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Developmental Biology

Isolement et imagerie en accéléré de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires primaires de souris pour analyser les attributs de mouvement collectif

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/62151
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons un protocole d’isolement et de culture de cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris pour l’imagerie en accéléré de la croissance bidimensionnelle (2D) et des tests de réparation des plaies. Nous fournissons également la méthodologie d’analyse des données d’imagerie time-lapse afin de déterminer la formation de flux cellulaire et la motilité directionnelle.

Abstract

Le développement du palais est un processus dynamique, qui implique la croissance verticale des étagères palatines bilatérales à côté de la langue, suivie d’une élévation et d’une fusion au-dessus de la langue. Les défauts de ce processus entraînent une fente palatine, une anomalie congénitale courante. Des études récentes ont montré que l’élévation de la plate-forme palatale implique un processus de remodelage qui transforme l’orientation de l’étagère d’une verticale à une horizontale. Le rôle des cellules mésenchymateuses du plateau palatal dans ce remodelage dynamique a été difficile à étudier. L’analyse quantitative basée sur l’imagerie time-lapse a récemment été utilisée pour montrer que les cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris (MEPM) peuvent s’auto-organiser en un mouvement collectif. Des analyses quantitatives ont pu identifier des différences dans les cellules MEPM mutantes à partir d’un modèle murin présentant des défauts d’élévation du palais. Cet article décrit des méthodes pour isoler et mettre en culture des cellules MEPM à partir d’embryons E13.5 - spécifiquement pour l’imagerie time-lapse - et pour déterminer divers attributs cellulaires du mouvement collectif, y compris des mesures de formation de flux, d’alignement de forme et de persistance de la direction. Il postule que les cellules MEPM peuvent servir de modèle proxy pour étudier le rôle du mésenchyme du plateau palatal pendant le processus dynamique d’élévation. Ces méthodes quantitatives permettront aux chercheurs dans le domaine craniofacial d’évaluer et de comparer les attributs de mouvement collectif dans les cellules témoins et mutantes, ce qui améliorera la compréhension du remodelage mésenchymateux pendant l’élévation du plateau palatal. De plus, les cellules MEPM fournissent un modèle cellulaire mésenchymateux rare pour l’étude du mouvement cellulaire collectif en général.

Introduction

Le développement du palais a été largement étudié car les défauts de la palatogenèse conduisent à une fente palatine - une anomalie congénitale courante qui survient dans des cas isolés ou dans le cadre de centaines de syndromes1,2. Le développement du palais embryonnaire est un processus dynamique qui implique le mouvement et la fusion du tissu embryonnaire. Ce processus peut être divisé en quatre étapes principales: 1) induction des étagères palatales, 2) croissance verticale des étagères palatales à côté de la langue, 3) élévation des étagères palatales au-dessus de la langue et 4) fusion des étagères palatales à la ligne médiane1,3,4. Au cours des dernières décennies, de nombreux mutants de souris ont été identifiés qui manifestent une fente palatine5,6,7,8. La caractérisation de ces modèles a révélé des défauts dans les étapes d’induction, de prolifération et de fusion du plateau palatal; cependant, les défauts d’élévation de l’étagère palatale ont été rares. Ainsi, la compréhension de la dynamique de l’élévation du plateau palatal est un domaine de recherche intrigant.

Une analyse minutieuse de certains mutants de souris présentant des défauts d’élévation de la plate-forme palatine a conduit au modèle actuel montrant que la région très antérieure de la tablette palatine semble se retourner, tandis qu’un mouvement vertical à horizontal ou un « remodelage » des étagères palatines se produit dans les régions moyennes à postérieures du palais1,3,4, 9,10,11. L’épithélium du bord médial de la plate-forme palatine initie probablement la signalisation requise pour ce remodelage, qui est ensuite entraînée par le mésenchyme de la plate-forme palatine. Récemment, de nombreux chercheurs ont identifié un retard d’élévation du plateau palatal dans des modèles murins qui ont montré des adhérences orales transitoires impliquant des étagères palatales12,13. Le remodelage mésenchymateux implique une réorganisation des cellules pour créer un renflement dans la direction horizontale, tout en rétractant simultanément la plate-forme palatine dans la direction verticale9,10,14. Parmi les nombreux mécanismes proposés pour affecter l’élévation du plateau palatal et le remodelage mésenchymateux sous-jacent figurent la prolifération cellulaire15,16,17, les gradients chimiotactiques18et les composants de la matrice extracellulaire19,20. Une question importante s’est posée : le retard d’élévation du plateau palatal observé chez les souris déficientes en Specc1l est-ilégalement dû en partie à un défaut de remodelage du plateau palatal, et ce défaut de remodelage pourrait-il se manifester par un défaut intrinsèque de comportement des cellules MEPM primaires21?

Les cellules MEPM primaires ont été utilisées dans le domaine craniofacial pour de nombreuses études impliquantl’expressiongénique 22,23,24,25,26,27,28,29, et quelques-unes impliquant la prolifération30,31 et la migration25,31,32 , mais aucun pour l’analyse collective du comportement cellulaire. L’imagerie en accéléré des cellules MEPM a été réalisée dans des tests de culture 2D et de réparation des plaies pour montrer que les cellules MEPM présentaient un mouvement directionnel et formaient des flux cellulaires dépendants de la densité - attributs du mouvement collectif21. De plus, les cellules mutantes Specc1l formaient des flux cellulaires plus étroits et présentaient des trajectoires de migration cellulaire très variables. Ce manque de motilité coordonnée est considéré comme contribue au retard d’élévation du palais chez les embryons mutants Specc1l 13,21. Ainsi, ces essais relativement simples utilisant des cellules MEPM primaires peuvent servir de proxy pour l’étude du remodelage mésenchymateux pendant l’élévation du plateau palatal. Cet article décrit l’isolement et la culture des cellules MEPM primaires, ainsi que l’imagerie et l’analyse en accéléré, pour les tests 2D et de réparation des plaies.

