胞群的能力。此外，检测面板还可以根据感兴趣的先天免疫细胞群进行定制，以观察它们在与受感染的上皮细胞共培养条件下各自的活化。
图1：hNESPC在播种后2/5/10天在3T3饲养层上生长。 第2天：注意hNESPC的小岛（一个例子用白色箭头标定），应在3T3饲养层播种2天后观察。第5天：第2天观察到的小岛现在应该更大（hNESPC的岛屿的例子由绿色圆圈划定），并且应该观察到3T3层正在退化。第10天：hNECPS应该主导整个板，很少或没有可见的3T3细胞。第2天和第5天的比例尺 = 50 μm（基于200x的放大倍率），第10天的比例尺= 100 μm，基于100x的放大倍率。缩写：hNESPC = 人鼻上皮干/祖细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：24 孔板和 12 孔板中膜插入物的孔图。 注意每个隔间使用的介质体积。hNESPC在膜插入物的顶端室中播种。缩写：hNESPC = 人鼻上皮干/祖细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图3：用于ALI共培养建立的24孔板和12孔板中膜插入物的孔图。 注意每个隔间使用的介质体积。请注意，对于培养基变化之间的不同间隔（2 天/3 天），要使用的培养基体积的差异。缩写：ALI =气液界面。 请点击此处查看此图的大图。
图4：hNEC层的β4-微管蛋白和MUC5AC共染色。 β4-微管蛋白被染成绿色，而MUC5AC被染成红色。细胞核用DAPI染成蓝色。MUC5AC表示存在产生粘液的高脚杯细胞，而β4-微管蛋白表示纤毛细胞上存在纤毛。比例尺 = 20 μm（基于 600 倍放大倍率）。缩写：hNEC =人鼻上皮细胞;MUC5AC = 粘蛋白 5AC;DAPI = 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的大图。
图5：有或没有鼻上皮或流感感染的上皮孵育24小时的PBMC的代表性结果。 MAIT，Vδ1 T细胞，Vδ2 T细胞和NK细胞的活化通过细胞类型特异性标记物测定，包括Vα 7.2 TCR，Vδ1 TCR，Vδ2 TCR，CD56和CD69染色。门上方的值表示CD69阳性细胞的百分比。缩写：PBMC=外周血单核细胞;上皮=鼻上皮;FLU-Epith = 流感感染的上皮;MAIT = 粘膜相关不变性T细胞;NK = 自然杀伤;TCR = T细胞受体;CD = 分化簇。 请点击此处查看此图的大图。
| 中等 | 食谱 | 组成 | 评论 |
| 中 3 | DMEM/营养混合物F-12 | 500 毫升 | |
| 人上皮生长因子 | 5纳克/毫升 | ||
| 胰岛素 | 2.5 微克/毫升 | ||
| 霍乱毒素 | 0.1 nM | ||
| 氢化可的松 | 0.5微克/毫升 | ||
| 3，3'，5-三碘-l-甲状腺原氨酸 | 2 nM | ||
| N-2 补充剂 | 5 毫升 | 10 微升/毫升 | |
| 抗生素-抗真菌药 | 5 毫升 | ||
| 差异化培养基 | 肺泌尿-ALI 基础培养基 | 441 毫升 | |
| 肺病 -阿里 10x 补充剂 | 50 毫升 | ||
| 氢化可的松溶液（200x） | 2.5 毫升 | ||
| 0.2% （2 毫克/毫升;1000 国际单位/毫升）磷酸盐缓冲盐水中的肝素钠盐 | 1 毫升 | ||
| 抗生素 - 抗真菌药（100x） | 5 毫升 | ||
| 肺动脉粥样蛋白-ALI维持补充剂（100x） | 500 微升 | 仅在使用前添加 | |
| 完整的Dulbecco的最小必需培养基（DMEM） | 二甲基吡喃/高血糖 | 450 毫升 | |
| 热灭活胎牛血清 | 50 毫升 | ||
| 抗生素 - 抗真菌药（100x） | 5 毫升 | ||
