Summary
我々は、二次元(2D)成長および創傷修復アッセイのタイムラプスイメージングのための一次マウス胚口蓋間葉細胞の単離および培養のためのプロトコルを提示する。また、タイムラプスイメージングデータの解析方法を提供し、細胞流の形成と指向運動性を決定します。
Abstract
口蓋の発達は、舌の隣にある両側口蓋棚の垂直成長に続いて、舌の上に標高と融合を伴う動的なプロセスである。この過程の欠陥は、口蓋裂、共通の出生時欠損につながる。最近の研究では、口蓋棚の標高には、棚の向きを垂直から水平に変換する改造プロセスが含まれていることが示されています。この動的なリフォームにおける口蓋棚間葉細胞の役割は、研究が困難であった。タイムラプスイメージングベースの定量分析は、最近、一次マウス胚性口蓋間葉(MEPM)細胞が集団運動に自己組織化できることを示すために使用されています。定量的解析では、口蓋の標高欠陥を持つマウス モデルから、変異 MEPM 細胞の違いを特定できます。本論文では、E13.5胚からMEPM細胞を分離して培養する方法について、特にタイムラプスイメージングのために、また、河川形成、形状アライメント、方向の持続性の測定を含む集団運動の様々な細胞属性を決定する方法について述べる。MEPM細胞は、標高の動的プロセス中に口蓋棚間葉系の役割を研究するためのプロキシモデルとして機能することができると考えています。これらの定量的方法により、頭蓋顔面場の研究者は、コントロール細胞と突然変異細胞の集団運動属性を評価および比較することができ、口蓋棚の上昇時の間葉リモデリングの理解を強化する。さらに、MEPM細胞は、一般的に集団細胞の動きを調べた稀な間葉細胞モデルを提供する。
Introduction
口蓋の発達は、口蓋形成の欠陥が口蓋裂につながり、単離した症例で起こる一般的な出生時欠損、または何百もの症候群1,2の一部として広範囲に研究されてきた。胚性口蓋の発達は、胚組織の移動および融合を伴う動的プロセスである。このプロセスは、口蓋棚の1)誘導、2)舌の隣の口蓋棚の垂直成長、舌の上の口蓋棚の3)上昇、および4)正中線1、3、4における口蓋棚の融合の4つの主要なステップに分けることができる。過去数十年にわたり、多くのマウス変異体が口蓋裂5、6、7、8を明らかに同定されてきた。これらのモデルの特徴は、口蓋棚誘導、増殖、および融合ステップにおける欠陥を示している。しかし、口蓋棚の標高欠陥はまれであった。したがって、口蓋棚の上昇のダイナミクスを理解することは、興味深い研究分野です。
口蓋棚の標高欠陥を有するいくつかのマウス変異体の慎重な分析は、口蓋棚の非常に前部領域が反転するように見えるが、口蓋棚の垂直から水平移動または「リモデリング」が口蓋1、3、4の後部領域に起こることを示す現在のモデルにつながっている。 9、10、11。口蓋棚の内側縁上皮は、この改造に必要なシグナリングを開始する可能性が高く、口蓋棚間葉によって駆動される。最近、多くの研究者は、口蓋棚12,13を含む一過性の経口接着を示すマウスモデルにおける口蓋棚の上昇遅延を同定した。間葉性のリモデリングは、細胞の再編成を伴い、水平方向に膨らみを作り出し、同時に口蓋棚を垂直方向9、10、14に引き込む。口蓋棚の上昇および基礎間葉リモデリングに影響を与えるために提案されたいくつかのメカニズムの中には、細胞増殖15、16、17、化学戦術勾配18、および細胞外マトリックス成分19、20がある。重要な疑問が生じた:Specc1l-欠損マウスで観察された口蓋棚の標高遅延も、口蓋棚の改造の欠陥も一因であり、この改修欠陥は、原発MEPM細胞21の挙動における本質的な欠陥に現れる可能性がありますか?