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Protocol

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été réalisées avec un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de kumc, conformément à leurs lignes directrices et règlements (numéro de protocole: 2018-2447).

1. Récolter des embryons E13.5

  1. Euthanasier les souris femelles gravides à l’aide d’une chambre d’inhalation de CO2 ou par une procédure approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Procédez immédiatement à la dissection.
  2. Exposez la moitié inférieure de la cavité abdominale en enlevant la peau et le péritoine. Excisez les deux cornes de l’utérus, qui contiennent les embryons E13.5.
  3. Placez brièvement l’utérus dans une solution saline tamponnée stérile au phosphate (PBS) pré-avertie à 37 °C pour rincer l’excès de sang, de cheveux ou d’autres débris. Placez l’utérus dans un plat stérile de 10 cm rempli de PBS stérile.
  4. À l’aide de petits ciseaux, coupez à travers la paroi utérine le long de l’utérus pour exposer chaque embryon, toujours dans son sac vitellin. Retirez le sac vitellin entourant l’embryon, mais conservez-le pour le génotypage, si nécessaire. Au fur et à mesure que les embryons sont retirés, placez chaque embryon dans son propre puits d’une plaque de 12 puits remplie de PBS.

2. Dissection des étagères palatales des embryons (Figure 1)

REMARQUE: Stériliser les instruments de dissection en acier inoxydable (voir le tableau des matériaux)après le traitement de chaque embryon en plaçant les instruments d’abord dans un bécher d’alcool éthylique à 100%, puis dans un stérilisateur d’instruments à 350 °C pendant 10 s, puis en les refroidissant dans un deuxième bécher de 100% EtOH.

  1. À l’aide d’une cuillère perforée stérilisée, placer l’embryon dans un nouveau plat de 10 cm rempli de milieu de culture MEPM composé du milieu essentiel minimum (DMEM) de Dulbecco contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS), de L-glutamine (4 mM L-Glu) et des antibiotiques-pénicilline et streptomycine (50 unités / mL).
  2. Décapiter l’embryon juste en dessous de la ligne de la mâchoire à l’aide de ciseaux stériles(Figure 1A,ligne pointillée rouge). Retirez la mâchoire inférieure en insérant un point de la pince fine stérilisée #5 dans la bouche, en la gardant juste à l’intérieur de la joue. Poussez la pointe de la pince insérée jusqu’à ce qu’elle sorte de l’arrière du crâne.
  3. Orientez la pince, le long de la ligne jaune de la figure 1B,de sorte que l’autre côté de la pince (qui est toujours à l’extérieur de l’embryon) plane juste au-dessus du conduit auditif, puis pincez la pince fermée pour couper le tissu. Si nécessaire, passez une autre pince fine le long de la couture de la pince maintenant fermée pour couper à travers tout tissu qui n’a pas été complètement sectionné par le pincement.
  4. Répétez l’étape précédente pour l’autre côté de la tête de l’embryon. Continuez la procédure de pincement pour enlever complètement la mâchoire inférieure, la langue et la partie inférieure du crâne et exposer les étagères palatales.
  5. Retirez le crâne du crâne en coupant juste au-dessus des yeux, comme le montre la figure 1C (ligne verte). Pour ce faire, placez la tête sur son côté gauche ou droit et positionnez les pointes des petits ciseaux en acier inoxydable devant et derrière le crâne juste au-dessus du niveau des yeux de l’embryon. Coupez le haut du crâne avec une seule prise rapide des ciseaux, créant une surface plane qui sera importante pour la stabilité dans les étapes ultérieures et qui devrait ressembler à la figure 1D lorsqu’elle est vue de côté.
  6. Placez la partie restante de la tête à l’envers, l’aspect supérieur de la tête (crâne enlevé) reposant à plat sur le fond du plat, ce qui fournira une surface stable pour le retrait de l’étagère palatale. Prenez un moment pour identifier les étagères palatales, qui sont maintenant exposées et tournées vers le haut et qui apparaîtront comme deux crêtes surélevées de chaque côté d’une rainure centrale dans la moitié antérieure de la tête (Figure 1E).
  7. Épinglez la partie restante de la tête au plat pour l’immobiliser pendant que les étagères sont retirées. Pour ce faire, insérez un point d’une pince fine à travers le tissu près de la région nasale de la tête, antérieure aux étagères palatales, et insérez l’autre point de la pince à travers la base du crâne, postérieure aux étagères palatales. Maintenez-les en place tout en effectuant l’excision des étagères palatales.
    1. En immobilisant la tête d’une seule main, choisissez l’une des deux étagères à retirer en premier, insérez les deux points d’une deuxième paire de pinces fines dans le tissu à la base de la surface latérale de l’étagère, et pincez pour couper le tissu (Figure 1F). Répétez cette opération le long de la base de la surface médiale de l’étagère, puis aux extrémités antérieure et postérieure de l’étagère pour vous détacher de la tête.
  8. Soulevez doucement l’étagère, en faisant des pincements supplémentaires, au besoin, pour libérer complètement l’étagère du tissu environnant.
  9. Répétez les deux étapes précédentes pour retirer la deuxième étagère palatale.
  10. Les étagères palatales pouvant maintenant être libérées des tissus environnants et placées dans du PBS(figure G),utilisez une pipette de transfert d’ampoule en plastique stérile pour aspirer les étagères de la pipette et transférez-les dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec environ 500 μL de PBS. Gardez les tubes contenant des étagères palatales sur de la glace pendant que le reste de la litière est traité de la même manière.
    REMARQUE: Alternativement, les étagères peuvent être placées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant de la trypsine pré-avertie (0,25%) immédiatement après la dissection (au lieu de les placer sur de la glace). Les échantillons seront plus frais, mais il faut veiller à chronométrager toutes les étapes de la procédure pour chaque échantillon individuel plutôt que de traiter les échantillons collectivement.

