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Developmental Biology

सामूहिक आंदोलन विशेषताओं का विश्लेषण करने के लिए प्राथमिक माउस भ्रूणीय पैलेटल मेसेंचिम कोशिकाओं के अलगाव और समय-चूक इमेजिंग

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/62151
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University
* These authors contributed equally

Summary

हम दो आयामी (2डी) विकास और घाव-मरम्मत परख के समय-चूक इमेजिंग के लिए प्राथमिक माउस भ्रूणीय महल मेसेंचिमल कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम सेल-स्ट्रीम गठन और दिशात्मक गतिशीलता निर्धारित करने के लिए समय-चूक इमेजिंग डेटा के विश्लेषण के लिए कार्यप्रणाली भी प्रदान करते हैं।

Abstract

तालू का विकास एक गतिशील प्रक्रिया है, जिसमें जीभ के बगल में द्विपक्षीय ताल अलमारियों का ऊर्ध्वाधर विकास शामिल है जिसके बाद ऊंचाई और जीभ के ऊपर संलयन होता है। इस प्रक्रिया में दोष फांक तालु, एक आम जन्म दोष का कारण बनते हैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि पैलेटल शेल्फ ऊंचाई में एक रीमॉडलिंग प्रक्रिया शामिल है जो शेल्फ के अभिविन्यास को ऊर्ध्वाधर से क्षैतिज में बदल देती है। इस डायनेमिक रिमॉडलिंग में पैलेटल शेल्फ मेसेंचिमल कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करना मुश्किल रहा है। समय-चूक-इमेजिंग आधारित मात्रात्मक विश्लेषण हाल ही में यह दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि प्राथमिक माउस भ्रूणीय पाॅलल मेसेंचिमल (एमईपीएम) कोशिकाएं सामूहिक आंदोलन में स्वयं को व्यवस्थित कर सकती हैं। मात्रात्मक विश्लेषण तालू ऊंचाई दोषों के साथ एक माउस मॉडल से उत्परिवर्ती MEPM कोशिकाओं में मतभेदों की पहचान कर सकता है । यह पत्र E13.5 भ्रूण से एमईपीएम कोशिकाओं को अलग-थलग करने और संस्कृति देने के तरीकों का वर्णन करता है- विशेष रूप से समय-चूक इमेजिंग के लिए- और सामूहिक आंदोलन के विभिन्न सेलुलर गुणों का निर्धारण करने के लिए, जिसमें स्ट्रीम निर्माण, आकार संरेखण और दिशा के हठ के उपाय शामिल हैं। यह posits है कि MEPM कोशिकाओं को ऊंचाई की गतिशील प्रक्रिया के दौरान पैलेट शेल्फ mesenchyme की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक प्रॉक्सी मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं । ये मात्रात्मक तरीके क्रैनियोफेशियल क्षेत्र में जांचकर्ताओं को नियंत्रण और उत्परिवर्ती कोशिकाओं में सामूहिक आंदोलन विशेषताओं का आकलन करने और तुलना करने की अनुमति देंगे, जो पैलेट शेल्फ ऊंचाई के दौरान मेसेंचिमल रिमॉडलिंग की समझ को बढ़ाएगा । इसके अलावा, एमईपीएम कोशिकाएं सामान्य रूप से सामूहिक सेल आंदोलन की जांच के लिए एक दुर्लभ मेसेंचिमल सेल मॉडल प्रदान करती हैं।

Introduction

तालू विकास का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है क्योंकि तालुजीनाइस में दोष फांक तालु का कारण बनते हैं - एक सामान्य जन्म दोष जो अलग-अलग मामलों में या सैकड़ों सिंड्रोम के हिस्से के रूप में होता है1,2। भ्रूण तालू का विकास एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें भ्रूणीय ऊतक का आंदोलन और संलयन शामिल है। इस प्रक्रिया को चार प्रमुख चरणों में विभाजित किया जा सकता है: 1) पैलेटल अलमारियों का शामिल होना, 2) जीभ के बगल में पाताल अलमारियों का ऊर्ध्वाधर विकास, 3) जीभ के ऊपर पाताल अलमारियों की ऊंचाई, और 4) मिडलाइन1,3,4पर पैलेट अलमारियों का संलयन। पिछले कई दशकों में, कई माउस म्यूटेंट की पहचान की गई है जो प्रकट फांक तालु5,6,7,8। इन मॉडलों के लक्षण वर्णन ने पैलेट शेल्फ प्रेरण, प्रसार और संलयन चरणों में दोषों का संकेत दिया है; हालांकि, पाताल शेल्फ ऊंचाई दोष दुर्लभ किया गया है । इस प्रकार, पाताल शेल्फ ऊंचाई की गतिशीलता को समझना अनुसंधान का एक पेचीदा क्षेत्र है।

पैलेटल शेल्फ ऊंचाई दोषों के साथ कुछ माउस म्यूटेंट के सावधानीपूर्वक विश्लेषण ने वर्तमान मॉडल को दिखा दिया है कि तालूल शेल्फ का बहुत पूर्वकाल क्षेत्र फ्लिप करने के लिए प्रकट होता है, जबकि तालू1,3,4के पीछे के क्षेत्रों के लिए क्षैतिज आंदोलन या "रीमॉडलिंग" के लिए एक ऊर्ध्वाधर 9,10,11. पाकल शेल्फ के मध्यीय किनारे एपिथेलियम की संभावना इस रीमॉडलिंग के लिए आवश्यक सिग्नलिंग शुरू करती है, जिसे तब पैलेटल शेल्फ मेसेनचिम द्वारा संचालित किया जाता है। हाल ही में, कई शोधकर्ताओं ने माउस मॉडल में पाताल शेल्फ ऊंचाई में देरी की पहचान की है जिसमें क्षणिक मौखिक आसंजन दिखाया गया है जिसमें पाताल अलमारियों12,13शामिल हैं । मेसेंचिमल रिमॉडलिंग में क्षैतिज दिशा में उभार बनाने के लिए कोशिकाओं का पुनर्गठन शामिल है, जबकि साथ ही ऊर्ध्वाधरदिशा9,10,14में पैलेटल शेल्फ को वापस लेना। पाताल शेल्फ ऊंचाई और अंतर्निहित मेसेन्चिमल रिमॉडलिंग को प्रभावित करने के लिए प्रस्तावित कई तंत्रों में सेल प्रसार15 , 16,17,केमोटेक्टिक ग्रेडिएंट18और बाह्राश मैट्रिक्स घटक19,20हैं । एक महत्वपूर्ण सवाल उठा: क्या पैलेटल शेल्फ ऊंचाई में देरी Specc1l-कमीचूहों में भी आंशिक रूप से पैलेटल शेल्फ रीमॉडलिंग में एक दोष के कारण मनाया जाता है, और क्या यह रीमॉडलिंग दोष प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाओं के व्यवहार में एक आंतरिक दोष में प्रकट हो सकता है21?