原発性MEPM細胞は、遺伝子発現22、23、24、25、26、27、28、29、および増殖を伴ういくつかの研究のために頭蓋顔面分野で使用されてきた30、31、32 を使用しますが、集合的な細胞行動分析には何もありません。MEPM細胞のタイムラプスイメージングを2D培養および創傷修復アッセイで行い、MEPM細胞が集団運動21の指向性運動および形成された密度依存性細胞ストリーム属性を示すことを示した。さらに、Specc1l変異細胞は、より狭い細胞ストリームを形成し、高可変細胞移動軌跡を示した。この協調運動性の欠如は、Specc1l変異胚13,21における口蓋上昇遅延に寄与すると考えられる。したがって、原発性MEPM細胞を用いたこれらの比較的単純なアッセイは、口蓋棚の上昇時に間葉リモデリングを研究するための代理として機能し得る。本論文では、2Dおよび創傷修復アッセイの経時経過イメージングと分析に加えて、一次MEPM細胞の単離と培養について述べている。
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Protocol
動物を含むすべての実験は、ガイドラインと規制に従って、KUMC制度動物の世話と使用委員会によって承認されたプロトコルで行われました(プロトコル番号:2018-2447)。
1. 収穫E13.5胚
- CO2吸入室を使用するか、機関動物ケアと使用委員会によって承認された手順によって、妊娠中の雌マウスを安楽死させる。すぐに解剖に進みます。
- 皮膚と腹膜を取り除くことによって、腹腔の下半分を露出させます。E13.5胚を含む子宮の角の両方を切り出す。
- 子宮を温め込んだ37°Cの無菌リン酸緩衝生理食塩水中(PBS)に短時間入れ、余分な血液、髪、または他の破片をすすぎさせる。無菌PBSで満たされた無菌10cm皿に子宮を入れます。
- 小さなはさみを使用して、子宮の長さに沿って子宮壁を切断し、各胚を露出させ、まだ黄身嚢に入れる。胚を取り巻く黄身嚢を取り除くが、必要に応じてジェノタイピングのためにそれを保存する。胚が取り除かれると、PBSで満たされた12ウェルプレートの独自の井戸に各胚を置きます。
2. 胚からの口蓋棚の解剖 (図1)
注:各胚を処理した後、100%エチルアルコール(EtOH)のビーカーに入れ、350°Cの器械滅菌器で100%EtOHの2番目のビーカーで冷却して、ステンレス鋼解剖器( 材料表を参照)を殺菌します。
- 殺菌したパーフォレーテッドスプーンを使用して、10%のウシ胎児血清(FBS)、L-グルタミン(4mM L-Glu)、抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシン(50/mL)を含むDulbeccoの最小必須培地(DMEM)で満たされた新しい10cmの培地に胚を入れます。
- 生殖不能のはさみを使用して、顎のラインのすぐ下の胚を切断します(図1A、赤い点線)。殺菌した細かい#5鉗子の1点を口に挿入して下顎を取り除き、頬のすぐ内側に保ちます。挿入された鉗子のポイントを、頭蓋骨の後ろから出るまで押し込む。
- 鉗子を 図1Bの黄色い線に沿って向き、鉗子の反対側(まだ胚の外側にある)が外耳道の上をホバリングするようにし、鉗子を挟んで組織を切断する。必要に応じて、ピンチによって完全に切断されなかった組織を切断するために、現在閉じている鉗子の縫い目に沿って別の細かい鉗子を実行します。
- 前の手順を、胚の頭部の反対側に対して繰り返します。ピンチカットの手順を続行して、頭蓋骨の下顎、舌、および下の部分を完全に取り除き、口蓋棚を露出させる。
- 図1C(緑色線)に示すように、目のすぐ上を切って頭蓋骨の頭蓋骨を取り除きます。これは、頭を左側または右側に配置し、小さなステンレス製のはさみの点を胚の目の高さまで頭蓋骨の前後に配置します。はさみの1つの速い切り取りで頭蓋骨の上部を切り取り、後のステップで安定性のために重要であり、側面から見ると図1Dのように見えるはずの平らな表面を作り出します。
- 頭の残りの部分を逆さまに置き、頭の上面(頭蓋骨を取り除く)を皿の底に平らに置き、口蓋棚の取り外しのための安定した表面を提供します。今露出して上向きになっている口蓋棚を特定し、頭の前半分の中央溝の両側に2つの隆起した尾根として現れます(図1E)。
- 棚が取り外されている間にそれを固定するために皿にヘッドの残りの部分をピン留めします。これは、頭の鼻領域の近くの組織を通して細かい鉗子の1点を挿入し、口蓋棚に前部を挿入し、頭蓋骨の基部を通して鉗子のもう一方の点を挿入し、後部を口蓋棚に挿入する。口蓋棚の切除を行いながら、これらを所定の位置に保持します。
- 片手で頭部を固定し、最初に取り除く2つの棚のいずれかを選び、2番目の細い鉗子の両方の点を棚の側面の基部の組織に挿入し、ピンチして組織を切断する(図1F)。これを棚の内側表面の底面に沿って繰り返し、棚の前端と後端の両方で頭から取り外します。
- 棚を静かに持ち上げ、必要に応じて追加のピンチを作り、周囲の組織から棚を完全に解放します。
- 前の 2 つの手順を繰り返して、2 番目の口蓋棚を取り外します。
- 口蓋棚が周囲の組織から解放され、PBS(図G)に入れられたので、無菌プラスチック電球転写ピペットを使用してピペットの棚を引き上げ、約500μLのPBSと一緒に1.5mLマイクロ遠心チューブに移します。残りのごみは同じ方法で処理されますので、氷の上に口蓋棚を含むチューブを保ちます。
注:または、棚は、解剖直後(氷の上に置く代わりに)、プリウォームトリプシン(0.25%)を含む1.5mLマイクロ遠心チューブに置くことができます。サンプルは新鮮になりますが、サンプルをまとめて処理するのではなく、個々のサンプルのすべての手順を時間に注意する必要があります。