3. Culture de cellules MEPM

REMARQUE: Dans les conditions décrites ici, les cellules épithéliales du palais ne survivent pas au premier passage, ce qui entraîne une culture cellulaire mésenchymateuse du palais pur. Utilisez une technique stérile pour effectuer toutes les étapes dans une hotte de culture tissulaire.

  1. Aspirer et jeter le PBS du tube de 1,5 mL, en prenant soin de ne pas jeter les étagères dans le processus. Ajouter immédiatement 200 μL de trypsine préchavée (37 °C) (0,25 %) à chaque tube contenant des étagères palatines. Pipetez brièvement les étagères de haut en bas dans la trypsine à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL pour accélérer la trypsinisation.
  2. Incuber les tubes pendant 5 min à 37 °C, puis pipet chaque échantillon de haut en bas pour aider à briser le tissu. Incuber les tubes pendant encore 5 min à 37 °C, et pipet de haut en bas une fois de plus pour compléter la dissociation du tissu.
    REMARQUE: Les étagères doivent être complètement ou presque complètement dissociées et suspendues dans la trypsine sans qu’il ne reste de morceaux de tissu visibles.
  3. Ajouter 800 μL de milieu de culture MEPM (étape 2.1) à chaque tube de 1,5 mL. Centrifuger le tube de 1,5 mL à 200 × g pendant 5 min pour granuler les cellules. Retirer le surnageant et ressusser la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture MEPM.
  4. Plaquer les cellules MEPM dans une plaque traitée par culture tissulaire de 6 puits contenant un milieu de culture MEPM. Laisser les cellules adhérer à la surface plastique pendant 12 h à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2.
    REMARQUE: Après une incubation d’une nuit, la grande majorité (~ 90%) des cellules se fixeront. À ce stade, les cellules adhérentes auront l’air assez homogènes, avec une forme triangulaire ou légèrement allongée.
  5. Changez le milieu tous les jours en aspirant doucement l’ancien milieu et en le remplaçant immédiatement par 1 mL de PBS stérile chaud sans calcium ni magnésium pendant environ 1 min. Aspirer le PBS et le remplacer par 3 mL de milieu de culture MEPM préwargé.
  6. Passage des cellules une fois qu’elles deviennent 100% confluentes.
    REMARQUE: Les cellules MEPM devraient proliférer en doublant en nombre presque quotidiennement.
    1. Pour passer les cellules, aspirez doucement l’ancien milieu et remplacez-le immédiatement par du PBS chaud sans calcium ni magnésium pendant environ 1 min. Aspirez le PBS et remplacez-le par 0,5 mL de trypsine préwarmée à 0,25%.
    2. Incuber à 37 °C pendant environ 5 min, ou jusqu’à ce que les cellules se détachent de la surface du plat lorsqu’elles sont doucement bercées d’avant en arrière à la main. Une fois que les cellules se sont détachées, ajoutez immédiatement 5 mL de milieu de culture MEPM pré-averti aux cellules trypsinisées.
    3. À l’aide d’un tuyau sérologique de 10 mL, prélever doucement les cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger le tube à 200 × g pendant 5 min pour granuler les cellules. Aspirer la trypsine et le milieu, et ressusser les cellules dans 3 mL de milieu de culture MEPM préwarmé. Pipetez doucement 1 mL de cellules dans un seul puits d’un plat de 6 puits et ajoutez 2 mL de milieu de culture MEPM pour porter le volume total à 3 mL.
      REMARQUE : Il s’agit d’une division 1:3 des cellules. Les députés européens peuvent être adoptés jusqu’à trois fois. La densité d’ensemencement des MEPM est quelque peu flexible et le nombre de cellules présentes varie en fonction du récipient de culture. Cependant, les DÉPUTÉS ne prolifèrent pas correctement lorsqu’ils sont divisés trop peu et devraient être confluents d’au moins 20 à 25% dans leur nouveau plat une fois qu’ils adhèrent.

4. Cryoconservation des cellules MEPM

  1. Une fois que les cellules MEPM trypsinisées sont granulées, ressuspendez les cellules dans un milieu de culture MEPM pour obtenir une concentration de ~ 1 × 106 cellules / mL. Pipet les cellules en cryoviales et ajouter une concentration finale de 5% de diméthylsulfoxyde dans le stock cellulaire. Coiffez le cryovial, mélangez brièvement en inversant et placez immédiatement les flacons dans un récipient de congélation qui refroidit à une vitesse de 1 °C/min.
  2. Placez la glacière dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit. Le lendemain, déplacez les cryoviaux dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme.
  3. Décongélation des cellules MEPM cryoconservées
    1. Retirez les cryoviaux du réservoir d’azote liquide et décongelez à température ambiante jusqu’à ce que le contenu commence à devenir liquide. Videz le contenu dans un tube conique de 15 mL contenant 9 mL de milieu de culture MEPM préwarmé.
    2. Centrifugez le tube à 200 × g pour granuler les cellules. Resuspendez les cellules dans 1 mL de milieu de culture MEPM et pipetez les cellules dans un seul puits d’une plaque de 6 puits. Ajouter 2 mL de milieu de culture MEPM chaud pour porter le volume total à 3 mL.
    3. Culture des cellules à 37 °C dans un incubateur avec 5% de CO2. Changez le support tous les jours.