जीनअभिव्यक्ति22, 23, 24, 25, 26, 27,28,29,और कुछ प्रसार30,31और प्रवास25,31, 32 शामिल कई अध्ययनों के लिए क्रैनियोफेशियल क्षेत्र में प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाओं का उपयोग किया गयाहै। , लेकिन सामूहिक सेल व्यवहार विश्लेषण के लिए कोई नहीं । एमईपीएम कोशिकाओं की समय-चूक इमेजिंग 2डी संस्कृति और घाव-मरम्मत परख में की गई थी ताकि यह दिखाया जा सके कि एमईपीएम कोशिकाओं ने दिशात्मक आंदोलन प्रदर्शित किया और सामूहिक आंदोलन21के घनत्व-निर्भर सेल धाराओं-विशेषताओं का गठन किया। इसके अलावा, Specc1l उत्परिवर्ती कोशिकाओं संकरा सेल धाराओं का गठन किया और अत्यधिक चर सेल प्रवास प्रक्षेप पथ दिखाया । समन्वित गतिशीलता की इस कमी को Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूण13,21में तालू ऊंचाई में देरी में योगदान करने के लिए माना जाता है । इस प्रकार, प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाओं का उपयोग करने वाले ये अपेक्षाकृत सरल परखें पैलेटल शेल्फ ऊंचाई के दौरान मेसेंचिमल रीमॉडलिंग का अध्ययन करने के लिए प्रॉक्सी के रूप में काम कर सकती हैं। यह पेपर 2डी और घाव-मरम्मत परख के लिए प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के साथ-साथ समय-चूक इमेजिंग और विश्लेषण का वर्णन करता है।

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Protocol

जानवरों से जुड़े सभी प्रयोगों को उनके दिशा-निर्देशों और विनियमों (प्रोटोकॉल संख्या: 2018-2447) के अनुसार, कुमसी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ किया गया था ।

1. हार्वेस्ट E13.5 भ्रूण

  1. एक सीओ2 साँस लेना कक्ष का उपयोग कर या संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित एक प्रक्रिया द्वारा गर्भवती महिला चूहों इच्छामृत्यु । तुरंत विच्छेदन के लिए आगे बढ़ें।
  2. त्वचा और पेरिटोनम को हटाकर पेट की गुहा के अवर आधे हिस्से को बेनकाब करें। गर्भाशय के दोनों सींगों को उत्पादित करें, जिनमें E13.5 भ्रूण होते हैं।
  3. गर्भाशय को अतिरिक्त रक्त, बाल या अन्य मलबे को कुल्ला करने के लिए गर्भाशय को पूर्ववार्मेड 37 डिग्री सेल्सियस बाँझ फास्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में रखें। गर्भाशय को बाँझ पीबीएस से भरे बाँझ 10 सेमी पकवान में रखें।
  4. छोटी कैंची का उपयोग करना, गर्भाशय की लंबाई के साथ गर्भाशय की दीवार के माध्यम से कटौती करने के लिए प्रत्येक भ्रूण का पर्दाफाश, अभी भी अपनी जर्दी थैली में । भ्रूण के आसपास जर्दी थैली निकालें, लेकिन यदि आवश्यक हो तो इसे जीनोटाइपिंग के लिए बचाएं। भ्रूण के रूप में हटा रहे हैं, एक 12 अच्छी तरह से PBS से भरा थाली के अपने ही कुएं में प्रत्येक भ्रूण जगह है ।

2. भ्रूण से पैलेटल अलमारियों का विच्छेदन(चित्रा 1)

नोट: स्टेनलेस स्टील विच्छेदन उपकरणों को स्टरलाइज करें (सामग्री की मेजदेखें) प्रत्येक भ्रूण को 100% एथिल अल्कोहल (एटोह) के बीकर में पहले रखकर, फिर 10 एस के लिए 350 डिग्री सेल्सियस पर एक उपकरण स्टरलाइजर में, और फिर उन्हें 100% एटोह के दूसरे बीकर में ठंडा करें।

  1. एक निष्फल छिद्रित चम्मच का उपयोग करके, भ्रूण को मेम्प संस्कृति माध्यम से भरे एक नए 10 सेमी पकवान में रखें जिसमें दुलबेको के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (डीएमईएम) शामिल हैं जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), एल-ग्लूटामाइन (4 m M L-Glu), और एंटीबायोटिक्स-पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 यूनिट/एमएलएएल) शामिल हैं।
  2. बाँझ कैंची(चित्रा 1A,लाल बिंदीदार रेखा) का उपयोग करके जबड़े की रेखा के ठीक नीचे भ्रूण को काटना। स्टरलाइज्ड फाइन #5 संदंश का एक बिंदु मुंह में डालकर, इसे सिर्फ गाल के अंदर रखते हुए निचले जबड़े को हटा दें। डाला संदंश के बिंदु के माध्यम से पुश जब तक यह खोपड़ी के पीछे से बाहर निकलता है ।
  3. चित्रा 1Bमें पीली रेखा के साथ संदंश उन्मुख, ताकि संदंश के दूसरे पक्ष (जो अभी भी भ्रूण के बाहर है) सिर्फ कान नहर पर मंडरा रहा है, तो चुटकी संदंश ऊतक में कटौती करने के लिए बंद । यदि आवश्यक हो, तो अब बंद संदंश के सीम के साथ एक और ठीक संदंश चलाएं ताकि किसी भी ऊतक के माध्यम से कटौती की जा सके जो चुटकी से पूरी तरह से कटे नहीं थे।
  4. भ्रूण सिर के दूसरे पक्ष के लिए पिछले कदम दोहराएं। खोपड़ी के निचले जबड़े, जीभ और अवर भाग को पूरी तरह से हटाने और पैलेट अलमारियों को बेनकाब करने के लिए चुटकी-कट प्रक्रिया जारी रखें।
  5. आंखों के ठीक ऊपर काटकर खोपड़ी के कपाल को हटा दें, जैसा कि चित्रा 1C (ग्रीन लाइन) में दिखाया गया है। सिर को उसके बायीं ओर या दाईं ओर रखकर और भ्रूण की आंख के स्तर के ठीक ऊपर खोपड़ी के सामने और पीछे छोटे स्टेनलेस स्टील कैंची के बिंदुओं को पोजिशनिंग करके ऐसा करें । कैंची के एक तेज स्निप के साथ खोपड़ी के शीर्ष को काट दें, एक सपाट सतह बनाते हैं जो बाद के चरणों में स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण होगा और जब पक्ष से देखा जाता है तो वह चित्रा 1D की तरह दिखना चाहिए।
  6. सिर के शेष हिस्से को उल्टा रखें, सिर के बेहतर पहलू (कपाल हटाया) पकवान के तल पर फ्लैट आराम के साथ, जो पैलेट शेल्फ हटाने के लिए एक स्थिर सतह प्रदान करेगा। एक पल के लिए पैलेट अलमारियों, जो अब उजागर कर रहे है और ऊपर का सामना करना पड़ रहा है और सिर के पूर्वकाल आधे में एक केंद्रीय नाली के दोनों ओर दो उठाया लकीरें के रूप में दिखाई देगा की पहचान करने के लिए(चित्रा 1E)।
  7. अलमारियों को हटा दिए जाने के दौरान इसे स्थिर करने के लिए सिर के शेष हिस्से को पकवान पर पिन करें। सिर के नाक क्षेत्र के पास ऊतक के माध्यम से एक ठीक संदंश का एक बिंदु डालने, पाताल अलमारियों के पूर्वकाल, और खोपड़ी के आधार के माध्यम से संदंश के दूसरे बिंदु डालें, पीछे से पाताल अलमारियों के लिए। पैलेटल अलमारियों के उत्तेजन का प्रदर्शन करते समय इन्हें जगह में रखें।
    1. एक हाथ से सिर को स्थिर करना, पहले हटाने के लिए दो अलमारियों में से किसी एक को चुनें, और शेल्फ की पार्श्व सतह के आधार पर ऊतक में ठीक संदंश की एक दूसरी जोड़ी के दोनों बिंदु डालें, और ऊतक(चित्रा 1F)को काटने के लिए चुटकी लें। शेल्फ की मध्यावधि सतह के आधार के साथ इसे दोहराएं और फिर शेल्फ के पूर्वकाल और पीछे के दोनों सिरों पर सिर से अलग करने के लिए।
  8. धीरे से शेल्फ उठा, अतिरिक्त चुटकी बनाने, के रूप में की जरूरत है, पूरी तरह से आसपास के ऊतकों से शेल्फ मुक्त करने के लिए ।
  9. दूसरे पाताल शेल्फ को हटाने के लिए पिछले दो चरणों को दोहराएं।
  10. अब आसपास के ऊतकों से मुक्त और पीबीएस(चित्रा जी)में रखा गया पाॅलल अलमारियों के साथ, पिपेट में अलमारियों को आकर्षित करने के लिए एक बाँझ प्लास्टिक बल्ब स्थानांतरण-पिपेट का उपयोग करें, और उन्हें पीबीएस के लगभग 500 μL के साथ 1.5 mL माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। बर्फ पर पैलेटल अलमारियों युक्त ट्यूबों को रखें क्योंकि बाकी कूड़े को उसी फैशन में संसाधित किया जाता है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, अलमारियों को विच्छेदन के तुरंत बाद (उन्हें बर्फ पर रखने के बदले) प्रीवार्म्ड ट्राइप्सिन (0.25%) युक्त 1.5 mL माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखा जा सकता है। नमूने नवसिखुआ हो जाएगा, लेकिन देखभाल के लिए प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के लिए सभी कार्यवाही कदम समय के रूप में सामूहिक रूप से नमूनों के इलाज के विरोध में लिया जाना चाहिए ।