3. MEPM細胞の培養
注:ここで説明した条件下では、口蓋上皮細胞は最初の通路を生き残らず、純粋な間葉間葉細胞培養をもたらす。滅菌技術を使用して、組織培養フード内のすべてのステップを実行します。
- 1.5mLチューブからPBSを吸引して廃棄し、その過程で棚を廃棄しないように注意する。ふろたの棚を含む各管に200 μLのプリウォーム(37°C)トリプシン(0.25%)をすぐに加えます。1000 μL ピペットチップを使用して、トリプシンに棚を簡単にパイプしてトリプシンを加速します。
- 37°Cで5分間チューブをインキュベートし、各サンプルを再び上下にパイプして組織を分解します。37°Cでさらに5分間チューブをインキュベートし、もう一度上下にパイプして組織の解離を完了します。
注:棚は完全にまたはほぼ完全に解約し、組織の目に見える塊が残っていないトリプシンに吊り下げされなければなりません。 - 各1.5mLチューブにMEPM培地(ステップ2.1)800 μLを加えます。200 ×g で1.5mLチューブを5分間ペレットにして5分間遠心する。上清を除去し、細胞ペレットをMEPM培地の1mLで再懸濁させた。
- MEPM細胞をMEPM培養培地を含む6ウェル組織培養処理プレートにプレートします。細胞が5%CO2のインキュベーターで37°Cで12時間プラスチック表面に付着するようにします。
注:一晩のインキュベーションの後、大部分の細胞(約90%)が付着します。この時点で、接着された細胞は、三角形またはわずかに細長い形状で、かなり均質に見えます。 - 古い培地を穏やかに吸い込み、カルシウムやマグネシウムを使わずに1mLの温かい無菌PBSに置き換えて、毎日培地を1分間変更します。PBSを吸引し、3mLのプレウォームMEPM培地に交換した。
- 細胞が100%コンフルエントになると細胞を通過させる。
注:MEPM細胞は、ほぼ毎日数を倍増することによって増殖する必要があります。- 細胞を通過するには、古い培地を軽く吸引し、カルシウムまたはマグネシウムを含まない温かいPBSで~1分間に置き換えます。PBSを吸引し、0.25%トリプシンのプリウォーム0.5mLに交換します。
- 37°Cで~5分間インキュベートし、手で前後に軽く揺れたときに細胞が皿の表面から切り離されるまでインキュベートする。細胞が剥離したら、すぐに5mLのプレウォームMEPM培地をトリプシン化細胞に添加する。
- 10 mLの血清学的ピペレットを使用して、15 mL円錐状のチューブに細胞を静かに集め、200×gで遠心分離して細胞をペレットにします。トリプシンおよび培地を吸引し、細胞を3mLの前温MEPM培地中に再懸濁させた。1mLの細胞を6ウェル皿の単一ウェルに軽くパイプし、2mLのMEPM培養培地を加えて総容積を3mLにします。
注: これはセルの 1:3 分割を構成します。MEPMは3回まで継代することができます。MEPMの播種密度はやや柔軟であり、細胞の数は培養容器によって異なります。しかし、MEPMは、あまりにもまばらに分割したときに適切に増殖せず、彼らが付着したら、彼らの新しい料理に少なくとも20〜25%のコンフルエントでなければなりません。
4. MEPM細胞の凍結保存
- 一旦トリプシン化されたMEPM細胞がペレット化されたら、MEPM培地中の細胞を再懸濁し、1〜1×6細胞/mLの濃度を得た。細胞をクリボビアルにピペトし、細胞ストックに5%ジメチルスルホキシドの最終濃度を加える。クライオビアルをキャップし、反転して短時間混ぜ、1°C/minの速度で冷却する凍結容器にバイアルをすぐに入れます。
- クーラーを-80°Cの冷凍庫に一晩入れます。翌日、長期間保存するために、凍結液を液体窒素タンクに移動します。
- 凍結保存されたMEPM細胞を解凍する
- 液体窒素タンクから凍結液を取り出し、内容物が液体になるまで室温で解凍します。中身を、9 mLの前温めMEPM培養培地を含む15 mL円錐管に空にします。
- 細胞をペレットに200×gでチューブを遠心分離する。細胞をMEPM培地の1mLに再懸濁し、細胞を6ウェルプレートの単一ウェルにピペトする。温かいMEPM培地を2mL加え、総容積を3mLにします。
- 5%CO2でインキュベーターで37°Cで細胞を培養する。毎日メディアを変更します。
MEPM細胞のライブイメージング - 2D集合移動アッセイ (図2)
- ライブイメージングに使用するプレートを準備します。
- 小さな外科用ハサミや鋭いメスを使用して、滅菌された2ウェルシリコーンインサートを〜1mmの高さに短くします。使用するサンプルごとに挿入を準備します。
- 鉗子を使用して、6ウェルプレートのウェルの中央に短くした2ウェルシリコーンインサートを置きます。すべてのエッジに沿って押し下げて、完全に接着していることを確認します。
- このプロトコルのセクション 4.3 の手順に従って、凍結保存されたセルを解凍します。MEPM細胞をカウントし、短いシリコーン挿入物の300細胞/mm2を1ウェルあたり40〜50 μL MEPM培地の総体積で入れます。5%CO2でインキュベーターで37°Cで細胞を一晩培養する。
- 翌日、ライブタイムラプスイメージングの準備をします。
- ステージ上のインキュベーターと自動イメージング機能を備えた位相コントラスト顕微鏡を使用してください。ステージ上のインキュベーターリザーに水を加えて、培養液の蒸発を減らします。温度を37°C、CO2を5%に設定します。6ウェル皿をステージ上のインキュベーターに入れる前に、湿度が上がるのに30分かかります。
- タイムラプスイメージングには、以下のような設定を使用します。