5. Imagerie en direct des cellules MEPM - Essai de migration collective 2D (Figure 2)

  1. Préparez une plaque à utiliser pour l’imagerie en direct.
    1. Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux ou un scalpel pointu pour raccourcir un insert stérile en silicone à 2 puits à une hauteur d’environ 1 mm. Préparez un encart pour chaque échantillon utilisé.
    2. À l’aide d’une pince, placez l’insert en silicone raccourci à 2 puits au centre d’un puits d’une plaque à 6 puits. Appuyez sur tous les bords pour vous assurer qu’il est entièrement adhéré.
  2. Décongeler les cellules cryoconservées en suivant les étapes de la section 4.3 du présent protocole. Compter les cellules MEPM et ensemencer 300 cellules/mm2 des inserts en silicone raccourcis dans un volume total de 40 à 50 μL de milieu de culture MEPM par puits. Culture des cellules pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur avec 5% de CO2.
  3. Le lendemain, préparez-vous à l’imagerie time-lapse en direct.
    1. Utilisez un microscope à contraste de phase avec un incubateur sur scène et une capacité d’imagerie automatique. Ajouter de l’eau au réservoir de l’incubateur sur scène pour réduire l’évaporation du milieu de culture; régler la température à 37 °C et le CO2 à 5 %. Laissez ~30 min pour que l’humidité s’accumule avant de placer le plat à 6 puits dans l’incubateur sur scène.
  4. Utilisez des paramètres équivalents aux suivants pour l’imagerie accélérée.
    1. Sélectionnez l’objectif 4x pour avoir de grands champs de vision et un filtre de contraste de phase.
      REMARQUE: L’autofocus, l’échantillon de recherche automatique, la pile z et l’éclairage automatique ne sont généralement pas nécessaires.
    2. Sélectionnez deux champs microscopiques par puits pour capturer la lumière des inserts en silicone raccourcis. Assurez-vous que toutes les positions d’imagerie ont la mise au point correcte.
      REMARQUE: Les plans d’image peuvent être ajustés pendant l’imagerie, mais un tel ajustement n’est généralement pas nécessaire.
    3. Sélectionnez le type de fichier de sortie d’image souhaité, puis sélectionnez ou désélélez les options de post-imagerie, telles que la création vidéo automatique et les filigranes, selon vos besoins. Le cas échéant, sélectionnez le contraste de phase comme mode d’imagerie.
      REMARQUE : L’utilisation de filigranes peut entraver les étapes de traitement d’image ultérieures.
    4. Réglez la durée de l’enregistrement sur 72 h. Configurez le programme pour capturer des images toutes les 10 minutes.
      REMARQUE: Habituellement, seulement 48 heures d’imagerie sont nécessaires, mais l’imagerie peut être arrêtée à tout moment avant la marque de 72 heures sans perdre les images qui ont déjà été prises.
    5. Assurez-vous que la chambre environnementale est opérationnelle comme l’exige la section 5.3.1. Enregistrez ces paramètres(la routine)et commencez l’imagerie.
  5. Poursuivez l’imagerie jusqu’à 72 h (ou l’heure spécifiée).

6. Imagerie en direct des cellules MEPM dans un essai de réparation des plaies (Figure 3)

  1. Préparez une plaque à utiliser pour l’imagerie en direct. À l’aide d’une pince, placez un insert stérile en silicone à 2 puits au centre d’un puits d’une plaque à 6 puits et appuyez sur tous les bords pour vous assurer qu’il est pleinement adhéré. Préparez un insert à 2 puits pour chaque échantillon utilisé.
  2. Décongeler les cellules cryoconservées en suivant les étapes de la section 4.3 du présent protocole. Compter les cellules MEPM et, si nécessaire, concentrer les cellules à au moins 350 cellules/μL.
  3. Ensemencez 1400 cellules/mm2 dans les inserts en silicone dans un volume de 100 μL de milieu de culture MEPM par puits. Culturez les cellules pendant 48 h à 37 °C dans un incubateur avec 5% de CO2, et changez le milieu tous les jours.
  4. Après 48 h, préparez un microscope pour l’imagerie time-lapse en direct comme décrit aux rubriques 5.3 et 5.4. Immédiatement avant de placer les cellules dans l’incubateur sur scène, ajoutez 3 mL de milieu de culture MEPM préwarmé au puits (mais à l’extérieur des inserts), puis retirez soigneusement les inserts en silicone.
    NOTE: Le mur séparant les 2 chambres laisse un espace qui est la « plaie ».
  5. Démarrez l’imagerie time-lapse comme décrit à la section 5.4, avec les différences suivantes :
    1. Utilisez un objectif de grossissement plus élevé (p. ex., 10x). Pour capturer la fermeture de la plaie, sélectionnez 5 champs de vision le long de chaque plaie, de sorte que la plaie soit parallèle à l’axe vertical de l’image.
  6. Arrêtez l’imagerie après 72 h ou lorsque les plaies sont complètement fermées.

7. Analyse computationnelle de séquences d’images time-lapse

Remarque : Effectuez les procédures suivantes sur un ordinateur équipé d’outils de calcul standard, tels que l’interpréteur python, le compilateur C et un shell (voir la Table des matériaux).