3. एमईपीएम कोशिकाओं की संस्कृति

नोट: यहां वर्णित शर्तों के तहत, तालू एपिथेलियल कोशिकाएं पहले मार्ग से जीवित नहीं रहती हैं, जिसके परिणामस्वरूप शुद्ध तालू मेसेन्चिमल सेल संस्कृति होती है। एक ऊतक संस्कृति हुड में सभी चरणों को करने के लिए बाँझ तकनीक का उपयोग करें।

  1. इस प्रक्रिया में अलमारियों को त्यागने के लिए ध्यान नहीं रखते हुए, 1.5 एमएल ट्यूब से पीबीएस को एस्पिरेट और त्यागें। तुरंत प्रत्येक ट्यूब में प्रीवार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) ट्राइपसिन (0.25%) के 200 माइक्रोन जोड़ें जिसमें पैलेटल अलमारियों शामिल हैं। ट्राइप्सिनीकरण में तेजी लाने के लिए 1000 माइक्रोल पिपेट टिप का उपयोग करके ट्राइप्सिन में अलमारियों को संक्षेप में पाइप्ट करें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, फिर ऊतक को तोड़ने में मदद करने के लिए प्रत्येक नमूने को फिर से ऊपर और नीचे पाइप करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 5 मिनट के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, और ऊतक के वियोजन को पूरा करने के लिए एक बार फिर ऊपर और नीचे पाइप करें।
    नोट: अलमारियों को पूरी तरह से या लगभग पूरी तरह से अलग किया जाना चाहिए और ऊतक शेष का कोई दृश्य हिस्सा नहीं होने के साथ ट्राइप्सिन में निलंबित कर दिया जाना चाहिए।
  3. प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब में एमईपीएम संस्कृति माध्यम (चरण 2.1) के 800 माइक्रोन जोड़ें। कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 5 मिनट के लिए 200 × जी पर 1.5 एमएल ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट निकालें, और एमईपीएम संस्कृति माध्यम के 1 मिलील में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  4. एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति में MEPM कोशिकाओं प्लेट-MEPM संस्कृति माध्यम युक्त प्लेट का इलाज किया । कोशिकाओं को 5% सीओ 2 के साथ इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर12घंटे के लिए प्लास्टिक की सतह का पालन करने की अनुमति दें।
    नोट: रातोंरात इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं के विशाल बहुमत (~ 90%) इस बिंदु पर, पालन कोशिकाओं को काफी सजातीय दिखेगा, एक त्रिकोणीय या थोड़ा लम्बी आकार के साथ ।
  5. पुराने माध्यम को धीरे-धीरे पसंद करके हर दिन माध्यम बदलें और तुरंत ~ 1 मिनट के लिए कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना गर्म बाँझ पीबीएस के 1 एमएल के साथ बदलें। पीबीएस को एस्पिरेट करें, और प्रीवार्मेड एमईपी संस्कृति माध्यम के 3 एमएल के साथ बदलें।
  6. कोशिकाओं को मार्ग एक बार वे १००% ढुलमुल हो जाते हैं ।
    नोट: MEPM कोशिकाओं को लगभग दैनिक संख्या में दोगुनी से पैदा करना चाहिए ।
    1. कोशिकाओं को पारित करने के लिए, धीरे-धीरे पुराने माध्यम को एस्पिरेट करें, और इसे तुरंत ~ 1 मिनट के लिए कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना गर्म पीबीएस के साथ बदल दें। पीबीएस को एस्पिरेट करें, और इसे 0.5 एमएल प्रीवार्मेड 0.25% ट्राइपसिन से बदलें।
    2. ~ 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, या जब तक कोशिकाओं पकवान की सतह से अलग जब धीरे हाथ से आगे और पीछे हिल। एक बार कोशिकाओं को अलग कर लिया है, तुरंत ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं के लिए prewarmed MEPM संस्कृति माध्यम के 5 एमएल जोड़ें ।
    3. 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में इकट्ठा करें, और कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें। ट्राइपसिन और मध्यम को एस्पिरेट करें, और प्रीवार्मेड एमईपी कल्चर मीडियम के 3 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। धीरे-धीरे 6-अच्छी डिश के एक कुएं में कोशिकाओं के 1 एमएल को पिपेट करें, और कुल वॉल्यूम को 3 मिलील तक लाने के लिए एमईपीएम कल्चर मीडियम के 2 एमएल जोड़ें।
      नोट: यह कोशिकाओं के एक 1:3 विभाजन का गठन किया । एमईपीएम को तीन बार तक पारित किया जा सकता है। एमईपीएम का सीडिंग घनत्व कुछ हद तक लचीला है, और मौजूद कोशिकाओं की संख्या खेती पोत के आधार पर भिन्न होती है। हालांकि, MEPMs ठीक से पैदा नहीं करते जब भी विरल विभाजन और अपने नए पकवान में कम से 20-25% ढुलमुल होना चाहिए एक बार वे पालन करते हैं ।

4. एमईपीएम कोशिकाओं का क्रायोप्रिजर्वेशन

  1. एक बार ट्रिप्सिनाइज्ड एमईपी कोशिकाओं को गोली लग जाती है, तो ~ 1 × 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एमईपीएम संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को क्रायोवियल्स में पिप्ट करें, और सेल स्टॉक में 5% डाइमेथाइल्सुल्फोक्साइड की अंतिम एकाग्रता जोड़ें। क्रायोवियल को कैप करें, संक्षेप में उलटा करके मिलाएं, और तुरंत शीशियों को एक फ्रीजिंग कंटेनर में रखें जो 1 डिग्री सेल्सियस/मिनट की दर से ठंडा होता है।
  2. कूलर को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें। अगले दिन, क्रायोवियल्स को लंबे समय तक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन टैंक में ले जाएं।
  3. विगलन क्रायोप्रीवित एमईपीएम कोशिकाएं
    1. तरल नाइट्रोजन टैंक से क्रायोवियल निकालें, और कमरे के तापमान पर गल जब तक सामग्री तरल बनने के लिए शुरू करते हैं । सामग्री को 15 एमएल शंकु नली में खाली करें जिसमें प्रीवार्म्ड एमईपी कल्चर मीडियम का 9 एमएल होता है।
    2. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 200 × जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें। एमईपीएम संस्कृति माध्यम के 1 एमसीएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और कोशिकाओं को 6-अच्छी प्लेट के एक कुएं में पिप्ट करें। कुल वॉल्यूम को 3 मिलील में लाने के लिए गर्म एमईपीएम कल्चर मीडियम के 2 एमएल जोड़ें।
    3. 5% सीओ2के साथ एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं संस्कृति। रोजाना माध्यम बदलें।