- 大きな視野フィルタと位相コントラストフィルタを使用するには、4倍の目標を選択します。
注: オートフォーカス、自動検索サンプル、z スタック、自動照明は通常必要ありません。 - 短いシリコンインサートのルーメンをキャプチャするために、ウェルごとに2つの顕微鏡フィールドを選択します。すべてのイメージング位置に正しいフォーカスがあることを確認します。
メモ:イメージプレーンはイメージング中に調整できますが、通常はそのような調整は必要ありません。 - 目的のイメージ出力ファイルタイプを選択し、必要に応じて、自動ビデオ作成やウォーターマークなどのポストイメージングオプションを選択または選択解除します。該当する場合は、撮像モードとして位相コントラストを選択します。
注: 透かしを使用すると、後続の画像処理手順が妨げられる場合があります。 - 録音の継続時間を 72 時間に設定します。10分ごとに画像をキャプチャするようにプログラムを設定します。
注:通常、イメージングの必要は48時間のみですが、撮影済みの画像を失うことなく、72 hマークの前の任意の時点でイメージングを停止できます。 - 環境室が 5.3.1 で必要に応じて動作していることを確認します。これらの設定 (ルーチン) を保存し、イメージングを開始します。
- 大きな視野フィルタと位相コントラストフィルタを使用するには、4倍の目標を選択します。
- 72時間(または指定時間)までイメージングを続けます。
創傷修復アッセイにおけるMEPM細胞の生画像化 (図3)
- ライブイメージングに使用するプレートを準備します。鉗子を使用して、無菌の2ウェルシリコーンインサートを6ウェルプレートのウェルの中央に置き、すべてのエッジに沿って押し下げて完全に接着していることを確認します。使用するサンプルごとに1つの2ウェル挿入を準備します。
- このプロトコルのセクション 4.3 の手順に従って、凍結保存されたセルを解凍します。MEPM細胞を数え、必要に応じて、細胞を少なくとも350個/μLに濃縮します。
- 1400細胞/mm2をシリコーンに100 μLのMEPM培地の体積に入れます。5%CO2で培養器で37°Cで48時間細胞を培養し、毎日培地を変える。
- 48時間後、5.3および5.4のセクションに記載されているように、ライブタイムラプスイメージング用の顕微鏡を調製する。ステージ上のインキュベーターに細胞を入れる直前に、3 mLの前温化されたMEPM培地をウェル(ただし挿入物の外側)に加え、シリコーンインサートを慎重に取り除きます。
注:2つのチャンバーを隔てる壁は、「傷」であるギャップを残します。 - 5.4 で説明したように、タイムラプスイメージングを開始します。
- 高倍率(例えば、10倍)の目標を使用します。創傷閉鎖を捕捉するには、創傷が画像の垂直軸と平行になるように、各創傷に沿って5つの視野を選択する。
- 72時間後、または創傷が完全に閉じたときにイメージングを停止します。
7. タイムラプス画像シーケンスの計算解析
メモ:Python インタプリタ、Cコンパイラ、シェルなどの標準計算ツールを搭載したコンピュータで、次の手順を実行します( 資料一覧を参照)。
- 合流性解析
注:この手順は、まばらな培養内の細胞増殖を推定したり、創傷閉鎖実験を定量化するために使用することができます。セルが占める領域を検出するために、セグメンテーションしきい値が画像の明るさの局所標準偏差に適用されます。このコードは、Wuらら33 とノイフェルトら34 によって以前に記述されており、http://github.com/aczirok/cellconfluency で入手可能です。- イメージのセグメンテーションしきい値を決定します。例として、しきい値 4 を使用してセグメンテーションを表示するには、次のコマンドを実行します。
segment.py -i インアウトイメージ.jpg -S 4 -test 出力.jpg
出力を確認し(出力.jpg)。
注: しきい値が低すぎる場合、顕微鏡写真の背景領域はセルカバーに分類されます。これに対し、閾値が高すぎる場合、セル被覆領域はそのように分類されません。最適なしきい値は、両方のエラーを最小限に抑えます。 - 提供されている area.sh スクリプトを使用して、画像シーケンスの合流値を計算します。
area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg.. > 合流性.dat
注: 判別しきい値 4 はステップ 1 で検証され、結果はファイル の合流性.datに格納されます。イメージを適切なフォルダに並べ替えることで、イメージ ファイル名の一覧を ワイルドカード 表記で置き換えることができます。
area.sh -S4 *.jpg >合流性.dat - 創傷閉鎖実験の場合、合流度データ A(t)を変換する-時間創傷端伝搬速度 V の関数としてパーセンテージとして表される細胞被覆領域のサイズを
ここで 、w はフィールドの幅を示し、dA/dtはA(t)の時間微分、すなわちセル被覆領域の膨張率を示す。
- イメージのセグメンテーションしきい値を決定します。例として、しきい値 4 を使用してセグメンテーションを表示するには、次のコマンドを実行します。
- 細胞運動性マップ
- 粒子画像のvelocimetry(PIV)アルゴリズムを実行して細胞運動性を特徴付け、画像ペア間の局所的な動きの範囲を抽出するが、個々の細胞を識別するわけではない。