| 完整的罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）中型 | RPMI 1640 （w L-谷氨酰胺） | 445 毫升 | |
| 热灭活胎牛血清 | 50 毫升 | ||
| 抗生素 - 抗真菌药（100x） | 5 毫升 | ||
| 完整的鹰的最小必需培养基（EMEM） | EMEM （w L-谷氨酰胺） | 450 毫升 | |
| 热灭活胎牛血清 | 50 毫升 | ||
| 感染介质 | EMEM （w L-谷氨酰胺） | 4 毫升 | |
| TPCK 胰蛋白酶 （500 微克/毫升） | 8 微升 | 最终TPCK胰蛋白酶浓度为1μg/mL | |
| 磁性活化细胞分选缓冲液 | 1x PBS | 498 毫升 | |
| 0.5 M 乙二胺四乙酸 | 2 毫升 | ||
| BSA（组织培养等级） | 2.5克 | ||
| 丝裂霉素 C 补充剂完全 DMEM | 完整的 DMEM | 10 毫升 | |
| 丝裂霉素 C | 500 微升 | 丝裂霉素 C （10 微克/毫升） |
表1：所用介质的配方。
| 细胞表面标记 | 荧光基团 |
| Vδ1 T细胞受体 | 荧光素异硫氰酸酯（FITC） |
| Vδ2 TCR | 佩里替宁-胆汁蛋白（PerCP） |
| 三氧化硫 | V500系列 |
| CD8 | 异叶花青素-菁7染料（APC-Cy7） |
| CD14型 | 藻红素-CF594 |
| CD56型 | 藻红素（PE）-菁7（Cy7） |
| CD69型 | 亮紫色 421 （BV421） |
| CD83型 | 异叶花青素 |
| CD161型 | 亮紫色 605 （BV605） |
| Vα 7.2 | 藻红素 |
| CD38型 | 亮紫外线 395 （BUV395） |
表2：样品表面染色标记。
| qPCR 反应混合物 | qPCR 预混液 | 5 微升 |
| 无核酸酶水 | 3 微升 | |
| 前向底漆 （1 mM） | 0.5 微升 | |
| 反向底漆 （1 mM） | 0.5 微升 | |
| cDNA （12.5 纳克/μL） | 1 μL | |
| 总反应量 | 10 微升 | |
| RT-PCR 反应混合物 | RT-PCR 5x 缓冲液 | 2.5 微升 |
| 随机引物（500 纳克/μL） | 0.2 微升 | |
| 核糖核酸酶抑制剂 | 0.625 μL | |
| dNTP 混合 | 2.5 微升 | |
| 反转录酶 | 0.5 微升 | |
| 核糖核酸（200纳克/微升） | 1 μL | |
| 无核酸酶水 | 12.675 微升 | |
| 总反应量 | 20 微升 |
表3：逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和定量PCR（qPCR）的反应混合物的配方。
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Discussion
针对病毒的先天免疫反应是抗病毒管理中一个尚未得到充分研究的领域。气道上皮细胞和先天免疫细胞协同工作以抑制感染期间的病毒复制，此外，如果病毒载量未受到控制，则作为过度反应的决定因素12，13，17。然而，开发用于研究上皮 - 先天免疫串扰的相关人类模型以研究先天免疫细胞的激活以赋予适当的抗病毒反应仍然是一个挑战。因此，这种ALI共培养模型代表了一种多功能技术，可用于评估鼻上皮层与免疫细胞之间的一系列相互作用。由于该模型结合了体外分化的hNEC，通过流式细胞术进行的PBMC活化分析和病毒感染，因此已经明确划分了许多关键步骤，以确保该协议的成功。此外，还可以对所涉及的气道部分进行进一步的修改，其中可以使用来自上气道和下气道的体外分化细胞，从而为方案增加了另一层多功能性。