5. एमईपीएम कोशिकाओं की लाइव इमेजिंग - 2D सामूहिक माइग्रेशन परख(चित्रा 2)

  1. लाइव इमेजिंग के लिए उपयोग करने के लिए एक प्लेट तैयार करें।
    1. ~ 1 मिमी की ऊंचाई पर बाँझ 2-अच्छी तरह से सिलिकॉन डालने को छोटा करने के लिए छोटी सर्जिकल कैंची या एक तेज स्केलपेल का उपयोग करें। उपयोग किए जा रहे प्रत्येक नमूने के लिए एक डालने तैयार करें।
    2. संदंश का उपयोग करना, छोटा 2-अच्छी तरह से सिलिकॉन डालने को 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं के केंद्र में रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए सभी किनारों के साथ नीचे दबाएं।
  2. इस प्रोटोकॉल की धारा 4.3 में चरणों का पालन करके गल क्रायोप्रेवित कोशिकाओं। MEPM कोशिकाओं की गणना करें, और बीज 300 कोशिकाओं / 5% सीओ2के साथ एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कोशिकाओं संस्कृति ।
  3. अगले दिन लाइव टाइम-लैप्स इमेजिंग की तैयारी करें।
    1. ऑन-स्टेज इनक्यूबेटर और ऑटोमैटिक इमेजिंग क्षमता के साथ फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करें। संस्कृति माध्यम के वाष्पीकरण को कम करने के लिए मंच पर इनक्यूबेटर जलाशय में पानी जोड़ें; तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस और सीओ2 से 5% तक सेट करें। आर्द्रता के लिए ~ 30 मिनट की अनुमति के लिए मंच पर इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से पकवान रखने से पहले का निर्माण ।
  4. समय-चूक इमेजिंग के लिए निम्नलिखित के बराबर सेटिंग्स का उपयोग करें।
    1. व्यू और फेज कंट्रास्ट फिल्टर के बड़े क्षेत्रों के लिए 4x उद्देश्य का चयन करें।
      नोट: ऑटोफोकस, ऑटो फाइंड सैंपल, जेड-स्टैक और ऑटो-लाइटिंग आमतौर पर आवश्यक नहीं हैं।
    2. छोटा सिलिकॉन आवेषण के ल्यूमेन पर कब्जा करने के लिए प्रति अच्छी तरह से दो सूक्ष्म क्षेत्रों का चयन करें। सुनिश्चित करें कि सभी इमेजिंग पदों पर सही ध्यान दिया गया है।
      नोट: इमेजिंग के दौरान छवि विमानों को समायोजित किया जा सकता है, लेकिन इस तरह के समायोजन आमतौर पर आवश्यक नहीं है।
    3. वांछित इमेज आउटपुट फ़ाइल-प्रकार का चयन करें, फिर वांछित के रूप में स्वचालित वीडियो निर्माण और वॉटरमार्क जैसे पोस्ट-इमेजिंग विकल्पों का चयन करें या डी-सेलेक्ट करें। यदि लागू हो, तो इमेजिंग मोड के रूप में चरण विपरीत का चयन करें।
      नोट: वॉटरमार्क का उपयोग करने से बाद के छवि प्रसंस्करण चरणों में बाधा आ सकती है।
    4. रिकॉर्डिंग की अवधि 72 घंटे निर्धारित करें। हर 10 मिनट में छवियों को कैप्चर करने के लिए कार्यक्रम सेट करें।
      नोट: आमतौर पर इमेजिंग के केवल ४८ एच की आवश्यकता होती है, लेकिन इमेजिंग पहले से ही लिया गया है कि छवियों को खोने के बिना ७२ घंटे के निशान से पहले किसी भी बिंदु पर रोका जा सकता है ।
    5. सुनिश्चित करें कि पर्यावरण कक्ष 5.3.1 में आवश्यकतानुसार चालू है। इन सेटिंग्स(दिनचर्या) को सहेजेंऔर इमेजिंग शुरू करें।
  5. 72 घंटे (या निर्दिष्ट समय) तक इमेजिंग जारी रखें।

6. घाव की मरम्मत की परख में एमईपीएम कोशिकाओं की लाइव इमेजिंग(चित्रा 3)

  1. लाइव इमेजिंग के लिए उपयोग करने के लिए एक प्लेट तैयार करें। संदंश का उपयोग करना, एक बाँझ 2-अच्छी तरह से सिलिकॉन एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं के केंद्र में डालने जगह है, और यह सुनिश्चित करने के लिए यह पूरी तरह से पालन किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए सभी किनारों के साथ नीचे प्रेस । इस्तेमाल किए जा रहे हर नमूने के लिए एक 2-अच्छी तरह से सम्मिलित करें।
  2. इस प्रोटोकॉल की धारा 4.3 में चरणों का पालन करके गल क्रायोप्रेवित कोशिकाओं। MEPM कोशिकाओं की गणना करें, और यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं को कम से कम 350 कोशिकाओं/
  3. बीज 1400कोशिकाओं/मिमी 2 सिलिकॉन आवेषण में 100 μL की मात्रा में MEPM संस्कृति माध्यम प्रति अच्छी तरह से. संस्कृति 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2के साथ एक इनक्यूबेटर में, और हर दिन माध्यम बदल जाते हैं।
  4. 48 एच के बाद धारा 5.3 और 5.4 में वर्णित लाइव टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए एक माइक्रोस्कोप तैयार करें। कोशिकाओं को मंच पर इनक्यूबेटर में रखने से तुरंत पहले, अच्छी तरह से (लेकिन आवेषण के बाहर) में प्रीवार्म्ड एमईपीएम संस्कृति माध्यम का 3 एमएल जोड़ें, और फिर सिलिकॉन आवेषण को ध्यान से हटा दें।
    नोट: 2 कक्षों को अलग करने वाली दीवार एक अंतर छोड़ देती है जो "घाव" है।
  5. निम्नलिखित मतभेदों के साथ, 5.4 में वर्णित समय-चूक इमेजिंग शुरू करें:
    1. एक उच्च आवर्धन (जैसे, 10x) उद्देश्य का उपयोग करें। घाव बंद करने पर कब्जा करने के लिए, प्रत्येक घाव के साथ देखने के 5 क्षेत्रों का चयन करें, ताकि घाव छवि की ऊर्ध्वाधर धुरी के समानांतर हो।
  6. 72 घंटे के बाद इमेजिंग बंद करो या जब घाव पूरी तरह से बंद हो गए हैं।

7. समय-चूक छवि दृश्यों का कम्प्यूटेशनल विश्लेषण

नोट: मानक कंप्यूटेशनल टूल से लैस कंप्यूटर पर निम्नलिखित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें, जैसे कि अजगर दुभाषिया, सी कंपाइलर, और एक खोल (सामग्री की तालिकादेखें)।