注:ここでは、Zamirら35 とCzirokら36によって詳細に説明されているように、50 μmの初期ウィンドウサイズが使用され、初期ウィンドウサイズは50 μmです。PIV 解析では、各イメージ フレーム t と (イメージ内の) 位置に対して v(x,t) の速度フィールドが得られます。 - セクション 7.1 で決定した、セル占有領域で計算された空間平均として、v(x,t) からセル運動の平均速度を抽出します。
- 粒子画像のvelocimetry(PIV)アルゴリズムを実行して細胞運動性を特徴付け、画像ペア間の局所的な動きの範囲を抽出するが、個々の細胞を識別するわけではない。
- 手動セルトラッキング
注:PIV分析は細胞運動性の自動評価を提供しますが、個々の細胞の挙動に焦点を当てるには、多くの場合、手動追跡が必要です。いくつかのツールはこの機能を提供しますが、手動で配置されたマーカーを最初の配置後に変更でき、追跡を時間の前後に実行できる場合は非常に便利です。- カスタム開発の Python ツール (http://github.com/donnagreta/cm_track) を使用してセル追跡を実行し、軌道セグメントの削除などの基本的なエディター機能も提供します。
注: この手動追跡ツールは、テキスト ファイル内の時刻 t のセル i の位置 P(i,t) を生成し、
cm_track.py -i イメージ/ -o トラック.dat
タイムラプスイメージがフォルダ画像内にあり、位置データがファイルトラックに収集されます.dat(図4)。
- カスタム開発の Python ツール (http://github.com/donnagreta/cm_track) を使用してセル追跡を実行し、軌道セグメントの削除などの基本的なエディター機能も提供します。
図4:個々の細胞軌跡の解析(A)位相差タイムラプス顕微鏡写真は、細胞(緑色の点)をマークする手動追跡手順(B、C)を行う。(D) セル位置 (x,y) は、その ID によって識別される各セルに格納され、各フレーム f. (E) 軌跡は、マイクログラフ上に重ね合わせたり、色分けして時間情報を示すことができます。例として、各軌道において、青から赤のカラーパレットは、赤と青がそれぞれ初期および最終セルの位置を示す、徐々に後の軌道セグメントを示します。(F)平均二乗変位などの軌道の様々な統計的特性を抽出し、様々な細胞集団の運動性を特徴付けるために使用することができ、この例では、野生型(wt,青)、およびノックダウン(kd、赤)MEPM細胞を含む。スケールバーは100 μmを表します。
- 2 つ目のツールを使用してイメージ上の軌道をオーバーレイし、次のように呼び出します。
visdat.py -d トラック.dat -i イメージ/ -o オーバーレイ/ -l999 -r3 -C2 - フォルダオーバーレイに軌道を重ね合わせ、画像を収集します。
注: この例では、セル位置データはファイル トラック.datに保存され、タイムラプスイメージシーケンスはフォルダイメージ内に格納されます。残りのパラメータは、描画される軌道の最大長(-l)、シンボルのサイズ(-r)、および使用されるカラースキーム(-C)を制御します。
- 個々の細胞軌跡の解析
- パスの全長による軌道の特徴付け
,
そして傷口に向かって正味変位
,
ここで Xは、傷に対して垂直な方向におけるPの投影を表します: 創傷がy軸に平行である場合の位置のx座標。 
各セルiおよびタイムポイントt37に対する誘導効率を計算する。これらの単一細胞メジャーの母平均によって文化を特徴付け、適切な時点tで評価する。
- パスの全長による軌道の特徴付け
- 細胞の集合的なストリーミング運動
- 前に説明した38, 39のように、移動セルの近くにある他のセルの平均速度によって、細胞の移動の局所的な空間的相関を特徴付けます。
注: 計算コードは https://github.com/aczirok/flowfield にあります。- 参照システムを前後、左、右の方向に合わせ、各ベクトルv(x,t)に合わせます (図 5A)。周囲のセルまたは PIV 速度ベクトルのそれぞれを、参照系の適切な空間セルに割り当てます (図 5B)。各ベクトルが参照系の原点として機能するように手順を繰り返します (図 5C,D) を指定した速度ベクトルが複数のビンに割り当てられます。
注: データ ポイントはベクトルの前にあり、別のデータ ポイントの左側にある可能性があります。 - 参照システムを共通の向き (図5C、F)に回転させ、それらをプールします (図 5G)。
注: プールされた速度データの各ビンの平均は、空間的相関を示す速度ベクトル(U)です: 平均は共有速度成分の尺度です (図 5H)。 - u(x)フローフィールドに指数関数
を合わせると、a、 x0、U0がパラメータを合わせられます。 3つのフィッティングパラメータのうち、x0、相関長(図5I、J)に焦点を当てます。
- 参照システムを前後、左、右の方向に合わせ、各ベクトルv(x,t)に合わせます (図 5A)。周囲のセルまたは PIV 速度ベクトルのそれぞれを、参照系の適切な空間セルに割り当てます (図 5B)。各ベクトルが参照系の原点として機能するように手順を繰り返します (図 5C,D) を指定した速度ベクトルが複数のビンに割り当てられます。
- 前に説明した38, 39のように、移動セルの近くにある他のセルの平均速度によって、細胞の移動の局所的な空間的相関を特徴付けます。
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各セルiおよびタイムポイントt37に対する誘導効率を計算する。これらの単一細胞メジャーの母平均によって文化を特徴付け、適切な時点tで評価する。