  1. Analyse de la confluence
    REMARQUE: Cette procédure peut être utilisée pour estimer la prolifération cellulaire dans une culture clairsemée ou pour quantifier les expériences de fermeture de plaie. Pour détecter les zones occupées par les cellules, un seuil de segmentation est appliqué à l’écart type local de luminosité de l’image. Le code a été décrit précédemment par Wu et al.33 et Neufeld et al.34 et est disponible à http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. Déterminez le seuil de segmentation des images. Par exemple, pour voir la segmentation avec un seuil 4, exécutez la commande
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -test sortie.jpg
      puis vérifiez la sortie (sortie.jpg).
      REMARQUE: Si le seuil est trop bas, les zones d’arrière-plan de la micrographie sont classées comme étant couvertes de cellules. En revanche, si le seuil est trop élevé, les zones couvertes de cellules ne sont pas classées comme telles. La valeur seuil optimale réduit au minimum les deux erreurs.
    2. Utilisez le script area.sh fourni pour calculer les valeurs de confluence d’une séquence d’images en tant que
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > la confluence.dat
      Remarque : La valeur de seuil de discrimination 4 est vérifiée à l’étape 1 et les résultats sont stockés dans la confluencedu fichier.dat . En triant les images dans les dossiers appropriés, la liste des noms de fichiers image peut être remplacée par une notation générique :
      area.sh -S4 * .jpg > la confluence.dat
    3. Pour les expériences de fermeture de plaie, transformer les données de confluence A(t)- la taille de la zone couverte de cellules exprimée en pourcentage en fonction de la vitesse de propagation du temps dans le bord de la plaie V comme
      Equation 1
      où w indique la largeur du champ et dA/dt est la dérivée temporelle de A(t), c’est-à-dire le taux d’expansion de la zone couverte de cellules.
  2. Carte de motilité cellulaire
    1. Exécutez un algorithme de vélocimétrie d’image de particules (PIV) pour caractériser la motilité cellulaire et extraire l’étendue du mouvement local « flux optique » entre les paires d’images, mais pas pour identifier les cellules individuelles.
      REMARQUE: Ici, une taille de fenêtre initiale de 50 μm est utilisée, comme décrit en détail par Zamir et al.35 et Czirok et al.36, avec une taille de fenêtre initiale de 50 μm. L’analyse PIV donne un champ de vitesse v(x,t) pour chaque image d’image t et emplacement (dans l’image) x.
    2. Extraire la vitesse moyenne de la motilité cellulaire de v(x,t) sous forme de moyenne spatiale calculée sur la zone occupée par la cellule, telle que déterminée à la section 7.1.
  3. Suivi manuel des cellules
    REMARQUE: Bien que l’analyse PIV fournisse une évaluation automatique de la motilité cellulaire, se concentrer sur le comportement des cellules individuelles nécessite souvent un suivi manuel. Bien que plusieurs outils offrent cette fonctionnalité, il est très utile que les marqueurs positionnés manuellement puissent être modifiés après leur placement initial et que le suivi puisse être effectué à la fois vers l’avant et vers l’arrière dans le temps.
    1. Effectuez un suivi des cellules avec un outil Python personnalisé (http://github.com/donnagreta/cm_track), qui fournit également des fonctions d’éditeur de base telles que la suppression de segments de trajectoire.
      REMARQUE: Cet outil de suivi manuel donne les positions P (i, t) de la cellule i au temps t dans un fichier texte et appelée comme
      cm_track.py -i images/ -o track.dat
      où les images time-lapse se trouvent dans le dossier images/ et les données de position sont collectées dans la piste de fichier.dat (Figure 4).

Figure 4
Figure 4: Analyse des trajectoires cellulaires individuelles. (A) Les micrographies time-lapse à contraste de phase sont soumises à (B, C) une procédure de suivi manuel, qui marque les cellules (points verts). (D) Les positions des cellules (x,y) sont stockées pour chaque cellule distinguée par son ID et pour chaque image f. (E) Les trajectoires peuvent être superposées sur les micrographies et codées par couleur pour indiquer des informations temporelles. Par exemple, dans chaque trajectoire, une palette de couleurs bleu à rouge indique progressivement des segments de trajectoire ultérieurs, le rouge et le bleu marquant respectivement les emplacements des cellules initiales et finales. (F) Diverses propriétés statistiques des trajectoires, telles que le déplacement carré moyen, peuvent être extraites et utilisées pour caractériser la motilité de diverses populations cellulaires, qui dans cet exemple incluent les cellules MEPM de type sauvage (wt, bleu) et knockdown (kd, rouge). Les barres d’échelle représentent 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Superposer des trajectoires sur des images à l’aide d’un deuxième outil, appelé en tant que
    visdat.py -d track.dat -i images/ -o superposition/ -l999 -r3 -C2
  2. Collectez les images avec les trajectoires superposées dans la superposition de dossier.
    Remarque : Dans cet exemple, les données de position de cellule sont stockées dans la piste de fichier.dat, tandis que la séquence d’images time-lapse se trouve dans les images de dossier. Le reste des paramètres contrôle la longueur maximale des trajectoires dessinées (-l), la taille des symboles (-r) et le jeu de couleurs (-C) utilisé.
  1. Analyse des trajectoires cellulaires individuelles
    1. Caractériser les trajectoires par la longueur totale du trajet
      Equation 2,
      et déplacement net vers la plaie
      Equation 3,
      où X désigne la projection de P dans la direction perpendiculaire à la plaie : la coordonnée x des positions lorsque la plaie est parallèle à l’axe y.
    2. Calculer l’efficacité de guidage comme Equation 4 pour chaque cellule i et point de temps t37. Caractériser les cultures par la moyenne de population de ces mesures unicellulaires, évaluées à un point temporel approprié t.
  2. Mouvement de flux collectif des cellules
    1. Caractériser les corrélations spatiales locales des mouvements cellulaires par la vitesse moyenne d’autres cellules qui se trouvent à proximité d’une cellule en mouvement, comme décrit précédemment38,39.
      REMARQUE: Le code de calcul est disponible à https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. Aligner un système de référence avec les directions avant, arrière, gauche et droite à chaque vecteur v(x,t) (Figure 5A). Assignez chacune des cellules environnantes ou vecteur de vitesse PIV à la cellule spatiale appropriée du système de référence (Figure 5B). Répétez la procédure car chaque vecteur sert d’origine aux systèmes de référence(Figure 5C,D)afin qu’un vecteur vitesse donné soit affecté à plusieurs bacs.
        REMARQUE : Un point de données peut se présenter devant un vecteur et à gauche d’un autre.
      2. Faites pivoter les systèmes de référence dans une orientation commune (Figure 5C, F) et mettez-les en commun ( Figure5G).
        REMARQUE: La moyenne de chaque bac des données de vitesse regroupées est un vecteur de vitesse (U) qui est indicatif de corrélation spatiale: la moyenne est une mesure d’une composante de vitesse partagée (Figure 5H).
      3. Ajuster les champs d’écoulement U(x) avec une fonction exponentielle Equation 5 , où a, x0 et U0 sont des paramètres d’ajustement. Parmi les trois paramètres d’ajustement, concentrez-vous sur x0, la longueur de corrélation(Figure 5I,J),qui est la distance caractéristique où les corrélations vitesse-vitesse locales disparaissent.