  1. कन्फ्यूशियस एनालिसिस
    नोट: इस प्रक्रिया का उपयोग विरल संस्कृति के भीतर सेल प्रसार का अनुमान लगाने या घाव बंद करने के प्रयोगों की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। कोशिकाओं के कब्जे वाले क्षेत्रों का पता लगाने के लिए, छवि चमक के स्थानीय मानक विचलन पर एक विभाजन सीमा लागू की जाती है। कोड पहले वू एट अल३३ और Neufeld एट अल३४ द्वारा वर्णित किया गया है और http://github.com/aczirok/cellconfluency पर उपलब्ध है ।
    1. छवियों के लिए विभाजन सीमा निर्धारित करें। एक उदाहरण के रूप में, एक सीमा 4 के साथ विभाजन देखने के लिए, आदेश जारी
      segment.py -i inout-छवि.jpg -S 4 -टेस्ट आउटपुट.jpg
      और फिर आउटपुट(आउटपुट.jpg)की जांच करें।
      नोट: यदि सीमा बहुत कम है, तो माइक्रोग्राफ में पृष्ठभूमि क्षेत्रों को सेल-कवर के रूप में वर्गीकृत किया गया है। इसके विपरीत, यदि सीमा बहुत अधिक है, तो सेल-कवर क्षेत्रों को इस तरह वर्गीकृत नहीं किया जाता है। इष्टतम सीमा मूल्य दोनों त्रुटियों को न्यूनतम रखता है।
    2. छवियों के अनुक्रम के लिए कन्फ्यूशियस मूल्यों की गणना करने के लिए प्रदान की गई area.sh स्क्रिप्ट का उपयोग करें
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > .dat
      नोट: भेदभाव सीमा मूल्य 4 चरण 1 में सत्यापित किया जाता है, और परिणाम फ़ाइल उदारता.datमें संग्रहीत कर रहे हैं । छवियों को उपयुक्त फ़ोल्डरों में छांटकर, छवि फ़ाइल नामों की सूची को वाइल्डकार्ड नोटेशन द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है:
      area.sh -S4 * .jpg > की .dat
    3. घाव बंद करने के प्रयोगों के लिए, कन्फ्यूशियस डेटा ए (टी) को बदलना-सेल-कवर क्षेत्र का आकार समय-इन घाव-किनारे प्रचार गति वी के एक समारोह के रूप में एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया है।
      Equation 1
      जहां डब्ल्यू क्षेत्र की चौड़ाई को दर्शाता है और डीए/डीटी ए (टी) का समय व्युत्पन्न है, यानी सेल-कवर क्षेत्र की विस्तार दर ।
  2. सेल मोटिविटी मैप
    1. सेल मोटिविटी की विशेषता के लिए एक कण छवि वेलोसिमेट्री (पीआईवी) एल्गोरिदम को निष्पादित करें, और छवि जोड़े के बीच स्थानीय आंदोलन "ऑप्टिकल प्रवाह" की सीमा निकालें, लेकिन व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान करने के लिए नहीं।
      नोट: यहां, 50 माइक्रोन के प्रारंभिक खिड़की आकार का उपयोग किया जाता है, जैसा कि ज़ामीर एट अल द्वारा विस्तार से वर्णित है।35 और Czirok एट अल36, 50माइक्रोन के प्रारंभिक खिड़की आकार के साथ। पीआईवी विश्लेषण प्रत्येक छवि फ्रेम टी और स्थान (छवि के भीतर) एक्स के लिए एक वेग क्षेत्र v (x, t) पैदावार करता है।
    2. सेल कब्जे वाले क्षेत्र पर गणना किए गए स्थानिक औसत के रूप में वी (एक्स, टी) से सेल मोटिविटी की औसत गति निकालें, जैसा कि धारा 7.1 में निर्धारित किया गया है।
  3. मैनुअल सेल ट्रैकिंग
    नोट: जबकि PIV विश्लेषण सेल गतिशीलता का एक स्वचालित मूल्यांकन प्रदान करता है, व्यक्तिगत कोशिकाओं के व्यवहार पर ध्यान केंद्रित करने के लिए अक्सर मैनुअल ट्रैकिंग की आवश्यकता होती है । जबकि कई उपकरण इस कार्यक्षमता प्रदान करते हैं, यह बहुत उपयोगी है अगर मैन्युअल रूप से तैनात मार्कर को उनके प्रारंभिक प्लेसमेंट के बाद संशोधित किया जा सकता है, और यदि ट्रैकिंग समय में आगे और पीछे दोनों किया जा सकता है।
    1. कस्टम-विकसित अजगर उपकरण (http://github.com/donnagreta/cm_track) के साथ सेल ट्रैकिंग करें, जो प्रक्षेप पथ खंडों को हटाने जैसे बुनियादी संपादक कार्य भी प्रदान करता है।
      नोट: यह मैनुअल ट्रैकिंग टूल एक टेक्स्ट फ़ाइल में समय पर सेल की स्थिति पी (i, t) पैदावार करता है, और जैसा लागू किया जाता है
      cm_track.py-i छवियां/-ओ ट्रैक.dat
      जहां समय-चूक छवियां फ़ोल्डर छवियों में हैं/और स्थिति डेटा फ़ाइल ट्रैक.dat (चित्रा 4)में एकत्र किया जाता है ।

Figure 4
चित्र 4:अलग-अलग सेल प्रक्षेप पथ का विश्लेषण। (A)चरण-विपरीत समय-चूक माइक्रोग्राफ(बी, सी)एक मैनुअल ट्रैकिंग प्रक्रिया के अधीन हैं, जो कोशिकाओं (हरे बिंदुओं) को चिह्नित करता है। (घ)सेल पोजिशन (एक्स, वाई) प्रत्येक कोशिका के लिए अपनी आईडी द्वारा प्रतिष्ठित और प्रत्येक फ्रेम एफ(ई)प्रक्षेप पथ के लिए माइक्रोग्राफ और रंग-कोडित पर मढ़ा जा सकता है ताकि लौकिक जानकारी को इंगित किया जा सके । एक उदाहरण के रूप में, प्रत्येक प्रक्षेपवक्र में, एक नीले से लाल रंग पैलेट उत्तरोत्तर बाद के प्रक्षेपवक्र खंडों को इंगित करता है, जिसमें लाल और नीले रंग के प्रारंभिक और अंतिम सेल स्थानों को क्रमशः चिह्नित किया जाता है। (च)प्रक्षेप पथ के विभिन्न सांख्यिकीय गुणों, जैसे कि मतलब वर्ग विस्थापन, निकाले जा सकते हैं और विभिन्न कोशिका आबादी की गतिशीलता को चित्रित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जिसमें इस उदाहरण में वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटी, ब्लू), और नॉकडाउन (केडी, लाल) एमईपीएम कोशिकाएं शामिल हैं। स्केलबार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. एक दूसरे उपकरण का उपयोग करके छवियों पर ओवरले प्रक्षेप पथ, जैसा कि लागू किया गया है
    visdat.py-डी ट्रैक.dat-i छवियां/-ओ ओवरले/-l999-r3-C2
  2. फ़ोल्डर ओवरले में मढ़ा प्रक्षेप पथ के साथ छवियों को ले लीजिए।
    नोट: इस उदाहरण में, सेल पोजीशन डेटा फ़ाइल ट्रैक.datमें संग्रहीत किया जाता है, जबकि समय-चूक छवि अनुक्रम फ़ोल्डर छवियों के भीतर होता है। बाकी पैरामीटर खींचे गए प्रक्षेप पथ (-एल), प्रतीकों के आकार (-आर) और उपयोग की जाने वाली रंग योजना (-सी) की अधिकतम लंबाई को नियंत्रित करते हैं।
  1. अलग-अलग सेल प्रक्षेप पथ का विश्लेषण
    1. कुल पथ लंबाई से प्रक्षेप पथ की विशेषता
      Equation 2,
      और घाव की ओर शुद्ध विस्थापन
      Equation 3,
      जहां एक्स घाव के लंबवत दिशा में पी के प्रक्षेपण को दर्शाता है: घाव वाई धुरी के समानांतर होने पर स्थिति का एक्स समन्वय।
    2. Equation 4प्रत्येक कोशिका और समय बिंदु टी 37के रूप में मार्गदर्शन दक्षता की गणना करें । इन एकल कोशिका उपायों की जनसंख्या औसत से संस्कृतियों की विशेषता है, एक उपयुक्त समय बिंदु टी पर मूल्यांकन किया ।
  2. कोशिकाओं की सामूहिक स्ट्रीमिंग गति
    1. कोशिका आंदोलनों के स्थानीय स्थानिक सहसंबंधों को अन्य कोशिकाओं के औसत वेग से चिह्नित करें जो चलती कोशिका के आसपास हैं, जैसा कि पहले38,39वर्णित है।
      नोट: कम्प्यूटेशनल कोड https://github.com/aczirok/flowfield पर उपलब्ध है।
      1. प्रत्येक वेक्टर वी (x, t) (चित्रा 5A)के सामने, पीछे, बाएं और दाएं दिशाओं के साथ एक संदर्भ प्रणाली को संरेखित करें। संदर्भ प्रणाली(चित्रा 5B)के उपयुक्त स्थानिक सेल के लिए आसपास के सेल या PIV वेग वेक्टर के प्रत्येक आवंटित करें । प्रक्रिया को दोहराएं क्योंकि प्रत्येक वेक्टर संदर्भ प्रणालियों(चित्रा 5C,D)की उत्पत्ति के रूप में कार्य करता है ताकि एक दिए गए वेग वेक्टर को कई डिब्बे को सौंपा जा सके।
        नोट: एक डेटा बिंदु एक वेक्टर के सामने हो सकता है, और एक और एक के बाईं ओर ।
      2. संदर्भ प्रणालियों को एक सामान्य अभिविन्यास(चित्रा 5C,F)में घुमाएं और उन्हें पूल करें(चित्रा 5G)।
        नोट: पूल किए गए वेग डेटा के प्रत्येक बिन का औसत एक वेग वेक्टर(यू)है जो स्थानिक सहसंबंध का संकेत है: औसत एक साझा वेग घटक(चित्रा 5H)का एक उपाय है।
      3. यू (एक्स) प्रवाह क्षेत्रों को एक घातीय फ़ंक्शन के साथ फिट Equation 5 करें, जहां ए, एक्स0 और यू0 फिटिंग पैरामीटर हैं। तीन फिटिंग मापदंडों में से, x0 पर ध्यान केंद्रित करें, सहसंबंध लंबाई(चित्रा 5I,जे),जो विशिष्ट दूरी है जहां स्थानीय वेग-वेग सहसंबंध गायब हो जाते हैं।