を合わせると、a、 x0、U0がパラメータを合わせられます。 3つのフィッティングパラメータのうち、x0、相関長(図5I、J)に焦点を当てます。
図5:培養細胞のストリーム形成の特徴付け(A,D)図4Aの位相コントラストタイムラプス画像を細胞の動きを識別するために用いられている。移動するセルごとに、参照枠(青)と空間ビン(白)を合わせて、隣接するセルを前後、左、右に分類しました。(B,E)隣接するセルの速度(黒いベクトル)は、同じ参照フレーム(C,F)に関連していた。この手順は、各セルとタイムポイントについて繰り返した。(G)このローカル情報をプールした後、各ビンには複数の速度ベクトル(グレー)が含まれ、平均モタイルセルに対する様々な場所での平均共移動速度(マゼンタ矢印)を決定することができます。(H)平均速度マップは、移動するセルに対してさまざまな位置での典型的なセル速度を特徴付けます。(I,J)最後に、このフィールドは、前と後(平行)軸に沿って、また左右(垂直)軸に沿ってサンプリングされました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
口蓋棚の解剖を図1に示す。切開のシーケンスは、組織の滑りを最小限に抑えるように設計されています.頭部の取り外し(図1A,B)に続いて、下顎が取り除かれる(図1B,C)。頭の上部の切開(図1C,D)は、逆さまに置くと組織を安定化させ(図1E)、ピンチ(図1F)、および物品用(図1G)を図表棚に可視化する。
単一の胚から切除された口蓋棚のペアはトリプシン化され、35mm皿または6ウェル皿の井戸で培養される。細胞密度が最適な成長のために低すぎるので、より大きな皿は好ましくない。合流すると、各ウェルの細胞がトリプシン化され、35mm相当の3つのウェル(通過#1)に通される。その後、1個の継代#1からのコンフルエント細胞を1×6細胞 /mLのアリコートに凍結することができる。冷凍アリコートは、その後、35mm相当の皿で育てられ、合流するように成長する。次に細胞をトリプシン化し(通過#2)、実験に従って播種します。凍結されたアリコートを作成して使用することは、特に細胞密度に関して条件を正常化するのに役立った。新鮮なMEPM細胞の使用は、実験における最終的な細胞密度の変動性をもたらし、これは新鮮な培養における生存可能またはサブ生存細胞の可変的な割合によるものと考えられている。また、これらの実験ではMEPM細胞の通過数は厳密に2個(上記にリスト)に限定された。
a)細胞密度が重要であることを考えると、b)単一胚からのMEPM細胞が限られていたり、c)イメージング光学が大型皿で優れていたり、2ウェルシリコーンインサートが使用された(図2および図3)。創傷修復アッセイの場合、MEPM細胞を高合流まで2ウェルシリコーンインサートで増殖させ、次いで挿入物を取り除き、包包するまで創傷を画像化した(図3)。しかし、2D培養では、MEPM細胞は成長するにつれてイメージングが必要だったので、2ウェルシリコーンインサートは単に高さの1/3rdにトリミングされ、明確なイメージングが可能になりました(図2C)。35mmの皿の小さい3Dプリントリング40はまた、2D運動性解析のために使用された(図2D)。
MEPM軌道(図4E)は持続性である:細胞運動の方向は数時間維持される。平均変位対時間分析(図4F)は、経過時間に比例する変位の形式での持続性を示しています。組織培養プラスチック表面上のMEPM細胞の典型的な速度は、10 μm/h、細胞培養の品質管理にも使用できます。運動性データの流れ解析では、MEPM細胞の共移動クラスターのサイズが約300μmであることを明らかにしている(図5I,J)。代表的な結果はまた、野生型と変異MEPM細胞の間に深い運動性の違いを示す。野生型と変異体の比較に加えて、2Dおよび創傷修復アッセイは、様々な生化学的処理と組み合わせることができます。例えば、PI3K-AKT経路活性化剤は、前述の21に記載されているように、MEPM細胞と共に使用されてきた。
図1:間葉細胞を単離する胚口蓋棚の解剖(A)E13.5マウス胚頭部を首に沿って切断して取り除く(赤線)。(B)次に、下顎と舌は、上顎と下顎の間(黄色の線)の間に、口腔に沿って切開して除去される。(C)口蓋棚除去のために組織を安定化させるために、頭頂部が切除される(緑色の線)。(D) 得られた解剖された上顎領域を逆さまに配置し、口蓋棚(黒い点線)を視覚化する。(F) 個々の口蓋棚の切除は、個々の突出棚(黄色)が上顎(青)からつままれる模式的に描かれています。(G)単一の胚から口蓋棚の切除されたペアは、トリプシン化し、35ミリメートル皿または6ウェルプレートで培養することができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:2D MEPM細胞培養の実験的セットアップ(A)MEPM細胞の凍結アリコートを解凍し、(B)35mm皿または6ウェルプレートで細胞を培養する。コンフルエントの場合、トリプシン化し、35 mm皿のプロトコルに記載されているように、トリミングされた2ウェルシリコーンインサートまたは(D)3Dプリントリングでこれらを播種します。培養空間が小さいと、大量の MEPM 細胞の必要性が最小限に抑えられます。トリムされたシリコーン挿入物または3Dプリントリングの低プロファイルは、ハロー効果なしで直接イメージングを可能にします。タイムラプスイメージングは、望ましい細胞密度が達成されるまで継続することができ、最大72時間です。代表的な画像は、(E)0時間、(F)24時間、および(G)45時間のタイムポイントで示されている。画像は4倍の目的を使用して撮影されました。