Figure 5
Figure 5: Caractérisation de la formation de flux de cellules cultivées. (A,D) Des images time-lapse à contraste de phase de la figure 4A sont utilisées pour identifier les mouvements cellulaires. Pour chaque cellule en mouvement, un cadre de référence (bleu) et des bacs spatiaux (blancs) ont été co-alignés pour catégoriser les cellules adjacentes comme étant à l’avant, à l’arrière, à gauche ou à droite. (B,E) La vitesse des cellules adjacentes (vecteurs noirs) était liée au même cadre de référence (C,F). Cette procédure a été répétée pour chaque cellule et chaque point temporel. (G) Après avoir regroupé ces informations locales, chaque bac contiendra plusieurs vecteurs de vitesse (gris), qui peuvent être moyenés pour déterminer la vitesse moyenne de co-déplacement (flèches magenta) à divers endroits par rapport à une cellule mobile moyenne. (H) La carte de vitesse moyenne caractérise donc les vitesses typiques des cellules à divers endroits par rapport à une cellule en mouvement. (I,J) Enfin, ce champ a été échantillonné le long de l’axe avant-arrière (parallèle) et également le long de l’axe gauche-droite (perpendiculaire). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

La dissection des étagères palatales est illustrée à la figure 1. La séquence d’incisions est conçue pour minimiser le glissement du tissu. Après le retrait de la tête (Figure 1A, B), la mâchoire inférieure est retirée ( Figure1B, C). L’incision de la partie supérieure de la tête (Figure 1C, D) est faite pour stabiliser le tissu lorsqu’il est placé à l’envers ( Figure1E) pour visualiser (Figure 1E, lignes pointillées), pincer (Figure 1F), et exciser (Figure 1G) les étagères palatales.

La paire d’étagères palatales excisées d’un seul embryon est trypsinisée et cultivée dans un plat de 35 mm ou dans un puits d’un plat à 6 puits. Les plats plus grands ne sont pas préférés car la densité cellulaire est trop faible pour une croissance optimale. À la confluence, les cellules de chaque puits sont trypsinisées et passées dans trois puits équivalents à 35 mm (passage #1). Les cellules confluentes du passage #1 peuvent ensuite être congelées en aliquotes de 1 × 106 cellules/mL. Les aliquotes congelées sont ensuite élevées dans un plat équivalent à 35 mm et cultivées jusqu’à la confluence. Les cellules sont ensuite trypsinisées (passage #2) et ensemencées selon l’expérience. La création et l’utilisation d’aliquotes congelées ont aidé à normaliser les conditions, en particulier en ce qui concerne la densité cellulaire. L’utilisation de cellules MEPM fraîches a entraîné une plus grande variabilité de la densité cellulaire finale dans les expériences, ce qui serait dû à une proportion variable de cellules viables ou sous-viables dans des cultures fraîches. De plus, le nombre de passages de cellules MEPM était strictement limité à deux (énumérés ci-dessus) pour ces expériences.

Considérant que a) la densité cellulaire était critique, b) les cellules MEPM d’un seul embryon étaient limitées, et c) l’optique d’imagerie était meilleure dans une grande boîte, des inserts en silicone à 2 puits ont été utilisés(Figure 2 et Figure 3). Pour les essais de réparation des plaies, les cellules MEPM ont été cultivées dans les inserts en silicone à 2 puits jusqu’à une confluence élevée, puis les inserts ont été retirés et la plaie imagée jusqu’à la fermeture (Figure 3). Cependant, pour la culture 2D, les cellules MEPM avaient besoin d’imagerie au fur et à mesure de leur croissance,de sorte que les inserts en silicone à 2 puits ont simplement été coupés à 1/3 de leur hauteur pour permettre une imagerie claire(Figure 2C). De petits anneaux imprimés en 3D40 dans des plats de 35 mm ont également été utilisés pour l’analyse de la motilité 2D (Figure 2D).