Figure 5
चित्र 5:सुसंस्कृत कोशिकाओं के स्ट्रीम गठन का लक्षण वर्णन। (A,D)चरण-विपरीत समय-चूक चित्रा 4A से कोशिका आंदोलनों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रत्येक चलती कोशिका के लिए, संदर्भ के एक फ्रेम (नीले) और स्थानिक डिब्बे (सफेद) को सामने, पीछे, बाएं, या दाएं होने के रूप में आसन्न कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए सह-गठबंधन किया गया था। (B,E) आसन्न कोशिकाओं (काले वैक्टर) का वेग संदर्भ के एक ही फ्रेम(सी, एफ)से संबंधित था। यह प्रक्रिया प्रत्येक कोशिका और समय-बिंदु के लिए दोहराई गई थी। (जी)इस स्थानीय जानकारी को एकत्र करने के बाद, प्रत्येक बिन में कई वेग वैक्टर (ग्रे) होंगे, जिन्हें औसत मोटिव सेल के सापेक्ष विभिन्न स्थानों पर औसत सह-चलती वेग (मैजेंटा तीर) निर्धारित करने के लिए औसत किया जा सकता है। (ज)औसत वेग नक्शा इस प्रकार एक चलती कोशिका के सापेक्ष विभिन्न स्थानों पर विशिष्ट कोशिका वेग की विशेषता है । (I,J) अंत में, इस क्षेत्र को फ्रंट-रियर (समानांतर) धुरी के साथ और बाएं-दाएं (लंबवत) धुरी के साथ भी नमूना लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

पाताल अलमारियों का विच्छेदन चित्र 1में दर्शाया गया है । चीरों का अनुक्रम ऊतक की फिसलन को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। सिर(चित्रा 1A,B)को हटाने के बाद, निचले जबड़े को हटा दिया जाता है(चित्रा 1 बी,सी)। सिर के ऊपरी हिस्से काचीरा (चित्रा 1C,D)ऊतक को स्थिर करने के लिए किया जाता है जब उल्टा रखा जाता है(चित्रा 1E)कल्पना करने के लिए(चित्रा 1E,बिंदीदार लाइनें),चुटकी(चित्रा 1F),और उत्पाद शुल्क(चित्रा 1G)पाताल अलमारियों ।

एक ही भ्रूण से उत्पादित पैलेट शेल्फ जोड़ी को 35 मिमी पकवान में या 6-अच्छी डिश के कुएं में ट्राइपसिनाइज्ड और सुसंस्कृत किया जाता है। बड़े व्यंजनों को पसंद नहीं किया जाता है क्योंकि इष्टतम विकास के लिए सेल घनत्व बहुत कम है। संगम पर, प्रत्येक कुएं से कोशिकाओं को त्रिपिंदीकृत किया जाता है और तीन 35-मिमी-समकक्ष कुओं (मार्ग #1) में स्थानांतरित कर दिया जाता है। #1 पारित होने से कन्फ्लूंट कोशिकाओं को फिर 1 × 10 6 कोशिकाओं/एमएल के एलिकोट्स में नीचे जमेहुए किया जा सकता है । जमे हुए aliquots बाद में एक ३५ मिमी के बराबर पकवान में लाया जाता है और संगम के लिए उगाया जाता है । कोशिकाओं को तो tripsinized (मार्ग #2) और प्रयोग के अनुसार वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । जमे हुए एलिकोट्स बनाने और उपयोग करने से स्थितियों को सामान्य बनाने में मदद मिली, विशेष रूप से सेल घनत्व के संबंध में। ताजा एमईपीएम कोशिकाओं के उपयोग के परिणामस्वरूप प्रयोगों में अंतिम कोशिका घनत्व में अधिक परिवर्तनशीलता हुई, जो ताजा संस्कृतियों में व्यवहार्य या उप-व्यवहार्य कोशिकाओं के चर अनुपात के कारण माना जाता है। इसके अलावा, इन प्रयोगों के लिए एमईपीएम सेल मार्ग की संख्या कड़ाई से दो (ऊपर सूचीबद्ध) तक सीमित थी।

यह देखते हुए कि एक) सेल घनत्व महत्वपूर्ण था, ख) एक ही भ्रूण से MEPM कोशिकाओं को सीमित थे, और ग) इमेजिंग प्रकाशिकी एक बड़ी डिश में बेहतर थे, 2-अच्छी तरह से सिलिकॉन आवेषण(चित्रा 2 और चित्रा 3)का इस्तेमाल किया गया । घाव की मरम्मत के लिए, MEPM कोशिकाओं को उच्च संगम तक 2-अच्छी तरह से सिलिकॉन आवेषण में उगाया गया था, फिर आवेषण हटा दिए गए थे, और घाव बंद होने तक इमेज्ड(चित्र 3)। हालांकि, 2डी संस्कृति के लिए, एमईपीएम कोशिकाओं को इमेजिंग की आवश्यकता थी क्योंकि वे बढ़े थे, इसलिए 2-अच्छी तरह से सिलिकॉन आवेषण को स्पष्ट इमेजिंग(चित्रा 2C)के लिए अनुमति देने के लिए उनकी ऊंचाई के 1/3आरडी तक छंटनी की गई थी। 35 मिमी व्यंजनों में छोटे 3 डी मुद्रित छल्ले40 का उपयोग 2D मोटिविटी विश्लेषण(चित्रा 2डी)के लिए भी किया गया था।