E、F、G = 300 μm のスケールバー。略語: 2D = 2 次元;MEPM = マウス胚性口蓋間質;3D = 3 次元。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MEPM細胞を用いた創傷閉鎖アッセイの実験的セットアップ(A)MEPM細胞の凍結アリコートを解凍し、35mm皿または6ウェルプレートで培養細胞を(B)する。コンフルエントのとき、細胞をトリプシン化し、(C)35mm皿の2ウェルシリコーンインサートでそれらを播種する。所望の合流が達成されるまでインサート中の細胞を培養し(〜48時間)、次いでシリコーンインサートおよび画像を除去する。代表的な画像は、挿入物の取り外し直後(D)、24時間後(E)、及び(F)40時間後に示される。創傷閉鎖は約36時間かかります。画像は10倍の目的を使用して撮影されました。スケールバーは300 μmを表します。略語: MEPM = マウス胚性口蓋間葉.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
口蓋棚の標高は、垂直から水平方向のリモデリングイベント1、3、4、9、11を構成します。このリフォームプロセスでは、口蓋棚間葉細胞が協調的に振る舞う必要があると仮定されています。野生型 MEPM 細胞を用いた分析は、この細胞の挙動が組み込みであり、定量化できることを示しています。したがって、これらのアッセイは口蓋裂の新規および既存のマウスモデルにおける主要な口蓋棚の上昇欠陥を発見するために使用することができる。セクション1と2で概説されている方法は、研究者が主要なMEPM細胞のアリコートを分離、培養、および凍結することを可能にするべきである。これらの細胞は、ここで説明する2D培養および創傷修復アッセイを含む多種多様な用途に使用することができる。2D培養物を、タイムラプスイメージングと組み合わせると、細胞密度の範囲にわたって基本的な細胞属性を決定する簡単な方法を提示する。ここで提示される細胞の配列と細胞ストリームの形成を評価する方法は、集合的な細胞運動の属性である(図4)。創傷閉鎖アッセイは、細胞移動41、42、43を評価するために一般的に使用される。「創傷」の無細胞領域は、周辺における細胞の方向移動の手掛かりを提供する。このプロセスのタイムラプスイメージングにより、移行中の細胞軌道の決定と評価が可能でした。これらの細胞軌道は、次に、細胞移動速度と方向性を決定する(図5)。
まず、野生型MEPM細胞のみを用いて培養およびアッセイの条件を最適化することが重要です。口蓋棚が正常にトリプシン化され、得られた単一細胞懸濁液が一晩でめっきされた後、細胞の大部分(〜90%)は皿の成長表面に容易に付着する。細胞が容易に接着しない場合、培養条件に何か問題がある可能性があります。最初は、接着された細胞は、三角形またはわずかに細長い形状でかなり均質に見えますが、高密度に成長するにつれて、よりスピンドル状になり、細長くなります(図2)。細胞の大きさが大きくなったり、多核になったりした場合、実験には使用しないでください。この最適化は、成長(合流時間)と創傷修復(閉鎖時間)を成功させるための基本的なワイルドタイプパラメータも確立します。細胞は、ほぼ毎日の数を倍増することによって増殖し、タイムラプス画像で、〜5〜10 μm/hの運動性を示す。同様に、野生型変異体比較を含むその後の実験において、これらの基本的なパラメータが野生型細胞によって満たされない場合、実験を分析から除外する必要がある場合がある。例えば、野生型MEPM細胞は、2ウェルシリコーンインサートを使用して創傷を完全に閉じるために36〜40時間かかります。実験で野生型細胞が創傷を閉じるのに40時間よりかなり長くかかる場合、実験全体が疑われる。MEPM細胞からの性能が悪いのは、1)凍結されたアリコートの品質が悪い、2)不十分なリバイバル、または3)過剰な分化が原因である可能性がある。分化または老化細胞は、非常に大きく成長し、分裂しないとして視覚的に検出することができます。そのような細胞の数が多い培養は避けるべきである。一般に、10倍の目標の視野に異常な細胞があってはならない(図3)。視野の外側にあるセルまたは 2 つのセルは、解析に重大な影響を与えるべきではありません。分析を2つの細胞の通路(上記)のみに制限することは、MEPM細胞の品質を維持するのに大いに役立ちます。
プライマリMEPM細胞を用いた2D培養および創傷修復アッセイの両方において、成功の鍵となるのは、高い初期細胞密度でした。この要件は、細胞を>1400細胞/mm2で播種した創傷修復アッセイの最適化中に最初に決定された。創傷に移行する細胞の密度を、2D培養アッセイにおいて播種密度として使用した。細胞軌道の自動分析を可能にしながら、〜300細胞/mm2 形成された細胞ストリームの播種密度。密度が 300 セル/mm2 を超える場合は、目で視覚化できるより鮮やかなストリームを形成する傾向がありますが、個々の細胞の追跡は困難になります。野生型および変異胚からの一次MEPM細胞を比較する場合、創傷閉鎖遅延は計算解析なしで評価することができるが、河川形成および方向の違いは目では識別できない可能性がある。たとえば、焦点の喪失などにより、細胞密度が高すぎる場合や画質が悪い/ぼやけている場合、自動セルトラッキングが困難になることがあります。このような場合には、手動細胞追跡を用いて、ImageJを用いて創傷修復アッセイで細胞軌道を決定することができる。非常に低濃度のHoechst核染色(MEPM培養培地中の20mM溶液の3μL/mL)も細胞追跡を容易にするために使用できます。しかし、蛍光レーザー毒性は、長期使用の問題になる可能性があります。