Les trajectoires MEPM(Figure 4E)sont persistantes : la direction de la motilité cellulaire est maintenue pendant plusieurs heures. L’analyse du déplacement moyen par rapport au temps(figure 4F)indique que la persistance sous forme de déplacement est proportionnelle au temps écoulé. La vitesse typique des cellules MEPM sur la surface plastique de culture tissulaire, 10 μm / h, peut également être utilisée pour le contrôle de la qualité de la culture cellulaire. L’analyse en flux des données de motilité révèle que les amas co-mobiles des cellules MEPM ont une taille d’environ 300 μm(Figure 5I,J). Les résultats représentatifs indiquent également une profonde différence de motilité entre les cellules MEPM de type sauvage et mutantes. En plus de la comparaison des types sauvages et des mutants, les tests 2D et de réparation des plaies peuvent être combinés à divers traitements biochimiques. Par exemple, des activateurs de voie PI3K-AKT ont été utilisés avec des cellules MEPM, comme décrit précédemment 21.

Figure 1
Figure 1: Dissection des plateaux palataux embryonnaires pour isoler les cellules mésenchymateuses. (A) Une tête d’embryon de souris E13.5 est enlevée en coupant le long du cou (ligne rouge). (B) Ensuite, la mâchoire inférieure et la langue sont enlevées avec des incisions le long de la cavité buccale, entre les mâchoires supérieure et inférieure (ligne jaune). (C) Pour stabiliser le tissu pour l’enlèvement de l’étagère palatale, le haut de la tête est excisé (ligne verte). (D) La région disséquée de la mâchoire supérieure qui en résulte est placée (E) à l’envers pour visualiser les étagères palatines (lignes pointillées noires). (F) L’excision des étagères palatales individuelles est représentée schématiquement, où les étagères individuelles saillantes (jaune) sont pincées du maxillaire (bleu). (G) Paire excisée d’étagères palatines d’un seul embryon, qui peut ensuite être trypsinisée et cultivée dans un plat de 35 mm ou dans une assiette de 6 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Installation expérimentale de la culture cellulaire MEPM 2D. (A) Décongeler une aliquote congelée de cellules MEPM, et (B) mettre en culture les cellules dans un plat de 35 mm ou une plaque à 6 puits. Lorsqu’elles sont confluentes, trypsiniser les cellules et les ensemencer comme décrit dans le protocole dans un plat de 35 mm soit avec (C) des inserts en silicone à 2 puits qui ont été coupés ou (D) avec des anneaux imprimés en 3D. Un petit espace de culture minimise le besoin d’un grand nombre de cellules MEPM. Le profil bas des inserts en silicone découpés ou des bagues imprimées en 3D permet une imagerie directe sans effet de halo. L’imagerie en accéléré peut se poursuivre jusqu’à ce que la densité cellulaire souhaitée soit atteinte, ce qui peut aller jusqu’à 72 h. Les images représentatives sont montrées à (E) 0 h, (F) 24 h et (G) 45 h. Les images ont été prises à l’aide d’un objectif 4x. Les barres d’échelle pour E, F, G = 300 μm. Abréviations: 2D = bidimensionnel; MEPM = mésenchyme palatal embryonnaire de souris; 3D = tridimensionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Mise en place expérimentale d’un essai de fermeture de plaie utilisant des cellules MEPM. (A) Décongeler une aliquote congelée de cellules MEPM et (B) des cellules de culture dans un plat de 35 mm ou une plaque de 6 puits. Lorsqu’elles sont confluentes, trypsiniser les cellules et(C)les ensemencer dans les inserts en silicone à 2 puits dans un plat de 35 mm. Culturez les cellules dans l’insert jusqu’à ce que la confluence souhaitée soit atteinte (~48 h), puis retirez l’insert en silicone et l’image. Les images représentatives sont montrées (D) immédiatement après le retrait de l’insert, (E) après 24 h, et (F) après 40 h. La fermeture de la plaie prend environ 36 h. Les images ont été prises à l’aide d’un objectif 10x. La barre d’échelle représente 300 μm. Abréviations : MEPM = mésenchyme palatal embryonnaire de souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’élévation du plateau palatal constitue un événement de remodelage vertical à horizontal1,3,4,9,11. Il est postulé que ce processus de remodelage nécessite que les cellules mésenchymateuses du plateau palatal se comportent de manière coordonnée. Les analyses avec des cellules MEPM de type sauvage montrent que ce comportement cellulaire est intrinsèque et peut être quantifié21. Ainsi, ces tests peuvent être utilisés pour découvrir des défauts d’élévation du plateau palatal primaire dans des modèles murins nouveaux et existants de fente palatine. Les méthodes décrites aux sections 1 et 2 devraient permettre aux chercheurs d’isoler, de mettre en culture et de congeler des aliquotes de cellules MEPM primaires. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour une grande variété d’applications, y compris la culture 2D et les tests de réparation des plaies décrits ici. La culture 2D, lorsqu’elle est combinée à l’imagerie time-lapse, présente une méthode simple pour déterminer les attributs cellulaires de base sur une gamme de densités cellulaires. Présenté ici est une méthode pour évaluer l’alignement cellulaire et la formation de flux cellulaires, qui sont des attributs du mouvement cellulaire collectif (Figure 4). Les essais de fermeture de plaie sont couramment utilisés pour évaluer la migration cellulaire41,42,43. La région sans cellules de la « plaie » fournit un indice pour le mouvement directionnel des cellules à la périphérie. L’imagerie en accéléré de ce processus a permis de déterminer et d’évaluer les trajectoires cellulaires pendant la migration. Ces trajectoires cellulaires, à leur tour, déterminent la vitesse de migration cellulaire et la directionnalité (Figure 5).