然而，当在病毒感染中处理上皮免疫细胞串扰时，至关重要的是病毒不直接与PBMCs相互作用，以鉴定hNEC释放的早期局部上皮衍生的可溶性因子。因此，该模型更适合于检查具有极化病毒释放的病毒，其中病毒仅从顶端表面萌芽进入顶端室，例如，流感病毒12 和SARS-CoV-2病毒19。此外，为了防止顶端释放病毒泄漏到基底腔室中，影响实验，足够厚度的完整上皮层至关重要。因此，重要的是进行TEER测量和病毒RNA定量，以确保结果没有病毒泄漏到基底室13，16，20中。>1000的TEER读数意味着完整的多层细胞适用于具有极化释放的病毒;基础培养基应不含任何病毒RNA污染13，15，16。然而，该模型对于双向释放病毒（如鼻病毒）的效用仍有待探索16.这种病毒不限于以极化的方式释放其后代，并且可能双向将新病毒释放到上皮的顶端和基部区域。在此模型可应用于具有非极化释放的病毒之前，需要进一步优化。
由于该协议涉及处理来自不同个体的人类样本，因此没有两个hNECs样本将表现出相同的性质和响应12，16。例如，由末端分化的hNEC层产生的粘液的粘度可能差异很大。纤毛发育的速度也可能不同。因此，在遵守该协议中规定的准则时，必须具有一定程度的灵活性。虽然当然可以利用上皮细胞系，但这将消除上皮层不同细胞类型之间相互作用的复杂性（粘液，不同细胞类型之间的相互作用），这将是研究上皮串扰如何影响PBMC反应的理想选择。原代细胞系对于模仿鼻组织的生理学是必要的，其中细胞是多层的，并且不同的细胞类型局限于它们自己的个体生态位，尽管变异性可能是一个问题。通过利用单细胞RNA测序来分化和分离异质细胞群，可以克服这方面的变异性。
可以评估的相互作用类型确实受到PBMC和hNECs起源的限制。当从不同的供体获得PBMMc和hNECs时，确保上皮完整性和分离至关重要。当PBMCs与hNEC接触时，可能发生同种异体免疫反应。因此，唯一相关的相互作用是由可溶性因素介导的相互作用，这些因子可以通过膜插入物，如上面的方案所述。然而，当两个细胞群来自同一个体时，该模型具有额外的效用层，因为现在可以评估hNECs和PBMC群体之间的常规免疫细胞反应，包括T细胞介导的细胞毒性和抗体介导的反应。此外，还可以进行表观遗传学研究，以检查基因组的修饰如何影响细胞因子基因/蛋白表达/分泌。
此外，可以将不同的细胞群添加到基底室中以进一步研究特定的细胞群。这可以通过分离感兴趣的细胞群（T细胞，NK细胞，单核细胞）并将其引入基底室而不是PBMC来执行。然而，该模型不能用于研究由于膜分离两个细胞群而需要直接接触的细胞相互作用。因此，适应性免疫反应的研究可能受到这一细节的限制。总之，这种ALI共培养模型为鼻子组织和免疫细胞之间串扰的体外研究提供了一个通用的起点。本手稿中描述的协议试图提供一种指南，即使人口/条件发生变化，该指南也会有所帮助。
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Disclosures
所有作者均声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢新加坡国立大学耳鼻喉科和微生物学和免疫学系的研究人员，感谢他们在hNEC培养和病毒培养相关工作方面的帮助。我们还要感谢国立大学医院耳鼻喉科的外科医生和外科团队，感谢他们协助提供研究所需的细胞和血液样本。
这项研究由国家医学研究委员会资助，新加坡No。NMRC/CIRG/1458/2016（致德云·王）和MOH-OFYIRG19may-0007（致谭启森）。Kai Sen Tan是2019年欧洲过敏和临床免疫学（EAACI）研究奖学金支持的获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |
References
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