手動追跡の場合、高い細胞密度がさらに追跡を隠すまで、創傷閉鎖の終わりから逆方向に細胞を追跡することが可能な限り容易であった。部分的な細胞軌道でさえ、細胞集団のために組み合わせると、有益であった。創傷修復アッセイとは対照的に、2D細胞培養解析には自動細胞追跡が必要であり、これが中間細胞密度が選択された理由の1つです。最後に、敏感なプライマリMEPMベースの分析を使用して、口蓋の標高に影響を与える可能性のある化合物および経路を特定することができます。これまでの研究では、PI3K-AKT経路の活性化は、Specc1l変異MEPM細胞21の細胞速度および方向性の両方を改善することが示された。他のMEPM研究はまた、下流のシグナル伝達カスケードを刺激したり、増殖を評価するために様々な成長因子または薬物治療を使用している22、29、30、44、45。したがって、MEPMベースの分析は、より多くの正または負の調節要因を同定するための迅速な方法を提供し、その後、インビボで検証することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
このプロジェクトは、国立衛生研究所の助成金DE026172(I.S.)とGM102801(A.C.)によって部分的に支援されました。I.S.はまた、生物医学研究優秀センター(COBRE)助成金(国立一般医学研究所P20 GM104936)、カンザスIDeA生物医学研究優秀基金(国立一般医学研究所P20 GM103418)、カンザス知的発達障害研究センター(KIDDRC)助成金(U54 Euniceケネディ・シュリバー、国立衛生研究所)の一部を支援されました。 HD090216)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C.
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
- Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
- Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
- Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
- Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
- Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
- Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
- Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
- Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
- Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
- Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
- Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
- Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
- Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
- He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).
- Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
- Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
- Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
- Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
- Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
- Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D.
- Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
- Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
- Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).
- Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
- Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
- Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
- Soderholm, J., Heald, R. Scratch n' screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
- Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , In Press (2021).