एमईपीएम प्रक्षेप पथ(चित्रा 4E)लगातार होते हैं: सेल मोटिविटी की दिशा कई घंटों तक बनाए रखी जाती है। मतलब विस्थापन बनाम समय विश्लेषण(चित्रा 4F)विस्थापन के रूप में दृढ़ता को इंगित करता है बीता समय के साथ आनुपातिक जा रहा है । ऊतक संस्कृति प्लास्टिक की सतह पर MEPM कोशिकाओं की विशिष्ट गति, 10 μm/h, भी सेल संस्कृति की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । गतिशीलता डेटा के प्रवाह विश्लेषण से पता चलता है कि एमईपीएम कोशिकाओं के सह-चलती समूह आकार में ~ 300 माइक्रोन(चित्रा 5I,J)हैं। प्रतिनिधि परिणाम भी जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती MEPM कोशिकाओं के बीच एक गहरा गतिशीलता अंतर का संकेत मिलता है । वाइल्डटाइप और उत्परिवर्ती तुलना के अलावा, 2डी और घाव-मरम्मत परख दोनों को विभिन्न जैव रासायनिक उपचारों के साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, PI3K-AKT मार्ग सक्रियकों का उपयोग एमईपीएम कोशिकाओं के साथ किया गया है, जैसा कि पहले 21वर्णित है ।

Figure 1
चित्र 1:मेसेंचिमल कोशिकाओं को अलग करने के लिए भ्रूणीय पैलेटल अलमारियों का विच्छेदन। (ए)गर्दन (लाल रेखा) के साथ काटकर एक E13.5 माउस भ्रूण सिर को हटा दिया जाता है। (ख)अगले, निचले जबड़े और जीभ को मौखिक गुहा के साथ चीरों के साथ ऊपरी और निचले जबड़े (पीली रेखा) के बीच हटा दिया जाता है। (ग)पैलेट शेल्फ हटाने के लिए ऊतक को स्थिर करने के लिए, सिर के शीर्ष उत्पादित (हरी रेखा) है। (घ)परिणामी विच्छेदित ऊपरी जबड़े क्षेत्रकोपैलेट अलमारियों (काले बिंदीदार रेखाओं) की कल्पना करने के लिए उल्टा रखा जाता है। (च)व्यक्तिगत पैलेटल अलमारियों के एक्सेसियन को योजनाबद्ध तरीके से चित्रित किया गया है, जहां व्यक्तिगत फैला हुआ अलमारियों (पीला) को मैक्सिला (नीले) से बंद कर दिया जाता है। (जी)एक ही भ्रूण से पैलेटल अलमारियों की उत्पादित जोड़ी, जिसे फिर 35 मिमी डिश में या 6-अच्छी प्लेट में ट्राइपसिनाइज्ड और सुसंस्कृत किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:2D MEPM सेल संस्कृति का प्रायोगिक सेटअप। (A)MEPM कोशिकाओं के एक जमे हुए aliquot Thaw, और(ख)एक ३५ मिमी पकवान या एक 6 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं संस्कृति । जब कन्फ्ल्यूent, कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें और उन्हें प्रोटोकॉल में 35 मिमी डिश में वर्णित के रूप में बीज दें या तो(सी)2-अच्छी तरह से सिलिकॉन आवेषण के साथ जो छंटनी की गई हैं या(डी)3 डी-मुद्रित छल्ले के साथ। एक छोटी सी संस्कृति अंतरिक्ष बड़ी संख्या में एमईपीएम कोशिकाओं की आवश्यकता को कम करती है। छंटनी की सिलिकॉन आवेषण या 3 डी मुद्रित छल्ले के कम प्रोफ़ाइल एक प्रभामंडल प्रभाव के बिना प्रत्यक्ष इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । वांछित कोशिका घनत्व प्राप्त होने तक समय-चूक इमेजिंग जारी रह सकती है, जो 72 घंटे तक हो सकती है। प्रतिनिधि छवियों(ई)0 घंटे,(एफ)24 घंटे, और(जी)४५ घंटे समय बिंदुओं पर दिखाया गया है । छवियों को 4x उद्देश्य का उपयोग करके लिया गया था। ई, एफ, जी = 300 माइक्रोन के लिए स्केलबार। संक्षिप्त रूप: 2D = दो आयामी; MEPM = माउस भ्रूणीय पाकल mesenchyme; 3D = त्रि-आयामी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:एमईपीएम कोशिकाओं का उपयोग करके घाव-बंद करने की परख का प्रायोगिक सेटअप। (A)एमईपीएम कोशिकाओं के एक जमे हुए एलिकोट को पिघलाएं, और(बी)संस्कृति कोशिकाओं को ३५ मिमी डिश या 6-वेल प्लेट में । जब ढुलमुल, कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें और(सी)उन्हें 35 मिमी डिश में 2-अच्छी तरह से सिलिकॉन आवेषण में बीज दें। संस्कृति डालने में कोशिकाओं जब तक वांछित संगम प्राप्त किया है (~ 48 एच), तो सिलिकॉन डालने और छवि को हटा दें। प्रतिनिधि छवियों(डी)डालने के तुरंत बाद दिखाया जाता है,(ई)24 घंटे के बाद, और(एफ)४० घंटे के बाद । घाव बंद होने में लगभग 36 घंटे लगते हैं। छवियों को 10x उद्देश्य का उपयोग करके लिया गया था। स्केलबार 300 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षिप्त: MEPM = माउस भ्रूण महल mesenchyme । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

पाताल शेल्फ ऊंचाई क्षैतिज रिमॉडलिंग इवेंट 1, 3 ,4,9,11के लिए एक ऊर्ध्वाधर है। यह पोस्ट किया गया है कि इस रीमॉडलिंग प्रक्रिया को समन्वयपूर्वक व्यवहार करने के लिए पैलेट शेल्फ मेसेंचिमल कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। वाइल्डटाइप एमईपीएम कोशिकाओं के विश्लेषण से पता चलता है कि यह कोशिका व्यवहार आंतरिक है और इसे21को मात्रात्मक किया जा सकता है । इस प्रकार, इन परख फांक तालु के नए और मौजूदा माउस मॉडल में प्राथमिक तालू शेल्फ ऊंचाई दोषों को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वर्ग 1 और 2 में उल्लिखित तरीकों जांचकर्ताओं को प्राथमिक MEPM कोशिकाओं के अलीकोट को अलग करने, संस्कृति और फ्रीज करने की अनुमति नी चाहिए। इन कोशिकाओं को तब विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है, जिसमें यहां वर्णित 2D संस्कृति और घाव-मरम्मत परख शामिल है। 2डी संस्कृति, जब समय-चूक इमेजिंग के साथ संयुक्त होती है, तो सेल घनत्व की एक श्रृंखला पर बुनियादी सेल विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करती है। यहां प्रस्तुत सेल संरेखण और सेल स्ट्रीम गठन का आकलन करने के लिए एक विधि है, जो सामूहिक सेल आंदोलन(चित्रा 4)के गुण हैं। घाव बंद करने की परख का उपयोग आमतौर पर सेल माइग्रेशन 41 ,42,43का आकलन करने के लिए कियाजाताहै। "घाव" का सेल-मुक्त क्षेत्र परिधि में कोशिकाओं के दिशात्मक आंदोलन के लिए एक संकेत प्रदान करता है। इस प्रक्रिया के समय-चूक इमेजिंग ने माइग्रेशन के दौरान सेल प्रक्षेप पथ के निर्धारण और मूल्यांकन की अनुमति दी। ये सेल प्रक्षेप पथ, बदले में, सेल माइग्रेशन गति और दिशात्मकता(चित्र 5) निर्धारित करते हैं।