Il est important d’optimiser d’abord les conditions de culture et d’essais en utilisant uniquement des cellules MEPM de type sauvage. Une fois que les étagères palatines ont été essayées avec succès et que la suspension unicellulaire qui en résulte a été plaquée pendant la nuit, la grande majorité (~ 90%) des cellules se fixeront facilement à la surface de croissance du plat. Si les cellules n’adhèrent pas facilement, il peut y avoir quelque chose qui ne va pas avec les conditions de culture. Initialement, les cellules adhérentes auront l’air assez homogènes, avec une forme triangulaire ou légèrement allongée, mais à mesure qu’elles atteignent une densité élevée, elles deviennent plus en forme de fuseau et allongées(Figure 2). Si les cellules deviennent considérablement grandes en taille ou multinucléées, elles ne doivent pas être utilisées pour des expériences. Cette optimisation établira également des paramètres de base de type sauvage pour une croissance réussie (temps de confluence) et réparation des plaies (temps de fermeture). Les cellules devraient proliférer en doublant en nombre presque quotidiennement et dans les images en accéléré, montrer une motilité d’environ 5-10 μm / h. De même, si, dans une expérience ultérieure impliquant une comparaison wildtype-mutant, ces paramètres fondamentaux ne sont pas respectés par les cellules wildtype, l’expérience peut devoir être exclue de l’analyse. Par exemple, les cellules MEPM de type sauvage prennent 36 à 40 h pour fermer complètement la plaie à l’aide des inserts en silicone à 2 puits. Si, dans une expérience, les cellules de type sauvage prennent beaucoup plus de 40 heures pour fermer la plaie, toute l’expérience serait suspecte. Les mauvaises performances des cellules MEPM peuvent être dues à 1) une mauvaise qualité de l’aliquote congelée, 2) une mauvaise renaissance ou 3) une différenciation excessive. Les cellules différenciées ou sénescentes peuvent être détectées visuellement car elles deviennent très grandes et ne se divisent pas. Une culture avec un grand nombre de telles cellules doit être évitée. En général, il ne doit pas y avoir de cellules anormales dans le champ de vision d’un objectif 10x(Figure 3); une cellule ou deux en dehors du champ de vision ne devraient pas avoir d’incidence importante sur l’analyse. Limiter l’analyse à seulement deux passages cellulaires (ci-dessus) aide grandement à maintenir la qualité des cellules MEPM.

Pour la culture 2D et les tests de réparation des plaies utilisant des cellules MEPM primaires, la condition clé du succès était une densité cellulaire initiale élevée. Cette exigence a d’abord été déterminée lors de l’optimisation du test de réparation des plaies dans lequel les cellules ont été ensemencées à >1400 cellules/mm2. La densité des cellules migrant dans la plaie a ensuite été utilisée comme densité d’ensemencement dans les tests de culture 2D. Une densité d’ensemencement d’environ 300 cellules/mm2 a formé des flux cellulaires, tout en permettant une analyse automatisée des trajectoires cellulaires. Les densités supérieures à 300 cellules/mm2 ont tendance à former des flux plus vifs qui peuvent être visualisés à l’œil, mais rendent le suivi des cellules individuelles difficile. Lors de la comparaison des cellules MEPM primaires d’embryons de type sauvage et mutants, bien que le délai de fermeture de la plaie puisse être évalué sans analyse informatique, la formation de flux et les différences de directionnalité peuvent ne pas être discernables à l’œil. Si la densité de cellule est trop élevée ou si la qualité de l’image est médiocre/floue, par exemple en raison d’une perte de mise au point, le suivi automatisé des cellules peut être difficile. Dans un tel cas, il est possible d’utiliser le suivi manuel des cellules pour déterminer les trajectoires des cellules dans les tests de réparation des plaies à l’aide d’ImageJ. Une très faible concentration de coloration nucléaire hoechst (3 μL/mL de solution de 20 mM dans le milieu de culture MEPM) peut également être utilisée pour faciliter le suivi cellulaire; cependant, la toxicité du laser fluorescent peut être un problème avec une utilisation prolongée.

Pour le suivi manuel, il était plus facile de suivre les cellules en sens inverse à partir de la fin de la fermeture de la plaie vers l’arrière autant que possible jusqu’à ce que la densité cellulaire élevée obscurcisse le suivi ultérieur. Même les trajectoires cellulaires partielles, lorsqu’elles sont combinées pour une population cellulaire, étaient informatives. Contrairement aux tests de réparation des plaies, le suivi cellulaire automatisé est nécessaire pour l’analyse de culture cellulaire 2D, ce qui est l’une des raisons pour lesquelles des densités cellulaires intermédiaires ont été choisies. Enfin, des analyses primaires sensibles basées sur le MEPM peuvent être utilisées pour identifier les composés et les voies susceptibles d’affecter l’élévation du palais. Des études antérieures ont indiqué que l’activation de la voie PI3K-AKT améliorait à la fois la vitesse cellulaire et la directionnalité des cellules MEPM mutantes Specc1l 21. D’autres études MEPM ont également utilisé divers facteurs de croissance ou traitements médicamenteux pour stimuler les cascades de signalisation en aval ou pour évaluer la prolifération22,29,30,44,45. Ainsi, les analyses basées sur le MEPM offrent une méthode rapide pour identifier beaucoup plus de facteurs régulateurs positifs ou négatifs, qui peuvent ensuite être validés in vivo.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce projet a été soutenu en partie par les subventions des National Institutes of Health DE026172 (I.S.) et GM102801 (A.C.). I.S. a également été soutenu en partie par la subvention du Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), la subvention du Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) et la subvention du Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056

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Biologie du développement Numéro 168 Palatogenèse Fente palatine Élévation palatine Cellules mésenchymateuses primaires Migration cellulaire Réparation des plaies Imagerie time-lapse Formation de flux cellulaire Mouvement cellulaire collectif Motilité cellulaire coordonnée
Isolement et imagerie en accéléré de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires primaires de souris pour analyser les attributs de mouvement collectif
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