केवल वाइल्डटाइप एमईपीएम कोशिकाओं का उपयोग करके संस्कृति और परख के लिए पहले शर्तों का अनुकूलन करना महत्वपूर्ण है। पैलेटल अलमारियों को सफलतापूर्वक आजमाया गया है और जिसके परिणामस्वरूप एकल-कोशिका निलंबन रातोंरात चढ़ाया गया है, कोशिकाओं का विशाल बहुमत (~ 90%) आसानी से डिश की वृद्धि-सतह से जुड़ा होगा। यदि कोशिकाएं आसानी से पालन नहीं करती हैं, तो संस्कृति की स्थितियों में कुछ गलत हो सकता है। प्रारंभ में, पालन की गई कोशिकाएं काफी सजातीय दिखेंगी, जिसमें त्रिकोणीय या थोड़ा लम्बी आकृति होगी, लेकिन जैसे-जैसे वे उच्च घनत्व में बढ़ते हैं, वे अधिक धुरी के आकार के हो जाते हैं और विस्तारित(चित्रा 2)। यदि कोशिकाएं आकार या बहुनीय में नाटकीय रूप से बड़ी हो जाती हैं, तो उनका उपयोग प्रयोगों के लिए नहीं किया जाना चाहिए। यह अनुकूलन सफल विकास (संगम के लिए समय) और घाव-मरम्मत (बंद होने का समय) के लिए बुनियादी वाइल्डटाइप पैरामीटर भी स्थापित करेगा। कोशिकाओं को लगभग दैनिक और समय-चूक छवियों में दोगुनी संख्या में दोहरीकरण करके पैदा करना चाहिए, ~ 5-10 μm/h की गतिशीलता दिखाना चाहिए । इसी तरह, यदि किसी भी बाद के प्रयोग में वाइल्डटाइप-उत्परिवर्ती तुलना शामिल है, तो इन बुनियादी मापदंडों को वाइल्डटाइप कोशिकाओं द्वारा पूरा नहीं किया जाता है, तो प्रयोग को विश्लेषण से बाहर रखने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, वाइल्डटाइप एमईपीएम कोशिकाएं 2-अच्छी तरह से सिलिकॉन आवेषण का उपयोग करके घाव को पूरी तरह से बंद करने के लिए 36-40 घंटे लेती हैं। यदि किसी प्रयोग में, वाइल्डटाइप कोशिकाएं घाव को बंद करने के लिए 40 घंटे से काफी अधिक समय लेती हैं, तो पूरा प्रयोग संदिग्ध होगा। एमईपीएम कोशिकाओं से खराब प्रदर्शन 1) खराब जमे हुए एलिकोट गुणवत्ता, 2) खराब पुनरुद्धार, या 3) अत्यधिक भेदभाव के कारण हो सकता है। विभेदित या सेंसेंट कोशिकाओं का पता नेत्रहीन रूप से लगाया जा सकता है क्योंकि वे बहुत बड़े होते हैं और विभाजित नहीं होते हैं। बड़ी संख्या में ऐसी कोशिकाओं वाली संस्कृति से बचना चाहिए। सामान्य तौर पर, 10x उद्देश्य(चित्र 3)के दृष्टिकोण के क्षेत्र में कोई असामान्य कोशिकाएं नहीं होनी चाहिए; देखने के क्षेत्र के बाहर एक या दो सेल वास्तव में विश्लेषण को प्रभावित नहीं करना चाहिए । विश्लेषण को केवल दो सेल मार्ग (ऊपर) तक सीमित करने से एमईपीएम कोशिकाओं की गुणवत्ता बनाए रखने में काफी मदद मिलती है।

प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाओं का उपयोग करके 2डी संस्कृति और घाव-मरम्मत परख दोनों के लिए, सफलता के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकता एक उच्च प्रारंभिक सेल घनत्व थी। यह आवश्यकता सबसे पहले घाव की मरम्मत परख के अनुकूलन के दौरान निर्धारित की गई थी जिसमें कोशिकाओं को >१४००कोशिकाओं/मिमी 2पर वरीयता दी गई थी । घाव में माइग्रेट कोशिकाओं के घनत्व को तब 2डी संस्कृति में सीडिंग घनत्व के रूप में उपयोग किया जाता था। ~ 300 कोशिकाओं/मिमी 2 का एक सीडिंग घनत्व सेल धाराओं कागठन किया, जबकि अभी भी सेल प्रक्षेप पथ के स्वचालित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । ३०० कोशिकाओं/मिमी2 से अधिक घनत्व अधिक ज्वलंत धाराओं है कि आंख से कल्पना की जा सकती है फार्म करते हैं, लेकिन व्यक्तिगत सेल ट्रैकिंग मुश्किल बनाते हैं । वाइल्डटाइप और उत्परिवर्ती भ्रूण से प्राथमिक MEPM कोशिकाओं की तुलना करते समय, हालांकि घाव-बंद करने में देरी का मूल्यांकन कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के बिना किया जा सकता है, स्ट्रीम गठन और दिशात्मकता मतभेद आंखों से स्पष्ट नहीं हो सकते हैं। यदि कोशिका घनत्व बहुत अधिक है या छवि की गुणवत्ता खराब/धुंधला है, उदाहरण के लिए ध्यान के नुकसान के कारण, स्वचालित सेल ट्रैकिंग मुश्किल हो सकता है । ऐसे मामले में, इमेजजे का उपयोग करके घाव-मरम्मत परख में सेल प्रक्षेप पथ निर्धारित करने के लिए मैनुअल सेल ट्रैकिंग का उपयोग करना संभव है। एमईपीएम संस्कृति माध्यम में 20 mm समाधान के Hoechst परमाणु दाग (3 μL/mL) की एक बहुत कम एकाग्रता भी सेल ट्रैकिंग की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, फ्लोरोसेंट लेजर विषाक्तता विस्तारित उपयोग के साथ एक मुद्दा हो सकता है।

मैनुअल ट्रैकिंग के लिए, जहां तक संभव हो घाव-बंद होने के अंत से रिवर्स में कोशिकाओं को ट्रैक करना आसान था जब तक कि उच्च सेल घनत्व आगे ट्रैकिंग अस्पष्ट न हो। यहां तक कि आंशिक सेल प्रक्षेप पथ, जब एक सेल आबादी के लिए संयुक्त, जानकारीपूर्ण थे । घाव-मरम्मत परख के विपरीत, 2डी सेल संस्कृति विश्लेषण के लिए स्वचालित सेल ट्रैकिंग की आवश्यकता होती है, जो एक कारण है कि मध्यवर्ती सेल घनत्व को चुना गया था। अंत में, संवेदनशील प्राथमिक एमईपीएम आधारित विश्लेषणों का उपयोग उन यौगिकों और रास्तों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो तालू ऊंचाई को प्रभावित कर सकते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि PI3K-AKT मार्ग की सक्रियता से सेल की गति और Specc1l उत्परिवर्ती MEPM कोशिकाओं की दिशात्मकता दोनों में सुधारहुआ 21। एमईपीएम के अन्य अध्ययनों में डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड को उत्तेजित करने या प्रसार 22 ,29,34,44,45का आकलन करने के लिए विभिन्न विकास कारक या दवा उपचार का भी उपयोग किया गया है । इस प्रकार, एमईपीएम-आधारित विश्लेषण कई और सकारात्मक या नकारात्मक नियामक कारकों की पहचान करने के लिए एक त्वरित विधि प्रदान करते हैं, जिसे तब वीवो में मान्य किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना के हिस्से में स्वास्थ्य अनुदान DE026172 (I.S.), और GM102801 (A.C. द्वारा समर्थित किया गया था। आई एस को बायोमेडिकल रिसर्च एक्सीलेंस (COBRE) अनुदान (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज P20 GM104936), कंसास आईडीए नेटवर्क फॉर बायोमेडिकल रिसर्च एक्सीलेंस ग्रांट (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज P20 GM103418), और कंसास इंटेलेक्चुअल एंड डेवलपमेंटल डिसएबिलिटी रिसर्च सेंटर (KIDDRC) ग्रांट (U54 Eunice Shriver राष्ट्रीय संस्थान) द्वारा भाग में भी समर्थन किया गया था । HD090216) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056

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References

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Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).

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